Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Клонирование кДНК и изучение экспрессии низкоаффинного Fc рецептора иммуноглобулина Е человека

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ПИВНЮК

Вадим Иосифович

КЛОНИРОВАНИЕ кДНК И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ НИЗКОАФФИННОГО Рс РЕЦЕПТОРА ИММУНОГЛОБУЛИНА Е

ЧЕЛОВЕКА.

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Институте биотехнологии.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Р. Г. Василов.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор И.С. Гущин

доктор биологических наук С. М. Деев.

Ведущая организация: Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского

диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ но адресу:

115478, г. Москва, Каширское шоссе, д.24 к. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздравмедпрома РФ.

Автореферат разослан "_"_ 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Л.С. Сеславина.

Защита состоится

1994 г. в

час на заседаншш

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Широкая распространенность аллергических заболеваний обуславливает актуальность изучения механизмов регуляции биосинтеза иммуноглобулина Е ОдЕ) - ключевого компонента реакций гиперчувствительностн немедленного типа. Одной из молекул, влияющих на уровень биосинтеза ^Е является низкоаффинный рецептор Ре-фрагмента человека (РсЕТШ) (Ое!еБре55е С., е1 а1., 1992). Некоторые моноклональные антитела к FcER.II способны супрессировать продукцию 1£<Е (ВоппеГоу Л, —У., е1 а1., 1990). Такой же активностью обладает и один из фрагментов этого рецептора (БагГаН М., е1 а!., 1992). Кроме того, сообщалось о способность фрагментов РсЕШ! вызывать и усиливать рост важнейших субпопуляцип клеток крови и их предшественников (Ве^Бреяве в., е1 а1., 1992). Механизмы, лежащие в основе описанных феноменов, остаются неясными, что обуславливает необходимость дальнейшего изучения структуры и функций этого рецептора.

Клонирование генов, кодирующих функционально важные молекулы иммунной системы, является важнейшим методом изучения их строения и, кроме того, дает возможность получить рекомбннантные препараты н уникальные по чувствительности ДНК-гибридизационные зонды для использования в дальнейших исследованиях и для разработки новых методов диагностики и лечения. Целью дайной работы было структурно-функциональное изучение низкоаффинпого рецептора 1дЕ человека.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1. Клонирование кДНК, кодирующей ннзкоаффшшый рецептор ^Е человека. 2. Изучение экспрессии РсЕШ1 в различных клеточных линиях. 3. Изучение роли Н.-4 в регуляции экспрессии ЕсЕШ1 в В-лпмфоцитах периферической крови.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. В данной работе описано клонирование кДНК низкоаффинного рецептора ^Е

человека из независимо полученной в нашей лаборатории В-лимфобластоид-иой клеточной линии. Первичная структура клонированной кДНК идентична опубликованной ранее из другой клеточной линии, что подтверждает ряд предположений о структуре этого рецептора. Клонированная кДНК была использована для получения высокоспецифичного зонда, с помощью которого изучена структура геномного гена FcER.II в ряде клеточных линий и регуляция экспрессии РсЕИП в очищенных В-лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Впервые показано, что отсутствие поверхностной экспрессии FcER.II в одной из исследованных клеточных линии связано с делецией геномных последовательностей, кодирующих рецептор. Показано, что влияние 1Ь-4 на экспрессию FcERII не зависит от присутствия в культуре Т-клеток и моноцитов. Полученные результаты свидетельствуют, что клонированная кДНК может быть использована для разработки новых методов диагностики и изучения аллергических болезней. Кроме того, клонирование кДНК РсЕИН позволило приступить к работе по получению рекомбинантных препаратов - фрагментов рецептора. Имеющиеся данные ! зидетельствуют, что такие препараты могут найти практическое применение в аллергологии и гематологии.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Методы клонирования кДНК ЕсЕЯП, структура клонированных фрагментов и их соответствие гену РсЕЕШ. 2. Строение гена ЕсЕЯП в геноме различных клеточных линий н его влияние на поверхностную экспрессию рецептора. 3. Усиление экспрессии РсЕШ1 в В-лимфоцитах периферической крови здоровых доноров под действием интерлейкина 4 не требует присутствия в культуре Т-клеток и моноцитов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Результаты работы доложены на Международном симпозиуме по Аллергологии и Клинической иммунологии "^Е:

регуляцня синтеза и клиническая значимость" (Москва, 1990), на ежегодных собраниях Европеской академии аллергологии и клинической иммунологии (Цюрих, 1991, Роттердам, 1993), на XIV международном конгрессе но Аллергологии и Клинической иммунологии (Киото, 1991), на ежегодном научном собрании Биохимического общества Республики Корея (Лнсан, 1991), на Международном конгрессе по созданию новых лекарств (Сеул, 1991), на XV конгрессе Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (Париж, 1992), на 8-ом международном конгрессе по Иммунологии (Будапешт, 1992).

