Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Комплекс молекулярно-биологических методик для скрининга рака шейки матки

На правах рукописи

КУЕВДА 1 Дмитрий Александрович

КОМПЛЕКС МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДИК ДЛЯ СКРИНИНГА РАКА ШЕЙКИ МАТКИ

14.03.10 — клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 1 ноя 2013

Санкт-Петербург 2013

005539427

005539427

Работа выполнена во ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук Шипулин Герман Александрович

Официальные оппоненты:

Молчанов Олег Леонидович - доктор медицинских наук, профессор, Клиника акушерства и гинекологии им. А.Я. Крассовского ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ, отделение вспомогательных репродуктивных технологий, заведующий.

Липова Елена Валериевна - доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента Российской Федерации, кафедра дерматовенерологии, микологии и косметологии, заведующая.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «10» декабря 2013 г. в 13-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д215.002.08 при ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан « 15» ноября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Митин Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Рак шейки матки (РШМ) занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости женщин детородного возраста. Классическим методом профилактики рака шейки матки считается скрининговое обследование женщин, в основе которого лежит цитологическое исследование соскобов эпителия цервикального канала с целью выявления атипичных клеток. Основной сложностью качественной реализации данной схемы является относительно низкий уровень чувствительности выявления предраковых изменений, в среднем составляющий 58% (вариация от 20% до 87%) (Arbyn М., et al., 2006), большое количество неопределенных результатов (до 15% ASCUS), снижающих специфичность исследования и требующих дополнительного тестирования (Nygard J.F., et al., 2003), а также высокий уровень субъективности при трактовке результатов (Подистов Ю.И. и соавт., 2003). Открытие этиологической роли вирусов папилломы человека (ВПЧ) высокого риска в развитии РШМ (Zur Hausen., et al., 1994) позволили предположить эффективность выявления вируса как нового подхода для скрининга рака шейки матки (Wright Т., et al., 2004; Cuzick J., et al., 2008). По результатам исследований, методики выявления ДНК ВПЧ (ВПЧ-тесты) оказались существенно более чувствительными, воспроизводимыми и объективными для выявления предрака и рака шейки матки по сравнению с цитологическим анализом. Однако ввиду особенностей папилломавирусной инфекции (способность к спонтанной регрессии и элиминации вируса) специфичность тестирования, направленного на выявление поражений шейки матки на основе ВПЧ-тестов, может быть существенно ниже, чем у цитологического анализа (Arbyn М., et al., 2009; Saslow D., et al., 2012), приводя к их непригодности для скрининга РШМ. Необходимость оптимизации диагностической специфичности анализа при сохранении высокого уровня чувствительности стали приоритетной задачей развития и стандартизации ВПЧ-тестов.

Степень разработанности темы исследования. В современной научной литературе активно обсуждается перспектива использования тестов, направленных на выявление ДНК ВПЧ для скрининга РШМ. Основное внимание уделяется стандартизации тестов и обеспечению оптимальных диагностических характеристик выявления онкогинекологических поражений. Показано, что на соотношение чувствительности и специфичности теста оказывает влияние спектр выявляемых генотипов (выявление большего числа генотипов ведет к росту чувствительности и потере специфичности) (Munoz N., et al., 2004), а также выявляемая концентрация вируса: низкая концентрация не ассоциирована с наличием или прогрессией интраэпителиальных поражений, высокая, напротив, чаще ассоциирована с наличием диспластических поражений эпителия. (Snijers P., et al., 2003; Saslow D., et al., 2012). В 2009 году международной группой экспертов были предложены требования к диагностическим характеристикам и правила валидации ВПЧ-тестов,

используемых для скрининга РШМ (Meijer C.J., et al., 2009). Несмотря на обилие разных вариантов отечественных тестов, направленных на выявление ДНК ВПЧ, многие из них не стандартизированы, ни один из них не проходил валидацию по международным требованиям.

Современные знания о естественном течении папилломавирусной инфекции позволили предположить эффективность дополнительных вирус-ассоциированных маркеров. Активно изучается значение вирусной нагрузка как динамического маркера прогрессии или элиминации инфекции, появляются сведения о том, что при постлечебном мониторинге тяжелой дисплазии клинической значимостью могут обладать существенно более низкие концентрации вируса (Минкина Г.Н., и соавт, 2009; Xi L.F., et al. 2011; Hamaguchi D., et al., 2013). Данные сведения позволяют предположить эффективность применения количественных тестов, направленных на выявление ДНК ВПЧ. В настоящее время валидированных для скрининга РШМ диагностических тестов для количественного определения ДНК ВПЧ не существует, выявление клинически значимых случаев инфицирования осуществляется только за счет подбора аналитической чувствительности теста.

Отдельное место в диагностике папилломавирусной инфекции уделяется определению генотипа ВПЧ. Наибольшим онкогенным потенциалом обладают генотипы 16 и 18, прогноз их выявления наиболее тревожный (Szoke К., et al., 2003). При их выявлении рекомендуется агрессивная тактика ведения и лечения больных, при выявлении других типов возможна выжидательная тактика (Castle Р.Е. et al., 2006; Saslow D. et al.,2012). Проведение генотипирования позволяет отличить реинфицирование от персистентной инфекции при повторном визите пациента. Данная информация важна, так как опасность представляет именно персистентная форма инфекции, недавнее инфицирование наиболее вероятно спонтанно излечивается (Kjaer S.K., et al., 2010). О реинфицировании говорит изменение, о персистентной инфекции - сохранение генотипа вируса через год (Marks М., et al., 2011; Chen Н.С., et al., 2011). В настоящее время большинство методик генотипирования достаточно трудоемки и не могут быть использованы на одной технологической платформе с скрининговым ВПЧ-тестом (Poljak М., et al., 2010). Разработка удобной методики генотипирования, используемой совместно со скрининговым ВПЧ-тестом на единой приборной базе представляет собой отдельную важную задачу.

Цель исследования. Разработка комплекса молекулярно-биологических методик для скрининга рака шейки матки, основанных на выявлении, количественном определении и генотипировании вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска.

Задачи исследования:

1. Разработать методику для выявления и количественного определения ДНК широкого спектра вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска на основе метода мультиплекс-ПЦР в реальном времени и оценить ее аналитические характеристики.

2. Разработать методику для генотипирования ДНК широкого спектра вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска на основе метода мультиплекс-ПЦР в реальном времени и оценить ее аналитические характеристики.

3. Разработать рекомендации по забору материала для методик выявления, количественного определения и генотипирования ДНК ВПЧ ВКР.

4. Изучить диагностические характеристики разработанных методик, оценить их в соответствие с международными требованиями и провести сопоставление с характеристиками цитологического метода выявления предрака и рака шейки матки.

5. Провести апробацию разработанных методик для выявления случаев неопластической патологии шейки матки при обследовании женщин, проходящих профилактический осмотр и среди больных дерматовенерологического профиля.

Научная новизна исследования.

Разработана концепция количественного определения ДНК ВПЧ как инструмента для оптимизации лабораторной диагностики папилломавирусной инфекции. Описанный подход позволил впервые в лабораторной практике применения ВПЧ-тестов использовать концентрационный порог для определения клинически значимых случаев инфицирования ВПЧ.

Выполненное впервые в лабораторной практике сопоставление диагностической чувствительности и специфичности выявления предрака и рака шейки матки при использовании методики, основанной на количественном определении ДНК ВПЧ ВКР, и цитологического анализа мазка и показало ббльшую диагностическая чувствительность количественного ВПЧ-теста при сходной специфичности.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Разработаны методики на основе высокочувствительной и специфичной технологии мультиплекс-ПЦР для выявления и количественного определения широкого спектра генотипов ДНК ВПЧ ВКР, а также генотипирования широкого спектра генотипов ВПЧ ВКР, ставшие основой наборов реагентов, предназначенных для использования в рутинной лабораторной практике.

Впервые была проведена валидация отечественной методики, направленной на выявление ВПЧ ВКР, в соответствие с международными требованиями к тестам, используемым для скрининга рака шейки матки.

