Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Регуляция экспрессии генов множественной лекарственной устойчиовсти в опухоли молочной железы при проведении неоадьювантной химиотерапии

На правах рукописи

Литвяков Николай Васильевич

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ В ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ НЕОАДЬЮВАНТНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ

14.01.12 — онкология (биологические науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

г ОКТ 2014 005552917

Томск 2014

005552917

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Томский научно-исследовательский институт онкологии» (до 01.09.2014 ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН) и Национальном исследовательском Томском государственном университете

Научный консультант:

Чердынцева Надежда Викторовна доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией молекулярной онкологии и иммунологии ФГБНУ «Томский НИИ онкологии»

Официальные оппоненты:

-доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой онкологии ФГБОУВПО «Санкт-Петербургский государственный университет» Правительства РФ Орлова Рапшда Вахидовна

- доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Комов Вадим Петрович

- доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией эпигенетики Медико-генетического научного центра РАМН Залетаев Дмитрий Владимирович

Ведущая организация - ФГБНУ «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина»

Защита состоится «09» декабря 2014 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.052.01 при ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России по адресу: 197758 г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68. Тел.: (812) 456-78-98, Факс: (812) 596-8947.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России по адресу: 197758 г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68 и на сайте http://www.niioncologii.ru/sites/default/files/files/20142208173459.pdf

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е.В. Бахидзе

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Предоперационная (неоадъювантная) химиотерапия (НАХТ) показана для использования у больных с местно-распространенным раком молочной железы (РМЖ) IIIA, ПШ, или IIIC стадий и может применяться у пациентов с IIA (T2N0 или TiNi) или IIB (T2N! или T3N0) стадиями РМЖ. НАХТ предназначена для уменьшения объема первичной опухоли и уровня региональной лимфаденопатии, обеспечивая выполнение радикального оперативного вмешательства, органосохранного лечения, а также позволяет оценивать чувствительность к послеоперационной химиотерапии [Goldhirsch А., et al., 2013, Kaußnann М., et al., 2012, Schwartz G.F., et al., 2004, Senkus E„ et al., 2013, Семиглазов В.Ф., и др., 2008]. В этой связи очень важно, чтобы у больных отмечался хороший ответ на химиотерапию (полная или частичная регрессия опухоли) [Bertheau Р., et al., 2005, Kaufmann М., et al., 2006, Kuerer H.M., et al., 1998, WolmarkN., et al., 2001].

Основной причиной неэффективности химиотерапии злокачественных опухолей считают формирование фенотипа множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), который характеризуется способностью опухолевых клеток выживать в условиях высоких доз широкого спектра химиопрепаратов. Выделяют два типа МЛУ: предсуществуюшая МЛУ, ее определяют индивидуальные особенности опухоли и организма больного, кроме того, она зависит от гистогенеза опухоли, в частности, высокая иредсушествующая МЛУ отмечена у опухолей, происходящих из метаболически активных тканей (почки, печень, поджелудочная железа, и др.). При предсуществующей МЛУ все клетки опухоли оказываются устойчивыми к химиотерапии еще до начала лечения. Второй тип лекарственной устойчивости - это приобретенная, или адаптивная, МЛУ, которая возникает в опухолевых клетках в процессе химиотерапии под воздействием лекарственных средств [Szakacs G., et al., 2006].

Фенотип множественной лекарственной устойчивости связывают с функционированием продуктов генов семейства ABC-транспортеров (АТР-Binding Cassette), их работу считают мажорным механизмом лекарственной устойчивости [Gillet J.P., et al., 2012]. ABC-транспортеры осуществляют выброс цитостатических препаратов, таргетных (лапатиниб, иресса, софатиниб, герцептин, акситиниб и др.) и гормональных средств из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ [Amiri-Kordestani L., et al., 2012, Eechoute К., et al., 2011, Schinkel A.H., et al., 2012].

Роль генов ABC-транспортеров в формировании фенотипа предсуществующей и адаптивной МЛУ была доказана в опытах in vitro с использованием подходов по индукции генной экспрессии и трансфекции генов ABC в чувствительные к цитостатнкам линии клеток [Allen J.D., et al., 2000, Gottesman M.M., et al., 2006, Hembruff S.L., et al., 2008]. В исследованиях in vitro

определены многие механизмы активации экспрессии ABC-транспортеров при воздействии химиопрепаратов и росте опухоли [Chen K.G., et al., 2012].

Данные о связи исходного уровня экспрессии АВС-транспортеров (определяющего предсуществующую МЛУ) с непосредственной эффективностью химиотерапии, общей и безметастатической выживаемостью пациентов крайне противоречивы для опухолей человека, в частности, для рака молочной железы, [Chintamani, et al., 2005, Faneyte I.F., et al., 2004, Fletcher J.I., et al., 2010, Gillet J.P., et al., 2007, Park S., et al., 2006].

Немногочисленные клинические исследования адаптивной МЛУ в определенной мере подтверждают только отсутствие эффекта лечения при стимуляции экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в процессе химиотерапии [Atalay С., et al., 2006, Kim В., et al., 2013, Leonessa F., et al., 2003, Wind N., et al., 2011]. Полученные данные противоречивы и ограничены очень узким кругом АВС-транспортеров. При этом совершенно не изучено, с чем связан ответ опухоли молочной железы на химиотерапию, почему, при лечении по одной и той же схеме у одних пациентов наблюдается ответ на химиотерапию, а у других лечение неэффективно, и как во всем этом участвуют АВС-транспортеры.

Хорошо изучены механизмы активации экспрессии генов ABC в опухолевых клетках, обеспечивающие резистентность к химиопрепаратам [Chen K.G., et al., 2012, Schinkel A.H., et al., 2012]. Напротив, связанные с ABC-транспортерами механизмы, определяющие ответ опухоли на химиотерапию, практически не известны. Одним из таких потенциальных механизмов, теоретически способных обеспечить эффективный ответ на химиотерапию, может выступать регуляторное действие продукта гена опухолевой супрессии ТР53, способного ингибировать экспрессию генов ABC [Johnson R.A., et al., 2001, Scotto K.W., 2003, Thottassery J.V., et al., 1997]. Гетерогенность клинической опухоли может вносить определенный вклад в реализацию эффективности химиотерапии [Bhatia S., et al., 2012]. Хромосомные аномалии в опухолевых клетках могут иметь важное значение в реализации активности химиопрепаратов [Han S., et al., 2010, McClelland S.E., et al., 2009]. Наконец, адаптационные изменения опухолевых клонов в процессе химиотерапии способны обеспечивать вариабельность ее эффективности у разных индивидуумов.

В настоящей работе внимание было сосредоточено на исследовании ключевых генов АВС-транспортеров, экспрессируемых в опухоли молочной железы: ÄBCB1, АВСВЗ, АВСС1, АВСС2, АВСС5, ABCG1 и ABCG2. Кроме того, был изучен ген MVP (LRP - Lung Resistance-Related Protein), который функционирует как эндоплазматический и/или связанный с ядерной мембраной транспортер лекарственного средства вместе с ABC-транспортерами [Mossink М.Н., et al., 2003].

По-видимому, в клинической ситуации, в отличие от экспериментов in vitro на клеточных линиях, происходит активный процесс становления МЛУ при лечении, на который оказывают влияние факторы организма и опухоли.

Изучение именно этого процесса, поможет понять причины индивидуальной вариабельности ответа на химиотерапию, механизмы химиочувствительности и химиорезистентности. Это позволит разрабатывать методы прогнозирования ожидаемой эффективности химиотерапии и наметить новые стратегии управления фенотипом МЛУ в опухоли молочной железы.

Цель работы

Исследование значимости экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы для реализации ответа на лечение и установление факторов, определяющих ее индивидуальную вариабельность в процессе неоадъювантной химиотерапии.

Задачи исследования

1. Изучить экспрессию АВС-транспортеров в опухоли молочной железы до лечения и после НАХТ в зависимости от основных клинико-патолошческих параметров заболевания и непосредственной эффективности химиотерапии.

2. Оценить прогностическую значимость экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ в отношении гематогенного метастазирования.

3. Оценить возможность нормализации уровня экспрессии АВС-транспортеров после НАХТ и в промежутках между курсами на основе изучения динамики экспрессии генов ABC в процессе НАХТ.

4. Изучить экспрессию белков ABC и соответствующих им генов АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в процессе НАХТ.

5. Изучить влияние внутриопухолевой морфологической гетерогенности на экспрессию АВС-транспортеров в процессе предоперационной химиотерапии.

6. Определить значение метилирования промоторных участков генов лекарственной устойчивости в регуляции их экспрессии в процессе НАХТ.

7. Изучить влияние функциональных изменений гена опухолевой супрессии ТР53 на регуляцию экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы

8. Определить роль хромосомных аномалий опухоли молочной железы в регуляции экспрессии генов лекарственной устойчивости.

9. Проанализировать изменения мутантных опухолевых клонов и экспрессию АВС-транспортеров в процессе НАХТ

10. Сформировать модель факторов, определяющих изменение экспрессии генов ABC в опухоли молочной железы в ответ на НАХТ.

Научная новизна

Впервые установлена связь изменения (повышения или снижения) экспрессии АВС-транспортеров в опухолевой ткани молочной железы в процессе лечения с клинической эффективностью НАХТ. В реализации эффекта НАХТ играет роль адаптивная множественная лекарственная устойчивость, которая формируется за счет повышения экспрессии генов АВС-транспортеров в процессе химиотерапии. Впервые установлен феномен снижения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли в ответ на воздействие химиопрепаратов. Снижение экспрессии генов ABC определяет низкую

экспрессию белковых продуктов этих генов, обеспечивает объективный ответ опухоли на НАХТ и является благоприятным прогностическим фактором, не зависящим от основных клинико-патологических параметров заболевания. Впервые выявлено однонаправленное изменение экспрессии пяти ключевых генов ABC: АВСВ1, АВСС1, АВСС2, ABCG1 и ABCG2 в строгом соответствии с эффектом НАХТ, которое отмечено у 75% больных и обозначено как градиентный феномен. Наличие градиентного феномена у больных РМЖ является независимым благоприятным фактором прогноза, в то время как наличие у пациента разнонаправленных изменений экспрессии указанных АВС-транспортеров в процессе НАХТ ассоциировано с гематогенным метастазированием.

Впервые было проведено комплексное исследование механизмов и факторов, определяющих повышение или снижение экспрессии генов АВС-транспортеров в опухоли молочной железы в процессе НАХТ. Установлено, что гипо- или гиперметилирование промоторов генов ABC определяет исходный уровень экспрессии АВС-транспортеров в опухоли, но не оказывает существенного влияния на изменение экспрессии генов ABC и формирование адаптивной МЛУ.

Впервые исследована связь разных морфологических структур инфильтративного компонента рака молочной железы с характером изменений экспрессии АВС-транспортеров и показано, что внутриопухолевая морфологическая гетерогенность не оказывает прямого влияния на регуляцию экспрессии генов ABC. Впервые установлено значение связанного с молекулами главного комплекса гистосовместимости 1 (МНС1) гена АВСВЗ в реализации высокого уровня химиорезистентности альвеолярных и трабекулярных структур.

Получены новые данные о вовлечении гена-супрессора опухолевого роста ТР53 в регуляцию экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы. Впервые показано, что экзонный полиморфизм ТР53 Arg72Pro rsl042522 и делеция локуса 17р13.1 гена ТР53 оказывают влияние на изменение экспрессии генов АВС-транспортеров в процессе НАХТ, установлена прогностическая значимость делеции локуса 17р13.1.

Впервые при помощи микроматричных исследований хромосомных аберраций в опухолях больных раком молочной железы выявлены делеции локусов генов АВС-транспортеров, установлена их важная роль в негативной регуляции экспрессии своих генов в процессе НАХТ, высокая прогностическая и предсказательная значимость делеций локусов генов ABC.

Впервые идентифицированы локусы в ДНК опухоли молочной железы, несбалансированные хромосомные аномалии которых определяют снижение экспрессии генов ABC, в то время как нормальное состояние этих локусов связано с повышением экспрессии и формированием адаптивной МЛУ. На основе полученных данных сделан важный вывод о том, что в большинстве случаев нет специальных механизмов снижения экспрессии генов ABC в клетках, а нарушены механизмы ир-регуляции, т.е. формирования ответа

опухоли на химиопрепараты. На основе оценки этих нарушений в опухоли до лечения можно прогнозировать ожидаемую эффективность НАХТ. Нарушение механизмов ир-регуляции генов ABC является характерным для клинической опухоли аберрантным явлением.

На основе микроматричных исследований изменения мутантных опухолевых клонов в процессе НАХТ впервые выявлено появление новых мутантных клонов у некоторых больных, при этом у них в 83% отмечается развитие гематогенных метастазов. Впервые установлено, что в процессе химиотерапии элиминируются, прежде всего, опухолевые клоны с делениями локусов генов ABC и опухолевые клоны, несущие хромосомные аномалии, связанные со снижением экспрессии АВС-транспортеров. Полученные новые знания позволили значительно расширить представления о механизмах формирования адаптивной множественной лекарственной устойчивости.

Теоретическая и практическая значимость

В результате выполнения исследования получены приоритетные данные о механизмах химиорезистентности опухоли молочной железы, установлены новые феномены и закономерности ответа опухоли на химиотерапию, выявлены генетические, морфологические и эпигенетические факторы регуляции формирования множественной лекарственной устойчивости. Новые данные о том, что клиническая эффективность НАХТ зависит не от начального уровня экспрессии генов ABC в опухоли, а от направленности изменения уровня их экспрессии у пациента при проведении химиотерапии, значительно расширяют представления о процессе формирования фенотипа адаптивной МЛУ в клинических условиях и обосновывают новую стратегию управления множественной лекарственной устойчивостью через регулирование экспрессии АВС-транспортеров, а не через подавление активности белков ABC, как это предлагалось ранее.

Установлено, что адаптивная МЛУ, возникновение которой обусловлено повышением экспрессии АВС-транспортеров в опухолн, может продолжаться более трех месяцев, и в краткосрочном периоде не происходит естественной нормализации уровня экспрессии генов ABC в опухоли. Это может иметь важное значение при индивидуальном планировании курсов химиотерапии и совершенствовании стратегии химиотерапевтического лечения в целом, в плане определения целесообразности двухфазной химиотерапии с предоперационными и послеоперационными циклами.

Выявленный феномен снижения экспрессии генов ABC транспортеров в опухоли, сопряженный с клиническим ответом на НАХТ, и результаты исследования возможных механизмов этого явления позволили сформулировать основную идею работы о том, что в большинстве случаев снижение экспрессии обусловлено нарушением в опухолевых клетках физиологических механизмов активации генов МЛУ в ответ на химиотерапию. Это позволяет обосновано предположить, что для регуляции формирования множественной лекарственной устойчивости опухоли необходимо нарушить

механизмы ир-регуляции их экспрессии в опухолевых клетках, например, используя сочетание таргетных препаратов, ингибирующих внутриклеточные сигнальные пути, и конвенциональных лекарственных средств, которые и будут оказывать основное противоопухолевое действие. Полученные знания могут стать основой новой стратегии управления множественной лекарственной устойчивостью опухоли.

