Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Действие кроветворных и лимфоидных клеток и вырабатываемых ими активных факторов на стромальную ткань IN VITRO

РГС 00 1 5 MAR 1393 .

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛВДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ .. ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМ. ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н. Ф. ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

ГОРСКАЯ Юлия Федоровна

ДЕЙСТВИЕ КРОВЕТВОРНЫХ И ЛИМФОВДЫХ КЛЕТОК И ВЫРАЕА1ЫВАШЫХ ИМИ АКТИВНЫХ ФАКТОРОВ КА СТРОМАЛЬНУЮ ТКАНЬ in vitro

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Российской

АМН

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор А.Я. Фриденштейн

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор К.А. Лебедев доктор биологических наук, профессор Е.В. Сидорова доктор медицинских нэук, профессор М.А. Туманян

Ведущее учреждение:

Институт иммунологии МЗ Российской Федерации

1та диссертации состоится ^/ - 1993 г.

часов на заседании специализированного совета

Д. 001. 07. 01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН /123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18/.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке НШЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. * _

Автореферат разослан "¿Ал? « "(лу_1593 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Е.И. Коптелоьа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА FAEOTH

Актуальностьjr . В органах гемо- и лкмфопозза кроветворные игтаоиднко глеи« подвергаются локалышм регулирующим воздеЯст-ам со стороны отрсмальной ткани этих органов, создающей на их рритории гемопоэткческое и гао/у;i ол огк ческо е мигазоокрукшие, обе-вчиврхицее ре1ульруеь?ув пролиферацию я дифференцировнугадопоэ-теских и Иь?мун с хсипэт ситных кл ет о к -пс едие ст в енни ков /Фриденш-7:л А.Я., Лурия Е.А., I960/. Актуальность изучения проблема мик-экрукачия опредкинется тем, что эта проблема рассматривает ме-шзмы, обеспечивающие способность стволовых гемопсэтичссккх кле-s поддерживать в организме процессы кроветворения и иммунитета» ¡действуя на клетки, ответственные за микроокруяение, псино, в iyqei.1 j дсбвдься направленного влияния на ход и интенсивность zk-шых процессов, а также па гемопоэз, в частности, при его реге->ации после облучения.

При индукции имьунясго ответа и под действием целого ряда фа-ров, выводящих кроветворную и лимфоцдную ткань из состояния ра-1йесия /например, после значительной хровопотерк или облучения/, юисходкт закономешие изменения содержания в ней кроветворных •ток-предшественников. Возникает зопрос, как вздут себя в таких уациях стромалькые клетки-предшественники и насколько взакмо-занно протекает регенерация тех и других категорий клеток.

К настоящему времени получено иного данных о действии строганых клеток на кроветворные и лимфоидные клетки. Зопрос не о , как регулкруегся сама стромадьная ткань, в частности, вопрос озмсекнх воздг-".ствиях яроветьорньгс и лмлфсидных клеток и прццу-усмих иг.м активных факторов на клетки стрела гораздо менее изу-. Мсзду чем, уке сегодая существуют все есноьажя полагать, '-тео акизация и поддержание микроокру.^ения - это процессы, требутацие ■¡ератившх взаимодействуй строгальных и кроветворны* /леток. :-;стно, например, что физиологическая перестройка костной ткани, 5ходимая для ез нор?/.ального функционирования и постоянно иду-в здоровом организме, незознстла без участия потомков крезет-шх клеток остеокластов Anihar-d с. et-ai..iS77/ При это;«, ак-юсть остеокластов может, ло-види'лму, регулирогАтЬсд фааггора-щцеляелыми активированными ли^фоцита-^ к макрофагами /факто-

р&\м некроза опухолейо. uß и кнтерлейкиноы I/ /?ertolini D-R. et.&l, '1986/.

Делъ канной работы состояла в изучении поведения стромаль-ной ткани в условиях, вкводящих кроветворную и лимфоидную" систему кз равновесия, а тайке в изучении регуляторкых влияний на стромалькые кяоногенше клетки как кроветворных и лиыфоидкых клеток, так ь факторов, вырабатываемых эиаш клетками при их ак-'тивадик.

О количестве строгальных кяетск-предше ствекников в кровет-ворпис и лимфоцдных органах судили по содержанию стромальных кло-ногенных клеток /KDK-®/, образугацкх колоник-клони фкбробластов при эксплантации в монослойные культуры суспензий клеток, приготовленных из этих органов. Основные задачи работы:

1. Выяснить динамик/ регенерации стромальных Елеток-предзествен-нмкоб костного мозга мышей после тотального облучения вивотных 1,6 Gy.

2. Выяснить динамику регенерации стромальных клеток-предшествен--киков костного мозга милей после введения животным циклофсс^емя-да.

3V Выяснить динамику изменения численности стромальны;: клопогонных клеток в лимфатических узлах морских свинок после однократного и повторного введения антигенов ш виво.

4. Определить, как влияю? ¡шагки кроветворных и лимфоидньс.' органов на эффективность клонирования стромальных клеток-предязствен-ников в мснослойных культурах кос-гного поз га и рост six культу-ральных дотомков у раüisk вкдое амвотных /морских свинок и юре-лмяозА

5. Определить, как влияет присутствие тромбоцитов крови на эффективность стромальных Елетск-лредеестЕеннмков и рост их культу-ральнкх потомков р. коьосло&шх культурах.

6. Определить, как влияэт присутствие митогенов на оффектишоегь клонирования стромаш-йк клеток-иредалествснникоа з мснэслоЯнгс: культурах костного и о зга и селезенки.

7. Выяснить влияний некоторых ростовых факторов, продуцируема активированными мслрофагкл: /иитерлейюн I, фактор ьекроза слу-

ч-олей*/ и лимфоцитами /интерлейкин 3/ на эффективность клони-зовэнкя костномозговых стромальных клеток-предрестзенкиков и их лультуральньх потомков ин витро.

Научнаг новизна. В работе впервые было изучено образование '.и витро колоний строгальных фкбробластов клоногонкташ стромаль-1ыми клетками кроветворных и лимфсидных органов под влиянием рл-щ воздействий, говорящих из равновесия кроветворную и лимфоид-[уда систему /тотальное обучение I,o Gy, введение циклофоссгамида, ммуннкй ответ после однократного и повторного введения зитих'е-ов, присутствие r/итогенов ик витрс/, а так,не строгальное колони-образование под действием клеток кроветворных й лимфолдкнх ор-аноз и ряда факторов, продуцируемых активированными лимфоцитами макрофагами. Вп&рвые выявлена кинетика изменения численности громалькых едеток-прадществешикоз /КОК-S/ костного мозга после бдучения животных 1,5 Gy и покасано, что несмотря на гистогече-лческуа обособленность этих клеток от строловюс кроветворных теток /йриденатейн А.Я.. Курглесова А.И., 1971/, численность н эх, и других меняется после облучения сходи/ образом. Изучена шамика регенерации костномозговых стрсмальных кдоногенкых кле-ж после введения животным циклофссфашда; показано, что они гадка а динамикой регенерации КОК-3 после облучения 1,5 Gy, од-iKo, циклофосфампд в дозе 200 :лг на кг обладает по отношению KDK-i более щадящим действием, чем низкие дозы облучения. :ервые показано, '»то численность КОК-Ф в лимфатических узлах кор-их свинок к в селезенках мьией в десятки раз увеличивается по-9 однократного введения ентигаюв, после поьгорнего введет;-, ткгенов число КОК-Ф возрастает в еще большей степени. Впервые казано, что костномозговые клетки и клетки кроветворных и лим-адных органов могут оказывать двоякое воздействие на клоноген-2 стремалькые клетки в зависимости от видовой принадлежности зл едких. А именно ( все испытанные популяции лпмфоиднкх и зветаорных клеток морских свинок и кроликов, а так*;е лейкоци-перифсрической крови кроликов с увеличением клеточкой пло-'чхгл подавляют обрагозание колоний фябробластод кленогенными зональными клетками костного мозга кролияог. В то з<- -ремч, ш-шлось. что на кчонсгенныэ стро:.шльнке клетки костного мозга

- б -

морских свинок костномозговые клетки и клетки селезенки морских- свинок действуют стимулирующим образом, тогда как клетки селезенки столиков, лимфатических узлов и тимуса морских свинок действуют подавляюще, а клетки костного мозга роликов не меняют величину эффективности клонирования /ЭКЮ-Ф/ этих животных. Показано, что тромбоциты, выделенные из крови кроликов, стимулируют образование колоний как первично выделенными К0К-5, так и рост их культуральнкх потомков. Однако, добавление костномозговых клеток ролика совместно с тромбоцитами снимает ростстимулиругап;ее действие последних на стромальные клетки кролика. В суше эти результаты свидетельствуют о том, что популяции костномозговых и лимфоидных клеток морских' свинок и кроликов содержат не только стгедаирующие клетки /о чем было известно ранее /Щриденштейн А.Я., 1990/, но и клетки, ин-- гибирущие пролиферацию стромальных клоногенных клеток и что чувствительность к ростстимулирующим и ростингибирувщим воздействиям у клоногенных стромалышх клеток разной видовой принадлежности неодинакова. Выяснилось, что действие облученных костномозговых клеток на размножение клеток пассажных штаммов костномозговых фибробластов морских свинок зависит от состоя-. ния штамма в момент пассирования - если большинство клеток находится в состоянии покоя, то есть выведено из пролиферативно-го цикла, то добавление облученных костномозговых клеток оказывает выраженное стимулирующее влияние на пролиферация пассированных костномозговых фибробластов, если же клетки штажа находятся в состоянии пролиферации, добавление облученных костномозговых клеток либо не оказывает влияния, либо ингибирует рост костномозговых фибробластов. Впервые показано, что для осуществления ингибиции роста КОК-Ф колоний в костномозговых культурах кроликов клеткам кроветворных и лимфоидных органов в культуральной среде необходимо присутствие эмбриональной телячьей сыворотки /ЗТС/. Наличие в культурах наряду с ЗТС как аутологической для реагируюи^х клеток сыворотки /сыворотка кроликов/ так и сывороток ряда взрослых животных других видов /сыворотки мышей, крыс/, резко сникает проявление эффекта ингибиции. Показано, что значительная часть /3/4/ ингибируощей активности обусловлена растворимым фактором /факторами/, про-

здящими через миллипорнкй фильтр. Установлено, что шгп-фующке рост КОК-Ф клетки адгезИЕны, радиорезкстентны и <еют маркер матаофаг-ов Р4/80. Т-клетки, по-видимому, не жнимаот существенного участил в изучаемом эффекте, [ерные показано, что присутствие митогенов в культурах хле-ж селезенки илг кондиционированной среды от таких культа в культурах селезенки и костного мозга резко подавляет яошеобразование. При этом, выяснилось, что в основе этого давления лежит обратимый блок пролиферации стрсмальиых кло-генных клеток, Клетки, ответственные за появление в кснди-ошгоовлчлой среде от стимулированных мктогснаии лимфоцитов лезенки активности, ингибируящей рост КОК-Ф. редиочувстзи-лыш и имеют фенотип Т'пу-Х+, Впервые изучено действие ряда :сторов, продуцирус.алх активированными мафсфатами и лимфо-гами /фактора некроза опухолейе< „ иьтерлеШаша I и штер-Зкина 3/ на колониеобраэовачие как первично выделенными

так и на рост их нулътуральннх потомков. Выяснилось, ~> указанные факторы в зависимости от их концентраций в куль-. зальной среде могут как стимулировать, так и ингибировать уг стромальных клеток в культурах. Показано, что характер :стеия ТН<5-<х и ИИ-1 на пассажные стромадьные фибробласты не мч&ется от действия этих факторов на рост КОК-3 колоний в [ьтурах первишо экеялантированных костномозговых клеток, из •о следует, что дейстзиэ ТКЗ-с< к ИЛ-1, по-видимому, каправ-о прямо на стромальные клетки и не опосредовано другими точными категориями. Напротив - для успешного действия ИЛ-3 рост КОК-Ф в культурах необходимо присутствие кроветворных ток.