Предложена величина количественного порога клинической значимости равная 1000 копий ДНК ВПЧ ВКР на 100 тысяч клеток человека и показана эффективность его применения для достижения оптимального уровня диагностической специфичности и чувствительности выявления предраковых поражений шейки матки при использовании ВПЧ-тестов.

На основании полученных результатов были предложены рекомендации к выполнению преаналитического этапа проведения анализа, включающие оптимальный локус и инструментарий для взятия материала и обеспечивающие

максимальную информативность проведения исследования, а также выработаны критерии оценки качества взятия материала в лаборатории.

Обоснована целесообразность использования методики для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ для раннего выявления предрака и рака шейки матки среди больных дерматовенерологического профиля в возрастных группах как старше, так и моложе 30 лет.

Методология и методы исследования. Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого исследования с использованием клинических, лабораторных, аналитических и статистических методов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методика для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ ВКР, обладающая высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности и специфичности, пригодная для применения при скрининге РШМ.

2. Разработана методика для генотипирования ДНК ВПЧ ВКР с высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности и специфичности, пригодная для применения при скрининге РШМ.

3. Диагностическая чувствительность и специфичность разработанных методик по отношению к неопластической патологии шейки матки соответствует международным научно-обоснованным критериям.

4. Диагностическая чувствительность методики для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ ВКР достоверно выше, чем у метода цитологического анализа мазка, что указывает на необходимость использования методик направленных на выявление и количественное определение ДНК ВПЧ при ранней диагностике РШМ.

5. Полученные данные о выявляемое™ случаев онкогинекологической патологии папилломавирусной этиологии среди больных дерматовенерологического профиля указывают на первостепенную необходимость внедрения ВПЧ-теста для профилактики РШМ у данной группы больных.

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Статистическая обработка полученных результатов осуществлена с помощью программы SPSS 11.5. Количественные показатели представлены в виде среднего арифметического значения, стандартного отклонения и стандартной ошибки среднего. Для величин, распределенных ненормально, использовались непараметрические характеристики - медиану, 1 и 3 квартили. Для оценки линейности количественных методик рассчитывался коэффициент корреляции Спирмена, для оценки воспроизводимости рассчитывался коэффициент вариации. Для сравнения групп использовались тест Манна-Уитни, критерий Вилкоксона и метод Хи-квадрат. Расчет интервала значений

при статистической обработке биномиальных данных (расчет диагностической чувствительности, специфичности, PPV) проводился по методу Вилсона. Для проверки соответствия разработанных методик международным требованиям величины чувствительности и специфичности оценивались в сравнении с референтными методиками при помощи теста «non-inferiority» (Meijer C.J., et al. 2009). Для всех видов анализа достоверным считались различия при р< 0,05.

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, протокол №20 от 04 октября 2013 г. Основные положения диссертации были доложены на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007» 28-30 ноября 2007 (г. Москва), Международном симпозиуме "Папилломавирусная инфекция и злокачественные новообразования. Интегрированная система надзора и профилактики" 4-6 июня 2009 (г. Санкт-Петербург), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2010», 24-26 ноября 2010 (г. Москва), II Международном симпозиуме по папилломавирусной инфекции, 7-9 июня 2011 (г. Санкт-Петербург), Международном междисциплинарном форуме «Шейка матки и вульвовагинальные болезни» 14-17 ноября 2012 года (г. Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликована 31 печатная работа, в том числе 9 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Внедрения результатов исследования. На основе разработанных методик созданы диагностические наборы реагентов: «АмплиСенс® ВПЧ ВКР Скрин-Титр-FL», «АмплиСенс® ВПЧ ВКР Генотип-FL». Наборы реагентов прошли Государственные испытания, зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и разрешены и применению на территории Российской Федерации. С января по сентябрь 2013 года производством ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора было выпущено 2800 наборов «АмплиСенс® ВПЧ ВКР Скрин-Титр-FL», и 1470 наборов «АмплиСенс® ВПЧ ВКР Генотип-FL». Наборы реагентов применяются в 185 лечебно-профилактических учреждениях страны. Полученные в ходе выполнения работы результаты использовались при создании практического руководства для врачей (Профилактика рака шейки матки: Руководство для врачей /под ред. акад. РАМН Г.Т.Сухих, проф. В.Н.Прилепской. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: МЕДпресс — информ, 2012.). Результаты проведенных исследований были включены в качестве учебного материала в программы сертификационных циклов усовершенствования «ПЦР-диагностика инфекционных заболеваний» на базе ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора (г. Москва, Россия) и НМАПО им. П.Л. Щупика МЗ Украины (г. Киев, Украина)

Личное участие автора в получении результатов. Автор составил план настоящего исследования, провел аналитический обзор литературы, сформировал критерии отбора образцов клинического материала, осуществлял

договоренности с коллабораторами по проведению совместных научных исследований, подбору пациентов и проведению необходимых диагностических процедур, выполнил весь объем молекулярно-биологических лабораторных исследований, участвовал в организации проведения цитологических и гистологических исследований, сформировал базу данных, провёл статистическую обработку и обобщение полученных результатов, сформулировал выводы и практические рекомендации.

Структура и объем диссертации.

Диссертация представлена на 185 страницах, включая 15 рисунков, 38 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов и выводов. Список использованной литературы включает 21 отечественный и 132 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика исследуемых групп пациентов.

В ходе работы было изучено 2082 образца соскобов эпителия зоны трансформации, цервикального канала и/или влагалища, собранных в пяти клинико-диагностических центрах г. Москвы, Московской области и г. Санкт-Петербурга. Образцы были разделены на группы, исходя из задач исследования:

Для изучения диагностической чувствительности выявления предрака и рака шейки матки методикой для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ были изучены образцы, полученные от 152 больных (группа 1) с диагнозом резко выраженная дисплазия шейки матки (N87.2 - здесь и далее по МКБ10) и карцинома in situ (D06.-), средний возраст 36,9±9,1 и 43 больных (группа 2) с диагнозом рак шейки матки 1-3 стадии (С53.-), средний возраст 46,1±11,4. Для постановки диагноза использовалось сочетание физикального, эндоскопического (расширенная кольпоскопия, кольпомикроскопия) и морфологического (гистологического) исследований. Для группы 1 параллельно вместе с забором материала для выявления ДНК ВПЧ осуществлялось взятие мазка-отпечатка для цитологического исследования, таким образом, было возможно сравнение диагностической чувствительности методик на одной и той же выборке.

Для изучения диагностической специфичности выявления диспластических поражений шейки матки были исследованы образцы суммарно от 863 пациенток (средний возраст 36,0±8,9 лет), у которых в ходе комплексного клинико-лабораторного обследования не была обнаружена онкогинекологическая патология шейки матки (исключены диагнозы групп N87, D06, С53). Для исключения патологии применялось физикальное обследование (осмотр в зеркалах, бимануальное обследование), эндоскопическое (кольпоскопия) и гистологическое исследования. Для всех женщин вместе с забором материала для выявления ДНК ВПЧ осуществлялось взятие мазка-отпечатка для цитологического исследования; параллельно

полученные результаты обеих методик использовались для сравнения диагностической специфичности.

Для апробации разработанных методик при проведении профилактических осмотров было обследовано 823 женщины (средний возраст 39,5±8,4 лет). На первом этапе обследования у всех женщин осуществлялось взятие мазка-отпечатка для цитологического исследования и соскоба для выявления, количественного определения и генотипирования ДНК ВПЧ. Все женщины с выявленной цитологической патологией и/или обнаружением ДНК ВПЧ направлялись на консультацию гинеколога для комплексного клинико-лабораторного обследования, включающего физикальное, эндоскопическое и гистологическое обследование, на основании которого ставился окончательный диагноз.