На основе оценки изменения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы идентифицирован новый информативный прогностический фактор, который может быть определен при проведении НАХТ. Он работает не только для пациентов с полной морфологической регрессией опухоли, но и для больных с частичной регрессией опухоли, стабилизацией или прогрессированием процесса, что значительно расширяет диапазон его возможного использования по сравнению с оценкой лекарственного патоморфоза. Установленное в работе явление градиентного феномена имеет высоко значимую связь с развитием метастатической болезни при раке молочной железы и является еще одним новым прогностическим фактором.

Высокая прогностическая значимость в отношении безметастатической выживаемости делеции локуса 17р13.1 гена ТР53 определяет возможность использования оценки CNA статуса этого локуса в качестве дополнительного прогностического фактора, который может быть исследован в опухоли молочной железы до лечения. Выявленная связь делеций локусов генов АВС-транспортеров в биопсийном материале опухоли молочной железы до лечения с эффективностью НАХТ и высоким уровнем безметастатической выживаемости обосновывает перспективность использования оценки делеций локусов генов ABC в качестве маркеров прогноза ожидаемой эффективности НАХТ, для персонализированного определения целесообразности ее проведения и в качестве дополнительного прогностического фактора. В практическом плане проведенные исследования дали возможность установить новые прогностические и предсказательные факторы и наметить мишени для терапевтического воздействия.

В целом проведенное исследование позволило решить важную научную проблему — выявить основные причины вариабельности индивидуального клинического ответа опухоли на химиотерапевтическое лечение, заложить основы персонифицированного подхода к назначению НАХТ и наметить пути формирования новой стратегии управления множественной лекарственной устойчивостью опухоли.

Положения, выносимые на защиту

Отсутствие клинического ответа на неоадъювантную химиотерапию обусловлено формированием адаптивной множественной лекарственной устойчивости в результате стимуляции экспрессии АВС-транспортеров в опухоли. При объективном ответе на химиотерапию в опухоли происходит снижение экспрессии АВС-транспортеров при воздействии химиопрепаратов, по сравнению с базовым уровнем до лечения.

Снижение экспрессии ABC-транспортеров обусловлено хромосомными аномалиями в опухолевых клетках, приводящих к нарушениям физиологических механизмов активации генов ABC в ответ на химиопрепараты.

В процессе химиотерапии в первую очередь происходит элиминация опухолевых клонов с нарушениями механизмов регуляции АВС-транспортеров, которые и являются чувствительными к действию химиопрепаратов клонами.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на:

III международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007), 4 Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (С.-Петербург, 2008), Российской научно-практической конференции «Современные аспекты диагностики и лечения рака молочной железы» (Томск, 2008), V-VII конференции молодых ученых им. Академика Н.В. Васильева (Томск, 2008 - 2010), Российско-Тайваньском форуме «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии» (Томск, 2009), VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), Международной конференции «Опухоль и хозяин: новые аспекты старой проблемы» (Киев, 2010), XVI и X Российских онкологических конгрессах (Москва, 2010, 2013 гг), 3rd Norwegian Cancer Symposium «Growth and Proliferation: Molecular Regulators of Cancer» (Oslo, 2011), Международной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Томск, 2011), Всероссийской конференции с международным участием «Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня» (Красноярск, 2012), VII и VIII съездах онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии (Астана, 2012, Казань, 2014), VIII Всероссийском съезде онкологов России (С.-Петербург, 2013), ESMO congress (Madrid, 2014). Результаты и автор исследования удостоены Всероссийской премии в области онкологии «In Vita Veritas» 2013 г. в номинации «За достижения в области экспериментальной онкологии».

Внедрение результатов исследования

Результаты работы включены в учебную программу и тематический план лекций для кафедры физиология человека и животных Биологического института Национального исследовательского Томского государственного университета на тему «Применение современных методов исследования генома и транскриптома в физиологии». Используются в учебном процессе Сибирского государственного медицинского университета и включены: - в рабочую программу послевузовской подготовки в интернатуре по специальности 040113-патологическая анатомия;

— методические рекомендации для преподавателей СибГМУ на практические и лабораторные занятия по учебной дисциплине патологическая анатомия, специальность «060101 -лечебное дело» по теме: «Клинико-морфологическая характеристика злокачественных опухолей эпителиального происхождения» для 3 курса лечебного, педиатрического, стоматологического и лечебного факультетов.

— в план чтения лекции по онкологии по теме «Молекулярные механизмы формирования и прогрессии злокачественных опухолей» на кафедре онкологии СибГМУ для студентов лечебного и педиатрического факультетов.

Разработано учебное пособие по специальностям 060101 и 060103 «Механизмы множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы», которое было утверждено на кафедре онкологии 4 октября 2013 года протокол № 7. Зарегистрирована база данных: Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2013621213 от 24 сентября 2013 г. Литвяков Н.В., Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., Цыганов М.М., Перельмутер В.М., Вторушин С.В., Завьялова М.В., Чердынцева Н.В. «База данных экспрессионный и клинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак молочной железы». Разработан лабораторный набор реагентов для оценки экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости и монорезистентности под названием «MDR-MR ЭКСПРЕССИЯ», утвержден Директором ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН 15 октября 2013 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 45 печатных работ, в том числе 21 статья, из них 9 статей в зарубежных журналах, 1 глава в зарубежной монографии, 1 зарегистрированная база данных.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 2 глав собственных результатов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 237 страницах и иллюстрирована 38 таблицами и 38 рисунками. Библиография включает 418 литературных источников, из них 402 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Было обследовано 145 больных РМЖ с морфологически верифицированным диагнозом, клинической стадией IIA - IIIC (TV4N0-3M0) люминального В, трижды-негативного и НЕ112-позитивного подтипов, в возрасте 28-68 лет (средний возраст 47,43 ± 0,78 лет), получавших в 2006-2010 годах лечение в клиниках ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН (г. Томск, Россия). Исследование проходило в соответствии с Хельсинкской Декларацией 1964 г. (исправленной в 1975 и 1983 гг.) и с разрешения локального этического комитета института, все пациенты подписали информированное согласие на исследование. Все обследованные больные имели IIA - IIIC стадии, и в соответствии с «Consensus Conference on Neoadjuvant Chemotherapy in

Carcinoma of the Breast, April 26 - 28, 2003, Philadelphia, Pennsylvania» [Schwartz G.F., et al., 2004] в неоадъювантном режиме получали 2-4 курса химиотерапии по схемам FAC (5-fluorouracil 600 мг/м2, adriamycin 50 мг/м2 и cyclophosphamide 600 мг/м2 один раз в 3 недели), САХ (cyclophosphamide 100 мг/м2 внутримышечно, adriamycin 30 мг/м2 внутривенно, xeloda 1200 мг/м2 перорально), или монотерапия таксотером (100 мг/м2 часовая инфузия в день). Через 3-5 недель после НАХТ проводилась операция, затем 2 курса адъювантной химиотерапии по схеме FAC, а лучевая терапия и/или гормональное лечение назначались по показаниям. Эффективность предоперационной химиотерапии оценивали по критериям ВОЗ с помощью УЗИ и/или маммографии.

Основную исследовательскую группу составили 120 больных. У них была изучена экспрессия генов ABC в биопсийном материале до лечения и генов и белков ABC-транспортеров в операционном материале после НАХТ. 25 больных РМЖ составили независимую группу для изучения динамики изменения экспрессии генов ABC в процессе НАХТ. У них экспрессия генов ABC-транспортеров изучалась в биопсийных образцах опухоли: до лечения, на 7 сутки от начала химиотерапии, на 21 сутки от начала лечения и в операционном материале после НАХТ.

Для выполнения исследований была создана и зарегистрирована электронная база данных: Свидетельство о государственной регистрации базы данных №2013621213 от 24 сентября 2013 г. «База данных экспрессионных и клинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак молочной железы»

Забор опухолевого материала. Для молекулярных исследований были использованы биопсийные опухолевые образцы (-10 мм3), взятые под контролем УЗИ: до лечения (в основной и независимой группах), на 7 и 21 сутки от начала НАХТ (для независимой группы), а также операционный материал (-60-70 мм3) после НАХТ (для обеих групп). Образцы опухоли помещали в раствор RNALater (Ambion, USA) и сохраняли при температуре -80°С (после 24-часовой инкубации при +4°С) для дальнейшего выделения РНК и ДНК. Для морфологических исследований забор тканей проводился в течение первого часа после выполнения операций. Взятые образцы помещались в 10% рН-нейтральный формалин.

Выделение РНК. Тотальная РНК была выделена из 145 биопсийных образцов до лечения, 50 биопсийных образцов, полученных на 7 и 21 сутки после начала НАХТ. Кроме того, РНК выделяли из 131 операционного образца этих же больных после НАХТ. РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, #74134). Ha спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составила от 80 до 250 нг/мкл, A26o/A:so = 1,95-2,05; AWA230 = 1,90-2,31.

Целостность РНК оценивалась при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA #5067-5367). RIN составил 5,6 - 7,8.

Выделение ДНК. ДНК из опухолевой ткани молочной железы выделяли из 94 образцов (68 биопсий и 26 операционных образцов этих же пациентов) при помощи набора QIAamp DNA mini Kit (Qiagen, Germany # 51304). Концентрация составила от 50 до 150 нг/мкл, А2бо/А28о= 2.10-2.35; А2бо/А2зо = 2.15-2.40. Целостность ДНК оценивалась при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) с использованием набора Agilent Genomic DNA ScreenTape System Quick Guide (Agilent Technologies, USA # 5067-5365), фрагменты ДНК, в основном, имеют массу более 48 kbp.

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Уровень экспрессии генов МЛУ: АВСВ1, АВСВЗ, АВСС1, АВСС2, АВСС5, ABCG1, ABCG2 и MVP оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе RotorGene-6000 (Corbett Research, Australia). Технология ПЦР подробно описана в нашей публикации (Litviakov N.V., et al. Changing the expression vector of multidrug resistance genes is related to neoadjuvant chemotherapy response. //Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2013, Vol.71 N.l P.153-163). Относительная экспрессия МЛУ была оценена с помощью метода Pfaffl в условных единицах относительно гена рефери GAPDH.

Генотипирование по SNP-маркерам. Генотипирование проводили при помощи ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе "CFX96" Bio-Rad Laboratories". Праймеры и зонды были разработаны при помощи программы "Vector NTI 11.5" (Invitrogen, USA) (Литвяков Н.В. и др. 2010).

Метилчувствительная ПЦР. Для детекции метилирования CpG островков промоторных областей ABC-транспортеров использовали метилчувствительную ПЦР [Petrenko A., et al., 2000]. Этот метод основан на способности метил-чувствительных рестриктаз (HpaW (CjCGG) и Hspal (CGCjG) (Сибэнзим, Россия)) гидролизовать CpG участки ДНК, не подвергшиеся метилированию и оставлять нерасщепленными 5mCG участки, содержащие метилцитозин. Нуклеотидная последовательность промоторных регионов исследованных генов была найдена в базе данных Transcriptional Regulatory Element Database (http://rulai.cshl.edu/cgi-

bin/TRED/tred.cgi?process=searchPromForm). Для внутреннего контроля ПЦР использовали фрагмент гена MTHFR (80 bp).

Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков ABC

Проводили по стандартной методике. Использовали следующие первичные моноклональные антитела: Авсв1 Р-гликопротеин — PGLYM (Novocastra™ Lyophilised antibodies, Leica Biosystems, UK), Abccl - Multidrug Resistance-Associated Protein MRP1 (Novocastra™ Lyophilised antibodies, Leica Biosystems, UK); Abcc2 - Multidrug Resistance-Associated Protein Anti-MRP2

antibody [M2 III-6] (ab3373) (Abeam, UK); Abcgl - ATP-Binding Cassette SubFamily G Member 1 Anti-ABCGl [EP1366Y] antibody (ab52617) (Abeam, UK); Abcg2 - Breast Cancer Resistance Protein Anti-BCRP/ABCG2 antibody [BXP-21] -Hematopoietic/Neural Stem Cell Marker (ab3380) (Abeam, UK); Mvp - Major Vault Protein Anti-MVP antibody [0.N.389] (abl4562) (Abeam, UK). С помощью светового микроскопа «Axiostar plus» (Carl Zeiss, Germany) детально оценивалась экспрессия белков ABC-транспортеров в опухолевых клетках и в строме. В качестве результата использовали значение % опухолевых клеток, экспрессирующих изучаемый белок.

Микроматричный анализ

Микроматричный анализ проводили на ДНК-чипах высокой плотности CytoScan м HD Array (Affymetrix, USA). Все процедуры проводили в соответствии с протоколом производителя на системе Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 7G. Для обработки результатов микрочипирования использовали программу «Chromosome Analysis Suite 2.0» (Affymetrix, USA). При помощи программы в хромосомах определяли несбалансированные хромосомные аберрации - делеции и амплификации (Loss и Gain), представляющие собой CNA-Copy Number Aberration (аберрации числа копий) опухолевой ДНК. Практически во всех случаях CNA были мозаичными, т.е. мутантная опухолевая ДНК определялась на фоне нормальной ДНК стромы опухоли.

Статистические методы

Статистическая обработка проводилась с использованием программы «STATISTICA 8.0» (StatSoft Inc., США). Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, непараметрический критерий Вилкоксона для связанных групп. Для анализа безметастатической выживаемости использовали метод Каплана-Майера [Kaplan E.L., et al., 1958]. Сравнение значимости различий между группами производилось с помощью log-rank теста. Сравнение частот по качественным данным анализировали при помощи двухстороннего критерия Фишера http ://vassarstats.net/odds2x2.htm I.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия ABC-транспортеров в зависимости от основных клипико-морфологических параметров. На первом этапе была изучена экспрессия в опухолевой ткани ABC-транспортеров и ее связь с патогенетически значимыми клинико-морфологическими параметрами, что важно с точки зрения выявления дальнейших направлений исследований и исключения или учета в дальнейшем анализе влияния тех или иных клинических показателей.

Всего лишь несколько генов до лечения показали связь с основными клинико-патологическими параметрами: уровень экспрессии АВСВЗ ассоциирован с возрастом, АВСС2 с менструальным статусом, ABCG2 с размером опухоли, АВСС5 с лимфогенным метастазированием и ABCG1 с ER статусом. Можно полагать, что это большей частью случайные ассоциации, обусловленные большим количеством сравниваемых параметров. Эти данные

объясняют слабую ассоциацию основных клинико-патологических параметров с ответом на НАХТ. В нашем исследовании экспрессия шести (двух - на уровне тенденции) из девяти АВС-транспортеров в опухоли молочной железы после НАХТ (но не до лечения) была связана с размером первичной опухоли.