Научная ценность полученных данных. Полученные данные дотают возможность регулировки стрсмальной ткани со стороны ветворгшх и лимфоидных клеток и факторов, вырабатываемых-при йктивацик, что открывает новое направление п изучении меха-•юп стромального мшфоо^фуяенпя, В ходе разработки этого на-влелия могут быть определены долслкисельгще пути воздействия :трому, созданщ/в гемопозтическое и тдлукологнчес:. -з микроох-гчле, с целью достижения игпраглсаной регуляции процессов ге-зоза и иммунитета.

Практическая ценность пплучеинже яаншх связана с тем, что

уже целый ряд факторов, вырабатываемых активированными макрофага1.« и лимфоцитами, в настоящее враля исходит все более широкое применение в клинике при лечении различных патологий. В связи с этим, необходимо учитывать, как оти факторы действует на такую функционально ванную клеточную категорию, как стрсмальная ткан! С другой стороны, данные о ростсиаудируалцих и ростингибируы-цих эффектах кроветворных и лимфоидкых клеток могут, в дальнейшем, оказаться полезными при разработке препаратов, способных при соответствующих патологиях вызывать как усиленную пролиферг цию стромальных клеток /например, при косиасс переломах/, так и ингибицию их пролиферации /например, при миелофиброзах/.

Полученные данные позволяют такке усовершенствовать метод клонирования стромальных клеток-предлественников, используемый настоящее время как в научных исследованиях, так и в клинике дл определения численности этих клеток по эффективности образовали стромальных колоний и создают предпосылки для правильной интерпретации его результатов.

Предложенные нами методические подходы используются в Центральном институте травматологии и ортопедии МЗ России /¡.'оенва/ и Центральном научно-исследовательском институте детской гемато логии МЗ России /Москве/, Экспериментальные данные и теоретичес кие положения диссертационной работы использованы в монографии "Клеточные основы ¡гаоветворного микроогтукения" /А.Я. Фриденште Е.А. Лурмя, 19В0/ и лекционных курсах по кммуноморфологии ка биологическом факультете МГУ им. Н.В. Ломоносова.

Диссертационная работа выполнена согласно темен основного плана научно-исследовательской работы НИИЗМ им. Н.5. Гзмэлеи РАЖ в рачках программы ГШТ 0.69.07 "Исследовать гачетические к молекулярные механизмы нарушений и>,-муггл1> ?.та и наследственных болезней к разработать на этой основе методы и способы профилактику диагностики и лечения".

Апробация работы. Диссертация апробирована ка объедаыек-ной научной конференции отдела иммунологии КИИЭМ км. К.Ф. Гамалеи РАЖ. Осноьные положения диссертационной работы доложены и обсу,¡едены на международных к всесоюзных съездах, симпозиумах и конференциях, перече:;* которых приведен ъ конце автореферата.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных тоет.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа измена на 206 страницах машинописи и состоит из введения, об-¡ра литературы /6 гла~/, раздела "материалы и мзтоды", собст-¡нных исследований /4 главы/, обсуждения результатов, выво-1В и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 33 ¿блицами и 17 графиками. Библиографический указатель включает $ источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДА

Животике.

экспериментах были использованы следуйте животные: . ■ Мыши обоего пола'линий СБА, С-г,ВЬ и Р-/СВАхС-^В1/ массой 18г, полненные из питомника "Столбовая" А!/л СССР. Морские свинки обоего пола массой 180-250 г, полученные из пи-мнлка "Кракова" АМН СССР. Кролики Калифорнийской, Новозеландской пород и породы "Шш-лла" массой 1,5-2 кг, полученные из питомника "Светлые горы" Н СССР или с Еыставки достижений народного хозяйства Москва/.

Приготовление клеточных суспензий, дренные'кости мышей и морских свинок, умерщвленных эфиром. еы~ ляли, не повреждая эпифизов. Кости очищали от окружающих мышц соединительной ткани, срезали оба эпифиза и шприцем вымывали стный мозг в среду с<-?гй?Л. Кроликов умерщвляли введением зозду-в вену и выделяли их тазовые кости-. Кости затем разъединяли на е половины и скальпелем выскребали из них губчатую ткань с ко-здм мозгом в среду ы.-МЕМ. Из полученных таким образом взвесей ?тск костного мозга далей, морских свинок и кроликов готовили «клеточные суспензии -двумя способами:

Пропускали костный мозг через шприц с иглами уменьшающегося змг:тра или разбивали его пастеровской пипеткой /механическая з. ггашя/.

Приготовляли взвесь костного мозга с помощью трипсина по мето-:е Н.В. Лациник и др. /1281/. Для трипсинизации фрагменты кост*-ло мозга перед пропускание.! через шприц помещали в 0,25% раст-) трипсина и обрабатывали на магнитной мешалке при °С 30 минут.

Селезенки, тимусы и лимфатические узлы морских свинок, а та; селезенки мышей и кроликов помещали в чешки Петри с культу-гьноП средой, разрезали ножницам-; на несколько частей и скаль-

пелем выдавливали клетки в среду. Все клеточные суспензии фильтровали через четырехслойный капроновый фильтр, центрифугировали 10 минут при 130 О и клеточные осадки ресуспенсировали в, среде с<-4ЁМ. Указанные способы приготовления клеточных суспензий обеспечивали высо:<ув жизнеспособность клеток - 95-28^. •

Для получения тромбоцитов брали у кролика кровь из сердца, добавляли к ней ЭДТА в концентрации & ммоль на I мл кроЕИ и центрифугировали 10 минут при 130 Освобожденный от эритроцитов супернатант центрифугировали 15 минут при 1300 в. Осажденные тромбоциты промывали сначала средой без кальция и магнш. с 5 шоль ЭДТА, а затем средой без ЭДТА в том же рокиме центрифугирования.

Метод культивирования.

В настоящей работе ислольаозали метод клонирования стро-мальнкх клеток-предеаестзенников кроветворных и лимфокдных органов в моиослойных культурах, ^ультивироьание проводили в среде <А -КЕМ с 10-20% эмбриональной телячьей сыворотки..в пластиковых I стеклянных матрацах с площадью дна 42, 25 и 17 кв. см , а такие в 12- и 24-х луночных плейтах.

Метод адгезии КОК-Ф.

Культуры костного мозга ставили в двух модификациях - культивируя либо полную популяции костномозговых кл-зток /П-культу-ры/, либо адгезивные костномозговые клетки /А-культ.ури/. Для по-лученкя последних использовали метод адггзии КОК-О /Дациник Н.В. и др., 1930/, позволяющий освободиться от ншрикрепляюшихся к поверхности культурзльного сосуда кроветворных и лимфовдкнх клеток. Для проведения метода адгезии метки костного морга, эксп-лантироьенные в монослойные лультуры, инкубирозалч 1,5-2 часа при 37°С. в среде, состоящей из эмбриональной теггячьей сыворотки и с<. Затем среду с- келринрепквшпкися клетками слизали, несколько раз промывали культуры свекей средой к далее культивировали их обыски« способом.

Кулътка^роракпе пассатлкх фибробластов.

В данной работе использовались фпбробласты пассажных штаммов костномозговых фибрббластов и фибробластов коки человека /по-.'¡учены из Центрального института травматологии и ортопедии Рос. КЗ, Москва/, а тагде фкбрсблаоты костного мозга морских свинок

кроликов. Для получения штаммов фибробластов эксллантирова-и поЗхЮ^клеток костного мозга морских свинок и по 0,1-1x10^ леток костного мозга кроликов на матрац площадью дна 50 кв. м., через 10 дней клетки снимали 0,2.5% раствором трипсина, ре-успензировали в среде с* -MEM и переносили в ноеый матрац. Куль-ивирование проводили в полной культуралькой среде. Пассироза-ие обычно повторяли по достижении культурами состояния конфлю-нтности. Снятые с поверхности пластика обычным способом с по-ощью трипсина фибробласты 3-10 пассивен помещали в пластикопые атрацы с площадью дна 25 кв. си. или в 24-х луночные плейты в оличестве 50-1000 клеток на культуру в среде Ы ^МЕМ с 15-2 мбриональной телячьей сыворотки.

Получение культур фибробластов с равной степенью пролише-атизной активности клеток.

В части опытов фибробласты костного мозга морских сеинок и роликов по 1-2x10^ помещали в матрацы с площадью дна 25 кв.см, культивировали следующим образом / Pledger '.Y.H. et. ¿1., 1977/: . Для поддержания клеток в состоянии пролиферации /"стшлулиро-анные"культуры/ меняли среду через день в течение 4-6 суток, • а дожидаюсь достижения состояния конфлюснтности, через сутт. поле последней смены среды клетки снимали трипсином и экспланти-эвали в количестве 150-200 фибробластов на матрац. . Для приостановки клеточной пролиферации /"заторможенные" культы/ культивирование проводили в течение 8-14 дней без смены реды, после чего клетки также снимали трипсином и пассировали количестве I50-2CQ фибробластов на матрац. ■>

Использование облученного гоидеца.

Во многих случаях культивирование проводили в присутствии фи-зра - то есть облученных 60 Gy клеток костного мозга морских сеи-ж, которые добавляли по 0,7-1,5x10^ клеток на матрац с площадью ¡а 25 кв.см, одновременно или через час после эксплантации ин-«сгных клетск.

Фиксация и окраска культур.

Культуры фиксировали на 7-12 день культивирования 96° спиртом, фашивали азур-зозином и подсчитывали либо общее чис.'... фибробла-'ов, либо число колоний, содержащих не менее 50 клеток. В поедаем случае определяли эффективность колониеобразования /ЭКО-Ф/, I есть количество КОК-Ф колоний, приходящееся на 10* или 10^ :еток эксплантироазшого костного мозга или 10^ клеток селезенки,

Облучение клеточных суспензий к тромбоцитов крози.