Для апробации разработанных методик при обследовании больных дерматовенерологического профиля была обследована 571 женщина (средний возраст 27,1±7,2 лет). На первом этапе обследования у всех женщин осуществлялось взятие только образца для выявления, количественного определения и генотипирования ДНК ВПЧ. Все женщины с выявленной ДНК ВПЧ направлялись в смотровой кабинет для взятия мазка-отпечатка для цитологического исследования и при обнаружении цитологической патологии любого уровня направлялись на консультацию гинеколога для комплексного клинико-лабораторного обследования и постановки окончательного диагноза.

Оценка различных вариантов взятия материала и оптимальных локусов суммарно проведена на 318 образцах соскобов эпителия пациенток, подобранных случайным образом.

Материалы н методы исследования.

Оценку аналитической чувствительности разработанных методик проводили с использованием генно-инженерных плазмид, содержащих ДНК генов L1 Е1 Е2 Е4 Е6 Е7 ВПЧ следующих генотипов: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Для получения генноинженерных плазмид проводили клонирование целевого фрагмента ДНК в вектор pGEM-BlueScript SKII. Концентрацию клонированного препарата ДНК оценивали методом лимитирующих разведений (Rodrigo A.G., et al., 1997)

Оценку аналитической специфичности разработанных методик проводили с использованием ДНК-плазмид, содержащие последовательность полных геномов неонкогенных генотипов ВПЧ: 1, 3, 4, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 27, 37, 38, 49, 50, 65, а также ДНК плаценты человека, ДНК и кДНК штаммов и клинических изолятов следующих микроорганизмов из коллекции ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора: вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, цитомегаловируса, вируса Эпшейна-Барр, вирусов герпеса человек 6 и 7 типов, вируса гепатита В, вируса гепатита С, вируса иммунодефицита человека, Escherichia coli, Lactobacillus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum,

Ureaplasma parvum, Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Dientamoeba fragilis, Enterococcus faecalis, Gardia intestinalis, Gardia lamblia, Haemophilus durcei, Trichomonas vaginalis в концентрации не ниже 109 копий ДНК/мл

Для экстракции ДНК ВПЧ ВКР из биологического материала использовали наборы реагентов ДНК-Сорб-АМ (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора - № ФСР 2007/00183 от 13 июля 2009г). ПЦР проводили с использованием процедуры «горячего старта», обеспеченной химически модифицированной Taq-полимеразой, активируемой при прогревании. Для проведения ПЦР в реальном времени использовались приборы роторного типа RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия) и приборы плашечного типа iQ5 iCycler («BioRad», США)

Для проведения дизайна праймеров и зондов были выполнены множественные выравнивания (компонент AlignX программного пакета Vector NTI Advance 11.0) и сравнительный анализ фрагментов генов у широкого спектра генотипов ВПЧ и других вирусов и микроорганизмов, полученных из базы данных Национального центра биотехнологической информации GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Для оценки соответствия методики выявления и количественного определения ДНК ВПЧ международным требованиям проводилось их сравнение с охарактеризованном для скрининга РШМ набором реагентов, основанном на технологии гибридного захвата, «HybridCapture 2 HPV Test» (Digene QIAGEN, США). Для сравнения результатов генотипирования использовалась методика, основанная на проведении реакции амплификации (ПЦР) с использованием консенсусных праймеров MY11/MY09 и GP5+/GP6+ (Weimin Q.U., et al., 1997) и последующим секвенированием продуктов реакции (реагенты Big Dye® Terminator vl.l Sequencing Standard Kit, автоматический секвенатор Applied Biosystems ABI Prism® 3130 (Applied Biosystems, США).

Цитологическое исследование проводили путем взятия мазков-отпечатков на стекло, в дальнейшем фиксируемых спиртом и окрашиваемых по методу Папаниколау. Работа по цитологической оценке образцов выполнялась врачами-цитологами ФГБУ «НИИАГ им. Д.О.Отта» Минздравсоцразвития и ФГБУ «Онкологический институт им. П.А. Герцена». Выявленные изменения эпителия классифицировались согласно системе Bethesda как нормальный эпителий, атипичные плоские клетки неустановленной значимости (ASCUS), плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени (L-SIL), плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокой степени (H-SIL) или карцинома. Гистологическую верификацию проводили в ФГБУ «Онкологический институт им. П.А. Герцена». Гистологические изменения были классифицированы как нормальный эпителий, цервикальная интраэпителиальная неоплазия уровня 1 (CIN1) - соответствует L-SIL, цервикальная интраэпителиальная неоплазия уровней 2 и 3 (CIN2, CIN3), рак in situ (соответствует H-SIL), инвазивная карцинома.

Результаты исследования и их обсуждение.

Разработка методики для выявления и количественного определения

ДНК ВПЧ ВКР и определение ее аналитических характеристик.

В результате анализа геномов ВПЧ были выбраны оптимальные области для создания групп консенсусных олигонуклеотидов (праймеров и гибридизционно-флуоресцентных меток). Первая группа олигонуклеотидов (3 праймера и 1 зонд) для выявления ДНК ВПЧ вида а9 высокого риска (генотипы 16, 31, 33, 35, 52, 58), вторая группа (3 праймера и 4 зонда) для выявления ДНК ВПЧ вида а7 высокого риска (генотипы 18, 39, 45, 59). Также в систему были включены типоспецифические олигонуклеотиды для выявления ДНК ВПЧ 51 и 56 генотипов высокого риска. Первая группа олигонуклеотидов локализована в области конца гена Е1 ВПЧ и амплифицирует фрагмент длиной 320 п.о., вторая — локализована в начале гена Е2 ВПЧ, фрагмент 280 п.о., олигонуклеотиды для 51 и 56 типов - в области Е6,Е7 и начала Е1 гена ВПЧ. Выбранные олигонуклеотиды не содержали «вырожденных позиций» (позиций, несоответствующих какому-либо генотипу), что было важно для сохранения одинаковой аналитической чувствительности к различным генотипам. Отдельно были выбраны олигонуклеотиды для определения ДНК человека (ДНК р-глобинового гена, фрагмент 210 п.о.). Все четыре группы олигонуклеотидов были объединены в единую мультипраймерную смесь, при этом, гибридизационно-флуоресцентные зонды были мечены различными парами флуорофор-тушитель. Для вида а9 использовалась пара 116С-ВНС>1, вида а7 - пара 1ЮХ-ВН(32, 51 и 56 типов - пара Су5-ВНС>2, для Р-глобинового гена - пара РАМ-ВН()1. Были подобранны и оптимизированы концентрации праймеров в составе реакционной смеси, выбрана оптимальная программа амплификации. Для определения концентрации ДНК ВПЧ проводилось исследование в каждом эксперименте контрольных точек — калибраторов в трех концентрациях. Каждый калибратор содержал в своем составе ДНК ВПЧ 16 типа, обнаруживаемую по каналу Уе11о\у/НЕХ, ДНК ВПЧ 18 типа, обнаруживаемую по каналу Огаще/ЯОХ, ДНК ВПЧ 56 типа, обнаруживаемую по каналу Яес1/СУ5 и ДНК 3-глобинового гена человека, обнаруживаемую по каналу Сгееп/РАМ. Амплификация ДНК человека совместно с ДНК ВПЧ служили эндогенным внутренним контролем, позволяющим оценить качество забора, транспортировки, хранения материала, а также всех этапов пробоподготовки. Для большей точности количественного определения был предложен принцип количественного учета ДНК человека и нормализации концентрации ДНК ВПЧ на концентрацию ДНК человека.