Экспрессия АВС-транспортеров у больных с различной эффективностью НАХТ. Следующим этапом работы было изучение связи экспрессии генов АВС-транспортеров с непосредственным эффектом предоперационной химиотерапии. Сравнивали уровень экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы до лечения и после НАХТ у больных с объективным клиническим ответом на ХТ (частичная регрессия+полная регрессия, п = 73) и у пациентов, не ответивших на предоперационную химиотерапию (стабилизация+прогрессирование, п = 47). Из всех АВС-транспортеров только уровень экспрессии гена АВСВЗ (который больше связан с функционированием иммунной системы и молекул главного комплекса гистосовместимости МНС1 и не осуществляет выброс лекарственных препаратов из клеток) в опухоли до лечения был статистически значимо выше у больных с объективным клиническим ответом.

8.00

■ До лечения □ ПиилеНАХГ

лисп 1 лист Ант аяггу лягса а яга/ а яга?

Рисунок 1 - Сравнение уровней экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы, до лечения и после НАХТ, отдельно в группах с объективным ответом (А, п=58) и с отсутствием ответа на НАХТ (Б, п=48). Статистический анализ р-уа1ие - по критерию Вилкоксона для связанных групп: 1-р=1,17х10'7; 2-р=0,008; 3-р=0,02 4-р=0,001; 5-р=0,0001; 6-р=0,000003; 7-р=0,00005; 8-р=1,51x10"7; 9-р=0,009; 10-р=0,004; 11-р=0,02; 12-р=0,00001; 13-р=0,03. Для АВСС5 в обеих группах р-уа1ие на уровне тенденции (< 0,1).

После проведения предоперационной химиотерапии происходит дивергенция групп по уровню экспрессии практически всех изученных генов в образцах опухоли после НАХТ. У больных с объективным ответом средние значения экспрессии генов АВСВ1, АВСВЗ, АВСС1, АВСС2, ABCG1, ABCG2 и МУР были статистически значимо ниже после НАХТ по сравнению с уровнем до лечении. У пациентов с устойчивостью к химиотерапии отмечается увеличение уровня экспрессии большинства генов в ткани опухоли после НАХТ по сравнению с уровнем до лечения (10 7 < р < 0,03, по непараметрическому критерию Вилкоксона для связанных групп) (рисунок 1).

Для подтверждения этой связи был проведен анализ ассоциации частоты снижения или повышения экспрессии с эффектом НАХТ. У пациенток с объективным клиническим ответом в опухоли наблюдается снижение экспрессии генов ABC в 61-84% случаев, а у пациенток с отсутствием ответа в процессе проведения химиотерапии наблюдается повышение уровня экспрессии этих генов в 63-88 % случаев (0,02 < р < 1,1х10"12) (таблица 1).

Таблица ]. - Изменение экспрессии генов ABC-транспортеров в процессе химиотерапии и эффективность НАХТ

Ген Эффективность НАХТ p-value

Объективный ответ Отсутствие ответа

Снижение экспрессии Повышение экспрессии Снижение экспрессии Повышение экспрессии

АВСВ1 49 (84%) 9 (16%) 6(12%) 42 (88%) 1,1 х 10"12

АВСВЗ 42 (74%) 15(26%) 26 (56%) 20 (44%) 0,09

АВСС1 39 (67%) 19 (33%) 14 (29%) 34(71%) 0,0002

АВСС2 44 (76%) 14 (24%) 13 (27%) 35 (73%) 6,5x10"7

АВСС5 35 (61%) 22 (39%) 17 (37%) 29 (63%) 0,02

ABCG1 48 (83%) 10(17%) 16 (35%) 30 (65%) 7,1х10"7

ABCG2 47 (81%) 11 (19%) 9 (19%) 39 (81%) 1,0x10"'°

МУР 47 (81%) 11 (19%) 15 (33%) 30 (67%) 0,000001

Статистический анализ: в таблице показано число наблюдений (процент) р-уа)ие-по двустороннему критерию Фишера, полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия.

Таким образом, нами была впервые установлена связь изменения экспрессии генов АВС-транспортеров в опухолевой ткани молочной железы в процессе лечения с эффектом НАХТ. Фактически установлены феномены индивидуального повышения или снижения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении химиотерапии и связи с этими изменениями ответа на предоперационную химиотерапию. Наши исследования четко показали, что в реализации эффекта НАХТ играет роль не предсуществующая, а адаптивная (изменяемая в процессе лечения) МЛУ. Это обосновывает новую стратегию управления множественной лекарственной устойчивостью через регуляцию экспрессии АВС-транспортеров (а не через подавление активности белков ABC, как это предлагалось ранее [Tamaki A et al., 2011]).

Значимость экспрессии ABC-транспортеров в опухоли молочной железы для безметастатической выживаемости пациентов. Данные мировой литературы о связи предсуществующей МЛУ с прогнозом при РМЖ оказались крайне противоречивыми. Это подтверждают результаты нашего исследования, из числа всех исследованных генов только для гена АВСВЗ предсуществующий уровень экспрессии в опухоли до лечения был связан с безметастатической выживаемостью. Была оценена безметастатическая выживаемость в зависимости от повышения или снижения экспрессии генов ABC в процессе НАХТ. Безметастатическая выживаемость пациентов с повышением экспрессии АВСВ1, АВСС2 и ABCG1 составила 50-55%, а у больных со снижением экспрессии этих генов колебалась в пределах 73-78%(log-rank test р = 0,0320,0061) (рисунок 2).

Рисунок 2. - Безметастатическая выживаемость больных РМЖ в зависимости от изменения опухолевой экспрессии АВС-транспортеров при проведении НАХТ.

Группы со снижением и повышением экспрессии генов АВСВ1, АВСС2 и А ВС а не различаются между собой по возрасту, менструальному статусу, размеру опухоли, частоте лимфогенного метастазирования, рецепторному статусу опухоли, по частотам молекулярных подтипов, гистологической форме и схеме НАХТ. Таким образом, изменение экспрессии генов АВС-транспортеров в процессе НАХТ имеет прогностическую значимость и может

рассматриваться как новый потенциальный прогностический фактор, который не зависит от стандартных клинико-патологических факторов прогноза. Повышение экспрессии АВСВ1, АВСС2 и ABCG1 является неблагоприятным прогностическим признаком, а снижение экспрессии является благоприятным прогностическим признаком.

Уменьшение экспрессии пяти основных генов ATP-Binding Cassette -АВСВ1, АВСС1, ABCC2, ABCG1 и ABCG2 в опухоли молочной железы после проведения НАХТ по сравнению с биопсийными образцами до лечения сочетается с объективным ответом на НАХТ. Повышение экспрессии этих генов связано с отсутствием непосредственного клинического эффекта НАХТ. У большинства пациентов - 80/106 (75%) наблюдается однонаправленное изменение экспрессии пяти основных ABC-транспортеров в процессе НАХТ в строгом соответствии с ее эффектом, т.е. снижение при хорошем ответе на НАХТ и повышение при его отсутствии. Это явление было названо нами градиентным феноменом. У 25% наблюдалось разнонаправленное изменение экспрессии пяти ABC-транспортеров, т.е. градиентный феномен отсутствовал. При наличии градиентного феномена пятилетняя безметастатическая выживаемость пациентов составила 73% против 39% у больных без градиентного феномена (log-rank test р=0,0018) (рисунок 3). Это позволяет рассматривать наличие градиентного феномена у пациентов в качестве благоприятного прогностического фактора. При отсутствии градиентного феномена относительный риск развития гематогенных метастазов составляет RR= 1,77(95%С1 1,11-2,83), уровень доверительной вероятности с поправкой Йетсар = 0,005.

0,31----

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Месяцы

Рисунок 3 - Безметастатическая выживаемость больных РМЖ в зависимости от наличия/отсутствия градиентного феномена.

Итак, в наших исследованиях был впервые установлен феномен связи изменения экспрессии (повышения или снижения) генов АВС-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении НАХТ с ее эффективностью и прогнозом заболевания.

Регуляция экспрессии ABC-транспортеров. Для понимания механизмов формирования адаптивной множественной лекарственной устойчивости необходимо было понять, почему и каким образом при использовании одной и той же схемы лечения у одних больных происходит снижение экспрессии генов ABC в опухоли, и это сочетается с хорошим эффектом НАХТ, а у других -повышение экспрессии генов ABC, и это обусловливает плохой ответ.

Исходя из физиологической функции ABC-транспортеров, повышение их экспрессии является нормальной реакцией клеток (в том числе и опухолевых) в ответ на химиопрепараты. Поэтому повышение экспрессии этих генов в процессе химиотерапии известно в литературе, и во многом понятны механизмы активации системы ABC-транспортеров [Chen K.G., et al., 2012].

Снижение экспрессии намного более непонятный и сложный феномен, и в литературе нами найдено лишь одно подтверждение феномена снижения экспрессии ABC-транспортеров в ответ на воздействие химиопрепаратов в клинической ситуации, которое опубликовано уже после выхода нашей статьи [Kim В., et al., 2013].

Доказательство феномена снижения экспрессии ABC-транспортеров в опухоли молочной железы при проведении НАХТ. Прежде всего, для доказательства существования феномена снижения экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ у 25 пациентов была проанализирована экспрессия ABC-транспортеров в четырех точках: до лечения, на 7-е и на 21-е сутки после начала 1 курса НАХТ и в операционном материале через 3-5 недель после всех курсов НАХТ. Уже на 7-е сутки у некоторых пациентов наблюдается снижение экспрессии генов ABC. За такой короткий период не может произойти и повышение и естественное убывание экспрессии генов ABC, следовательно, можно констатировать, что феномен снижения экспрессии ABC-транспортеров при воздействии химиопрепаратов реально существует.

Была установлена продолжительность периода адаптивного повышения экспрессии ABC-транспортеров в ответ на лечение и показано, насколько долго сохраняется повышенная экспрессия генов ABC в опухоли после прекращения химиотерапии. Для этого проанализировано время окончания химиотерапии и дата оперативного вмешательства по историям болезни. В редких случаях период между последним курсом химиотерапии и оперативным вмешательством существенно превышал 5 недель. Были случаи, когда повышенная, относительно исходного уровня, экспрессия генов ABC сохранялась более 80-90 дней (срок от окончания последнего курса до операции), т.е. если адаптивная МЛУ сформировалась, то она длительно сохраняется, и это надо учитывать при формировании тактики лечения.

Экспрессия белков ABC-транспортеров в опухоли молочной железы. В

операционном материале после проведения НАХТ у 38 больных была изучена экспрессия семи белков МЛУ: Mvp - продукта гена MVP, Bcrpl - продукта гена ABCG1, Всгр - продукта гена ABCG2, Mrpl - продукта гена АВСС1, Мгр2 -белка гена АВСС2 и Р-гликопротеина - продукта гена АВСВ1. У больных, в

опухоли которых при проведении НАХТ наблюдалось снижение экспрессии мРНК генов МУР, АВСС2, АВСС1 и АВСВ1, в образцах после НАХТ отмечается низкий процент клеток, экспрессирующих соответствующие белки: Мур, Всгр, Мгр1 и Р-гликопротеин, по сравнению с пациентами, у которых экспрессия мРНК генов АВС-транспортеров в процессе НАХТ повышается (рисунок 4).

■ Повышение экспрессии гена в Снижение экспресспдгена t

М\-р Всф1 Вир Мгр1 Мгр2

Рисунок 4.-Экспрессия белков химиорезистентности в опухоли молочной железы после НАХТ в зависимости от изменения экспрессии их генов. Примечание: уровень значимости критерию Вилкоксона-Манна-Уитни: 1 -р = 0,035; 2-р = 0,027; 3-р = 0,039- 4-

по

р = 0,028.

Полученные результаты еще раз подтверждают существование феномена снижения экспрессии АВС-транспортеров в ответ на химиопрепараты, теперь уже на белковом уровне.

Экспрессия АВС-транспортеров и внутриопухолевая морфологическая гетерогенность. Показано, что инвазивно-протоковая карцинома молочной железы (80% от всех опухолей молочной железы) имеет высокую степень внутриопухолевой морфологической гетерогенности, которая связана с различным клиническим прогнозом. Инфильтративный компонент инвазивного протокового рака представлен тубулярными, трабекулярными, солидными, альвеолярными структурами и дискретными группами опухолевых клеток [Zavyalova M.V., et al., 2011]. Пациенты с альвеолярными структурами в опухоли были менее чувствительны к НАХТ, у 143/231 (62%) этих больных, отсутствовал ответ на НАХТ, в то время как у больных без альвеолярных структур в опухоли только 70/151 (46%)(р = 0,0028) пациентов не отвечали на НАХТ. Также и больные с трабекулярными структурами в опухоли чаще показывали устойчивость к химиотерапии, по сравнению с пациентами без этих структур (59% против 45%; р=0,0272). Полученные результаты продемонстрировали, что внутриопухолевая морфологическая гетерогенность рака молочной железы оказывает существенное влияние на эффективность неоадъювантной химиотерапии. Мы сравнили уровень экспрессии генов ABC в

опухолевой ткани молочной железы до лечения и после НАХТ при наличии или отсутствии в ней разных типов морфологических структур. Наличие тех или иных морфологических структур не оказывало существенного влияния на экспрессию генов ABC-транспортеров и ее изменение в процессе НАХТ. Не выявлены отличия по уровню экспрессии ABC-транспортеров и частоте повышения или снижения экспрессии генов ABC в зависимости от спектра указанных структур. Анализ экспрессии генов МЛУ в альвеолярных и трабекулярных структурах, вырезанных из опухоли при помощи лазерной микродиссекции, показал низкий уровень экспрессии генов ABC. Интересные результаты были получены только по гену АВСВЗ, уровень экспрессии которого был статистически значимо ниже в опухоли с альвеолярными структурами (до лечения и после НАХТ) и в опухоли с трабекулярными структурами (до лечения). Согласно ранее представленным данным, у больных с отсутствием ответа на НАХТ отмечается низкий уровень экспрессии гена АВСВЗ в опухоли до лечения, а у больных с объективным ответом отмечается высокий уровень экспрессии АВСВЗ. Следовательно, одним из механизмов, обусловливающих химиорезистентность альвеолярных и трабекулярных структур, является низкая экспрессия гена АВСВЗ.

Метилирование промоторов генов ABC-транспортеров и их экспрессия в процессе НАХТ. Следующим изученным нами фактором, который предположительно мог бы определять экспрессию генов АВС-транспортеров, явилось метилирование промоторов изучаемых генов. Метилирование промоторных регионов генов является одним из основных механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов [Jones Р.А., 2012]. Опухоли оказывается «выгодно» их гипометилирование и высокая активность экспрессии АВС-транспортеров, поскольку это помогает избегать повреждающего действия химиотерапии. Очень часто наблюдается низкий уровень метилирования промоторных регионов этих генов в опухолевой ткани [Sharma G., et al., 2010]. Была исследована связь метилирования промоторной области трех генов MVP, ABCG2 и АВСВ1 непосредственно в опухолевой ткани молочной железы до лечения и уровня экспрессии этих генов до лечения и после НАХТ у конкретных больных. С использованием базы данных TRED -Transcriptional Regulatory Element Database (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=search PromForm), были найдены нуклеотидные последовательности промоторов этих трех генов. Метилирование исследовалось при помощи метода метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР).