Клеточные суспензии и тромбоциты крови облучали на холоду при температуре 4°С на кобальтовом облучателе при мощности дозы 6. Gy в минуту.

Облучение животных.

Взрослых мьшей облучали тотально 1,Ь Gy на кобальтовом облучателе при мощности дозы~2 С-у в минуту.

Антигены.

В качестве антигенов были использованы дифтерийный ачаток-,син,. :фисталлический овальбумин, К- и 0-антигены и микробная масса Saimón г ££ct- iyphimu^lum. , Дифтерийный анатоксин /по 80 tf на животное/ и кристаллический озальбумин /от 25 до 375С0 мкг на гсг/ вводили морским свинка?/, под к сну пятки левой задней конечности в 0,1 мл физиологического раствора. Б ряде опытов овачьбумга вводили знутрибркшяно в дозе 200 мкг на кг в I мл физиологического раствора. Н- и О-алтигены /по 10 мкг/, г такке микробную массу S. {yp/zimu г1ит /по 500 мкг/ вводили швам СБА внутрибрп-гинно в 0,5 мл физиологического раствора.

Митогеги,

Часть культур клеток селезенки и костного козга неиммуншх доноров Еырзщизали в присутствии фитогемагглютиниьа /СГА, 30 мкг на мл/, конканавш/ша А Дон А, 4 мкг на мл/ или облученных 1,5 Gy аллогенкых селезеночных клеток /1-5x10^ клеток на мл/. Кон- ■ дкциоаироЕанную сред/ из ^льтур клеток селезенки ьаалей, сга,--/-лировгнных кн витро £ГА, Кон А. или из однонаправленной культуры емзаенных лимфоцитов селезенки /КССЛ/ пенгрнфугировазд 15 минут при 1300 G, стерилизовали фильтрацией через мпллыюрный фильтр НА и добавляли в *ульяуры клеток костного козга и селезенки ъ количестве 25-40Х ст общего объема гу^ьтураяъкой среды.

ЦпкдофосфамИда.

Циклсфоефамид в дозах £00 мг на кг и 275 ьг на кг рводили мылам внутр;;брю!Линно £ 0,2 мл дистиллированной воды.

OfíSidQ-ка .клетс-чгелс суспензий специфическими здтискзссс'т-

шт. Hiy-I и Р4/60.

Клеточные суспензии селезенки мыв ей инкубировались в течение одного saca при 57°С с янтиоувороткаи к ангигшам Thy-I или

Р4/80 /получена, соответственно, из Всесоюзного онкологического дентра, Москва и Института патологии Оксфордского университета, Великобритания/ в присутств!ж комплемента с последующей 3-х кратной отмывкой клеточных взвесей средой, Анти Тьу-! сыворотка использовалась в разведении 1:200, анти Р4/В0 сыворотка -з разведении 1:250 и 1:500. Разведение комплемента /сыворотка :фови морских свинок/ составляло 1:10. Ростовые факторы.

В работе использовались следующие ростовые факторы: [. Рекомб;шантный ТК5- с< человека /получен из института молеку-1ярной биологии Российской АН/, . Рскомбкнентиый 11Л.--3 мышей /Gen7.irp.fi /, 5. Очищенный ИЛ-1 мышей /йепиате /.

Ростовые факторы добавляли в полные и адгезичные культуры «ервично эксплантированного костного мозга мьпей, а также в культуры пассстшх фибрсбластоз костного мозга роликов я костного гсзга и коки человека через 1-54 часа после эксплантации клеточ-их взвесей на все время культивирования. Статистическая обработка результатов.

Разброс данных, представленных в графиках и таблицах, о"арак-'еризован с помощью стандартной ошибки средних величин /М +т/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОЕСУШДЕККЕ

I. Динамика изменения численности стромальных клоногачкых ¡слеток в кроветворных и лимфояднкх органах при действии факторов, выводящих из равновесия кроветворную и лнмфоид--ну» систему.

Поскольку стрсмальнке клетки, обеспечивающий гемогюэтическсе иммунологическое ми кр о о крук ени е, на территории кроветворных и имфеидных органов находятся вместе с гемопоэтическими и ликфоид-ыки .клетками и могут, по-видимому, испытывать регуляторше вли-кия со стороны последних, представлялось интересным выяснить, как менно ведут себя стрсмалькые клетки б условиях, когда насушает-я состояние равновесия кроветворной я лимфоидкой тканч. В связи этим, в данной работе была сделана попытка изучить д.-^амизеу ре-

генерации стромальшх клоногенных клеток /КОК-Ф/ после тотального облучения кивотных 1,5 Gy и введения цкклофосфамида. а также в ситуациях, когда происходит усиленная пролиферация антиген-реактивных клеток, то есть при иммунном ответе. •

Оказалось, что хотя непосредственно после тотального облучения мышей 1,5 Gy погибает около 40$ КОК-2, начиная со второго дня после облучения кх число продолжает падать и, к 6 дню составляет лиаь 9,3% от нормы. Затем, содержание KQK-5 в бедренных костях постепенно восстанавливается, приближаясь к 25 дна к нор. мальному урозню, но ке превышая его /граф. I/. Интересно, что б течение первых суток после облучения число KGK-S? изменяется не однонапразленно,-Как вирдо из-графика 1, через 6 чассз после облучения отмечается побьем вдела KQK-Ф примерно в 2 раза /от Ъ8% сразу после облучения до ПА% через 6 часов после облучения/. В конце первых суток число НОК-3 еновь скисается до уровня, соот ветствуыцего их содержанию сразу после облучения. Динамика изменения SKQ-5 в костном мозге облученных мыкей имеет, в обцем, сходаый характер.

1Мафик I,.Изменение содержания KDK-Ф в костном моаге бедра ышюй после облучения животных 1,5 Gy.

10й У

ю-

"7'/У/ . // ••/// jll1' till*— ~'/7tr//

\

\

оГ

4 &

TlTjZ 45"

час.

По оси абсцисс - срок после облучения /сутки/

По оси ординат - содерг&иие rDK-'S в костном коя?е бедра облу-

чеиаас мызей ко ер&пнеыл с н«soo'jij'"¿rer-tiзалк животными /%/

- отклонегш: Bar.ii-'.-ii; нор:к

Эксплантация JCl&iOK КОФШОГС мозге сблучкзшх кивоаних поо-

лзЕОднлась в присутствии стандартного фидера. Кроме того, было юказано, что фидерные свойства самого костного мозга облученных ■1ьшсй не изменены сколько-нибудь значительно по .сравнешш с фи-' :;ер!шми свойствами нормального костного мозга. Действительно, ЭКО-5 в смененных культурах костного мозга нормальных и облученных ¡ясней оказалась 'аддитивной 5К0-5 каждого компонента сме-:и. Отсюда следует, что подавление колониеобразования при эксплантации костного мозга облученных мышей объясняется снижением з нем количества клеток-предиествешиксп для колоний фиброблас-гоз.

Как было ранее, показано с помощью хромосомных и антигенных «аркероз /Фриденштейн А.Я., Ьуралесова А.И., ГС71/, стромзльные ■слетки, к которым относятся КОК-Э, принадлежат к клеточным лиги ям , гистогенетически независимым от стволоеых кроветворных слеток. Однако, кз приведенных выше данных видно, что динамика •вменения числа КОК-Ф в костном мозге облучгшшх мазей почти совпадает с динамикой изменения ччслашостп стволовых ¡¡розетвор-¡ых клеток в костном мозге после облучения 1,5 Су /Ьа,№.а ь.й., еЬоИеМй., 1959/. Возникэет предположение, что постргдкэд.сн--регенерация стромашшх нлеток-предшествегаиков и стволоеых фовотзорных клеток происходит взаимосвязанно, Возмогло, что пролетающееся падение числа КОК-Ф через несколько дней после облу-;ения может происходить вследствие расхода части стромальнкх кле-т-предшествешиков на образование дифферишпровг^лгого пстомст-¡а зрелых стрсмалькых элементов /как это происходит в случае итво-;ош>: кроветворных клеток/, нужных для формирования нового ми?ро-ифу.хския для пролиферации кроветворных клеток, или для создания !.чаццарма, необходимого при усиленном размножении их-пстсмхоз на ■ерритории кроветворного органа.

Как известно, стрсиальныо ялоногенкые клетки относягся к ка-егйрии клеток, медленно пролифорпрущих в организме /¿риденштейи ,.Л., 1974/. Тем не- менее, оказалось, что циклофосфамид в доз« СО и 275 мг на кг оказывает весьмд существишое влияние на стро-алькуэ ткань. Этот факт, гю-видимпму, объясняется «еем, что ци-яофосфяпзд представляет из себя алкалирумщее соединение ■- он яоссбен поврзвдать «легочную ДИК вне зависимости от того, з ка-:ой стадии жизненного цикла находятся клетки, хотя бистро г.роли-

ферирующие клеточные популяции и более чувствительны к действию этого агента / Бе \Уус 'д.ъ. ей ¿1. , 1970/. Из приведенных данных /графики 1,2/ видно, что поведение строгальных клеток после введения циклофосфамида в дозах 200 и 275 мг на кг очень похоже на их поведение после облучения животных 1,5 Оу. В частности, своебраз-ной особенностью изменения численности КОК-Ф после одно!фатнсго введения циклофосфамида, как и после однократного облучения небольшими дозами является то, что в течение первых суток эти изменения не однонаправленны, а именно, через несколько часов отмечается увеличение количества КОК-Ф в несколько раз по сравнению с их числом, остающимся непосредственно после приложенного воздействия. Затем число КОК-Ф начинает падать, достигая минимума через несколько суток, и только после этого вторичного запада содержание стромальных клоногеннкх клеток в костном мозге начинает расти. Ранний подъем числа КОК-55 после введения циклофосфамида /также, как и после облучения/, очевидно, не может происходить только за счет пролифе-' рации етих клеток. Возможно, здесь имеет место репопуляция КОК-Ф из других органов, либо дополнительное ре^футирование 1ГК-® за счет приобретения кол он е образующих свойств теми клетками, которые до этого момента такими свойствами не обладали, либо репаративное восстановление поврежденных КОК-Ф.

График 2. Изменение содержания КОК-Ф в Кистном мозге мышей после введения циклофосфамида в дозе 200 мг на кг

По оси ординат - содержание К011-Ф в кос.тним мозге бедра обработанных циклофосфамидом ¡.'¿тей не сравнению с интактными мышами*/%/

УУ/УХ - отклонение ъеличкн нормы

Из полученных данных следует, что введение циклофосфамида оказывает значительное ингибирующее влияние на стромальные клетки, хотя регенерация пула КОК-5 наступает сравнительно быстро, если доза циклофосфамида не слишком велика /84% на 9 день при дозе 200 иг на кг/. Таким образом, циклофосфамид, как' по отношению к стьоловым кроветворным клеткам / de Wys ví.d. et; al. , 1970/, так и по отношению к КОК-5, обладает, по-видимому, более щадящим действием, чем низкие дозы облучения. Действительно, регенерация КОК-5 после введения 200 мг на кг циклофосфамида идет быстрее, чем после облучения даке такой небольшой дозой, как 1,5 Gу.