Для определения аналитической чувствительности каждая точка ряда 10-кратных разведений контрольных плазмид для каждого генотипа была исследована в разработанной методике, а также методике на основе консенсусных праймеров МУ11/МУ09 и ОР5+/ОР6+ и методике НуЬпсЮарШге 2 в экспериментальной серии по 3 повтора каждой концентрации. Для уточнения величины аналитической чувствительности последняя уверенно

проходящая концентрация в ряде разведении для каждого генотипа разводилась двукратно и исследовалась в 7 повторах. Величины определенной аналитической чувствительности разработанной методики находились в диапазоне 600 - 8000 копий ДНК ВПЧ в мл в зависимости от генотипа вируса. Для НуЬпс1СарШге 2 аналитическая чувствительность была на 2 порядка ниже -2*104 — 5*105 в зависимости от генотипа , что связано с тем, что тест заявлен как выявляющий только клинически значимые случаи инфицирования. Аналитическая чувствительность двураундовой ПЦР МУ-6р+ сильно варьировала от типа к типу: 1*103 - 8*106, что указывает на невозможность использования подхода ПЦР с универсальными консенсусными праймерами для диагностики ПВИ в связи с возможным недовыявлением ряда генотипов (например, 39, 51). В ходе проведения исследования аналитической специфичности перекрестных реакций (обнаружение кривых в ходе ПЦР в реальном времени, свидетельствующих об амплификации посторонней мишени) выявлено не было. Аналитическая специфичность - 100%.

Для определения линейного диапазона измерений разработанной методики проводилось исследование рядов десятикратных разведений ВПЧ 16,18 и 51 генотипов, определяемых различными группами олигонуклеотидов по разным каналам детекции в присутствии ДНК Ь-глобинового гена человека в концентрации 107 копий/мл. Образцы каждой концентрации исследовались в пяти повторах. Из полученных данных были определены зависимости ^ теоретической концентрации и ^ измеренной концентрации, рассчитан коэффициент корреляции. Пример зависимости для ВПЧ 16 типа (Рис. 1):

Экспериментальная концентрация ДНК ВПЧ 16 1§ копий / 100 5 тысяч клеток 4 3 2

Я2 = 0,9946

Теоретически расчетная концентрация ДНК ВПЧ 16 1§ копий/100 - тысяч клеток

Рис.1 Линейный диапазон методики для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ.

Определенный линейный диапазон: 103 - 108 копий на 100 тыс. клеток.

Для оценки прецизионности в условиях повторяемости (в пределах одной серии) были проведены эксперименты по определению ДНК ВПЧ трех генотипов 16, 18 и 51 в концентрации, соответствующей предполагаемому уровню клинической значимости (1000 копий ДНК ВПЧ на 100 тыс. клеток), а также ДНК плаценты человека в концентрации 0,01 нг/мл. Образцы исследовались в 12 повторах в пределах одной серии. Коэффициент вариации логарифма концентрации ДНК ВПЧ имел достаточно низкую величину и

составил 2,2% (ВПЧ 16), 2,8% (ВПЧ 18), 1,4% (ВПЧ 51). Для оценки прецизионности в условиях воспроизводимости (воспроизводимости между сериями) было исследовано 5 образцов, содержащих генотипы 16,18,51,33,45 в концентрации ДНК ВПЧ равной или несколько выше порога (1000 копий на 100 тыс. клеток). Все образцы были исследованы в четырех сериях. В зависимости от генотипа коэффициент вариации составил 4,2% - 8,2%.

Разработанная методика с возможностью точного определения концентрации ДНК ВПЧ в образце позволила впервые в практике создания скрининговых ВПЧ-тестов ввести количественный порог для положительных результатов - отрезную точку («cut-off») - и не осуществлять искусственное снижение аналитической чувствительности для оптимизации диагностической специфичности. При этом количественный подход позволяет гибко настраивать желаемый уровень порога и таким образом добиться максимального уровня диагностической чувствительности при сохранении диагностической специфичности на высоком уровне. Дополнительным преимуществом данного подхода является возможность выявлять случаи инфицирования с низкой концентрацией ДНК ВПЧ и отличать их от случаев отсутствия инфекции, а также возможность определения прогноза течения инфекции на основании данных о вирусной нагрузке (Xi L.F., et al. 2011; Hamaguchi D., et al., 2013). Уровень порога был установлен нами на уровне 1000 (3 Lg) копий ДНК ВПЧ на 100 тыс. клеток исходя из изученных данных литературы (Snijers P., et al., 2003; Meijer С., et al., 2009), полученных нами экспериментальных данных по аналитической чувствительности валидированного для скрининга РШМ теста Hybrid Capture 2, а также предварительно полученных нами данных по концентрации ДНК ВПЧ в образцах предрака и рака шейки матки (5,4 [ДИ95% 3,1 - 7,7] Lg копий ДНК ВПЧ на 100 тыс. клеток), в которых концентрация ДНК ВПЧ ниже 3 Lg копий ДНК ВПЧ на 100 тыс. клеток практически не встречалась. В дальнейшем данная установленная величина порога использована для клинической валидации разработанной методики.

Разработка методики для генотипирования ДНК ВПЧ ВКР и определение ее аналитических характеристик.

С учетом описанной в литературе относительно невысокой частоте встречаемости ВПЧ ВКР при скрининговом обследовании женщин (5-25%) (Aral S.O., et al., 2008; Hariri S., et al., 2011; Бдайциева Э.Т., и соавт., 2010) была предположена целесообразность схемы обследования, включающей на первом этапе выявление всего необходимого спектра ВПЧ ВКР с возможностью количественного определения в одной реакции амплификации, а затем проведение генотипирования, требующего большего количества усилий, только для положительных образцов (минимизация затрат времени, ресурсов оборудования, средств на реактивы).

В результате анализа геномов 14 генотипов ВПЧ были выбраны оптимальные области для выбора типоспецифических олигонуклеотидов (ген Е6). При выборе обращалось внимание на межпраймерные взаимодействия с

целью создать мультиплексные смеси. Разработанный дизайн позволил в 4 реакциях амплификации и по 4 флуоресцентным каналам раздельно детектировать 14 генотипов вируса и ДНК человека в качестве внутреннего контроля. Были подобранны и оптимизированы концентрации праймеров в составе реакционной смеси, было показано, что возможно применение программы амплификации, аналогичной методике для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ. В отличие от всех коммерчески доступных систем для генотипирования ВПЧ, использующих универсальные консенсусные праймеры и последующую гибридизацию с типоспецифическим зондом (РоЦак М., е1 а1., 2010), разработанный подход с полностью типоспецифическими олигонуклеотидами позволил использовать ту же приборную базу, что и методика выявления ВПЧ ВКР - аппараты для проведения ПЦР в реальном времени. Данный подход также предполагает снижение риска лабораторной контаминации продуктами ПЦР и снижение издержек на внедрение и поддержание дополнительного оборудования. Изучение аналитических характеристик разработанной методики (схема исследования аналогична описанной выше) продемонстрировали высокий уровень чувствительности (250-1000 копий ДНК ВПЧ/мл), идентичную для различных генотипов. В ходе проведения исследования аналитической специфичности перекрестных реакций, в том числе на альтернативные генотипы ВПЧ, выявлено не было. Аналитическая специфичность - 100%.

Обоснование рекомендаций по забору материала для проведения исследований с использованием разработанных методик.

Ввиду того, что вирусы папилломы человека являются строго эпителиотропными, взятие материала для исследования должно проводиться с поверхности эпителия слизистой оболочки урогенитального тракта. Однако образцы, взятые в разных локусах, могут значительно отличаться как по объему материала, так и по количеству возбудителя.

Для обоснования рекомендаций по взятию материала были исследованы 98 парных образцов мазков со свода влагалища и с поверхности зоны трансформации и цервикального канала (Рис.2). Из представленных данных видно, что в образцах эпителия цервикального канала ДНК ВПЧ присутствует в достоверно большей концентрации. Также в большем количестве в материале присутствуют клетки эпителия. Был сделан вывод о предпочтительности данного вида материала для диагностики папилломавирусной инфекции.

Во втором исследовании был проведен анализ различных инструментов, используемых для взятия материала и времени экспозиции инструмента с материалом с транспортной средой. Гинекологом последовательно собирались образцы эпителия, взятые различным способом. Сравнение проводилось по концентрации ДНК человека. Особое внимание уделялось величине разброса концентрации, отражающей степень стандартизованное™ взятия материала.

Концентрация ДНК ВПЧ*

Концентрация ДНК

lg копий/мл

человека

и

1 .....................................

6

5 .......................................

4 -

3 ......................................................................

2 ..................