ПУБЛИКАЦИИ: По материалам диссертации опубликопано 12 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 131 работу. Диссертация изложена на 107 страницах, содержит 10 рисунков и 6 таблиц.

СОД ПРЖ AI Uli-: РА БОТЫ.

В настоящее время известно два тина рецепторов иммуноглобулина Е: высокоаффиннмн (Ка=10'М' )на поверхности базофилов и тучных клеток (FcERl) и FcERII (рис. 1), (Ка=10' М ' ) на В-лимфоцитах и ряде других клеток крови человека. FcERl!, называемый также CD23. играет важную роль в процессах, регулирующих биосинтез IgE. Кроме того FcERlI принимает участие и в других физиологических процессах. Опубликованные данные о функциях этого рецелтора суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Функции низкоаффишюго рецептора 1§Е.

Фунукцни Клетки

Связывание Взаимодействие с СП21 Все

Высвобождение 1И, ЮТ-альфа, Синтез суперокспдов Фагоцитоз частиц покрытых ^Е Моноциты

^Е-зазисимая презентация антигена Моноциты и В-клетки

1^Е-зависнмая цитатокснчность Мокоцкты, тромбоциты, зозииофкллы

Супрессия продукции 1&Е Ингибирование активации и дифферекцнровки В-клетки

Рисунок 1. Гипотетическая модель строения низкоаффишюго рецептора

Стрелки - сайты ирогеолнтического расщепления, ведущего к образованию -связывающих факторов указанной М.т. Жирная линия - "лейциновая

1.КЛОНИРОВАНИЕ к ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ НИЗКОАФФИННЫЙ РЕЦПТОР 1яЕ.

Ранее в нашей лаборатории была получена клеточная линия 1В путем трансформации вирусом Эпштейна-Барр мононуклеаров периферической крови. С помощью моноклональных антител к СВ23 и проточной цнтофлюориметрии показали, что клетки этой линии экспрессируют на поверхности РсЕКП. Из клеток этой линии выделяли суммарную РНК. Было выделено 18 мг суммарной РНК. При этом выход составлял 2 мг РНК па 1X10" клеток.Были синтезированы два олигонуклеотидных зонда, комплементарных участкам ДНК опубликованной последовательности кДНК РсЕКП с 661 по 678 нуклеотид л с 1162 по 1179 луклеотид, с помощью которых дот-гибридизацией показали наличие специфической РНК С023 в препарате суммарной РНК из линии 1В. В качестве отрицательного контроля использовали препарат суммарной РНК из линии НЬ-бО, не экспрессиру-ющей С023 по литературным данным. РоН(А)+ фракцию мРНК получали в результате двух циклов хроматографии на о^о(с!Т)- целлюлозе. Выход составлял 1% от суммарно!! РНК. Синтез первой цепи кДНК проводили на матрице полученной роН(А)+ мРНК в двух параллельных реакциях с использованием в качестве затравки как (сГГ),2.1(| , так и статистической смеси гексадезоксинуклеотидов. Продукты обеих реакций смешивали и осуществляли синтез второй цепи кДНК с помощью ДНК-полимеразы I и РНКазы Н (рис. 2). Затем двухцепочечную ДНК обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой и метилировали с помощью ЕсоШ-метилазы. ЕсоШ-липкие концы формировали путем лигирования с ЕсоМ-линкерами и последующей обработки рестриктазой ЕсоШ. Полученную таким образом кДНК клонировали в составе вектора 10 по ЕсоШ-сайту. Эффективность

2322 -2027 ^

564 —

1 2 3

Рисунок 2. Сшггезлрованная кДНК на матрице poli (А)+ РНК из клеточной линии 1В.

1 - маркеры молекулярных весов (л/IIind III). 2 - первая цепь. 3 - вторая цепь.

клонирования составила 1Х101 БОЕ на мкг кДНК. Полученная фаговая библиотека содержала IXЮ* клонов.

Скрининг библиотеки кДНК проводили гибридизацией с эквимолярной смесью двух радиоактивно меченых олигонуклеотидных зондов. Библиотеку кДНК высевали на чашки Петр>г диаметром 90мм с плотностью около 20000 БОЕ на чашку. Инкубировали чашки при 37° С до появления бляшек и сни-мали реплики на нитроцеллюлозиые фильтры. Проводили нредгибридизацию фильтров, как описано и гибридизовали с олигонуклеотидны.чи зондами.