Значительные изменения в стромальной ткани происходят и при ^ иммунном ответе. Оказалось, что после введения антигена /дифтерийного анатоксина/ под коку пятки лезой задней конечности морских свинок содержание К0К-Ф в подколенных лимфатических узлах резко возрастает. В регионарном узле оно достигает 34 единиц утке через сутки после иммунизации /тогда как у нормальных морских свинок число этих клеток в подколенном лимфоузле составляет в среднем 0,25/, держится на этом уровне до 7 дня, а затем падает, но даке через 28 суток составляет 7 единиц. В контррегионарн'м узле также происходит увеличение числа К0К-&, но оно наступает позже и выражено менее резко, так как основное количество анти. гена при иммунизации под коку пятки концентрируется в регионарном узле. Такая кинетика изменения числа К0К-5, по-видимому, связана с возросшей потребностью в стромальной ткани, необходимой для формирования ноггйх структур /в частности, вторичных фолликулов/ на территории лимфоузла.

Интересно было выяснить, как меняется численность ЮК-Ф при повторном введении антигена. При этом, целесообразно было индуцировать вторичный иммунологический ответ дозой антигена, которая не вызывала бы или вызывала бы слабый подъем содержания KQK-Ф в лимфатических узлах при первичном введении. Выяснилось, что введение овальбумша, начиная с дозы 50 миг на кг, повышает содержание ItOK-JS в регионарных лимфатических узлах сравнительно умеренно. Действительно, через сутки после иммунизации о., -льбуми-ном морских свинок в дозе 50 мкг на кг содержание HDKJ5 в отих

органах составляет в среднем 40 единиц, в дозе 30 «кг на кг -29, а е дозе 25 мкг на кг - б через сутки после введения антигена и 47 - через трое суток. '

Повторное введение овальбумина под коку пятки левой задней конечности в дозах от 50 до 25 мкг на кг было сделано морским свинкам через 2 месяца после внутрибршиккого введзния 200 мкг на кг этого ке антигача. Оказалось, что при повторном введении выбранных доз антигена подъем числа КОК-5 в регионарных лимфоузлах значительно превышает увеличение их числа при однократном введении той же дозы антигена /в 3-4 раза при дозис 30 и 50 мкг на кг и почти в 10 раз при дозе 25 мкг на кг через сутки после введения антигена, а через трое суток - з 2,5 раза/.

Повторная доза в 30 мкг на кг вызывала значительный подъем содержания ШК-Ф и в контррзгкшарных узлах /в 4,5 раза/ по сравнении с соответствующей контрольной группой. Через трое суток после повторного введения-овальбумина наблюдается дальнейший подъем содержания КОК-О в лимфоузлах /в регионарных а среднем в 1,8 раза, а хз контррегионарных ~ в 8,5 раз/, по сравнению с содержанием КОК-Й в соответствусдрос лимфоузлах через сутки после повторного введения той же дозы антигена /табл. I/.

Таблица I. Содержание КОК-й в подколенных лимфатических узлах морских свинок после повторного введения овальбумина.

Доза овальбумина /Mia? на кг/ Срок после иммунизации /сутки/ Положение Количе-димфоузла ство клеток Ж 3K0-S . /хМ"5/ Содержание КОК-S в лимфоузле

50 1 X лезий правый 9,80 5,50 1,27 0,00 124 0

30 . I леный правый 5,60 1,45 1.75 3.76 98 54

т л левый правый 7,60 2,00 1,60 2,30 , 122 46

25 I левый правый 5,40 1,50 1,20 0,08 65 I

3 лезый ппавый 11,40 1,30 1,00 1,00 114 13

3 левьй правый 6,50 1,30 1,65 0.30 120 л

Из полученных данных нельзя заключить, что стрсмальные клетки лимфоузлов-распознают антиген и сохраняют иммунологическую память. Реакция стромальной ткани может являться результатом воздействия на нее кммунологически компетентных клеток, распознающих антиген и выделяющих соответствующие факторы, влияющие на состояг!ие стромы. Реакция стромальных предшественников может быть связана с обеспечиванием специфического микроокружения для пролиферации и дифференцирован лимфоидных клеток. Как известно, в ходе повторного образования антител интенсивность пролиферативных реакций а лимфеидной ткани резко возрастает по'сравнению с ентитолообразованием по первич-. нояог типу. То, что при повтор;!ом введении антигена число КОК-0 также возрастает сильнее, чем при первичном введении, хоро-ео согласуется с предполоаением об участии стромальных клеток в создании плацдармов для пролиферации и дп.ффсрекЦ1*ропки им-кунокомпетентных клеток. Но исключено, в прочим, что увеличение содержания К0К-Ф в лгмфоузлах после 1ао,<унизац!ш связано с болео тон газ мехгцшзмани регулировки 12здунопоэза. Характерно, что добавление овальбумина з дозах от 3 до 3000 мкг на. мл среда в цультурт сеясзенок свшок практически не влияют на эффективность колениеобразованил независимо от дозы антигена з среде. Полученный результат метет указывать на то, что стро-нальные клетки-предпественники вряд ли прямо реагирует на присутствие антигена и что механизм, вызывающий увеличение содержания КОК-Ф, гораздо более сложен и не реализуется в моно-слсйных культурах ин витро. •

В целом, из иплот.енных п этой главе данных следует, что все рассмотренные воздействия, выводящие из равновесия кроветворную и лимфоиднуа ткань и сопровождающиеся усиленной пролиферацией гемопоэтичсских и лимфоидных клеток, приводят к резким сдвигам и в популяции стрсмачьных клоногенных клеток. Полученные результаты позволяют предположить, что ответ гемопоэти-ческих, лимфеидных и страдальных клеток на возмущающие воздействия мохст происходить.'взаимосвязанно. Вопрос о том, насколько пирока эта взаимосвязь и каковы ее клеточше и гуморальные основы может быть гыяснсп з дальнейшем исследовании.

2. Влияние клеток кроветворных и лимфоидных органов

на рост стромаиьных клоногешшх клеток ин витро.

В этом разделе работы изучался эффект воздействия кроветворных и лимфоидных клеток на рост стромалъных клсноганных клеток-предшественникоз в культурах костномозговых клеток разных видов животных, а именно, морских свинок и кроликов. Взвеси клеток костного мозга при постановке этих опытов готовили двумя способами - либо с помощьп шприца /механическая дезагрегация/, либо с помощью трипсина.

Ранее было показано, что в культурах клеток костного мозга мышей и морских свинок, приготовленных с помощью трипсина, 3 КО-С примерно ъ 10 раз выше, чем в суспензиях, приготовленных путем механической дезагрегации и это связано с тем, что при трипсикизации высвобождается существенно большее количество ЮК-Ф, чем при механической дезагрегации костномозговых клеток /Лациник Н.В. и др., 1981/. Это подтвердилось и в настоящем исследовании. Действительно, максимальная ЭКО-Ф для костного мозга морских свинок составила для механически дезагрегированных взвесей 2,0 + 0,2x10для трипсиниэировааных - 28 - 8 х10~^, Б то ке время, для костного мозга кроликов максимальная Э1Ю-Ф как.для механически дезагрегированных, так к для трипси-низировачных суспензий была практически одинакова /соответственно, 1,1 + 0,5 и 1,8 + 0,2 хЮ"4/. Причина этого обстоятельства на ясна.

Выяснилось, что при увеличении плотности эксплантации костного мозга морских свинск от 0,02x10^ до 500x10'^ клеток на кв. см. /граф. 3/ /все равно за счет штакишх или облученных костномозговых клеток и независимо от способа приготовления клеточной взвеси /трипсином или шприцем,', как ЭН)-$, так и размер образующихся колоний значительно возрастают, причем тем больше, чем Еыше была плотность костномозговых клеток морских свинок. Наоборот - в >ультурах клеток костного мозга кроликов /граф. 4/ при увеличении эксплантационяой плотности /как за счет интактных, так и за счет облученных клеток/, происходит доэозависимое снижение ЭКО-Ф вплоть до полной ингибиции коло-

График 3. Эффективность колониосбразоБ&ния костного мозга морсгах свинок в присутствии облученных костномозговых клеток морских свинок.

График '4. Эффективность колониесбразования костного мозга кроликов в присутствии облученных костномозговых ¡теток кроликов.

.. ..

По ос!' абсцисс - плотность эксплантации костномозго. к ¡слеток на см

Но оси ординат - средняя 8К0-3, выраженная в % по стнонению к максимальной ЭКО-З каждого опита, которая принята за 100 %.

Клеточке взвеси приготовлены с пемоаьэ шптзша /I/ или с пелояь» трипсина /2/

Плотность эксплантации достигается, за счет кнтактных /непрерывная линия/ или за счет ¡штактнш: и облученных клеток /пунктирная линия/.

необразования при суммарной плотности интактных и облученных клеток порядка 50x10^ клеток на кв. см., независимо от способа получения клеточных взвесей /трипсин, шприц/. Параллельно с уменьшением величины ЭК0-3 уменьшается и размер колоний фибро-бластов.

Для пснимания природы действия облученного фидера представлялось интересгшм сравнить, как влияют на рост КОК-Ф кроветворные и лимфоидные клетки, взятые из разных органов. Выяснилось, что присутствие облученных клеток костного мозга кроликов в кухъ-турах костного мозга морских свинок не меняет их ЭКО-Ф. Наоборот - присутствие облученных клеток костного мозга морских свинок в культурах костного мозга кроликов подавляет ЭШ-Ф последних почти на Облученные клетки лимфоузлов, тимуса и лейкоциты периферической крови кроликов и морских свинок вызывали до» зозависимую ингибицию образования ШК-й 'колоний. Эта ингибиция проявлялась при добавлении аутологических клеток кролика и аллс-геншх фидерных клеток морских свинок, однако, в культурах костного мозга морских езинок она была выражена заметно слабее, нежели в соответствующих культурах костного мозга кроликов. Примерно тот же эффект вызывали ксеногенкые облученные клетки.

•Облученные клетки селезенки оказывали отчетливо различное действие на КОК-Ф кроликов и морских свинок /табл. 2/. Из таблицы видно, что одни и те же фидерные клетки /клетки селезенки кроликов/ резко ингибируат колснкеобразование в культурах костного мозга кроликов и, в меньшей степени, в культурах костного мозга морских свинок. Соответственно, фидерные клетки селезенка морских свинок стимулируют кслонкеобразование в культура:! костного мозга морских свинок /в 2,7 разе/ и подавляет его /на 90/5/ в культурах костного мозга кроликов. Таким образом, ЖЖ-Ф 1фо-ликов были более чувствительны, чем КОК-Ф морских овшок к инги» бирующему действию как клеток селезенки, так и о его к других кроветворных и ликфоиднах органов. Именно эта высокая чувствительность костномозговых КОК-Ф роликов к ингибирувщим воздействиям могла явиться причиной того, что при повышении концентрации самих костномозговых клеток кролика в 1ультурах эффективность образования; КЖ-Ф колоиий падала.