1 -

Цервикальный Свод Цервикальный Свод канал влагалища канал влагалища

Показаны: медиана, 1 и 3 квартили; достоверность различий: *р=0,038; "р<0.001

Рис.2. Концентрации ДНК ВПЧ и ДНК человека в парных образцах эпителия цервикального канала и влагалища

В результате при взятии: 1) зондом универсальным с последовательным погружением транспортную среду и сохранением в ней зонда до доставки в лабораторию, N=55 медиана концентрация ДНК человека составила 5,76 (1 и 3 квартили: 5,40-6,21) Lg копий/мл 2) цервикальной цитологической щеточкой с последующим погружением в транспортную среду на 20-30 секунд, N=55 -6,09 (5,43-6,49) Lg копий/мл 3) цервикальной цитологической щеточкой с последовательным погружением транспортную среду и сохранением в ней щеточки до доставки в лабораторию, N=55 - 6,49 (6,20-6,73) Lg копий/мл; 4) цервикальной цитологической щеточкой для жидкостной цитологии с последовательным погружением транспортно-фиксирующую среду для жидкостной цитологии и сохранением в нем щеточки до доставки в лабораторию - 6,82 (6,69-7,23) Lg копий/мл. Между группой 1 и 2 нет достоверных отличий (р=0,13), остальные группы попарно отличались (р<0,0001). Был сделан вывод о том, что оптимальным способом взятия материала, обеспечивающим больший выход ДНК и меньший разброс, является использование цервикальных щеточек при условии их сохранения в транспортной среде до доставки образцов в лабораторию (группы 3 и 4).

Оценка диагностических характеристик методики для выявления и количественного определения и методики для генотипирования ДНК ВПЧ.

В силу того, что методика выявления и количественного определения ДНК ВПЧ разрабатывалась в первую очередь для использования при скрининге РШМ, то для оценки диагностической чувствительности рассматривалась способность методики выявлять случаи тяжелой дисплазии (CIN2, CIN3, Са in situ) и инвазивной карциномы. С другой стороны случаи папилломавирусной инфекции при отсутствии признаков поражения эпителия не сопряжены с необходимостью лечения. Потому для оценки диагностической специфичности разработанной методики рассматривались случаи выявления ДНК ВПЧ при отсутствии патологических изменений эпителия (как низкой, L-SIL, так и высокой, H-SIL степени).

В первую очередь представляло интерес рассмотреть диагностическую специфичность методики выявления и количественного определения ДНК ВПЧ с использованием предложенного порога клинической значимости (количественный формат исследования) и без него (качественный формат исследования), а также сравнить его со специфичностью цитологического анализа мазка (рис. 3).

Диагностическая специфичность, %

(Группа женщин, не имеющих верифицированной патологии шейки матки и для которых ДНК В Л Ч не была выявлена)

N = 863

100 95 90 85 80 75 70 65 60

І 90.7 84.6 89.9

іш

я Т Щ 1

Ш І 1

!

■

ш

Разработанная методика с учетом порога (>1000 коп на 100 тыс. клеток)

Разработанная методика без учета порога *

Цитология (ASCUS, L-S1L и выше) Л

Достоверность различий: *р< 0.0001 = 0,569

Рис.3 Диагностическая специфичность методики для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ и цитологического анализа.

Для сравнения результатов, в качестве положительных при цитологическом исследовании рассматривались все случаи с выявленной цитологической патологией (L-SIL+), а также случаи выявления атипичных клеток неясного значения ASCUS, как потенциально связанных с истинной атипией (Nygard J.F., et al., 2003; ALTS Group, 2003). Диагностическая специфичность выявления диспластической патологии шейки матки для разработанной методики с использованием порога составила 90,7% [88,6%-92,5%] и достоверно не отличалась от специфичности цитологического анализа. Данные согласуются с опубликованными для теста HybridCapture 2: 91,3% [89,5-93,1%] (Meijer CJ., et al., 2009). Без применения порога клинической значимости специфичность ВПЧ-тестирования снижалась на 6,1% и становилась достоверно ниже специфичности цитологического исследования (84,6% [82,0%-86,9%]). В условиях скрининга данное снижение специфичности приводило бы к увеличению на 66,2% количества женщин с положительным результатом теста, но не нуждающихся в лечении. Таким образом, введение порога клинической значимости можно было считать оправданным.

Для оценки диагностической чувствительности выявления предрака и рака шейки матки разработанной методикой были изучены две группы образцов. Первая группа получена от больных, у которых в ходе комплексной диагностики были выявлены изменения характерные для предрака шейки матки. При взятии образца для исследования наличия ДНК ВПЧ проводилось

одновременное взятие материала для цитологического исследования, что позволило провести сравнительную оценку диагностической чувствительности цитологического метода и разработанной методики. Вторая группа образцов получена от пациентов с ранее установленным диагнозом РШМ, которым планировали начало терапии. Все образцы были исследованы в разработанной методике в количественном формате с применением порога клинической значимости (1000 копий ДНК ВПЧ ВКР на 100 тыс. клеток). Результаты оценки диагностической чувствительности представлены на рис. 4.

Диагностическая ] 00.0% Р'-^жгг—.................... 95.3%-

чувствительность, 90.0% ! 75 п% * 1

% 80.0% . I1

I

Рис.4 Диагностическая чувствительность методики для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ и цитологического анализа.

Диагностическая чувствительность методики с учетом обеих групп составила 97,4% [94,1%-98,9%]. В трех образцах ДНК ВПЧ разработанной методикой не была выявлена. Сравнение полученных данных с опубликованными указывает на высокие показатели чувствительности разработанной методики: чувствительность HybridCaptue 2 оценена как 97,9% (Meijer C.J., et al., 2009), и COBAS 4800 - 90% (Heideman D.A.M., et al., 2011). Сравнение диагностической чувствительности выявления предрака шейки матки цитологическим методом и разработанной методикой выявило достоверное превосходство последней (75% [67,6%-81,2%] против 98% [94,5%-99,3%]).

При оценке соответствия разработанной методики выявления и количественного определения ДНК ВПЧ международным научно-обоснованным критериям (Meijer С.J., et al., 2009) проводился расчет специфичности разработанной методики относительно рекомендованного для сравнения теста Hybrid Capture 2. Исследование проведено на группе образцов, полученных от женщин без выявленной патологии CIN2+ (НИИ АГ им. Д.О.Отта, N=786). В соответствие с требованиями новый тест должен иметь специфичность достоверно не ниже, чем 98% специфичности теста сравнения (статистический метод «non-inferiority»). Проведенные расчеты показали, что

100.0% 90.0% 80.0% 70.0% 60.0% 50.0% 40.0% 30.0% 20.0% 10.0% 0.0%

98.0%

I

75.0%

95.3%

■ Методика выявления и количественного определения ДНК впч

■ Цитологический анализ мазка

Тяжелая рак шейки матки дисплазия (N=43)

(N=152)

Достоверность различий: * р < 0.0/

при использовании разработанной методики в качественном формате результаты не соответствуют требуемому уровню специфичности, в то время как количественная оценка и введение порога клинической значимости позволяют достоверно утверждать, что специфичность методики не ниже 98% специфичности Hybrid Capture 2 (р=0,0004). Таким образом, следуя международным требованиям, для применения разработанной методики в скрининге РШМ и достижения высокой диагностической специфичности необходимо использование количественного порога клинической значимости.

Для оценки соответствия уровня диагностической чувствительности разработанной методики международным требованиям (Meijer C.J., et al., 2009) (не ниже 90% уровня чувствительности охарактеризованного в скрининге теста по отношению к CIN2+) был так же применен тест «non-inferiority». Анализ проведен на 195 образцах предрака и рака шейки матки. Так как мы не располагали данными теста сравнения Hybrid Capture 2, однако обладали результатами гистологического исследования, являющегося золотым стандартом при постановке диагноза предрак и рак шейки матки, сравнение проводилось с гипотетическим тестом, чувствительность которого равна 100%. Подобное допущение делало сравнение максимально строгим в отношении разработанной методики. Тем не менее, в результате проведенных расчетов разработанная методика имела чувствительность достоверно не ниже, чем 90% идеального теста с гипотетической 100% чувствительностью. Таким образом, разработанную методику следует считать соответствующей международным требованиям по чувствительности выявления CIN2+.