В результате скрининга было идентнфицированно 4 положительных сигнала гибридизации. Все эти клоны, обозначенные 11Е121, 1?Е6, ЯЕ91, ИЕ61, были доведены до индивидуального состояния и, как было показано (рис. 3), содержали вставки кДНК размером 1300, 1000, 840 и 200 пар

-2322 ~ 2027

-564

12 3 4

Рисунок 3. Гибридизация по Саузерну клонированных вставок кДНК.

1 - клон RE121. 2 - клон RE91. 3 - клон RE61. 4 - клон RE6. 5 - маркеры молекулярной массы (X/Hind III).

оснований, соответственно, гибрвдизующнеся с теми же олигонуклеотидными зондамн. Затем вставки кДНК были переклонированы в вектора р11С19 и М13тр8 по ЕсоШ сайту в обеих орнентациях. Рестриктный анализ и определение нуклеотиднон последовательности методом Сэнгера показали, что все положительные клоны содержат фрагменты кДНК низкоаффшшого рецептора ^Е человека, причем клон ИЕ121 включает практически всю кДНК а-формы этого рецептора за исключением небольших 3' и 5'-концевых цетранслирусмых участков (рис. 4).

109 мссстссАААСтссАСТААссАСАсстстсАтгетссссесгеАстьсАстсссттотсАоссАетсАст

130 ОСТССАТСАТСЕССАСААТССААССАОедССбСС АТС БАЙ СМ бйТ САА ТАТ ТСА ЪАй АТС

Ме1: - й1и - СIи - у - в1п - Туг - Эег - С1и - 11е

1149 а ССС АСС ССС ТСТ ЙСС сст стс сас тст ТЙА ССАТЗСАТАСАСССАСССССАСАЗСААОА -Рго-ТПг-Рго-8ег-А1а-Рго-1.еи-Н|э-вег •

1209 СССТСААеАСССССААССАССеСПААААСССТСТТТБТЕОСТаШССТСССТйТСАСАТТТГСТеССАС 1280 ССАААСЗСАСССАбСТСАСАСАТСТСССССТССТСТДТССССССТЗССТТСССАСОАСТАСАССССААСАС 1351 САссстстссАОАтассАзтссссссААСАССАСсстстссАСАтаАеАСттАСАССссААСАаСА

Рисунок 4. 3' и 5'-концевые нуклеотидные последовательности кДНК клона ИЕ121 и соответствующая аминокислотная последовательность низкоаффшгаого рецептора ^Е.

Слева - нумерация нуклеотидов согласно Людину и соавт.

Анализ первичной структуры всех клонов показал, что нуклеотидная последовательность клонированных нами фрагментов кДНК СЮ23 из клеточной линии 1В полностью совпадает с опубликованной Людиным с соавт. и соответствует ей, как показано (рис. 5). Полученные результаты свидетельствуют, что нами действительно была клонирована кДНК, кодирующая низкоаффинный рецептор иммуноглобулина Е. Как отмечалось выше, все три группы, клонировавшие РсЕИП ранее, в качестве источника мРНК использовали клеточную линию НРМ18866. Нами впервые была клонирована кДНК, кодирующая этот гликопротеин из независимо

1 5\

2

3

4

5

Dg На N

109

1436

405

¡395

606

1440

1123 1317

Рисунок 5. Схема строения клонированных фрагментов кДНК, кодирующей низкоаффинный рецептор иммуноглобулина Е.

Нумерация нуклеотидов, как в работе Людина н соавт. Bg - Bgl I; На - Нае II; Н - Hind III~, N - Neo I. 1 - опубликованная последовательность. Прямоугольник - транслируемая область, pi, р2 - участки, комплементарные олнгонуклеотидным зондам. 2 - клон REI21. 3 - клон RE91. 4 - клон RE6. 5 - клон RE61.

полученной клеточной линии. Поскольку олигонуклеотидные зонды, использованные для скрининга, комплементарны участкам ДНК идентичным у обеих известных форм CD23, то полученные результаты могут служить доказательством того, что В-лифоциты, трансформированные вирусом Эпштенна-Барр экспрессируют преимущественно a-форму рецептора.

РЕСТРИКТНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ГЕНА FcERlI В РАЗЛИЧНЫХ ЛИНИЯХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА.

В отличие от клеточных линий, полученных путем трансформации вирусом ЭБ in vitro, аналогичные клеточные линии трансформированные этим же вирусом in vivo (так называемые лимфомы Беркита) практически не экспрессируют FcERlI. Для изучения этого феномена нами было проведено рестриктное картирование гена рецептора в различных клеточных линиях. Предварительно были отработаны условия получения биотинили-ровашюго зонда и детекции с помощью коиьюгатов анидина с полимерной т1ероксидазой и щелочкой фосфатазой.