Таблица 2. Действие облученных клеток селезенки на эффек-, тизность клонирования в культурах клеток костного мозга роликов и морских свинок.

Интактные клетки-"мишени" Облученные клети ЭКО-З /в % от контроля/

костный мозг ролика - 100

и и селезенка кролика 0

л ii селезенка морских 10

сеинок

100 40

270

-л——

Примечание. Облученные клетки селезенки добавляли по 1-2x10 клеток на культуру.

ЭКО-Ф в культурах клеток костного мозга без добавления клеток селезенки принимали за 100%.

Как было ранее показано, ответственны!.® за колониесткмулк-рующее действие костномозговых клеток являются тромбоциты и ме-гакариоциты /Фриденштейн А.Я., 1990/. Для того, чтобы проверить, стимулируют ли тромбоциты ЭК0-Ф в культурах костного мозга роликов, их использовали вместо полной популяции фидерных костномозговых клеток. В таблице 3 представлены результаты опытов, з которых в культуры костномозговых клеток кролика добавляли фидерные костномозговые, клетки, тромбоциты, либо смесь тех и других. Из таблицы видно, что при добавлении фидерных костномозговых клеток ЭЖ)-Ф падасг, добавление костномозговых клеток совместно с тромбоцитами несколько снижает ЭКО-5, в то врамя, как'добавление только тромбоцитов без фидерных костномозговых клеток существенно /в 7 раз/ увеличивает ЭКО-5. Можно, в этой связи предполагать, что эффективность образования К0К-Ф колоний в культурах костномозговых клеток зависит от суммарн э воздействия на КЭК-Ф ингибиторов, которые находятся среди клеток костного мозга и стимуляторов колониеобразовгния, которыми явля-отся тромбоциты и мегакарноциты.

костный мозг морских свинок

И II

II II

селезенка кролика

селезенка морских „свинок

Таблица 3. Эффективность колониеобразсвания в культурах клеток костного мозга кроликов в присутствии облученных тромбоцитов крови 1и облученных костномозговых клеток кроликов.

Количество облученных клеток костного мозга /хЮ5/ Количество тромбоцитов /х108/ ЭКО-Ф интактнкх клеток костного мозга /:с10-у

- - 0,3 + 0,1

2 - 0

2 3 0,1 + 0,0 .

2 " б 0,1 ч- 0,0

- 3-6 0,6 + 0,2

- 12-18 2,0 + 0,4

- 30 1,8 + 0,1

Примечание. Клетки костного мозга эксплантироЕались по 1-3x10 на культуру. Кровь к костный мозг брали у одного и того ке донора. Облученные костномозговые клетки добавляли по 1-1,5х10\на культуру.

Тагом образом, в целом, полученные в этих опытах результаты, показывает, что костномозговые клетки, сопутствующие КОК-Ф в культурах костного мозга, могут оказывать разнонаправленное влияние на ЭКО-Ф, то есть среди них присутствуют и ингибиторы, и стимуляторы образования КОК-5 колоний.

Необходимо отметить, что поскольку щгибируащео действие клеток лимфатических узлов на костномозговые КОК-З происходит в системе, где присутствуют только аутологичные клетки, то его нельзя объяснить обычной реакцией клеток на трансплантационные антигены. Что касается ингибицик роста КОК-55 костного мозга кроликов, осуществляемой ксеногенньши для них клеткам;:, то, учита-вая, что эта шгибиция производится тяжело облученными /60 5у/ клеткают и требует тех ке количеств клетск и культуральных условий, чхо и шгибиция в аутслогической системе, то предположение о том', что в основе этих эффектов ленаг разные механизмы, выглядит маловероятном. Опыты с иепользокзнием специфических антисывороток, проделанные в культурах, где ¡итксдодил роста хост-

номозговых КОК-5 кроликов осуществлялась ксеногенными для них . клетками / а именно, облученными клетками селезенки мшей/, показали, что Т-метки, по-видимому, не принимает существенного участия в ингибиции стромального кслониеобразовония. В самом деле, если обработать клетки селезенки мышей ентчсывороткой к Тьу-1 антигену с комплементом, эффект ингибиции полностью сохраняется. Если же из суспензий клеток селезенки удалить адгезивные клетки или обработкой соответствующей сывороткой с комплементом убрать клетки с маркером Р4/60, их ингибируюцая активность в значительной степени отменяется /табл. 4/. .

Таблица 4. Колониеобразование в культурах костного мозга кроликов в присутствии клеток селезенки мышей • СБА, обработанных ин витро зятисывсротками к антигенам 1Ьу-1 или £4/60 с комплементом.

Еид аптисыво- № Вид обработки кле-ротки опыта ток селезенки СВА

Число колоний ЗКЭ-З костного мезга кро-лИхсв/^о-4/

Анти Тьу-1

1,2

кктаэтные клетки

комплемент

анти ТЬу-1 + комплемент

25,26,31,32 2,8+0,2

0,1,4,7 1,1,6,6

1,1,3,5

С,4цО,2 0,4+0,2

0,3+0,1

Анти Р4/80

интактнке клетки

комплемент

анти 54/80 + комплемент

26.28 2,3 4,9

12,20

интактныо клетки

комплемент

анти Р4/о0 + комплемент

134,138 2,10 10,14

10?, ПО

2,7+0,1 0,2+0,1 0,6+0,2

1,6+0,4

6,8+0,1 о,з+о,г 0.6+0,1

Примечание. Разведение антискворогокг опыт 1,2 - 1:200, опыт.'.З -1:509, опит 4 - 1:250.

Таким образом, ингибирующее действие клеток кроветворных и лимфоидных органов, направленное на KQK-Ф, очевидно, связано с активностью макрофагов. ,

Результаты опытов, в которых костномозговые клетки-"мише-ни" были отделены от ингибирувщих клеток лимфатических узлов кролика миллипорным фильтром, свидетельствуют о том, что активность ингибирующей популяции в значительной степени /на 755ь/ обусловлена проходящим через миллилорный фильтр растворимым фактор on! /или факторами/.

Выяснилось, что для проявления эффекта ингибиции роста КОК-Ф клетками лимфатических узлов кроликов и селезенки мышей в культурах необходимо присутствие эмбриональной телячьей сыворотки /ЗТС/ все равно инактивированнсй или неинактиЕирован-кой. Напротив - присутствие в культурах как аутологичкой для . реагирующих клеток сыворотки /кроличей/, так к сывороток взрослых животных ряда других видов, чьих клеток е реагирующей системе нет /сыворотки мышей, крыс/, резко снижает или полностью отменяет ингибицио роста KDK-Ф как клетками аутологичных лимфатических узлов, так и ксеногенными клетками селезенки мышей, если кнгибирулщих клеток в культуре не слишком много. Таким образом, ингибирующее действие клеток кроветворных и лимфоидных органов в отношении роста КОК-Ф может, по-видимому, регулироваться сывороточными факторами. С чем связано то обстоятельство, что ингибируюцее дейсто^с- клеток лимфоидных органов проявляется только в присутстЕ^»- yiC, остается неясным. Подобный эффект был описан и для другие случаев ингибиции клеточной пролиферации в культурах при добавлении лимфоцитов / Golub S.H., 1979/.

Интересно, что кондиционированная среда от краткосрочных /2-х часовых/ культур костного мозга мышей содерлит ингибитор пролиферации стволовых кроветворных клеток / v/right E.G., Lorimore S.A.- , 1987/. Удалось выяснить, что источником этой ингябирумцей активности являются адгезивные радиорезистентные клетки о фенотипом макрофагов /fhy-1,2", F4/80"1'/. При этом, оказалось, что макрсфаги, полученные ио долго;кизуи',их костномозговых культур или от соотвсгсгеуоз?« клс.ток-япедаестаснников и культурах на основе к^гид-целлядоси, сиосббш; редуцировать

как ростстимулирующую, так и ростингибирующую активность в отношении стволовых кроветворных клеток. Таким образом, макрофаги, по-видимому, могут быть велным и^чниг.ом воздействий, регулирующих пролиферацию как стромалкшх клоногекных, так и стволовых кроветворных клеток ин витро.

■ 3. Влияние облученных костномозговых клеток и тромбоцитов крови кроликов на рост культуральных потомков стромальных клоногекных клеток костного мозга морских свинок и роликов ин витро.

Как известно, при пассировании KDK-5 костного мозга морских свинок и роликов дают длительно поддерживающиеся штаммы диплоидных костномозговых фибробластов. Чувствительность фибро-бластов пассажных культур 'к ростстимулирующему действга костномозговых клеток у морских' свинок проверяли, сравнивая, как облученные костномозговые клетки влияют на пролиферацию пассажных фибробластов из культур, либо "заторможенных" /то есть длительно растущих без смены среды и пассируемых только после достижения конфлюентности/, либо "стимулированных" /то есть рзс-тущих с регулярной сменой среды и пассируемых до достижения состояния конфлюентности//Pledger- W.H., et.al, 1977/. Оказалось,

что действие облученных костномозговых клеток на размножение клеток пассажных штаммов костномозговых фибробластов морских сеи-нок зависит от состояния штамма в момент пассирования. Если большинство клеток находится в состоянии покоя, то есть"выведено из пролиферативкого цикла, то добавлаше облученных костномозговых клеток оказывает выраженное сгимулируншее влияние на пролиферацию пассированных фибробластов. Если же клетки птамма находятся в состоянии пролиферации, то добавление облученного фидера после их пассирования либо практически не оказываем никакого действия, либо вызывает некоторую ннгибицив роста фибробластов в культурах ./табл. 4,5/.

Зависимость пролиферации КОК-Ф и их :;ультуральных потомков от дополнительных ростстпмулирующих'гоздейстгий, потмо тех, которые обеспечиваются лрпсутстгием в культуральной ередо высоких концентраций эмбриональной сыворотки /20^/ отличает их от других -типов фибрсбластОЕ, растущих в 1сультурах. Действительно,

известно, что для диплоидных культуральных штаммов фиброблас- , тов различного происхождения ростстимулирущих факторов, содержащихся в среде с высокой концентрацией эмбриональной сыворо-, тки /20%/ оказывается достаточно для масимальной пролиферации. Поэтому, ростстимулирующее действие костномозговых клеток на К0К-5 свидетельствует о том, что костномозговые КОК-Ф могут иметь необычную по сравнении с другими фибрсбластами потребность в ростстимулирующих воздействиях. Как уке было сказано, К0К-2 костного мезга находятся в организме в фазе /Фриден--штейн к.Я. и др4, 1974/. Очевидно, что кале КОК-Ф, выделенные из организма, так и пассажные костномозговые фибробластк, выведенные из клеточного цикла /"культуралышй" Ог^/, нундшотся для вступления в период в более высоких концентрациях ростовых факторов по сравнению со стимулированными пассатными фи-бробластамн, находящимися в пролиферативном пуле.