В результате установлено, что гипометилирование промоторных регионов изученных генов сочетается с их высокой экспрессией до лечения и повышением экспрессии в процессе НАХТ (рисунок 5, больная Л1). При гиперметилировании промоторов генов MVP (больные К1 и Л2), ABCG2 (больные К1 и К2) и АВСВ1 (больные К2 и Л2), сочетающимся с низкой экспрессией до лечения, в некоторых случаях отмечается повышение их экспрессии в процессе НАХТ, т.е. гиперметилирование промотора не

определяет негативную регуляцию экспрессии гена в процессе НАХТ. Данные МЧ-ПЦР для промотора АВСВ1 были подтверждены при помощи бисульфитной конверсии и последующем секвенированием.

Внутренний контроль MTHFR 80 bp

MVP

IbJj

Л1

К1

.12

+контроль

Промотор MVP 405 bp

0.8 0.6 0.4 • 0.2 -О

ABCG2

Ukl

Л1 К1

К2

Л2

+контроль

Промотор ABCG2 365 bp

Л1 К1 К2

+контроль

Промотор ABCВ1 263 bp

Рисунок 5 - Уровень экспрессии генов MVP, ABCG2 и Л ВС В! в опухоли до лечения и после НАХТ и метилирование их промоторов в опухоли до лечения.

Примечание: На гистограммах представлена экспрессия генов в опухоли больных JIl, Kl, К2 и J12 до лечения (синие столбики) и после НАХТ (красные столбики)(по оси ординат-условные единицы). Метилирование промоторов генов оценивалось при помощи метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР) при использовании смеси метилчувствительных рестриктаз HpaU (QCGG) и Hspa\ (CGC^G) (Сибэнзим, Россия). MspI (Fermentas, Termo Scientific) использовали на первом этапе в качестве контроля наличия CpG островков в участкс амплификации). Результаты МЧ-ПЦР представлены в виде электрофореграммы для всех больных. Отсутствие специфичного бенда (или слабая его выраженность) свидетельствует о гипометилировании промотора. В качестве положительного контроля использовалась геномная ДНК из крови, не подвергавшаяся рестрикции. В качестве внутреннего контроля эффективности МЧ-ПЦР использовали участок гена MTHFR - 80 bp (выбран из 10 кандидатов) без сайтов рестрикции HpaW, Hspal и MspI.

Таким образом, метилирование промоторов генов АВС-транспортеров определяет предеуществующий уровень их экспрессии, но не оказывает влияние на адаптивное изменение экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ. Одним из объяснений этому является известный феномен снижения метилирования генов ABC в процессе химиотерапии [Wilting R.H., et al., 2012]. Однако пока не установлены точные маркеры, которые позволили бы прогнозировать снижение уровня метилирования промоторов АВС-транспортеров у конкретного больного в процессе проведения химиотерапии в случае их гиперметилирования.

Ген-супрессор опухолевого роста ТР53 и экспрессия АВС-транспортеров в опухоли молочной железы. На следующем этапе была изучена роль гена ТР53 в регуляции экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ. Установлено, что наличие соматических мутаций гена ТР53 в опухоли сопряжено с отсутствием ответа на НАХТ, что может быть связано со стимуляцией экспрессии гена ABCBI (как это было установлено в работе [Sampath J., et al., 2001 ]) и других АВС-транспортеров.

Была определена связь одного экзонного (rs 1042522) и двух интронных (rsl2602273 и rs8073498) полиморфизмов гена ТР53 с эффективностью НАХТ и экспрессией АВС-транспортеров. Rsl2602273 и rs8073498 не показали значимой роли в регуляции экспрессии АВС-транспортеров и эффективности НАХТ. Напротив, функционально значимый экзонный полиморфизм ТР53 Arg72Pro rsl042522 показал хорошую связь с эффектом НАХТ и экспрессией генов ABC.

Носители дикого Arg/Arg генотипа rsl042522 лучше отвечали на НАХТ по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа. Высокая эффективность НАХТ у носителей Arg/Arg генотипа сочеталась с низкой экспрессией генов АВСС1 и АВСС5 в образцах опухоли после НАХТ и со снижением экспрессии генов ABCBI, АВСС1, ABCG2 и MVP в процессе НАХТ, в сравнении с гетерозиготным и минорным генотипами. У носителей Arg/Arg генотипа rsl042522 статистически значимо чаще наблюдается делеция локуса 17р13.1, в котором расположен ген ТР53 (в 27/41 - 65% случаев), чем у носителей Arg/Pro+Pro/Pro генотипов (12/29, 41% случаев). Делеция локуса 17р13.1 гена ТР53 не влияет на уровень экспрессии АВС-транспортеров в опухоли до лечения и после НАХТ, однако связана с более частым снижением экспрессии генов ABC в процессе НАХТ, чем при нормальном состоянии локуса (таблица 2). Наконец, у больных с делецией 17р 13.1 пятилетняя безметастатическая выживаемость значительно выше (85%), чем у больных с нормальным состоянием локуса 17р13.1 (55%) (log-rank test р = 0,024) (рисунок 6).

Возможным объяснением связи делеции локуса 17р 13.1 гена ТР53 и негативной регуляции экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ может быть сохранение второго не делетированного аллеля в диком виде, в то время как при нормальном состоянии локуса 17р 13.1, TP53 должен быть инактивирован при помощи точковых мутаций.

Таблица 2. - Частота изменения экспрессии АВС-транспортеров в опухоли молочной в процессе НАХТ при делеции и нормальном состоянии локуса 17р 13.1 гена ТР53

Ген Изменение экспрессии Делеция 17р13.1 Норма+амплификация 17р13.1

АВСВ1 Повышение 13 (33%) 16(55%)

Снижение 26 (67%) 13 (45%)

р-уа)ие 0.060

АВСВЗ Повышение 13 (34%) 13 (45%)

Снижение 25 (66%) 16(55%)

р-уа1ие 0,263

АВСС1 Повышение 18(46%) 16(55%)

Снижение 21 (54%) 13 (45%)

р-уа1ие 0,312

АВСС2 Повышение 12(31%) 15 (52%)

Снижение 27 (69%) 14 (48%)

р-уа1ие 0,067

АВСС5 Повышение 16 (42%) 18 (62%)

Снижение 22 (58%) 11 (38%)

р-уа1ие 0,084

АВС01 Повышение 10(26%) 17(59%)

Снижение 29 (74%) 12(41%)

р-уа1ие 0,006

АВСв2 Повышение 14 (36%) 17(59%)

Снижение 25 (64%) 12(41%)

р-уа1ие 0,053

МУР Повышение 11 (28%) 15 (52%)

Снижение 28 (72%) 14 (48%)

р-уа1ие 0,043

Примечание: уровень доверительной вероятности р-уа1ие по критерию Фишера, полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия, полужирным курсивом различия на уровне тенденции (р <0,1).

— Делеция локуса 17р13.1

Нормальное состояние локуса 17р 13.1

О—

6 (3—ь

0

0 ОН-III 1 1 1111 1 1111 11111 1

О

СИ--:

6-Ь; Цэд-Капк Т«^ р = 0,024

а-—.

о--н

6+-*++.....+---4-

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Месяцы

Рисунок 6. - Безметастатическая выживаемость больных раком молочной железы при делеции и нормальном состоянии локуса 17р 13.1 гена ТР53.

Таким образом, экзонный полиморфизм TP 53 Arg72Pro rsl042522 и делеция локуса 17р 13.1 геиа TP 53 оказывают влияние на процессы негативной регуляции экспрессии генов ABC-транспортеров в процессе НАХТ. Делеция локуса 17р13.1 гена TP53 является благоприятным прогностическим признаком, за счет влияния на экспрессию генов ABC.

Хромосомные аберрации в опухолевой ДНК и экспрессия АВС-транспортеров в процессе НАХТ. Далее мы проверили основную гипотезу (предположение) о том, что причиной снижения экспрессии АВС-транспортеров под действием химиопрепаратов являются многочисленные аберрации (и прежде всего, хромосомные), которые характерны для солидных опухолей [Gordon D.J., et al., 2012, McGranahan N., et al., 2012], и, возможно, нарушают механизмы активации ABC-транспортеров. Была изучена роль структурных хромосомных аномалий в регуляции экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в процессе НАХТ. Делеции или амплификации хромосомных регионов и отдельных хромосом называют аберрациями числа копий ДНК (CNA - copy number aberration). Для исследования использовалась микроматрица высокой плотности фирмы Affymetrix (USA) CytoScan™ HD Array, позволяющая «видеть» одновременно весь спектр мутантных опухолевых клонов. С помощью микроматриц была исследована ДНК 68 пациентов, полученная из биопсиийных образцов опухоли до лечения. Если исходить из идеи о нарушении механизмов активации АВС-транспортеров, то наше внимание привлекли, прежде всего, делеции локусов самих генов ABC. Была проанализирована экспрессия генов АВС-транспортеров при нормальном состоянии и делеции локусов, в которых они локализованы, и частота объективного ответа на НАХТ при делециях локусов генов ABC. Установлено, что в подавляющем большинстве случаев (75%-100%) при делеции локуса гена ABC его экспрессии снижается в процессе химиотерапии (уровень экспрессии гена в пост-НАХТ образцах опухоли ниже по сравнению с парными пре-НАХТ образцами) (таблица 3).

Таблица 3.-Частота снижения экспрессии генов АВС-транспортсров в процессе НАХТ, делеции их локусов в опухолевой ДНК и эффективность НАХТ.

Ген Локус Кол-во Всего Частота делеция Частота Частота

гена случаев делеций локуса гена ABC снижения ответа на

снижения локуса при снижении экспрессии НАХТ при

экспрессии гена ABC его экспрессии при делеции делеции

от случаев локуса гена локуса гена

снижения ABC ABC

АВСВ1 7q21.1 39 10 10(25,6%) 100% 100%

АВСВЗ 6р21.32 41 7 6(14,6%) 86% 100%

АВСС1 16р 13.1 34 8 7 (20,6%) 88% 88%

АВСС2 10q24 41 24 20 (48,8%) 83% 71%

А ВС С5 3q27 33 4 3 (9,1%) 75% 100%

ABCG1 21q22.3 41 13 10(24,4%) 77% 62%

ABCG2 4q22.1 37 14 11 (29,7%) 79% 79%

MVP 16pl 1.2 40 7 6(15,0%) 86% 86%

Делеция локуса гена ABC не оказывает влияния на предсуществующий уровень его экспрессии. До лечения уровень экспрессии всех изученных генов в опухоли у больных с делецией локуса и без нее не различался. Однако делеция локуса гена ABC влияет на формирование адаптивной экспрессии гена - после НАХТ уровень экспрессии делетированного гена был ниже, чем у больных с нормальным состоянием локуса. Статистически значимые различия достигнуты для генов АВСВ1, АВСС1, АВСС2, ABCG1 и ABCG2. После проведения НАХТ уровень экспрессии в образцах при делеции локуса в 2,5-7,5 раз ниже, чем в образцах без делеции (таблица 4).

У 9-49% пациентов со снижением экспрессии того или иного гена ABC наблюдалась делеция его локуса, т.е. делецией локуса можно объяснить до половины случаев снижения экспрессии генов ABC в процессе НАХТ. Наибольшая частота делеций локуса была выявлена для гена АВСС2 (49% случаев снижения экспрессии), у других значимых для формирования МЛУ генов частоты делеций локусов колебались в пределах 20-25% (таблица 3).

Таблица 4. - Уровень экспрессии АВС-транспортеров до лечения и после НАХТ у больных с нормальным состоянием или делецией соответствующего локуса гена ABC.

Гены Точка Норма Делеция p-value

АВСВ1 До лечения 3,18±0,73 4,05±1,81 0,584

После НАХТ 4,29±1,25 0,57±0,28 0,028

АВСВЗ До лечения 0.85±0,09 1,15±0,69 0,416

После НАХТ 0,90±0,22 0,46±0,18 0,253

АВСС1 До лечения 1.33±0,32 0,83±0,25 0,689

После НАХТ 1,53±0,37 0,43±0,16 0,047

АВСС2 До лечения 3,54±0,91 2,22±0,72 0,096

После НАХТ 3,77±1,36 1,55±0,59 0,032

АВСС5 До лечения 2,28±0,43 3,34±1,33 0,194

После НАХТ 2,70±0,45 3,08±1,35 0,560

ABCG1 До лечения 2,03±0,47 1,12±0,44 0,409

После НАХТ 1,78±0,39 0,33±0,10 0,009

ABCG2 До лечения 2,02±0,38 1,93±0,88 0,306

После НАХТ 2,50±0,51 0,78±0,34 0,044

МУР До лечения 0,51±0,12 0,46±0,21 0,990

После НАХТ 0,60±0,!6 0,21±0,08 0,275

Примечание: р-уа1ие - уровень доверительной вероятности по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни; полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия.

При делеции локусов АВС-транспортеров отмечается хороший ответ опухоли на НАХТ. Все 100% пациентов с делениями локусов 7q21.1, 6р21.32 и 3q27 генов АВСВ1, АВСВЗ и АВСС5 соответственно, ответили на НАХТ. Объективный клинический ответ на НАХТ отмечен у 62% - 88% пациентов с делециями локусов генов АВСС1 (16р13.1), АВСС2 (10q24), ABCG1 (21q22.3) и ABCG2 (4q22.1) (таблица 3). Это предполагает возможность использования делеций локусов генов ABC в качестве маркеров прогноза ожидаемой эффективности НАХТ. Кроме того, при делеции хотя бы в одном из локусов

генов АВСВ1, АВСВЗ, АВСС1, ABCG2 и МУР отмечаются высокие показатели безметастатической выживаемости - метастазы были отмечены только у ! -й больной из 22 (5%) в группе с делецией хотя бы одного из генов АВСВ1, АВСВЗ, АВСС1, ABCG2 и МУР, в то время как в группе без делеции локусов этих генов метастазы наблюдались у 15/46 (33%) больных (log-rank test р = 0,008), т.е. наличие в опухоли делеции локусов этих генов является благоприятным прогностическим фактором (рисунок 7).

л ......норма

g 1,0 о. -Делеция

s о о-Ь-Н-1—ж—н+н—н—н-

П б--.