Оценка диагностических свойств методики генотипирования ДНК ВПЧ осуществлялась по ее способности к определению генотипа в образцах, охарактеризованных как положительные ВПЧ-тестом на первом этапе анализа. Исследованы образцы, полученные от женщин, проходящих профилактический осмотр (N=823, НИИ АГ им Д.О.Отта). При использовании разработанной методики было успешно проведено генотипирование 97,9% образцов (95 из 97), показавших положительные результаты при тестировании тестом HybridCapture 2, и 100% образцов (100 из 100), показавших положительные результаты (клинически значимая концентрация ДНК ВПЧ) при тестировании разработанной нами методикой выявления и количественного определения. Таким образом, методика генотипирования являлась чувствительным инструментом, позволившим проводить определение генотипа практически всех выявленных образцов. При оценке правильности определения генотипа ВПЧ в качестве метода сравнения использовалось прямое секвенирование с использованием праймеров MY11/MY09 GP5+/GP6+. Сравнение проведено на 35 образцах, с выявленной ДНК ВПЧ. Правильность определения генотипа составила 95%. Расхождения между методом секвенирования и разработанной методикой были связаны с присутствием в образце 2 генотипов ВПЧ в различных концентрациях. Так как чувствительность секвенирования по Сэнгеру для смеси образцов не превышает 20%, то при различиях в

концентрации мишеней более чем в 5 раз (различия пороговых циклов в ПЦР в реальном времени более чем на 3 единицы) возможно недовыявление минорной мишени. Так как во всех случаях недовыявленный генотип в методике секвенирования присутствовал в меньшей концентрации (значения пороговых циклов отличались более чем на 3) по сравнению с выявленным, то различия в результатах могут быть объяснены особенностями метода секвенирования.

Апробация разработанных методик для выявления и характеристики случаев неопластической патологии шейки матки при обследовании

женщин, проходящих профилактический осмотр и среди больных дерматовенерологического профиля.

Данный этап работы был направлен на апробацию разработанных методик на небольших пилотных группах: женщины, проходящие профилактический осмотр, и женщины, обратившиеся с жалобами или подозрениями на ИПГТГТ к дерматовенерологу.

Для женщин, проходящих профилактический осмотр, была применена схема скрининга, основанная на параллельном тестировании мазков цервикального канала цитологическим методом и методом выявления ДНК ВПЧ, рекомендованная Американским обществом по кольпоскопии и цервикальной патологии, ASCCP (Wright T., et al., 2006 с дополнениями Apgar B.S., et al., 2009) как оптимальная в случае доступности обоих тестов. Из 823 пациенток, привлеченных на профилактический осмотр и которым при проведении осмотра забирался мазок-отпечаток для цитологического исследования и образец для ДНК ВПЧ тестирования, 22 были удалены из анализа данных по причине невалидности ДНК ВПЧ теста (недостаточно материала для анализа). Далее анализировался 801 образец. ДНК ВПЧ ВКР была выявлена у 100 (12,5%). Цитологические изменения были обнаружены у 83 пациенток (10,4%). Среди ДНК ВПЧ ВКР положительных лиц тяжелая дисплазия или РШМ были выявлены в 6 случаях, среди положительных при цитологическом исследовании - в 5 случаях (все ДНК ВПЧ положительные). Полученные результаты продемонстрировали, что применение методики выявления и количественного определения ВПЧ ВКР позволило увеличить чувствительность выявления предраковой патологии шейки матки с 83,3% (5/6) при использовании только цитологического анализа до 100% (6/6). Предсказательная ценность положительного результата ВПЧ-теста (PPV) по отношению к тяжелой дисплазии и РШМ составила 12,2% [ДИ95%: 5,7-24,2%] (6/49). Следует отметить, что в отличие от методики определения ДНК ВПЧ ВКР, интерпретация результатов которой была достаточно проста, в случае цитологического анализа клиническая интерпретация диагноза ASCUS представляла сложность. В связи с этим мы рассматривали женщин, для которых при цитологическом исследовании было получено заключение ASCUS, как потенциально имеющих патологию шейки матки и рекомендовали проведение кольпоскопического обследования. Принимая во внимание данную практику, прогностическая ценность положительного результата

цитологического исследования оказывалась равной 11,6% [ДИ95%: 5,1-24,5%] (5/43) и достоверно неотличимой от прогностической ценности положительного результата ДНК ВПЧ тестирования. Таким образом, если бы в настоящем исследовании применялся один какой-то тест, то предпочтение следовало бы отдать методике выявления ДНК ВПЧ как более чувствительной, но имеющей одинаковую с цитологическим анализом предсказательную ценность положительного результата. Интересен результат генотипирования образцов, от пациенток с тяжелой дисплазией и РШМ: при классическом доминировании ВПЧ 16 типа (3 случая), другие образцы содержали ВПЧ 31 (2 случая), 45 и 52 типов (по 1 случаю). Образцов, содержащих ВПЧ 18 типа, выявлено не было.

Особый интерес представляло обследование группы лиц, обратившихся с жалобами в кожно-венерологическую службу. В ряде исследований отмечается, что риск инфицирования ВПЧ ВКР и вместе с тем риск развития предрака и рака шейки матки увеличивается при наличии таких факторов как раннее начало половой жизни, частая смена половых партнеров, а так же сопутствующие инфекции, передаваемые половым путем (Kjaer S.K., et al., 2001; Muñoz N. et al., 2004). Таким образом, женщины, имеющие ИППП или относящиеся к группе риска заболевания ИППП, имеют больше шансов развития РШМ. При планировании проведения пилотного проекта в дерматовенерологической службе во внимание принимался тот факт, что специалисты КВД в рутинной практике не осуществляют взятие мазков отпечатков для цитологического обследования. С учетом данного ограничения, была выбрана схема обследования, предполагающая проведение ВПЧ тестирования на первом этапе скрининга (Cuzick J. et al, 2006). В случае обнаружения ДНК ВПЧ в клинически значимой концентрации проводилось цитологическое исследование, а при выявлении цитологической патологии рекомендовалось посещение гинеколога с целью и проведения кольпоскопического и гистологического исследований для постановки точного диагноза. Данная схема была удобна для кожно-венерологического диспансера вследствие того, что взятие соскоба эпителия для выявления ДНК ВПЧ ВКР могло проводиться совместно с исследованием, направленным на выявление возбудителей ИППП и представляло рутинную процедуру, в отличие от приготовления мазка-отпечатка для цитологического исследования. Кроме того, тест для выявления ДНК ВПЧ мог быть сделан при первичном приеме при наличии выраженного воспаления влагалища и/или шейки матки, являющегося противопоказанием для цитологического исследования. Важным являлось и взаимодействие служб: при выявлении ДНК ВПЧ дерматовенеролог мог мотивированно направлять пациентку на прием гинеколога для проведения дальнейших этапов обследования. Были исследованы образы соскобов цервикального канала 571 пациентки. В результате проведенного исследования было установлено, что выявляемость ВПЧ ВКР в клинически значимой концентрации составила 16,8%. Характерным было то, что выявляемость ВПЧ в

данной группе существенно не отличалась от описаннои в литературе величины для популяции в целом - 15% (Hariri S., et al., 2011). Также среди больных дерматовенерологического профиля в возрасте старше 30 лет выявляемость ВПЧ примерно совпала с полученной нами для когорты женщин старше 30 лет, проходящих диспансерное наблюдение (12,1%), отличия статистически недостоверны. Таким образом, по выявляемое™ папилломавирусной инфекции группа пациенток кожно-венерологического диспансера не отличалась от диспансерной группы и популяции в целом. Однако важным отличием данной группы была выявляемость предраковой и раковой патологии (рис 5).