Что касается кроликов, то у них пролиферация пассатных костномозговых фибробластов независимо от состояния шта\ма ь момент пассирования подавляется облученными клетками фидера /примерно в 5 раз/, ко резко /в 6-12 раз/ усиливается в присутствии облученных тромбоцитов. Таким образом, создается впечатление, что у культураяьикх потомков КОК-® костного у. о зга кроли-хов, как и у первично выделешгпх КОК-Ф етих кивотных, повышена чувствительность.к ристшгибиружщому слиянии фидерных кле«ак и, поэтов, при одновременном действии рос'гск:«уаируп1й£х и ростин-гибкрувцих факторов, они сильнее отзечшп на последние. Чем определяется эта повышенная чуестеихсльность к ингибирую^м воздействия!«, на сегоднгамий день остается неясным.

Таблица 4. Рост фибробластов из "заторможенных" штаммов костного мозга морских свинок.

№ опыта Число зкеп- ланткрованных фибробластов Наличие облученных клеток костного мозга Количество фпброблае-ч-оа в куль- тУРе/хЮ3/ ЧИСЛО колоний &1-броблас-тов

I 150 150 + А'7) 1,1 19,21 0,01 0,14

2 150 - к>2> - 5,II 0,07

150 - + 95,131 0,75

3 150 - 0,15 0,0 0,4 0,01

150 + 17 0,12

- -

Таблица 5. Рост фибробластов из "смодулированных" штаммов костного мозга морских свинок.

ь опыта Число эксп- Наличие об-лантированшх лученных кле-фибрсбластсв ток костного мозга Количество Число ко-фибробластов лений в культуре фибробла- /х103/ стов эко-а

I 200 - 13 + 3 32,33,46 0,19 .

200 + 15 + 3 39,43,44 0,21

л А. 150 — 2,6 + 0,1 3,5 0,03

150 + 3,5 + 0,5 ■ 4,7 0,04

з . 200 — 77,83,83 0,40

200 + . 63,91 0,34.

4 150 - А/3 25,30,35 0,20

150 + 10,16,22 0,П

7

1рш1ечзние. Облученные костномозговые клетки добавляли по 10 на матрац, ¡культуры фиксировали через б - 8 дней.

4. Действие факторрз, продуцируемых активированными макрофагами и .лимфоцитами, на рост етршзльных клопогонных клеток кн витро.

В этом разделе работы ш изучали действие присутствия ми-югенов /Кон А, ЗГА/ в культурах костного,мозга и селезенки, i танке действие ряда факторов, вырабатываемых аэтивирован-шми макрофагами и лимфоцитами /ТН2 -<л, ИЛ-Х, ИЛ-3/ на пролиферации стромальных клокогенных клеток и их культуральных ютомков rai витро.

Что касается действия митогенов на стромзльнне клетки, тс, сак оказалось, их добавление резко /на 93&/ снижало ЭК0-"$ в ¡ультурах салэзенш, но оказывало значительно меньшее влияние ia ЭКО-Ф э культурах костного мозга мшпеЯ. ЭИО-Ö в культурах слеток селезенки шлей СБА такса существенно /на 503/ уменьшись в присутствии облученных клеток аллогенной селезенки !g?BI/6. При этом, добавление кондшдаонированной среда от кле-•ок селезенки, стимулированных ин витро Кон А, СГА или в одно-1аправленной культуре смененных л1й.;фоцнтов /табл. 6/ подавляло

Таблица 6. Влияние добавления кондиционированной среды от •лимфоцитов, стимулированных ин витро митогена-ми, на ЭКЬ-4 в культурах клеток селезенки и костного мозга мышей С8А.

Источник клеток-"мишеаей" для. действия КССЛ Митоген Время стимуляции лим<1юцитов /сутки/ Подавлени ЭК0-® По!

Костный мозг Кон А 3 72,0 + 7,1

Кон А 9 100

Селезенка Кон А 3 96,0 + о,;

ФГА I 0

&ГА 3 74,0 + 3,(

Селезенка аллогенные клетки селезенки Сд^В 1/6 I 0 •

и в з 69,0 ± 6,С

Примечание. Иондицкснированную среду /КССЛ/ добавляли в количество 25-40% от объема культуральной среда на все время культивирования.

ЭКО-Ф в культурах как селезенки, так и костного мозга, причем, ингибирующая активность появлялась в кондиционированной среде /КССЛ/ на третьи сутки от качала стимуляции. Эти донные хорошо согласуются с прежними результатами, согласно которым ингиби-рующ'.й эффект в отношении КОК-Ф вызывают и штигеш при добавлении их в культуры специфически сенсибилизированных лимфоид-ных клеток /Лурия Е.А., 1972/,- и чтс при этом в культуральной среде накапливается- гуморальный ингибирукший фактор.

В сяязи с изложенным возникает вопрос о том, каков же механизм икгабиции роста КЗК-Т -идиционировишой средой от стимулированных ыитогеиами лимфоцитов. Если бы в основе действия КССЛ на КОМ лежал цитотоксичсский оффект, то ЭКО-Ф культур после их отмывания от КССЛ и дальнейшего культивирования на оби-

той среде не повышалась бы, так itaic колониеобразующие кле-•ки были бы убиты. Мезду тем, ЭЮ-Ф в тагах культурах с;уще-¡твенно повышается, достигая уровня, !не сильно отличающего-¡я от контрольного через 10—II дней, считая день отмены КССЛ ;ервьм днем культивирования. Из этих' данных следует, "О-би-.имочу, что в основе кнгибиции роста K0K-S з мснослойных ультурах костного мозга мышей под действием КССЛ лекит, гла-ihkm образом, подавление пролиферации этих клеток, причем ito подавление является обратимым: после отмывания 1;ультуры it КССЛ и замены среды на обычную блок пролиферации КОК-Ф ;нимается и они дают начало росту колоний фибрсбластов.

Выяснилось, что облучение 10 Gy предотвращает выработку летками селезенки активности, подавляющей рост КОК-О ии Еитро. !сли с помощью обработки глтисывороткой к антигену Tfcy-I с :о;отлементом убрать из суспензий селезенки Т - лимфоциты, то :а:: глгнбиция ее собственных К01ЫЗ в присутствии митогенов, ак и ингибиция роста костномозговых KQK-0 з присутствии кон-.кциспированнсй среда от таких культур отменяется. Полученше ;аннке согласуются с дангкми о том, что добавление кондицио::и-»овшшой среды от культур лимфоцитов человека, стимулированных н зитро митогена-'л и антигена1«, меняет морфологиа культур че -ювеческого костного мозга таким образом, что вместо преимущз-iTBSKHcro роста фкбробластов наблюдается рост макрсфзгоЕ, при-isj, источником действующего фактора в кокдицненироганион ерз-;е является Т~лю.:фо1гиты, которые для его выработга," по-види-:о:сг, должга быть аетиЕОТСвакы /cordon M.Y. at.&l. , ISS2/.

Надо отметить, что, как видно из излехенгсв: деякых, ссбы-ия, происходящие в популяции клоток лимфоидной ткани при акти-¡еции антигенами и ми-гогенти, отрагеттся на состоянии стромсль-:ой ткани сущгетвенно различным образом: при активации антигена ин вивс происходит уг-еличские численности стромалы;ых кле-■ок-предшествснников, а при агмивзций ик 2-;тро ¡дагог-еяами и ан~ игенами происходит ингибиция стромалькых коленкеобразу^гх кле-•ои. Эта ингибиция опосредуется гуморальным фактором, вцр&бьт*-■аемым, по-видимочу, активировикыми лимфоцитами. Пр:-плша этих :глуг?ясся разнонаправленными з^фекгоя требует дальнейшего изу-¡ения н, возможно, связана с различней сту.у;стурнсй организацией .¡■'мфеидных глето:; в организмо к в культуру.

Как уже было сказано, образование стромальных КОК-Ф колоний осуществляется при наличии в среде роцр / ШтеЛа. J- et. ах. , 1965/ и пока не идентифицированного ростового фактора, отсутствующего в сыворотке и вырабатываемого мегакариоцита-ми и тромбоцитами /йриденштейн А.Я., 1990/. Действительно, образование КОК-Ф колоний в культурах адгезивных костномозговых клеток /А-культурах/, то есть освобожденных от неприкре-пившихся клеток костного мозга, требует добавления облученных /фидерных/ костномозговых клеток или тромбоцитов /у мьшей. /Лациник Н.В. и др., 1990/ и морских свинок/, или только тромбоцитов /у кроликов/. В этой связи анализ вопроса о чувствительности КОК-Ф к ростстимулирующим и ростингибирующим фактора:.! желательно проводить параллельно в А-культурах, в которых ЭКО-45 резко снижена, и в обычных /полных/ костномозговых культурах /П-культурах/, то есть при высокой ЭКО-2. Б данной работе при постановке П-культур была использована исходная плотность эксплачташи костномозговых клеток мьшей, обеспечивающая величину ЭК0--Ф 1,0-2,7 х10"^, то есть около 1/3 максимальной ЭКО-Ф /максимальная величина ЗКО-З, при которой практически катдая клоногенная прикрепивааяся клетка дает колонию, требует значительно большего количества фидера /Сриденштейн А.Я. и др., 1990/. Такая сравнительно низкая ЭКО-Ф позволяет выявить но только ингибируюшую, но и стимулирушую активность изучаемых факторов в отношении пролиферации КОК-Ф. ЗКО-4? в А-культурах, практически лишенных собственного фидера» составляла 0,2-0,3 хКГ5.

. Оказалось, что Ю1-1 /£раф, 5/ ке оказывал влияния на 8К0-$ при его концентрациях в кульгуральной среде шше 1,5 единиц на мл, более высокие дозы этого фактора шгибировали колониеобра-зование в культурах обоих типов, причел, ота .кнгибиция б*ла выражена тем больше, чем больше была концентрациям-!.

Присутствие в культуральней среде малых доз ТН»-<*/1-20 единиц на мл/ приводило примерно к 1,5-кратному увеличению числа колоний в П-культурах и к 2-1фатному в А-культурах, Дальнейшее повышение концентрации сопровождалось, как и в случае

ИЛ-1, ингибицией коленизобразевачия вплоть до полного его подавления в цультурах обеих типов /граф. 6/, . : ; • "

График 5. Колониеобразование в культурах костного мозга мышей в присутствии интерлейккна I.