1 0,9 8

s й

з а

| 0'8f он--: Log-Rank Test р = 0,008

о ОН- •

¥ о

S 0,7 ОН-. £ Ó-+. у Ó++-H-H-.....-Н—Ht+

fe 0,6 5 en <U

W

0,5 ---■-----------'-

о 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Месяцы

Рисунок 7. - Безметастатическая выживаемость у больных с делецией хотя бы одного из локусов генов АВСВ1, АВСВЗ, АВСС1, ABCG2 и МУР

Для того, чтобы определить хромосомные регионы с CNA, которые могут участвовать в регуляции делетированных генов ABC-транспортеров, мы провели анализ связи наличия делеции локусов генов ABC и CNA всех цитобэндов. Для этого всех обследованных больных разделили на две группы: первую группу составили больные, у которых хотя бы в одном из локусов всех изученных генов ABC-транспортеров наблюдается делеция (п = 34); во вторую группу вошли больные, у которых не было делеции локусов указанных генов (п = 34). Оказалось, что у 85% (29/34) больных с делецией хотя бы одного локуса гена ABC-транспортера наблюдалась делеция в длинном плече 13 хромосомы в регионе 13ql4.2, при отсутствии делеции - только у 9% пациентов (рисунок 8). По критерию Фишера различия между этими двумя группами по частоте встречаемости делеции 13ql4.2 были статистически значимыми (р = 2.03x10'"). Среди кодирующих белки генов, локализованных в 13q i4.2, наиболее известным является ген-супрессор опухолевого роста RB1. С одной стороны, делеция RB1 может быть одной из причин нарушения механизмов системы активации ABC-транспортеров в ответ на химиопрепараты, с другой стороны, теоретически возможна реализация механизма непосредственной негативной регуляции экспрессии АВС-транспортеров через деацетилазу гистонов HDAC1 и RB1.

Норма

о. -Делеция

¿ о-h-H-1—ж—н+н—н—н-

8а

Q

0_н ó + Log-Rank Test р = 0,008

Ó

он-. Ó-+.

СЖ--Н-Н-.....*• + *+

iM

» Амплификации ■ Делецгш

àuMA.....Ш

il.LMJ.I-IJ.LLUoL

13ql4.2

80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 -20,0 -40,0 -60,0 -80,0 -100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 -20,0 -40,0

Рисунок 8. - Частота аберраций числа копий ДНК в группах больных делецией локусов генов АВС-транспортеров (А) и без делеции локусов генов АВС-транспортеров (Б). Примечание: на рисунках А и Б по оси ординат - процент больных, несущих CNA (амплификации-выше оси абсцисс, делеции-ниже оси абсцисс), по оси абсцисс -цитобэнды (п = 852), распределенные по хромосомам.

Далее были идентифицированы хромосомные локусы, связанные с регуляцией экспрессии каждого АВС-транспортера в отдельности (таблица 5, желтый цвет). Амплификация локуса lq32.2 длинного плеча 1 хромосомы и делеция локуса 1 lq22.3 ассоциированы со снижением экспрессии гена АВСВ1, АВСС2 и ABCG2 в процессе НАХТ, а нормальное состояние локуса - с повышением экспрессии этих генов. По-видимому, гены АВСВ1, АВСС2 и ABCG2 образуют единый кластер с общими механизмами регуляции экспрессии при помощи единого регуляторного паттерна. Это подтверждается взаимной корреляцией уровня экспрессии этих трех генов до лечения и после НАХТ. Общие механизмы регуляции экспрессии генов АВСВ1, АВСС2 и ABCG2 могут быть реализованы с участием генов, локализованных в регионах lq32.2 и Ilq22.3, которые и образуют регуляторный паттерн. Нарушение за счет амплификации и делеции этих механизмов приводит, в конечном счете, к снижению уровня экспрессии генов в образцах опухоли, полученных после химиотерапии. Вторым регуляторным регионом следует признать локус

1 с]23.3 , амплификации этого локуса с наибольшей частотой встречаются при снижении экспрессии генов АВСВЗ, АВСС1, АВСС5 и МУР (таблица 5, лиловый цвет).

Таблица 5.-Локусы с амплификациями и делециями. ассоциированные со снижением и повышением экспрессии генов ABC в процессе НАХТ

Гены CNA Локус с CNA, связанный с изменением экспрессии генов ABC Локус с наибольшей частотой в группе со снижением Повышение при CNA/Повыш ение при норме Снижение при CN А/снижение при норме p-value

АВСВ1 Gain lq32.2 (43,4) Iq32.2 (74,4) 10/19(34/66) 28/11 (72/28) 0,003

Loss llq22.3(46,7) 17р 13.1 (69,2) 5/24 (17/83) 25/14(64/36) 0,0002

АВСВЗ Gain 8pl 1.23 (28,9) lq23.3 (63,4) 2/24 (8/92) 15/26 (37/63) 0,009

Loss 8p23.3 (25,0) 16/11 (59/41) 15/26 (37/63) 0,084

АВСС1 Gain 16pl 1.2 (29,4) lq23.3 (70,6) 13/21 (38/62) 3/31 (9/91) 0,008

Loss lp22.1 (29,4) 17р13.1 (64,7) 4/30 (12/88) 14/20 (41/59) 0,012

АВСС2 Gain lq32.2 (31,3) lq32.2 (68,3) 11/16(41/59) 27/14(66/34) 0,049

Loss Uq22.3 (60,9) 17pl3.1 (68,3) 2/25 (7/93) 28/13 (68/32) 8.1x10"'

АВСС5 Gain lq23.3 (22,6) 1Q23.3 (69,7) 16/18(47/53) 23/10(70/30) 0,083

Loss 3p21.1 (39.9) 17p 13.1 (69,7) 6/28 (17/83) 19/14(58/42) 0,0009

ABCG1 Gain la42.2 (39,8) lq42.2 (73,2) 9/18 (33/67) 29/12(71/29) 0,003

Loss 17pl3.1 (36,1) 3 7p 13.1 (73,2) 10/17(37/63) 30/11 (73/27) 0,005

ABCG2 Gain lq32.2 (43,4) lq32.2 (75,7) 11/20 (35/65) 27/10(73/27) 0,003

Loss 1 lq22.3 (33,7) 17pl3.1 (70,3) 8/23 (26/74) 22/15 (59/41) 0,007

MVP Gain lq24.2 (38,3) lq23.3 (71,4) 8/18 (31/69) 29/13 (69/31) 0,003

Loss 16q22.3 (42,1) 17pl3.1 (69,0 7/19(27/73) 29/13 (69/31) 0,001

Примечание: p-value - уровень доверительной вероятности по двухстороннему критерию Фишера; в скобках частоты встречаемости, %, в первом столбце в скобках указаны разность частот встречаемости локуса между группами с повышением и снижением экспрессии гена; цветами выделены общие для разных генов локусы, Gain - амплификация, Loss - деления.

Интересным результатом проведенного анализа явилась идентификация общего для всех изученных генов ABC локуса 17q 13.1, делеции которого с наибольшей частотой (в 63-74% случаев) встречались при снижении экспрессии этих генов в процессе НАХТ (рисунок 5, голубой цвет). Его делеция сопряжена со снижением экспрессии всех ABC-транспортеров в процессе НАХТ. В области 17q 13.1 локализован хорошо известный ген-супрессор опухолевого роста -ТР53. Получается, что ТР53 участвует в регуляции всех исследованных нами ABC-транспортеров, причем, его делеции ассоциированы с негативной регуляцией генов ABC.

Очень важным моментом является то, что со снижением экспрессии генов ABC-транспортеров в процессе НАХТ сопряжены CNA, а не нормальное состояние локусов. Это еще раз подтверждает мысль о том, что снижение экспрессии ABC-транспортеров все-таки является аберрантным явлением, характерным именно для клинической опухоли, и не наблюдается в случае исследований на культурах опухолевых клеток. Нарушения регуляторных паттернов, такие, как амплификации локусов lq23.3, lq32.2, делеции 13q 14.2,

Ilq22.3, 17ql3.1 приводят к снижению, а не к повышению экспрессии под действием химиопрепаратов, как это происходит при сохранении нормальных механизмов регуляции.

Хромосомные аномалии показывают только ассоциацию со снижением экспрессии ABC-транспортеров в процессе НАХТ, но не объясняют механизма снижения. Для прояснения этого вопроса мы изучили, что происходит с мутантными опухолевыми клонами в процессе НАХТ, как клональная эволюция опухоли под действием химиопрепаратов участвует в реализации феномена снижения экспрессии АВС-транспортеров.

Клональная эволюция опухоли в процессе НАХТ и изменение экспрессии АВС-транспортеров. При воздействии на опухоль химиопрепаратов происходят эволюционные изменения мутантных опухолевых клонов. При этом может происходить их частичная или полная элиминация, образование новых клонов, экспансия минорных клонов, которые могут приобретать доминирующее положение в опухоли, заселяя освободившиеся место после гибели отдельных клонов.

Различные опухолевые клоны РМЖ характеризуются специфическими структурными и числовыми хромосомными аберрациями, которые образовались в результате клональной эволюции в процессе канцерогенеза [Navin N., et al., 2011, Ng C.K., et al., 2012]. Все их одновременно можно видеть при помощи микроматрицы CytoScan HD Array (Affymetrix, USA). Кроме этого, можно производить и количественный анализ статуса числа копий (CNstate) каждой мозаичной хромосомной аберрации, которая фактически говорит о представленности (в %) мутантного клона с данной аномалией на фоне нормальной ДНК опухолевой стромы и других мутантных клонов, без данной аномалии. Если знать CNstate каждой мозаичной хромосомной мутации, то можно определить число опухолевых мутантных клонов в конкретной опухоли, а суммарный CNstate всех мозаичных мутаций отражает соотношение опухолевой паренхимы и стромы в опухолевой ткани молочной железы.

Для исследования клональной эволюции опухоли в процессе НАХТ из числа пациентов случайным образом были отобраны 26 больных, у которых микроматричный анализ был проведен не только в образцах биопсии опухоли до лечения, но и в операционном материале после проведения НАХТ. Установлено, что в большинстве случаев изменение частоты CNA, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов в процессе НАХТ хорошо коррелирует с изменением объема опухолевого узла в ответ на химиотерапию (коэффициент корреляции Спирмена г =0,54-0,72, р<0,05). По нашему мнению, эти показатели могут служить в качестве дополнительных критериев для оценки эффективности НАХТ, и по ним можно говорить генетической эффективности НАХТ. В отличие от объема опухоли, изменение частоты CNA, опухолевой паренхимы CNstate и изменения числа мутантных клонов отражают истинное влияние химиотерапии на опухоль и показывают, как в процессе химиотерапии меняется генетический ландшафт опухоли. При увеличении в процессе НАХТ

числа мутантных клонов (на рисунке 9 показано появление новых мутантных опухолевых клонов у конкретной больной в процессе НАХТ) у 5 из 6 (83%) пациенток наблюдались метастазы. При уменьшении числа мутантных клонов или отсутствии генетического ответа опухоли на НАХТ (опухолевые клоны не меняются), наблюдается 100% выживаемость (Log-Rank Test р=0,00001) (рисунок 10).

Рисунок 9. - Хромосомные аномалии в опухоли больной БЗ до лечения (А) и после НАХТ (Б). Выделено появление новых аномалий: делеции в коротком плече 6 хромосомы и амплификации и делеции в 10 хромосоме.

i

8 0.9

" 0.8 со

I 0,7

5 о-6

Я

В 0.5

О

¡0.4 5 о,з

¿¡5 о,1

"'О 10 20 30 40 50 60 70 80 Месяцы

Рисунок 10. - Безметастатическая выживаемость больных РМЖ в зависимости от появления или элиминации мутантных опухолевых клонов в процессе НАХТ.

I II I I-Н—Н—II I I I I I I

----Появление новых клонов

-Элиминация клонов

О**

Log-Rank Test р = 0,00001

О...............:

6..........+

Мы предполагаем, что образовавшиеся de novo в процессе НАХТ мутантные опухолевые клоны и являются теми клонами, которые выходят в кровеносное русло и осуществляют отдаленное метастазирование. Этот вопрос требует дальнейшего анализа. Скорее всего, появление новых мутантных клонов носит случайный характер и не зависит от количества клеток в опухоли, поскольку не связано с размером опухоли. В случаях гетерогенных опухолей клинически эффективная на первых этапах химио- или таргетная терапия, может уничтожать доминантные опухолевые клоны и, в некоторых случаях, способствовать пролиферации минорных химиорезистентных субпопуляций и/или дальнейшей клональной эволюции, приводящей к образованию новых мутантных опухолевых клонов и прогрессии.

Была проанализирована частота повышения и снижения экспрессии генов ABC в процессе НАХТ в зависимости от уменьшения или увеличения частоты амплификаций, делеций, CNA, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов (таблица 6).

Таблица 6. - Изменение экспрессии генов АВС-транспортеров в процессе НАХТ в зависимости от изменений частоты амплификаций, делеций, СЫА, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов._____

Изменение в процессе НАХТ

Частоты амплификаций Частоты делеций Частоты CNA Опухолевой паренхимы Числа клонов

ТилиО 4 t илиО i |или0 1 ТилиО 1 ТилиО 1

АВСВ1 9/3 (75/25) 4/10 (29/71) 7/3 (70/30) 6/10 (38/62) 8/3 (73/27) 5/10 (33/67) 8/2 (80/20) 5/11 (31/69) 7/2 (28/72) 6/11 (35/65)

p-value 0,024 0,113 0.055 0,021 0,048

АВСВЗ 7/5 (58/42) 4/10 (29/71) 6/4 (60/40) 5/11 (31/69) 7/4 (64/36) 4/11 (27/73) 6/4 (60/40) 5/11 (31/69) 4/5 (44/56) 7/10 (41/59)

p-value 0,129 0,150 0,069 0,150 0,598

АВСС1 9/3 (75/25) 6/8 (43/57) 7/3 (70/30) 8/8 (50/50) 8/3 (73/27) 7/8 (47/53) 8/2 (80/20) 7/9 (44/56) 7/2 (28/22) 8/9 (47/53)

p-value 0,104 0,278 0,178 0,078 0,138

АВСС2 8/4 (67/33) 5/9 (36/64) 7/3 (70/30) 6/10 (38/62) 7/4 (64/36) 6/9 (40/60) 7/3 (70/30) 6/10 (38/62) 7/2 (28/72) 6/11 (35/65)

p-value 0,119 0,113 0,214 0,113 0,048

АВСС5 7/5 (58/42) 7/7 (50/50) 6/4 (60/40) 8/8 (50/50) 7/4 (64/36) 7/8 (47/53) 6/4 (60/40) 8/8 (50/50) 5/4 (56/44) 9/8 (53/47)

p-value 0,488 0,464 0,324 0,464 0,613

ABCG1 8/4 (67/33) 3/11 (21/79) 5/5 (50/50) 6/10 (38/62) 6/5 (54/46) 5/10 (33/67) 6/4 (60/40) 4/12 (25/75) 5/4 (56/44) 6/11 (35/65)

p-value 0,026 0,412 0,248 0,086 0,281

ABCG2 9/3 (75/25) 4/10 (29/71) 7/3 (70/30) 6/10 (38/62) 8/3 ami) 5/10 (33/67) 8/2 (80/20) 5/11 (31/69) 7/2 (28/22) 6/11 (35/65)

p-value 0,024 0,113 0,055 0,021 0,048

MVP 6/6 (50/50) 6/8 (43/57) 5/5 (50/50) 7/9 (44/56) 6/5 (54/46) 6/9 (40/60) 6/4 (60/40) 6/10 (38/62) 5/4 (56/44) 7/10 (41/59)

p-value 0,512 0,536 0,388 0,237 0,387

Представлено количество и частота (%) случаев - повышение экспрессии/снижение экспрессии генов ABC; p-value - уровень доверительной вероятности по критерию Фишера.