Собственные данные , Данные публикаций

число случаев на 100 тыс. женского населения

Больные дермато-'венерологического ^ достоверность

профиля различий: *р <0,05

Рис 5. Выявляемось предрака и рака шейки матки в различных группах женщин (сравн. Курцер М.А. и др., 2004; Ко1ашегш-Та1опеп Ь.й а1, 2008)

Проводя сравнение двух изученных нами групп видно, что выявляемость предрака и рака 1ПМ среди больных дерматовенерологического профиля в 2,06 раза выше, чем среди женщин диспансерной группы и существенно превосходит средне-популяционную. Выявляемость поражений тяжелой степени была достаточно высока как среди больных старше 30 лет (2,12% от всех обследованных 2116 случаев на 100 тыс. женщин), так и среди молодого контингента (1,57% от всех обследованных или 1570 случаев на 100 тыс. женщин). Предсказательная ценность положительного результата методики выявления и количественного определения ДНК ВПЧ, хоть и была достоверно выше для группы женщин старше 30 лет (16,7%), оставалась на высоком уровне и для женщин моложе 30 лет (8,3%). Таким образом, с учетом ограниченной доступности цитологического анализа мазка в дерматовенерологической службе и высокой выявляемое™ предраковой патологии видится целесообразным использование методики выявления и количественного определения ДНК ВПЧ ВКР для ранней диагностики случаев предрака и рака ШМ в группе больных дерматовенерологического профиля для всех возрастных групп пациенток (как старше, так и моложе 30 лет).

ВЫВОДЫ

1. Разработана стандартизированная методика для выявления и количественного определения ДНК широкого спектра вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59) на основе ПЦР в реальном времени и определены ее аналитические характеристики: чувствительность (600-8000 копий/мл), линейный диапазон (1000 - 100,000,000 копий/мл), специфичность (100%).

2. Разработана стандартизированная методика для генотипирования 14 ВПЧ ВКР (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68) на основе метода типоспецифической мультиплекс-ПЦР, определены аналитическая чувствительность (250-1000 копий/мл) и специфичность (100%).

3. Показано, что оптимальным для разработанных методик способом взятия материала является проведение соскоба эпителия цервикального канала и зоны трансформации при помощи цервикальных цитологических щеточек

4. Установлено, что чувствительность обнаружения случаев предрака и рака шейки матки методикой для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ (97,4% [94,1%-98,9%]) достоверно выше чувствительности методики цитологического анализа мазка (75,0%[67,6%-81,2%]). Диагностическая специфичность методик достоверно не отличалась (92,0%[90,0%-93,6%] и 91,0% [88,9%-92,7%]).

5. Методика для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ при сравнении с международно-одобренной для скрининга рака шейки матки методики Hybrid Capture 2 соответствовала международным научно-обоснованным требованиям к тестам, используемым для скрининга рака шейки матки.

6. Показана высокая частота совпадения результатов (95% [83,5%-98,6%]) разработанной методики для генотипирования ДНК ВПЧ ВКР и метода прямого секвенирования. Генотипирование было успешным для 100,0% [96,3%-100,0%] образцов, положительных при применении методики выявления и количественного определения ДНК ВПЧ ВКР.

7. Показана возможность обнаружения большего числа случаев (6 из 6) предрака шейки матки разработанной методикой для выявления и количественного определения ДНК ВПЧ по сравнению с цитологическим анализом мазка (5 из 6) при обследовании женщин, проходящих профилактический осмотр.

8. Установлена высокая выявляемость предрака и рака шейки матки среди больных дерматовенерологического профиля (1751 случай на 100 тыс. женщин) с помощью разработанных лабораторных методик обнаружения ДНК ВПЧ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для повышения качества и информативности скрининга рака шейки матки

рекомендуется проводить количественное ВПЧ-тестирование при проведении

профилактических осмотров и обследовании больных

дерматовенерологического профиля.

С целью получения адекватных результатов скрининга рака шейки матки с использованием методик для выявления, количественного определения и генотипирования ДНК ВПЧ необходимо осуществлять забор материала при помощи цервикальных цитологических щеточек с поверхности эпителия цервикального канала и зоны трансформации. Рабочая часть щеточки должна помещаться в пробирку с транспортной средой и сохраняться в ней до доставки образцов в лабораторию.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективы данного исследования лежат в дальнейшей оценке эффективности применения разработанных методик в условиях пилотного проекта по сплошному скринингу рака шейки матки. Новое исследование позволит определить оптимальную схему исследования, возраст женщин, вовлекаемых в скрининг, рациональные межскрининговые интервалы, социо-экономический эффект от внедрения ВПЧ-тестирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kuevda, D. Diagnostic sensitivity of high risk HPV Real-Time PCR kits in comparison with nested MY 11/09 - GP5+/GP6+ PCR and HybridCapture II / D. Kuevda, O. Shipulina // Proceedings of 22nd International papillomavirus conference. - Vancouver, Canada. — 2005. — P. 121.

2. Куевда, Д.А. Разработка и апробация метода количественного определения ДНК генотипов вируса папилломы человека на основе ПЦР в режиме реального времени / Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина, Г.А. Шипулин // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2006. -№4. - С. 18-21.

3. Kuevda, D. Novel high-risk HPV DNA detection kit for low-income countries / D. Kuevda, V. Nasonova, O. Shipulina // Proceedings of International Expert Meeting EUROGIN. - Paris, France. - 2006. - P.33.

4. Куевда, Д.А. Количественный подход в диагностике папилломавирусной инфекции. / Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина // Клиническая гинекология: избранные лекции, под ред. В.Н. Прилепской, М.: МЕДпресс-информ, 2007. -С.88-96.

5. Куевда, Д.А. ВПЧ-тестирование: алгоритмы диагностики и требования к молекулярным тестам для выявления вирусов папилломы человека / Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина // Генодиагностика инфекционных болезней - 2007 (Молекулярная диагностика - 2007), М.: Сб. трудов VI Всерос. науч.-практ. конф, 2007. - Т. 3. - С. 108-119.

6. Куевда, Д.А. Первые результаты апробации ВПЧ-тестирования в программе цервикального скрининга в Москве / Куевда Д.А., Сафонова А.П., Пиксасова О.В., Шипулина О.Ю.// Генодиагностика инфекционных болезней - 2007 (Молекулярная диагностика - 2007), М.: Сб. трудов VI Всерос. науч.-практ. конф, 2007. - Т. 3. - С.127-129.

7. Куевда, Д.А. Высокая вирусная нагрузка и интеграция ВПЧ в геном человека как молекулярные маркеры диспластических изменений шейки матки / Д.А. Куевда, Н.В. Ермакова, О.Ю. Шипулина и соавт. //. Генодиагностика инфекционных болезней - 2007 (Молекулярная диагностика - 2007), М.: Сб. трудов VI Всерос. науч.-практ. конф, 2007. - Т. 3. — С.130-132.

8. Куевда, Д.А. Разработка и апробация тест-системы для генотипирования вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска на основе мультипраймерной ПЦР в реальном времени/ Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина // Молекулярная диагностика инфекционных болезней, Минск: Сб. трудов Международ, науч.-практ. конф. - 2007. - С.78-80.

9. Куевда, Д.А. Разработка методики выявления клинически значимого количества вируса папилломы человека с использованием качественных ПЦР-ВПЧ-тестов АмплиСенс / Д.А. Куевда, B.C. Насонова, О.Ю. Шипулина, Г.Н. Минкина // Молекулярная диагностика инфекционных болезней, Минск: Сб. трудов Международ, науч.-практ. конф. — 2007. -С.81-82.

10.Куевда, Д.А. Количественный подход в диагностике генитальной папилломавирусной инфекции / Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина, Г.Н. Минкина, О.В. Пиксасова // Генодиагностика инфекционных болезней -2007 (Молекулярная диагностика - 2007), М.: Сб. трудов VI Всерос. науч.-практ. конф, 2007. - Т. 3. - С.120-123.