__ . 0 . 0,5... 1,5 5 15 50 • ЮС ......

[о оси абсцисс - концентрация ИЛ-1 /единиц на мл культуральной среды/

[о оси ординат - ЭКО-Ф в П-культурах /I/ и А-культурах /2//х10 / Жсплантировано по 10® клеток на лун!у с плоцадыэ дна 2,5 см^.

График 6. Колониеобразование в культурах костного мозга мышей в присутствии фактора некроза опухолей <*.

^ оси ординат - ЗЮ-5 в П-культурах /I/ и А-культурах /2//х!0"°/ •ссплантировано по 10° ялзтох на лунку с пзицадоэ дя? 2,5 см**.

Таким образом, дейстзие на рост стромальных клсногенных.

клеток носит двухфазный характер в зависимости от концентрации THi-p. в гульууральной среде.

Существуют данные, что как нефракцяонированная КССЛ, так и отдельные содержащиеся в ней цитокккы /1Н®- ы., TH£-ß, ИЛ-1/ обладают способност-ыг) не только резорбировать уже имеющуюся костную ткань, но к шгабировать образование новой костной • ткани /ßRrtoli.rii'D.E. et. al.' , 1986/, Поскольку есть все основания считать ст-ромалькые клоногашыо клетки костного мозга стволовыми клетками костной ткани /Чайлахян Р.К. и др., 1978/, из полученных данных следует, что шгибиция ео образования под действием достаточно высоких доз ИЛ-1 и ?Н5-<* монет реа-( лизовываться уле на уровне.стволовых клеток кости.

Vül-З /граф. 7/ в концентрациях от 0,8 до 50 единиц на мл примерно в 1,5 раза увеличивал ЭКО-Ф в П-культурах. В более высоких концентрациях ИЛ-З пнгибировал холениеобразование s П-кулмурах. В А-культурах эффект действия ИД-3 оазисил от начальной плотности эксплантации костномозговых клеток: если сна

а

составляла 10 ' гостномозгознх клеток на лупку, ст'лмулир^тсплй эффект ИЛ-З /3-х кратный/ имея место, но его ингибнруюцего действие при высоких концентрациях не наблюдалось. Если не оксн-лантатдаонная плотность составляла 2x10° клеток iui дукьу, ЙЛ-3 не оказывая ья ингабируащего, ни стюулирующего действия е А-хультурах.

Ирч изучении действия ростовых факт проз кг; h'ülv-ö в культурах первично окешшлтнровакных клеток следует учесть, что даже в адгезивных культурах клеток костного мозга помимо K0K-Ö присутствует к другие адгезивные клетки /я частности, макрофага/, а таю.е, по-Еидимсцу, некоторое /хотя и небольшое/ количество неадгезивкых кроветворных клеток, которые всо-гаки остаются в культурах, как бы тщательно их ко отмывали. Таким образом, возникает вопрос, действуют ли изучаемые ростовые фаю.'ори прямо на KöK-Ф или vtx действие опосредовано другими категория;® клеток, присутствующими в культурам. Лдг.о отметить, что при добавлении ¡1Л-3 в Ц-аултуры, а та*с;е в А-культуры, ,зксплгнтировашше с высокой исходной клеточной плотностью костномозговых клеток, про-

График 7. Колониеобразовгние в культурах костного мозга мышей в присутствии штерлейкша 3. !

йо оси абсцисс - концентрация ИЛ-3 /единиц на мл./ До оси ординат ~ ЭКО-й /хЮ~°/ в П-1ультурах /I/ и А-тультурах /2/, эксплантировачо по 10® клеток костного мозга на лунку с пдсвмдыо дна 2,5 ю^ -- ЭДО-Э в А-культурах /3/ /хЮ"®/, зксплантиро-вано по 2x10° клеток костного мозга на лунку плоцадьл 2,5 ст.£.

исходила заметная стда/ляция гемачозза, Поэтому, представляется вероятны:/;, что эффект увеличения ЭЮ-5 в этих случаях мог зависеть не ст действия самого ИЛ-3, а от влияния части- пролкфсриру-ицих гелспоэтических кяе-гок на стромальгаде клетки. Б этой связи было интересно выяснить, как ростовые факторы действует на стро-мачьяке габрсбласты :-.з пас.сатакх костномозговых культур, гда нет прю/оси никаких другие клеток.

Оказалось, что хотя присутствие ИЛ-1 з культурзльной ерзде /'граф. 8/ 2 ковдак'ргши до 5 единщ ка мл практически не влияло

на рост фибробластов костного мозга кроликов, более высокие дозы этого фактора почти полностью подавляли колониеобр&зование. ТНФ- и а концентрациях охало 0,05 единиц на мл приводил примерно к 1.5 - кратнему увеличению числа фибробластов з культурах костного мозга кроликов /чего нз было отмечено для фибробластов костного мозга человека/, более высокие дозы ТН£- ^ подавляли рост фибробластоз костного мозга кроликов вплоть до полной его кнгибиции к существенно снижали рост фибробластов костного мозга человека.

График &. Влияние- М-1 и ТНО- на рост фибробластоз из пассажных костномозговых культур.

По оси ординаг -

д/ правая шкапа: '1 - число йибробласюв костного мозга человека /хШ3/ в присутствий ТЙ5-«»: ,

б/ левая шкала: 2 -• ч:сло фибробластов ксжи человека /хЮ°/ ь присутствии ТНй-«<, 3"- ЭКО-5 /х10*7 фибробластов костного мозга кроадкев в присутствии ТНФ-»:, 4 - ЭЮ-4 010'-/ фиброблэстяв костного мозга кроликов в присутствии

Примечание. Фи.О'робласты помешали в лунки с площадью дна 2,5 в количестве 100-500 кде:гок на лунку.

Таким образом, но полученным данны.1.?, характер действия ИД-I и ТН5- с.' на пассажные сгрсмальныо фкбрсбласты практически не отличается от действия этих факторов на рост К0К-5 колонки в

ультурах первично эксплантир о ванных костномозговых клеток, з этого следуем, что действие I11--I и ТНФ-ha первично экс-лантированные KDK-Ф, в противсполо?лость КЛ-3, направлено, возможно, рямо на стромальные клетки и не опосредовано другими кле-очными категория.®.

Известно, что M-I и ТНЗ-с< подавляют рост опухолевых гле-ок ряда линий ин витро. ДзухфазныД характер действия ТН£-с<!, ходный с таковым для стромалне'х механоцитов. получен дгя леток L-929, BI6PI0 и клеток t.E-160 нео /линия карт?:нсмы v.:-овека/. Б то же время, кемалигнигирсванные клетки устойчивы : цитогоксическому действию стих факторов, которые Еыступар? ак митогены для диплоидных фибрсбластоз нестромального проис-:ождения /le J., Yiloeit J., 1907/. Действительно, в нгших опы-■а>: рост диплоидных фиброблгстоз кони человека тоне стимули-ювзлся под действием TMS-/граф. 8/. Почецу рост первично ксплантироЕанных КОК-8 и их кулътуральных потомков из диплоид-нх итгммов костномозговых фибробластов ингибируется присутствием в культурачьнсй средо достаточно больших доз ИЛ-1 и ТН5-<*, ;ока остается неясным.

В делом, данные, полученные в настоящей работе, свидетельс-,'вуйт о том, что поведение популяции сгромальвых клеток-предше-:твен.ч"ков в сильной степени зависит от кроветворных и лчмфокд-их клеток и факторов, вырабатываемых при их активации. Вопрос ) тем, насколько верно ростстимулнруюцее* и ростшгиокрующее элияние .^оветворных и ошмфоидных клеток," ойкаруяекноо на"-.и з флыур&х, отражает рзгудятогане взаимодействия, существующие i гемопсз'ягазских к гайлфоиднкх органах в организме, мочют быть •ыягнен г дальнейшем исследовании.

В Ы В 0 Д U

i. Изучено мюкиеобразований пн в/лре стромальгтми клокогеикы-м хслегками п д влипшем ряда воздействий, ьазедд^х из ра*но-зесия кроветворную и лшхоидкуи спстег/у /тотальное облучение 1,5 , введение циьлсфосфаг.шда, иммунный ответ посла однократного повторного введения антигенов/> Пскаогно. что все рассмотренное воздействия, сопрсьездгвщ^еел усиленной пролиферацией гэмо-гозуич'зоз« и лимфоидн«х клеток, приводят к резким пдеигом чис-

ленности стромальных клон о генных клеток. Полученные результаты указывают на то, что ответ гемопозтических, лимфоидных и стромальных шлеток на возмущающие воздействия может происходить взаимосвязанно.\

2. Изучено колоняеобразование стромальных ююногенных клеточ

в присутствии клеток кроветворных и лимфоидных органов. Установлено; что популяции костномозговых и лимфоидных клеток морских свинок и кроликов содержат не только стимулирующие клетки /о чем было известно ранее /йроденштейн А.Я., 1990/, но и клетки, ингибирующие пролиферацию стромальных клоногенных клеток ян витро и что -чувствительность к ростстдулкрующим и ростин-гибирующим воздействиям у клоногенных клеток разной видовой принадлЕмости неодинакова.

3. Показано, что ингибирующие рост КОК-Ь клетки кроветворных и лкмфеидных органов адгезивны, радиорезистентны и имеют маркер макрофагов Р4/80. Т-клетки, по-видимому, не принимают существенного участия а реализации этого эффекта.

4. Действие облученных костномозговых меток на размножение культур альньгх потомков ЮК-Ф из пассажных штаммов костномозговых фибробластов морских сбинок зависит от состояния штамма в момент пассирования. Если большинство клеток находится в состоянии покоя, то есть выведено из пролиферативного цикла, то до-бавлачие облученных костномозговых клеток оказывает выраженное стимулирующее влияние на пролиферация пассированных костномозговых фкбробластов. Если же клетки ытамиа находятся в состоянии пролиферации, то добавление облученного фидера либо не оказывает никакого действия, либо вызывает некоторую ингибицшо роста фкбробластов в культурах. Пролиферация пассажных костномозговых фибробластов кроликов подавляется облученными клетками фидера независимо от состояния штамма, в момент пассирования.

5. Присутствие митогенов /Кен А, ЗГА/ в культурах клеток селезенки мышей или присутствие кондиционированной среды от таких культур/КССЛ/ в культурах селезенки и костного мозга реако подавляет КОК-Ф колоннеобразование. Показано* что в основе ингиби-ции роста КОК-й под действием КССЛ лешт обратимый блок пролиферации стромальных клеток.

6. Клетки, ответственные за выработку в КССЛ активности, иншби-рукщей рост стромальных клоногеьшых клеток, радиочувствительны

и имеют маркер Thy-I, то'есть, по видимому, являются Т-лим-фоциташ. ■ ••

7. Факторы, продуцируемые активированными маотсфагами и лимфоцитами Д1й ИЛ-1,'МЛ-3/, в зависимости ст их концепт-раций d культуральной среде, могут как стимулировать /ТШ-U, ЙЛ-З/, так и ингибировать /ГНФ-л, ИЛ-I, ИЛ-3/ рост- стрема-лькых клеток в культурах. При этом, действие указанных факторов мой от быть направлено либо прямо на стромальныз клет-киДНФ-с<, 114-1/, либо опосредовано присутствующими з культурах кроветворными клетками ,/ИЛ-З/.