Был также проведен и обратный анализ зависимости изменений частоты амплификаций, делеций, СЫА, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов от изменения экспрессии генов АВС-транспортеров (таблица 7).

Таблица 7. - Изменение частоты амплификаций, делеций, СЫА, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов в зависимости от изменения экспрессии генов АВС-транспортеров в процессе НАХТ.

Гены Изменение в процессе НАХТ

Экспрессии генов ABC Частоты амплифика ций Частоты Делеций Частоты CNA опухолевой паренхимы Числа клонов

АВСВ1 Повышение 9/4(69/31) 7/6 (54/46) 7/6 (54/46) 8/5 (62/38) 8/5 (62/38)

Снижение 3/10(23/77) 3/10(23/77) 3/10 (23/77) 2/11 (15/85) 2/11 (15/85)

p-value 0,024 0,113 0,113 0,021 0,021

АВСВЗ Повышение 6/4 (60/40) 5/5 (50/50) 5/5 (50/50) 6/4 (60/40) 6/4 (60/40)

Снижение 6/10(38/62) 5/11 (31/69) 5/11 (31/69) 4/12 (25/75) 4/12 (25/75)

p-value 0,238 0,293 0,293 0,086 0,086

АВСС1 Повышение 9/6 (60/40) 7/8 (47/53) 7/8 (47/53) 8/7 (53/47) 8/7 (53/47)

Снижение 3/8 (27/73) 3/8 (27/73) 3/8 (27/73) 2/9(18/82) 2/9(18/82)

p-value 0,104 0,278 0,278 0,078 0,078

АВСС2 Повышение 8/5 (62/38) 7/6 (54/46) 7/6 (54/46) 7/6 (54/46) 7/6 (54/46)

Снижение 4/9 (31/69) 3/10(23/77) 3/10(23/77) 3/10(23/77) 3/10(23/77)

p-value 0,119 0,113 0,113 0,113 0,113

АВСС5 Повышение 6/7 (46/54) 5/8 (38/62) 5/8 (38/62) 6/7 (46/54) 6/7 (46/64)

Снижение 6/7 (46/54) 5/8 (38/62) 5/8 (38/62) 4/9(31/69) 4/9(31/69)

p-value 1,0 1,0 1,0 0,344 0,344

ABCG1 Повышение 8/3 (73/27) 5/6 (45/55) 5/6 (45/55) 6/5 (55/45) 6/5 (55/45)

Снижение 4/11 (27/73) 5/10 (33/67) 5/10(33/67) 4/11 (27/73) 4/11 (27/73)

p-value 0,026 0,412 0,412 0,150 0,150

ABCG2 Повышение 9/4(69/31) 7/6 (54/46) 7/6 (54/46) 8/5 (62/38) 8/5 (62/38)

Снижение 3/10 (23/77) 3/10 (23/77) 3/10(23/77) 2/11 (15/85) 2/11 (15/85)

p-value 0,024 0,113 0,113 0,021 0,021

MVP Повышение 6/6 (50/50) 5/7 (42/58) 5/7 (42/58) 6/6 (50/50) 6/6 (50/50)

Снижение 6/8 (43/57) 5/9 (36/64) 5/9 (36/64) 4/10(29/71) 4/10(29/71)

p-value 0,512 0,189 0,189 0,237 0,237

Примечание: в таблице представлено количество и частота (%) случаев повышения экспрессии/уменьшение частоты амплификаций, делеций, СЫА, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов соответственно. р-уа1ие - уровень доверительной вероятности по критерию Фишера, полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия, полужирным курсивом выделены значения р-уа1ие на уровне тенденции <0,1

Установлено, что в 56-80% случаев при уменьшении под действием химиопрепаратов частоты амплификаций (но не делеций), СЫА, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов, наблюдается снижение экспрессии генов АВСВ1, АВСВЗ, АВСС1, АВСС2, АБСа и АВСС2. Наоборот, при снижении экспрессии в 73-85% случаев отмечается элиминация опухолевых клонов. Это свидетельствует о тесной взаимосвязи фактора снижения

экспрессии генов ABC и элиминации опухолевых клонов в процессе НАХТ, которая выражается в сокращении мутантной ДНК.

Установлено, что элиминация опухолевых клонов и делеция локусов АВС-транспортеров являются независимыми механизмами, которые могут приводить к снижению экспрессии генов ABC самостоятельно. Из всех 26 обследованных только у больной Н1 отсутствуют изменения в процессе НАХТ частоты амплификаций, делеций, CNA, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов в процессе НАХТ (рисунок 11 А и Б). Кроме того, у этой больной нет делеций исследованных генов АВС-транспортеров, а локусы практически всех генов ABC амплифицированы, тем не менее, экспрессия всех генов лекарственной устойчивости (за исключением АВСС1) в процессе НАХТ снижается (рисунок 11 В).

4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50

АВСВ1 АВСВЗ ЛВСС1 АВСС2 АВСС? ABCG1 ABCG2

Gain Gain Gaiti Gain Норм Gain Норм

Рисунок 11. - Хромосомные аберрации и экспрессия генов ABC у больной Н1 до лечения (А) и после НАХТ (Б), В - экспрессия генов ABC до лечения и после НАХТ и состояние их локусов. Примечание: на рисунках А и Б синим цветом выделены амплификации, красным -делеции в опухоли больной Н1; Больная Hl: T2N2Mo, трижды-негативный тип, эффект НАХТ - частичная регрессия 57%, 2 степень патоморфоза. схема НАХТ-4 курса FAC. метастазов нет, общая выживаемость 74 месяца

Это наблюдение является уникальным и со всей ясностью свидетельствует о том, что, независимо от элиминации опухолевых клонов и делеции локусов генов ABC, существует еще один самостоятельный механизм, связанный со

снижением экспрессии генов лекарственной устойчивости, который реализуется в ответ на химиотерапию. Очевидно, этот механизм обусловлен уникальными хромосомными аномалиями в опухоли больной HI. Мы проанализировали, какие существуют уникальные нарушения у больной HI и нет ли их у других обследованных больных. Оказалось, что единственным уникальным локусом, которой амплифицирован только у больной HI, является цитобэнд 3р12.3 (на рисунке 11 отмечен стрелкой), в котором локализован ген DAP4C (death-associated protein 4С), усиливающий MS77(macrophage stimulating 1 )-индуцированный апоптоз и стабилизирующий р53, который является негативным регулятором экспрессии АВС-транспортеров.

В процессе химиотерапии, если происходит элиминация мутантных опухолевых клонов, элиминируются, прежде всего, клоны, которые несут делеции генов ABC и хромосомные нарушения, представленные в таблице 5. На рисунке 12 показана элиминация в процессе НАХТ опухолевых клонов, несущих делеции локусов генов ABC и идентифицированные аберрации, связанные с нарушением механизмов ир-регуляции экспрессии генов ABC (в соответствие с таблицей 5).

Б - после НАХТ

Рисунок 12.-Элиминация в процессе НАХТ у больной Р2 мутантных опухолевых клонов, несущих делеции локусов генов ABC (ABCG2-4q22A, АВСС2- 10q24, ABCGl-2\q223) и нарушения механизмов ир-регуляции экспрессии генов ABC (del llq22.3, del 13ql4.2, del 17pl3.1) - показано стрелками.

A - до лечения

Таким образом, установлено, что низкий уровень экспрессии генов ABC в опухоли до лечения не является причиной для элиминации опухолевых клонов

в процессе НАХТ. Получены данные, свидетельствующие о тесном взаимодействии фактора изменения экспрессии генов ABC в процессе НАХТ и изменения опухолевых мутантных клонов под действием химиопрепаратов. На рисунке 13 представлен итог наших исследований и приводятся предполагаемые, на основе полученных данных, факторы регуляции экспрессии ABC-транспортеров в процессе НАХТ, которые определяют вариабельность индивидуального ответа на химиотерапию. В зависимости от состояния первичной опухоли события в процессе НАХТ могут развиваться по трем возможным сценариям.

1. Примерно в 40% первичных опухолей, благодаря небольшому количеству повреждений за счет несбалансированных хромосомных аномалий, сохраняются основные механизмы ир-регуляции экспрессии АВС-транспортеров в ответ на химиопрепараты. После начала НАХТ, как и полагается, в опухолевых клетках повышается экспрессия АВС-транспортеров и формируется фенотип адаптивной МЛУ. Эти опухолевые клетки оказываются химиорезистентными и выживают в процессе НАХТ. При этом может происходить даже уменьшение объема опухоли, но, тем не менее, опухоль генетически не отвечает на лечение, поскольку паренхима и число мутантных клонов практически не изменяется или даже увеличивается. У этих больных неблагоприятный прогноз, особенно при увеличении числа мутантных клонов. Изменения числа мутантных клонов в процессе НАХТ вообще может стать новым универсальным прогностическим фактором для многих локализаций.

2. Примерно у 57% опухолей еще до начала лечения в клетках, наблюдается высокая частота несбалансированных хромосомных аномалий, которые приводят к значительным нарушениям в механизмах ир-регуляции экспрессии генов АВС-транспортеров в ответ на химиопрепараты. У больных отмечается хороший ответ на НАХТ и благоприятный прогноз. Нами были идентифицированы некоторые нарушения в системе активации генов ABC, прежде всего, это делеции локусов самих генов АВС-транспортеров (3q27, 4q22.1, 6р21.32, 7q21.1, 10q24, Nql3.2, 16pl 1.2, 16pl3.1, 21q22.3), кроме того, это амплификации amp lq23.3, amp lq32.2, amp lq44, del llq22.3, del 13ql4.2 (была установлена их ассоциация со снижением экспрессии отдельных генов ABC). Четко было показано, что при наличии делеции генов АВС-транспортеров в опухоли до лечения, опухолевые клоны с делециями генов ABC и amp lq23.3, amp lq32.2, amp lq44, del llq22.3, del 13ql4.2 не сохраняются после НАХТ и элиминируются. Это приводит к выводу о том, что в начале курсов химиотерапии уничтожаются чувствительные опухолевые клоны с нарушениями ир-регуляции, которые не способны ответить повышением экспрессии генов АВС-транспортеров на химиопрепараты и сформировать адаптивную МЛУ. Происходит значительное сокращение опухолевой паренхимы, числа мутантных клонов и в результате, в конце сеансов НАХТ, паренхиматозно-стромальное соотношение уменьшается. Была показана низкая экспрессия генов ABC в строме, по сравнению с опухолевой тканью, учитывая это, уменьшение паренхиматозно-стромального соотношения

будет приводить к низкой суммарной экспрессии, которую мы детектируем в опухолевой ткани в целом. В конечном счете, снижение экспрессии АВС-транспортеров в опухолевой ткани после НАХТ - это отражение процессов элиминации опухолевых клонов с нарушениями ир-регуляции экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в ответ на химиотерапию и уменьшения паренхиматозно-стромального соотношения под действием химиопрепаратов. Дополнительные доказательства этому были получены при изучении белковой экспрессии АВС-транспортеров. Было установлено, что при снижении экспрессии мРНК гена ABC отмечается и низкая частота опухолевых клеток, экспрессирующих белок ABC в опухоли после НАХТ. Основная идея состоит в том, что, в большинстве случаев, нет особых механизмов снижения экспрессии генов ABC в клетках, а нарушены механизмы ир-регуляции, т.е. ответа опухоли на химиопрепараты. Оценивая их до лечения можно прогнозировать эффективность НАХТ. Этот вывод имеет еще одно интересное практическое следствие. Для того, чтобы регулировать формирование множественной лекарственной устойчивости опухоли, не надо ингибировать продукты генов АВС-транспортеров, а надо нарушить механизмы ир-регуляции их экспрессии в опухолевых клетках. Для этого могут быть использованы разные подходы, начиная от простых ингибиторов сигнальных путей, или довольно простой вариант - сочетание таргетных препаратов, ингибирующих внутриклеточные сигнальные пути, и конвенциональных лекарственных средств, которые и будут оказывать основное противоопухолевое действие в условиях нарушения за счет таргетных препаратов механизмов ир-регуляции экспрессии АВС-транспортеров и формирования МЛУ. Это может стать новой стратегией управления множественной лекарственной устойчивостью опухоли.

3. Истинное снижение экспрессии генов ABC в опухолевых клетках в процессе НАХТ наблюдается в 3% опухолей. В них нет делений локусов генов ABC. не происходит изменений частоты CNA, опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов. Снижение экспрессии генов ABC определяется наличием уникальной хромосомной аномалии - амплификации региона 3р12.3, в котором локализован DAP4, усиливающий MST1--индуцированный апоптоз и стабилизирующий р53, негативно регулирующий экспрессию АВС-транспортеров. Однако этот механизм нуждается в экспериментальной проверке. Еще одним дополнительным фактором, который может определять истинное снижение экспрессии АВС-транспортеров, может служить делеция локуса 17ql 3.1, содержащего ген-супрессор опухолевого роста ТР53.

Таким образом, решена важная научная проблема - выявлены основные причины и факторы вариабельности индивидуального ответа опухоли на химиотерапевтическое лечение, установлены закономерности развития множественной лекарственной устойчивости, идентифицированы новые прогностические и предсказательные факторы, которые позволяют заложить основы персонифицированного подхода к назначению НАХТ больным РМЖ и разработки оригинальной стратегии управления множественной лекарственной устойчивостью опухоли.

Делеции локусов генов ABC-транспортеров (3q27, 4q22.1, 6р21.32, 7q21.1. 10q24, 1 lql3.2, 16pll.2, 16pI3.1, 21q22.3), кроме того, это amp lq23.3, amp lq32.2, amp lq44, del 1 lq22.3, del 13ql4.2

Рисунок 13. - Факторы, определяющие изменение экспрессии генов ABC в процессе НАХТ.

I_I 1-сценарий: В клетках первичной опухоли низкая частота CNA, сохраняются механизмы ир-регуляции

экспрессии ABC-транспортеров. В процессе НАХТ повышается уровень экспрессии ABC-транспортеров в опухолевых клетках, формируется адаптивная МЛУ. Опухолевые клетки не элиминируются, число мутантных клонов увеличивается или не изменяется. Ответ на НАХТ отсутствует, прогноз неблагоприятный.

ШЯ 2-сценарий: 95% случаев снижения экспрессии генов ABC. В клетках первичной опухоли большое количество CNA, нарушены механизмы ир-регуляции экспрессии ABC-транспортеров в ответ на химиопрепараты за счет несбалансированных хромосомных аномалий (CNA). В процессе НАХТ экспрессия А ВС-транспортеров не повышается, в опухолевых клетках не формируется адаптивная МЛУ, Происходит уменьшение опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов. При уменьшении соотношения опухолевой паренхимы и стромы экспрессия генов ABC снижается. Ответ на НАХТ хороший, прогноз благоприятный.