11.Шипулина, О.Ю. Разработка панели контрольных образцов ДНК вирусов папилломы человека, ее валидация и тестирование в ВПЧ-тестах «АмплиСенс». / О.Ю. Шипулина, Д.А. Куевда, Н.В. Ермакова, А.В. Шишова // Генодиагностика инфекционных болезней - 2007 (Молекулярная диагностика - 2007), М.: Сб. трудов VI Всерос. науч.-практ. конф, 2007. - Т. 3. — С.153-155

12.Kuevda D. First Results of High-risk HPV DNA Testing in Moscow Screening Program / D. Kuevda, A. Safonova, O. Piksasova, O. Shipulina // Proceedings of the 24th International Papillomavirus Conference and Clinical Workshop. -Beijing. - 3-9 November, 2007. - P.87.

13.Kuevda D. Value of Viral Load Measurement in HPV DNA Testing / D. Kuevda, O. Shipulina, G. Minkina et al.// Proceedings of the 24th International Papillomavirus Conference and Clinical Workshop. - Beijing. - 2007. - P.88.

14.Куевда, Д.А. Генодиагностика папилломавирусной инфекции высокого канцерогенного риска. Количественный подход / Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина // Под.ред. В.Н. Прилепской. - М.: МЕДпресс-информ, 2008. -С.284-293.

15.Киселева, В.И. ВПЧ-отрицательный рак шейки матки и его прогноз/ В.И. Киселева, Л.И. Крикунова, А.П. Шинкаркина, Л.В. Любина, Г.П. Безяева, Д.А. Куевда, и соавт.// Российский онкологический журнал. - 2008. - №3. - С.23-26.

16.Видяева, И.Г. Частота выявления вируса папилломы человека высокого онкогенного риска у женщин репродуктивного возраста республики Тыва/ И.Г. Видяева, Л.Н. Уразова, Л.Ф. Писарева, С.К. Ховалык, О.Ю. Шипулина, Д.А. Куевда //Бюллетень СО РАМН. - 2008. - №3 (131). - С. 13-17.

17.Куевда, Д.А. Опыт применения ВПЧ-тестирования для раннего выявления предрака шейки матки в дерматовенерологической службе / Д.А. Куевда, О.Б. Трофимова, Н.В. Болыпенко //Тезисы научных работ X Всероссийского съезда дерматовенерологов. — С.-Петербург. — 7-8 октября 2008. - С.67-68.

18.Минкина, Г.Н. Количественное ВПЧ-тестирование в постлечебном наблюдении пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями высокой степени тяжести / Г.Н.Минкина, М.В.Гаврикова, О.Ю.Шипулина, Д.А.Куевда, и соавт. // Материалы Международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее». - Москва, 31 марта-1 апреля 2008. - С. 98-99.

19.Минкина, Г.Н. Результаты ВПЧ ДНК - генотипирования у пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями / Г.Н.Минкина, Е.В.Комарова, О.Ю.Шипулина, Д.А.Куевда // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов. - Москва, 2008. - С. 421-422.

20.Куевда, Д.А. Распространенность папилломавирусной инфекции высокого канцерогенного риска и ассоциированной с вирусом папилломы человека онкогинекологической патологии среди пациенток дерматовенерологического профиля./ Д.А. Куевда, О.Б. Трофимова, Н.В. Болыпенко и соавт.// Инфекционные болезни. - 2009. -№4. - С.28-32.

21.Минкина, Г.Н. Диагностика остаточных/рецидивных предраковых заболеваний шейки матки после электроэксцизии / Г.Н. Минкина, И.Б. Манухин, М.В. Гаврикова, Е.В. Комарова, О.Ю. Шипулина, Д.А. Куевда // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2009. - Т. 8, №5. - С.23-27.

22.Куевда, Д.А. Вирусная нагрузка онкогенных типов ВПЧ как маркер тяжести цервикальных поражений/ Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина, Г.Н. Минкина // Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, Инфекционные болезни. - 2009. - №1, Приложение, - С. 107.

23. Куевда, Д.А. Апробация ВПЧ-тестирования для скрининга цервикальных патологий/ Д.А. Куевда, А.П. Сафонова, О.Ю. Шипулина // Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, Инфекционные болезни. - 2009. - №1, Приложение, - С. 106-107.

24.Минкина, Г.Н. Роль тестирования на вирус папилломы человека в сортировке неясных цитологических атипий / Г.Н. Минкина, Е.В. Комарова, О.Ю. Шипулина, Д.А. Куевда, соавт.// Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Амбулаторно-поликлиническая практика - платформа женского здоровья». - М. - 2009. - С. 169.

25.Киселева, В.И. Инфицирование вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска и прогноз рака шейки матки./ В.И. Киселева, Л.И.

Крикунова, JI.B. Любина, Г.П. Безяева, JI.B. Панарина, Н.И. Юрочкина, Д.А. Куевда и соавт.// Вопросы онкологии. - 2010. -1.56, №2. - С.185-190.

26.Комарова, Е.В. Роль ВПЧ-тестирования и генотипирования в диагностике цервикальных интраэпителиальных неоплазий / Е.В. Комарова, Г.Н. Минкина, М.В. Гаврикова, C.B. Фириченко, O.K. Храмова, О.Ю. Шипулина, Д.А. Куевда //Медицина критических состояний. -2010. -№ 1. - С. 32-26.

27.Куевда, Д.А. Клиническая валидация количественного ВПЧ-теста "АмплиСенс ВПЧ ВКР Скрин-титр FL" в соответствии с международными требованиями / Д.А. Куевда, О.Ю. Шипулина, Г.Н. Минкина и соавт.// Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». - М. -2010. — Т.З. — С. 380-383.

28.Шипулина, О.Ю. Оценка частоты выявления ИППП и вирусов папилломы человека высокого и низкого онкогенного риска среди девушек—подростков Московской области / О.Ю. Шипулина, И.В. Михеева, Т.Н. Романюк, Д.А. Куевда, и соавт. //Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. - №.6 (61).-С. 35-41.

29.Shipitsyna, Е. Prevalence of high-risk human papillomavirus types and cervical squamous intraepithelial lesions in women over 30 years of age in St. Petersburg, Russia / E. Shipitsyna, E. Zolotoverkhaya , D. Kuevda et al. // Cancer Epidemiol. -2011.-V. 35 (2).-P. 160-164.

30. Трофимова, О.Б. Клиническая валидация первого российского ВПЧ-теста / Трофимова О.Б., Куевда Д.А., Шипулина О.Ю., и соавт.// Материалы Международного междисциплинарного форума «Шейка матки и вульвовагинальные болезни». - М. - 14-17 ноября, 2012. - С.89-90.

31.Ершов, В.А. Репродукция вируса папилломы человека 16 генотипа и интеграция вирусной ДНК в измененном цервикальном эпителии./ В.А. Ершов, A.A. Вязовая, Е.В. Ильинская, A.C. Лисянская, Д.А. Куевда и соавт.// Онкология. Журнал им. П.А.Герцена. - 2013. - №1. - С. 21-26.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

ВКР Высокий канцерогенный риск РШМ Рак шейки матки

ВПЧ Вирусы папилломы человека ШМ Шейка матки

впч- тест Тест, направленный на выявление ДНК ВПЧ ВКР ASCCP Американское общество колъпоскопии и патологии ШМ

ДИ Доверительный интервал ASCUS Атипичные плоские клетки неопределенной значимости

ИППП Инфекции, передаваемые половым путем CIN Цервикальная интраэпителиальная неоплазия (степени 1, 2 или 3)

квд Кожно-венерологический диспансер H-SIL плоскоклеточное интраэпители-альное поражение высокой степени

ПЦР Полимеразная цепная реакция L-SIL плоскоклеточное интраэпители-альное поражение низкой степени

Подписано в печать 03.11.2013 Заказ № 10908 Тираж 100 экз. Объем 1 п.л.

Формат 60x90/16 Отпечатано: ООО «ВП24» г. Москва, ул. Трубная, д. 21 Телефон 651-64-48 www.vp24.ru