3. В целом, полученные результата свидетельствуют о том, что рост' стромалъных клоногенных клеток и их культуралььых потомков ин зитро в сильной степени зависит от действия д-фоветвор-ных и лимфоиднгтх клеток-и продуцируемых ими факторов, Taiсил образом, полученные данные' доказывают возможность регулировки стромальной ткали со стороны гемопоэтических и лимфоидных клеток и факторов, вырабатываемых при их активации.

Список работ, опубликованных по -теме диссертации.

1. Лациник Н.В., Кейлис-Еорок И.В., Дериглазоза Ю.Ф.'Способность предаестзенников колоний фибробластоподобннх клеток, вырастающих в монослойных кульTjp;ах клеток костного мозга, включать Н -тимидин // Материалы всесоюзного симпозиума по вопросам консервирования, культивирования и типировалия костного мезга. - Москва, ЦОЛИГПК .ИЗ СССР, 1971. - с. 103-104:

2. Кулагина И.К., Дериглазова Ю.З, Регенерация строгальных клеток-предпестзешиков костного мозга мызей после сублеталь-HOi'O облучения // Тезисы 8 конференции "Зопросы радиационной • иммунологии к микробиологии". - Москва, НЕКЭУ ил. К.й. Гамалеи Ж CCCF, 1972. - с; 35-39.

3. Фридеглктейн А.Я., Дериглазова Ю.Ф., Кулагина Я.Я. Клонирование клеток-предшественников для фибробластоп в монозлейных культурах меток. // Еюл. зкепер. бисл. и мед. - 1973. - 10. -с. SO-S'3.

4" rriederstein A.J., Gorskaja U.P., Kra<isins И» Я. Fibroblast precursors in noraal irradiated Muse hemopoietic organs. // r-xp. Kematox. - 1976. - N 1С. - '¿¿7-274-.

5' Friedenstein A.J., Deriglasova V.!1., ..Kulagina N.M*S ,

Panasjuk A.F., Rudakova S.F., Luria E.A., Rudokov I.A. Precursors for fibroblasts in different populations of hemopoietic cells an detected bj tha in vitro colony essay method. // Exp. Hematol. -1974. - Я 12. - p. 267-274.

6. Горсксл Ю.®.-; Эриденгстейн А.Я., Кулагина H.H. Клетки-предеест-венники фабробластов, выявляемые методом клонирования клеток кроветворных органов нормальных и облученных мышей // Еюл. экспер. . биол. и мед. - 1976. - №. - с. 614-615.

7. Иванов-Смоленский А.А., Горская Вуралесова А.И., Лаци- . ник Н.В. Проксхо?здение стромзльных механоцитов в культурах- костного мозга // Вол «»экспер. биол. и мед. - IS76. - № 10. - с. 1270 -1271.

8. Кузнецов С.А., Лурия Е.А., Горская Ю.Ф., Грошева А.Г., Шкловс-кий-Корди К,Е., Домрачеза Е.И., Воробьев А.И. Анализ остеогенных свойств стрсмальных мехакоцктов костного мозга в культурах // В сб. ''глетки-предяествендаки кроветворной ткани". - М., 197?. -

с. 119-124.

9. Иванов-Смоленский А.А., Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В., Горская . Ю.&., Куралесова А.И., Лациник К.В., йриденштейн А.Я. Происхожде-

нпе стромальякх механоцитов костного мозга по данным их типиро-вгния по изоантигенем и хромосомным маркерам // Онтогенез. -1998. 3. - с. 245-252.

10. Герасимов D.B., Чайлахян Р.К., Горская Ю.О., Грогаеса А.Г. Перенос кроветворного михфоокружения цельной популяцией и от-' дельными клонами стрсмальных механоцитов, выращенными ин витро // Тезисы I Всесоюзного съезда гематологов и трансшузиологов. - Москва, IS79. - с. 135.

11. Friedenstein A. J., Ivanov-SmolensM. A.A., Ciia.-jlakian R.K., Cerasimov U.V., Gorskaya U.P., ftiiralesova A.I., Latziivik H.Y. Origin of bone marrow stromal mechanocytss ir. rudiochiraeras

end heterotopic transplants // 3xp. Kematol. - 1976. - Ii6 -p.440-444.

12. Лациник К.В., Горская Ю.Ф., Пронин А.В., Фриденлтейн А.Я., Сидорович С,Ю„ Радиочувствительность и пострадиационная регенерация стромзльннх предшественников костного мозга // Радиобиология. - 1979. - Р 6. - с. 848-657.

1.3. »'riodottctein A.J., Xetzinik 11.7., Chajlakian R.K., Luria Б. A.,

Gorskaja U.F., Grosheva A.G., Gerasinov U.V..-Kuznetzcv S.A. Вопэ ■marrow stromal mechanocytes; cloning in vitro and the transfer of iionopoietic nicroenviroriment // Proo. 9 Intern. Symp. on comparative leiikenia and related deseases. - Moscow, - p. 52-54«

14 .•Friedenstein A.J., Latzinik H.V., Gorskaja U.F., Sidorovitoh S.U. Radiosensitivity and postirradiation ehajiges of bene marrow clonogeneio stromal nechanocyie3 // International Radiobiology. -1901. - Ы5. - p.-115-117.

15. Геншша E.H., Герасимов Ю.В., Горская Ы.Ф., Х^ригулевич Н.И., плагина К.Н., Куралесоза А.И., Сидорович С.Ю., Чайлахян Р.К. Клетки, создающие кикрооотухение: свойства, влияние внешних факторов и регуляция антителообргйовачия а культурах !/ Материалы Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии".-«LIGSI. -ч. I. - с. 19-20.

16.-Грошева А.Г., Горская Ю.Ф., Фридекытейн А.Я. Перенос костномозгового ми кр о окружения стромальными клетками, выращенными в культурах и трансплантированными в келатиновых губках // Бюл экспер. биол. и мед. - 1981. -J? 5. - с. 608-610.

17. Frieaenstein A.J., Latzinik H.V., Grosheva A.G., Gorskaja U.F. liarrow mioroenvironnent transfer oy heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured colls in porous sponges // Exp. Hematol. - 1982. - !l 2, - p. 217-227.

IB. ©ридеьтатейн А.Я., Яациник H.B., Куралесова А.И.. Чайлахян Р.К,, Горская 30.5., Сидорович С.Й., Герасимов В .В. Клетки-гпереносчики • кроветворного микроокрукания // Итога науки и техники ВИНИТИ. -серия :'Иммукологкя!'. - М., 1933. - с. 5-23. 19. ЛациникК.В., Горская Ю.Ф., Грошева А.Г., (Ериденштейн A.R. Содержание стрональнкх колоиеобразуюших клеток /ЮК-5/ в костном мозге мышей и клональчая природа образуемых ими колоний // Онтогенез. - J98o. - № I - с. 27-£5.

P.O. Лацинкк Н.В., Горская Ю.Ф., Павленко Р.Г., Фридектатейн А.Я.: Содержание стромгльных зшоксгенных клеток в костном мозге мышей // Ьюл. экспер. биол. и мед. - 1905. ~ lfi 4 - с. 468-470.

21. Горская Ю.$., Гроаева А.Г. Действие антигенов и митогенов на стромальные колопесбразузецие клетка лимйоидной ткани // укмуноло-гия. - 19Е36. - * 3. - с. Г.6-29.

22. Горская Ю.й., Грсяева А.Г. К вопросу о механизме ингьбиции роста стромгльных клзтох-лредпестэенниксв в мокослойных культу-

pax клеток костного мозга мышей кондиционированной средой от лимфоцитов, стимулированных ин витро коиканавалином А // Им- ' мунологря. - 1987. - л> I. - с. 42-43.

23. Зорина А.И., Горская Ю.Ф., Гропева А.Г., Згридегалтейи А.Я. Влияние костномозговых клеток кз колонсобразовэние стрсмаль-них клеток и на пролиферацию их кулътуральных потомков //' Вюл.гкепер. бйол, и мед. - 1988. - № 12 - с. 704-706. . '24. .Лацяник К.З., Фриденатейн А.Я., Горская Ю.Ф., Москвина И.Л., Ей Хук Чсн,Зависимость образования КОК-Ф колоний от стимулирующего воздействия гемопооткческих клеток // Еал. окспер. биол. к мед. - 1990. - № II. - с. 519-522. 25. йриденштейн А.Я., Лединик Н.В., Горская Ю.Ф., .Лурия Б.А.' -Гуморальная природа колонестимулирующего воздействия костчо-ысоговых клеток, на образование стромалышх колоний в культурах костного мозга // Еюл. окспер. биол. и мед. - 1990. - № II. - с. 509-510.

25. Горская Ю.5., йриденштзйн А.П., Голованова Т.А. Влияние ростовых факторов на образование стромапьных КОК-З колоний в культурах костномозговых клеток мышей // Еюл. экспер. биол. и мед. - ISSI. - № 12. - с. 615-617.

27. Горская Ю.5. Влияние Ш1--1 к ТКФ-о< на рост страдальных фи-бробластоЕ ин Еитро // Еюл. экспер. биол. и мед. - 19Э2. -

Jv I - с. 63-89.

28. Горская Ю.Ф., illy клина Е.Ю. О клетках, иьгабируощих образование етромальных 1ЮК-Ф колоний в коотнлмозгоька г/льтурах // Гематология и траасфузиология. - 1992. 7-8. -с. Ю-12,

29. Горская Ю.Ф., 2?ридешшгеГи А.Я», Зорина А.И. Влияние гемо- . поэтических и лимфоидных клеток'на образование стромальшк КОК-<5 колоний в культурах костномозговых клеток кроликов // Гематология и трансфуоиология. - 1992. - № 9-10 - с. 3-5 ,

30. Friedenstein A.J., Latainik К.У., Gor.ikaya Yu.F., Luria Е.А. and Koslivina T.L. Bone rr.arrow strccal colony formation requires stimulation Ъу haeraopoietic cells // Bone and Mineral. - 1992.

- П 18 - p. 193-213. .

Материалы диссертации ролокены на: I. Всесоюзной симпозиуме по вопросам консервирования, иультязи-ро^-:ил и тнпировакия костного мозга, Москва, 1971.

. УШ конференции "Вопросы радиационной ивдунологии и ми-робиологии", Москва, 1972.

!. I Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов, Моск-а, 1979.

. IX Международном симпозиуме по сравнительному изучению ейкемии и родственных заболеваний, Москва, 1979. . Всесоюзной конференции " Актуальные вопросы иммунологии", осква, .1981.