I I 3-сценарий: 5% случаев снижения экспрессии генов ABC. В опухолевых клетках амплификация 3р12.3 и 17р13.1. В процессе НАХТ опухолевые клетки не элиминируются, число мутантных клонов не изменяется, происходит истинное снижение экспрессии генов ABC в опухолевых клетках.

Выводы

1. Экспрессия генов ABC-транспортеров до лечения слабо ассоциирована с основными клинико-патологическими параметрами. С эффективностью НАХТ связаны изменения экспрессии ABC-транспортеров: АВСВ1, АВСС1, АВСС2, MVP, ABCG1 и ABCG2 в опухоли в процессе лечения, которые определяют формирование адаптивной МЛУ. У пациентов со снижением уровня экспрессии ABC-транспортеров в процессе НАХТ в 61-84% случаев отмечен клинический эффект химиотерапии. Повышение экспрессии ABC-транспортеров в опухоли в процессе химиотерапии обусловливает формирование адаптивной МЛУ и сопряжено с отсутствием ответа в 63-88 % случаев.

2. У пациентов, в опухоли которых выявлено повышение экспрессии генов АВСВ1, АВСС2 и ABCG1 в процессе НАХТ, показатели безметастатической выживаемости составили 50-55%, что существенно ниже, чем у больных со снижением экспрессии этих генов - 73-78% (log-rank test р = 0,032-0,0061). Это свидетельствует о благоприятном прогностическом значении снижения экспрессии ABC-транспортеров и неблагоприятном - повышения уровня их экспрессии в процессе химиотерапии.

3. Выявлен градиентный феномен, представляющий собой однонаправленное изменение экспрессии генов АВСВ1, АВСС1, АВСС2, ABCG1 и ABCG2 в соответствии с эффектом НАХТ, наличие которого у пациента является благоприятным прогностическим признаком. Безметастатическая выживаемость больных с наличием градиентного феномена составила 73% против 39% (log-rank test р=0,0018) у больных без градиентного феномена с разнонаправленным изменением экспрессии этих генов.

4. Установлено, что продолжительность периода адаптивной МЛУ, обусловленной повышением экспрессии ABC-транспортеров, может достигать трех месяцев после окончания введения химиопрепаратов, при этом уровень экспрессии генов ABC в операционном материале не зависит от продолжительности периода после окончания курсов химиотерапии. У некоторых пациентов экспрессия ABC-транспортеров в опухоли может понижаться, относительно исходного уровня до лечения, уже на 7-е сутки от начала 1 курса НАХТ, что доказывает существование феномена снижения экспрессии генов ABC под действием химиопрепаратов в условиях клинической опухоли, который не определяется естественной нормализацией экспрессии после окончания воздействия.

5. У больных со снижением экспрессии мРНК генов МУР, ABCG2, АВСС1 и АВСВ1 в опухоли молочной железы выявлен низкий уровень опухолевых клеток в операционном материале, экспрессирующих кодируемые этими генами белки: Mvp, Bcrp, Mrpl и Р-гликопротеин, по сравнению с пациентами, у которых экспрессия мРНК генов ABC-транспортеров в процессе НАХТ повышается, что подтверждает феномен снижения экспрессии АВС-транспортеров в процессе НАХТ на уровне белков.

6. Внутриопухолевая морфологическая гетерогенность, обусловленная наличием в инфильтративном компоненте альвеолярных, трабекулярных,

тубулярных, солидных структур и дискретных групп клеток, не оказывает существенного влияния на экспрессию и изменение экспрессии основных АВС-транспортеров в процессе НАХТ. Одним из факторов повышенной химиорезистентности опухоли с наличием альвеолярных и/или трабекулярных структур является низкий уровень экспрессии гена АВСВЗ, участвующего в презентации антигенов вместе и молекулами МНС1. Такой же низкий уровень экспрессии АВСВЗ обнаруживается в опухоли до лечения у больных с отсутствием ответа на НАХТ, в то время как у больных с объективным ответом отмечается высокая экспрессия АВСВЗ.

7. При гипометилировании промоторных регионов генов АВСВ1, MVP и ABCG2 в опухоли больных до лечения показана высокая экспрессия этих генов и повышение в процессе НАХТ. Гиперметилирование промоторов генов МЛУ приводит к низкой экспрессии генов ABC в опухоли до лечения, но не оказывает существенного влияния на изменение экспрессии этих генов при проведении НАХТ и не определяет снижение экспрессии генов с гиперметилированными промоторами в процессе НАХТ. По существу, уровень метилирования промоторных областей ABC-транспортеров обусловливает только исходный уровень их экспрессии в опухоли до лечения, который формирует предсуществующую МЛУ.

8. Полиморфизм в кодирующем регионе гена опухолевой супрессии ТР53+119C>GArg72Pro rsl042522 связан с эффектом НАХТ и экспрессией генов ABC-транспортеров. Носители Arg/Arg генотипа rsl042522 хорошо отвечают на НАХТ, у них наблюдается низкая экспрессия генов АВСС1 и АВСС5 в образцах опухоли после НАХТ и чаще снижается экспрессия генов АВСВ1, АВСС1, ABCG2 н MVP в процессе НАХТ, по сравнению с пациентами с гетерозиготным и Pro/Pro генотипами. Делеция локуса 17р13.1 гена ТР53 является благоприятным прогностическим признаком, сочетается с Arg/Arg генотипом rsl042522, при этом в 1,6 раза чаще отмечается снижение экспрессии генов ABC в процессе НАХТ, по сравнению с пациентами с нормальным состоянием локуса 17р13.1.

9. В подавляющем большинстве случаев (75%-100%) при делеции локусов генов ABC-транспортеров в опухоли до лечения их экспрессия в процессе химиотерапии снижается, а уровень экспрессии в образцах опухоли после НАХТ в 2,5-7,5 раз ниже, чем у больных с нормальным состоянием локусов. Делецией локуса можно объяснить до половины случаев снижения экспрессии генов ABC в процессе НАХТ, поскольку, у 9-49% пациентов со снижением экспрессии того или иного гена ABC наблюдалась делеция его локуса. У 85% (29/34) больных с делецией хотя бы одного локуса гена АВС-транспортера наблюдается делеция в регионе 13ql4.2 (против 9% (3/34) случаев у больных без делеций локусов генов ABC, р = 2.03х10'п, по критерию Фишера). Все пациенты с делециями локусов генов АВСВ1 (7q21.1), АВСВЗ (6р21.32) и АВСС5 (3q27) ответили на НАХТ. Объективный клинический ответ на НАХТ у больных РМЖ с делециями локусов генов АВСС1 (16pl3.1), АВСС2 (10q24), ABCG1 (21q22.3) и ABCG2 (4q22.1) наблюдался у 62% - 88% пациентов.

10. Идентифицированы хромосомные локусы, аберрации в которых сопряжены со снижением экспрессии каждого изученного АВС-транспортера в отдельности. Снижение генной экспрессии определяют следующие хромосомные аномалии: амплификации lq32.2 и lq23.3, делеции llq22.3 и 17ql3.1, в то время как повышение экспрессии генов ABC в процессе НАХТ определяет нормальное состояние этих локусов. При снижении экспрессии генов АВСС5, ABCG1, ABCG2 и МУР в процессе НАХТ уровень делеций и CNA в целом в опухоли до лечения значительно выше (почти в два раза) по сравнению с больными, у которых отмечено повышение экспрессии генов. Это свидетельствует о том, что снижение экспрессии АВС-транспортеров под действием химиопрепаратов обусловлено нарушением механизмов их ир-регуляции и является характерным для клинической опухоли аберрантным явлением.

11. Изменение частоты CNA, содержания опухолевой паренхимы и числа мутантных клонов в процессе НАХТ коррелирует с изменением объема первичного опухолевого узла в ответ на химиотерапию (г = 0,54-0,72, р<0,05) и отражает изменение (элиминацию или новообразование) опухолевых клонов в процессе химиотерапии и генетическую эффективность НАХТ. В 56-80% случаев при элиминации под действием химиопрепаратов мутантных опухолевых клонов наблюдается снижение экспрессии генов АВСВ1, АВСВЗ, АВСС1, АВСС2, ABCG1 и ABCG2 и наоборот, при снижении экспрессии в 7385% случаев отмечается элиминация мутантных опухолевых клонов. Это свидетельствует о тесной взаимосвязи фактора снижения экспрессии генов ABC в процессе НАХТ и элиминации опухолевых клонов под действием химиопрепаратов, которое выражается в уменьшении представленности мутантной ДНК.

12. В 40% первичных опухолей благодаря небольшому количеству повреждений за счет несбалансированных хромосомных аномалий, сохраняются основные механизмы ир-регуляции экспрессии АВС-транспортеров и в ответ на химиопрепараты формируется адаптивная МЛУ. Более чем в половине опухолей выявлена высокая частота несбалансированных хромосомных аномалий, которые приводят к значительным нарушениям систем активации экспрессии генов АВС-транспортеров в ответ на химиопрепараты (делеции локусов самих генов АВС-транспортеров (3q27, 4q22.1, 6р21.32, 7q21.1, 10q24, llql3.2, 16pll.2, 16pl3.1, 21q22.3), амплификации lq23.3, lq32.2, lq44, делеции1 llq22.3, 13ql4.2 - связаны со снижением экспрессии отдельных генов ABC). Опухолевые клоны с указанными нарушениями в большинстве случаев после НАХТ элиминируются, что приводит к значительному сокращению содержания опухолевой паренхимы, числа мутантных клонов. В результате этого в конце сеансов НАХТ паренхиматозно-стромальное соотношение уменьшается, обеспечивая низкую суммарную экспрессию генов ABC в опухолевой ткани. Истинное снижение экспрессии генов АВС-транспортеров в опухолевых клетках в процессе НАХТ обнаруживается в единичных опухолях и обусловлено амплификацией 3р12.3.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Литвяков Н.В. Множественная лекарственная устойчивость. Механизмы возникновения и молекулярные маркеры.//Сибирский онкологический журнал,-2005,- №4,- С. 64-65.

2. Денисов Е.В., Бабышкина H.H., Малиновская Е.А., Гарбуков Е.Ю., Литвяков Н.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Статус гена р53 при раке молочной железы: взаимосвязь мутаций и полиморфизма 72 кодона // Материалы III международной конференции «Фундаментальные науки - медицине». -Новосибирск, 2007. - С.23.

3. Литвяков Н.В.. Гарбуков Е.Ю., Пономарева A.A., Бабышкина H.H., Малиновская Е.А., Завьялова М.В., Вторушин C.B., Перельмутер В.М., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Молекулярно-генетические подходы в предсказании эффективности неоадъювантной химиотерапии при раке молочной железы. // Вопросы онкологии,- 2008.-№2 приложение,- Т.54 М.54.-тезисы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2008»,- С.-Петербург, 18 апреля 2008.- С.16-17.

4. Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Вторушин C.B., Слонимская Е.М., Крицкая Н.Г., Гарбуков Е.Ю, Литвяков Н.В.. Стахеева М.Н., Бабышкина H.H., Малиновская Е.А., Денисов Е.В., Лебедев И.Н., Назаренко М.С, Сенников С. В., Горева Е.П., Козлов В.А., Воевода М.И., Максимов В.Н., Белявская В.А., Чердынцева Н.В. Генетические и клинико-патологические особенности рака молочной железы у больных с сохраненной менструальной функцией и в менопаузе// Успехи геронтологии - 2008.-Т. 21, № 3.- С.443-453 (IF-0,363).

5. Денисов Е.В., Литвяков Н.В.. Стахеева М.Н., Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., Бабышкина H.H., Стегний В.Н., Чердынцева Н.В. Мутации в гене-супрессоре ТР53 и их связь с особенностями клинического течения рака молочной железы. // Сибирский онкологический журнал.-2008.-№2.- С.32-36 (IF-0,410).

6. Завьялова М.В., Литвяков Н.В.. Гарбуков Е.Ю., Вторушин C.B., Стахеева М.Н., Савенкова О.В., Крицкая Н.В., Перельмутер В.М., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Взаимосвязь чувствительности опухоли к неоадъювантной химиотерапии с морфологическим строением первичного опухолевого узла при уницентрическом инфильтрирующем протоковом раке молочной железы. // Сибирский онкологический журнал.-2008.-№6. - С.30-34 (IF-0,410).

7. Литвяков Н.В.. Гарбуков Е.Ю., Пономарева A.A., Завьялова М.В., Перельмутер В.М., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Взаимосвязь с эффективностью НАХТ экспрессии генов лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы.// Материалы российской научно-практической конференции «Современные аспекты диагностики и лечения рака молочной железы». - Томск, 2008. - Сибирский онкологический журнал, Приложение 2 -С.56-58.

8. Цыганов М.М., Литвяков Н.В., Гарбуков Е.Ю., Мерзлякова М.К. Взаимосвязь экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы с эффективностью неоадъювантной химиотерапии.//Сибирский онкологический журнал 2009 приложение №1 стр. 211-212

9. Litwakov N.V.. Garbukov E.Yu., Babyshkina N.N., Tsyganov M.M., Merzlyakova M.V., Zav'ialova M.V., Perel'muter V.M., Slonimskaya E.M., Cherdyntseva N.V. Relationship of Expression of Multidrug Resistance Genes in Tumor Tissues From Breast Cancer Patients with the Neoadjuvant Chemotherapy Efficacy.// Tomsk Region and Taiwan: Experience of Scientific-Technical and Innovation Cooperation Volume 2 Experience and prospects for cooperation between Russian and Taiwanese scientists in the field of studying molecular-genetic mechanisms of cancer development and applying results of basic studies in oncology. Forum Proceedings 16-17 September, 2009 Tomsk.- P.116-118.

10. Denisov E.V., Cherdyntseva N.V., Litviakov N.V., Malinovskaya E.A., Voevoda M.I., Belyavskaya V.A., Stegniy V.N. TP53 mutations and Arg72Pro polymorphism in breast cancer patients' tumors. // Cancer Genetics and Cytogenetics. - 2009. - Vol.192. - P.93-95 (IF-1,929).

11. Гервас П.А., Литвяков H.B., Стахеева M.H., Миллер С.В., Добродеев

A.Ю., Гарбуков Е.Ю., Бабышкина Н.Н., Кухарев Я.В., Васильева М.В., Слонимская Е.М., Белявская В.А., Тузиков С.А., Чердынцева Н.В. Влияние полиморфизма генов апоптоза и репарации на эффективность неоадъювантной химиотерапии злокачественных новообразований.// Сибирский онкологический журнал.- 2009.- №4.- С.41-47 (IF-0,410).

12. Цыганов М.М., Гарбуков Е.Ю., Мерзлякова М.К., Халюзова М.В., Волкоморов В.В., Литвяков Н.В. Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости и маркеров химиочувствительности в опухоли молочной железы до и после неоадъювантной химиотерапии. // Сибирский онкологический журнал.- 2010.- Приложение 1.- С.107-108.

13. Волкоморов В.В., Гарбуков Е.Ю., Мерзлякова М.К. Цыганов М.М., Халюзова М.В., Литвяков Н.В. Взаимосвязь экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости с полиморфизмом генов МЛУ и цитокинов. // Сибирский онкологический журнал.- 2010.- Приложение 1.- С.30-31.

14. Cherdyntseva N.V., Denisov E.V., Gervas Р.А., Litwakov N.V., Slonimskay E.M., Perelmuter V.M., Choinzonov. E.L. Age related function of tumor suppressor gene TP53: contribution to cancer risk and progression //Experimental oncology. -2010. - Tom Vol. 32 , N Sup. - P. 24. - International conference Tumor and host: novel aspects of old problem. Kiev, 21-24 September

15. Литвяков H.B.. Денисов E.B., Гарбуков Е.Ю., Цыганов М.М., Волкоморов

B.В., Мерзлякова М.К., Халюзова М.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Экспрессия генов резистентности и маркеров химиочувствительности в опухоли молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии.//Материалы XVI Российского онкологического конгресса Москва 23-25 ноября 2010.-С.100.

16. Литвяков Н.В., Денисов Е.В., Гарбуков Е.Ю., Цыганов М.М., Мерзлякова М.К., Волкоморов В.В., Халюзова М.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Экспрессия генов резистентности и маркеров химиочувствительности в опухоли молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии.//Медицинская генетика (Тезисы VI съезда Российского общества медицинских генетиков г. Ростов-на-Дону,14-18 мая 2010 г.,) - С.104.

17. Litviakov N.V.. Denisov E.V., Takhauov R.M., Karpov A.B., Skobel'skaja E.V., Vasil'eva E.O., Goncharik O.O., Ageeva A.M., Mamonova N.V., Mezheritskiy S.A., Sevost'janova N.V., Koshel A.P. Association Between TP53 Gene ARG72PRO Polymorphism and Chromosome Aberrations in Human Cancers. // Molecular Carcinogenesis.- 2010.- Vol. 49.- P.521-524 (IF-4,770).

18. Cherdyntseva N.V., Gervas P.A., Litwakov N.V.. Stakcheeva M.N., Ponomareva A.A., Dobrodeev A.Yu., Denisov E.V., Belyavskaya V.A., Choinzonov E.L. Age-related function of tumor suppressor gene TP53: contribution to cancer risk and progression. // Experimental oncology.- 2010. -Vol. 32., Spl. - P.205-208 (IF-1,110).

19. Zavyalova M, Perelmuter V, Vtorushin S, Denisov E, Litviakov N. Slonimskaya E, Cherdyntseva N The breast tumor morphological heterogeneity and cancer progression//3rd Norwegian Cancer Symposium "Growth and Proliferation: Molecular Regulators of Cancer".-2011.-P.46

20. Денисов E.B., Цыганов M.M., Таширева Л.А., Литвяков Н.В.. Завьялова М.В., Вторушин С.В., Чердынцева Н.В., Перельмутер В.М. Экспрессионная гетерогенность морфологических структур и их стромального микроокружения в опухолевой ткани молочной железы // Тезисы докладов Международной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 5-9 сентября 2011 г., Томск. С. 58-60.

21. Литвяков Н.В.. Денисов Е.В., Гарбуков Е.Ю. Цыганов М.М., Волкоморов

B.В., Мерзлякова М.К., Вторушин С.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В., Экспрессия генов резистентности и маркеров химиочувствительности в опухоли молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии. Сборник статей: Молекулярные и биологические технологии в медицинской практике,-«Офсет», Новосибирск,- 2011,- Вып.16,- С. 69-74.

22. Литвяков Н.В.. Чердынцева Н.В., Цыганов М.М., Гарбуков Е.Ю., Мерзлякова М.К., Волкоморов В.В., Вторушин С.В; Завьялова М.В., Слонимская Е.М. Гены лекарственной устойчивости и химиотерапия при раке молочной железы. //Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня».- Красноярск 24-25 мая 2012 г

C. 108-117.

23. Denisov E.V., Sukhanovskaya T.V., Dultseva T.S., Malinovskaya E.A., Litviakov N.V.. Slonimskaya E.M., Choinzonov E.L., Cherdyntseva N.V. Coordination of TP53 Abnormalities in Breast Cancer: Data from Analysis of TP53 Polymorphisms, Loss of Heterozygosity, Methylation, and

Mutations II Genetic Testing and Molecular Biomarkers.- 2011.- Vol. 15, N12.-P. 901-907. (IF-1,444).

24. Литвяков H.B., Чердынцева H.B., Цыганов M.M., Денисов Е.В., Мерзлякова М.К., Гарбуков Е.Ю., Вторушин C.B., Завьялова М.В., Слонимская Е.М. Ассоциация генетического полиморфизма с изменением экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы в процессе иеоадъюваитной химиотерапии. // Медицинская генетика.- 2011.- №10.- С. 37-43. (1Г-0,368).

25. Чердынцева Н.В., Иванова Ф.Г., Литвяков Н.В., Кухарев Я.В., Малиновская Е.А. Молекулярно-генетические особенности прогрессии и ответа на терапию злокачественных новообразований: этнические аспекты. // Медицинская генетика.- 2011.- №10.- С. 28-36. (IF-0,368).

26. Litviakov N.V.. Cherdyntseva N.V., Tsyganov M.M., Garbukov E.Yu., Slonimskaya E.M. Alteration in expression of MDR genes in breast carcinoma patients following preoperative chemotherapy is related with clinical response.// Седьмой съезд онкологов и радиологов стран СНГ / Казахский НИИ онкологии и радиологии. - 2012.- Астана.-С. 424

27. Cherdyntseva N.V., Denisov E.V., Litviakov N.V., Maksimov V.N., Malinovskaya E.A., Babyshkina N.N., Slonimskaya E.M., Voevoda M.I., Choinzonov E.L. Crosstalk Between the FGFR2 and TP53 Genes in Breast Cancer: Data from an Association Study and Epistatic Interaction Analysis. // DNA and Cell Biology.- 2012.- Vol. 31, N 3.- P. 305-315. (IF-2,344).

28. Цыганов M.M., Гарбуков Е.Ю., Литвяков H.B. Изменение экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы в процессе предоперационной химиотерапии и безметастатическая выживаемость. //Сибирский онкологический журнал.- 2013.- Приложение 1.-С. 92-93.

29. Цыганов М.М., Геращенко Т.С., Денисов Е.В., Завьялова М.В., Литвяков Н.В. Внутриопухолевая морфологическая гетерогенность рака молочной железы: экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости и эффективность неоадъювантной химиотерапии. //Сибирский онкологический журнал.- 2013.- Приложение 1.- С. 93-94.

30. Литвяков Н.В.. Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., Цыганов М.М., Денисов Е.В., Завьялова М.В., Чердынцева Н.В. Вектор изменения экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы при проведении неоадъювантной химиотерапии и безметастатическая выживаемость.//Вопросы онкологии. - 2013. - Том 59, Прил. к № 3, том 1. -С. 93-94. - Материалы VIII съезда онкологов России, С.-Петербург, 11-13 сентября 2013 г.

31. Литвяков Н.В., Цыганов М.М., Денисов Е.В., Гарбуков Е.Ю., Христенко К.Ю., Вторушин C.B., Завьялова М.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Градиент экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы при проведении предоперационной химиотерапии: клиническая значимость и регуляция.// Вопросы онкологии. - 2013. - Том 59,

Прил. к № 3, том 1. - С. 94-95. - Материалы VIII съезда онкологов России, С.Петербург, 11-13 сентября 2013 г.

32. Zavyalova M.V., Perelmuter V.M., Vtorushin S.V., Denisov E.V., Litvyakov N.V., Slonimskaya E.M., Cherdyntseva N.V. The presence of alveolar structures in invasive ductal NOS breast carcinoma is associated with lymph node metastasis. // Diagnostic Cytopathology.- 2013.- Vol. 41, N 3.- P. 279-282. (IF-1,520).

33. Litviakov N.V.. Cherdyntseva N.V., Tsyganov M.M., Denisov E.V., Garbukov E.Y., Merzliakova M.K., Volkomorov V.V., Vtorushin S.V., Zavyalova M.V., Slonimskaya E.M., Perelmuter V.M. Changing the expression vector of multidrug resistance genes is related to neoadjuvant chemotherapy response.//Cancer Chemotherapy and Pharmacology.- 2013.- Vol.71, N.I.-P. 153-163. (IF-2,795).

34. Zavyalova M.V., Denisov E.V., Tashireva L.A., Geraschenko T.S., Litviakov N.V., Skryabin N.A., Vtorushin S.V., Telegina N.S., Slonimskaya E.M., Cherdyntseva N.V., Perelmuter V.M. Phenotypic Drift as a Cause for Intratumoral Morphological Heterogeneity of Invasive Ductal Breast Carcinoma Not Otherwise Specified. // BioResearch Open Access.- 2013.-Vol. 2, N 2.- P. 148-154. (IF-no)

35. Чердынцева H.B., Литвяков H.B.. Денисов E.B. Основные достижения в фундаментальной онкологии в 2012 году.// Практическая онкология.-2013.- Т.14.- №1.- С.1-12 (EF-1,031).

36. Кухарев Я.В., Стахеева М.Н., Дорошенко А.В., Литвяков Н.В.. Бабышкина Н.Н., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Связь иммунологических показателей с эффективностью неоадъювантной химиотерапии у больных раком молочной железы//Сибирский онкологический журнал.- 2013.- Т.56.- №2.- С. 50-57 (IF-0,410).

37. Литвяков Н.В. Градиентный феномен экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли молочной железы при проведении неоадъювантной химиотерапии: связь с прогресснрованием заболевания. // Сибирский онкологический журнал.- 2013.- Т.58, №4, С. 511 (IF-0,410).

38. Литвяков Н.В.. Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., Цыганов М.М., Денисов Е.В., Вторушин С.В., Христенко К.Ю., Завьялова М.В., Чердынцева Н.В. Связь безметастатической выживаемости больных раком молочной железы и вектора изменения экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в опухоли при проведении неоадъювантной химиотерапии.//Вопросы онкологии.- 2013.- Т.59, №3.-С. 334-340 (IF-0,253).

39. Геращенко Т.С., Денисов Е.В., Литвяков Н.В.. Завьялова М.В., Вторушин С.В., Цыганов М.М., Перельмутер В.М., Чердынцева Н.В. Внутриопухолевая гетерогенность: природа и биологическое значение. // Биохимия.- 2013.- Т.78, вып. 11.- С. 1531-1549. (IF-1,353).

40. Denisov E.V., Litviakov N.V., Zavyalova M.V., Perelmuter V.M., Vtorushin S.V., Tsyganov M.M., Gerashchenko T.S., Garbukov E.Y., Slonimskaya E.M., Cherdyntseva N.V. Intratumoral morphological heterogeneity of breast cancer: neoadjuvant chemotherapy efficiency and multidrug resistance gene expression.//Scientific reports.- 2014 - N4. 4709.- P.l-7. doi:10.1038/srep04709 (IF-5,078).

41.Литвяков H.B.. Цыганов M.M., Чердынцева H.B. Микрочиповый анализ числа копий ДНК опухоли молочной железы: связь с непосредственной эффективностью химиотерапии и экспрессией АВС-транспортеров.//Материалы V Съезда онкологов и радиологов Казахстана 29-30 апреля 2014 г. Алматы, Республика Казахстан, №115 (http://onco.kz/sites/default/files/tesis у siezd.pdf)

42. Литвяков Н.В., Цыганов М.М., Иваньковская П.В., Ибрагимова М.К., Слонимская Е.М., Коростелев С.А., Чердынцева Н.В. Микроматричный анализ аномалий числа копий ДНК опухоли молочной железы: связь с эффектом неоадъвантной химиотерапии и экспрессией генов множественной лекарственной устойчивости. //Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» Москва 2014.- Том II раздел 8 .- С.60-61.

43. Литвяков Н.В., Цыганов М.М., Чердынцева Н.В., Слонимская Е.М., Иваньковская П.В., Ибрагимова М.К., Гарбуков Е.Ю., Коростелев С.А., Чердынцев Е.С., Потапова О.Ю., Чойнзонов Е.Л. Микроматричный анализ аномалий числа копий дик опухоли молочной железы: связь с эффектом неоадъювантной химиотерапии. // Сибирский онкологический журнал.- 2014.- №3.- С. 19-27.(IF-0,410)

Результаты интеллектуальной деятельности

Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2013621213 от 24 сентября 2013 г. Литвяков Н.П., Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М., Цыганов М.М., Перельмутер В.М., Вторушин С.В., Завьялова М.В., Чердынцева Н.В. «База данных экспрессионных и клинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак молочной железы».

Глава в монографии

Denisov E.V., Cherdyntseva N.V., Litviakov N.V., Malinovskaya Е.А., Babyshkina N.N., Belyavskaya V.A., Voevoda M.I. TP53 Gene Polymorphisms in Cancer Risk: The Modulating Effect of Ageing, Ethnicity and TP53 Somatic Abnormalities.//Tumor Suppressor Genes Edited by Yue Cheng www.inteclionen.com.- 2012 P.79-110.

Список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота AXT - адъювантная химиотерапия ВОЗ - всемирная организация здравоохранения ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЗНО - злокачественные новообразования ИГХ - иммуногистохимия

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

МЧ-ПЦР - метилчувствительная ПЦР

НАХТ - неоадьювантная химиотерапия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

РНК - рибонуклеиновая кислота

УЗИ - ультразвуковое исследование

ABC - ATP-Binding Cassette

CGH - Comparative Genomic Hybridization

CNA - Copy Number Aberration (аберрации числа копий)

ER - рецептор эстрогенов

HER2 - рецептор эпидермального фактора роста

LOH - потеря гетерозиготности

LRP - Lung Resistance-Related Protein

МНС I - главный комплекс гистосовместимости 1 класса

OR - отношение шансов

Pgp - Р-гликопротеин

PR - рецептор прогестерона

RIN - RNA Integrity Number

RR - относительный риск

RT-qPCR - количественная обратно-транскршггазная ПЦР в режиме реального времени

SE - стандартная ошибка

SNP - однонуклеотидный полиморфизм

Благодарности:

Автор выражает благодарность заведующей отделением общей онкологии Томского НИИ онкологии профессору Слонимской Е.М., заведующему отделением патанатомии и цитологии профессору Перельмутеру В.М., старшему научному сотруднику отделения общей онкологии к.м.н. Гарбукову Е.Ю., всем сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии и иммунологии.

Работа была поддержана грантами ФЦП (2012-2013 гг) по теме «Оптимизация стратегии химиотерапии рака молочной железы на основе факторов химиорезистентности и химиочуБСтвительности» государственный контракт №8291 от 27 августа 2012 г. и РФФИ 13-04-98111 р_сибирь_а

Издание подготовлено в авторской редакции.

Отпечатано на оборудовании Издательского Дома Томского государственного университета,

Тираж 110 экз. Заказ 553. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 36, тел. (3822) 531-528, 529-849. E-mail: rio.tsu@mail.ru