Подбор условий биотинилирования проводили с использованием рекомбинаптнон плазмиды р121Е путем подбора оптимального весового соотношения компонентов и условий облучения. Полученные препараты проверяли путем нанесения на нитроцелюлозиые фильтры и последующей детекции коньюгатом авидин - полимерная пероксидаза. Различные сочетания параметров реакции биотинилирования и соответствующие им пределы обнаружения приведены в таблице 2.

Таблица 2. Подбор условий получения биотинилированных зондов.

Весовое соотношение ДНК/ФБ Условия облучения Время облучения (мин.) Чувств. детекции (xlO'V) №

пробирка 10 200 1

1/1 эппендорф 20 100 2

стеклянный 10 50 ¿1

кагшиляр 20 25 4

пробирка ' to 100 э

1/2 эппендорф 20 50 6

стеклянный 10 25 7

каниляр 20 25 8

Анализ геномной ДНК вышеперечисленных клеточных линий с использованием биотинилированной кДНК СБ23 в качестве зонда проводили путем картирования участков расщепляемых эндонуклеазами рестрикции. Для

этого выделяли из клеток геномную ДНК, аликвоты которой обрабатывали эндонуклеазами рестрикции ЕсоЛ1 или ВатШ. Полученные смеси фрагмен тов разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану п гибрпдниовали с бнотпнилироваиной кД ПК СГ)23 (клоп р121Е). В качестве маркеров молекулярной массы использовали биотипилированные фрагменты фага ?„, расщепленного рестриктазой Н1пс1Ш. Полученные результаты схематически представлены на рисунке в. Ранее, Сатер с соапт. провели сравнительный рсстрикцнонный анализ ДНК из плаценты человека и из линии ЯРМ18866 с помощью радиоактивно

Есс >RI BamHT

6 1 2 3 4 5 t 2 3 4 5

23130 —

9416

6557 -

4361 — —

2322 2027 -

Рисуиок 6 Гибридизация по Саузерну геномной ДНК различных клеточных линий с биотинилироваиным зондом (схема)

1. RPM18866 2. U937 3. Raji 4. Namalva 5. Daudi 6. Маркеры молекулярной массы (X/Hind III)

Образцы ЛНК с максимальной степенью биотшшлировання проверяли методом дот гибридизации, используя в качестве зондов. Чувствительность дегекцнн досттала 50 пг. в точке. Замена коныогата стрептавидин-полимер-ная пероксидаза на авидин-щелочпая фосфатаза позволила повысить чувствительность дотекшш до 1 пг ДНК клона р 121Н на точку, что соответствует результатам, полученным в других лабораториях и является достаточным для детекции однокоцийиого гена рецептора в геноме человека.

Поверхностную экспрессию СБ23 изучали в четырех В-клеточных rпп^ияx^RP^П88667_DaídГ^Nalualva^Raji и одной промиеломоноцнтарной липни Ь'937 нммунофлюоресцептными методами с помощью проточного цитофлуориметра ГЛСЗсап и различных мопоклональных антител к С 1)23 (МНМб, Ьеи20, Н050). Результаты приведены в таблице 3. Они полностью совпадают с опубликованными данными (таблица 3).

Таблица 3. Поверхностная экспрессия С 1)23 в различных клеточных линиях человека.

„\о Клеточная линия Экспрессия лит. дан. CD23 опыт Примечания

1 RPMI8866 + + В-клсточная трансф. in vitro вирусом ЭБ

2 U937 + + промиеломоно-цитарная. Вирус ЭБ (-)

3 Raji ? В-кл. лимфома Беркита. Вирус ЭБ (+)

4 Daudi - - то же, вирус ЭБ (+)

5 Namalva - - то же, вирус ЭБ (-)

меченой кДНК С023 и рестриктаз ЕсоЮ, ВашШ и РвЫ. В результате был обнаружен некоторый полиморфизм длины рестриктных фрагментов, образующихся под действием эндонуклеазы РвН.

Структура геномного гена ЕсЕШ1 в клеточной .пиши ИРМ18866, выявленная нами, полностью совпадает с данными этих исследователей. Дополнительная высокомолекулярная полоса (30 т.п.о.) в наших результатах может быть артефактом, связанным с условиями электорофореза или неполной рестрикцией.

В остальных анализировавшихся клеточных линиях нами был обнаружен незначительный полиморфизм рестриктных фрагментов, образующихся пол действием ЕсоШ. Фрагмент ДНК размером 20 тыс. и.о., гибрндилующ-нйся с кДНК ЕсЕШ1 детектировался во всех клеточных линиях (искл. ОаисЮ. Однако при расщеплении ДНК из линий Ш37 и Мата1уа образовывалось два и один дополнительный фрагмент соответственно(см. рис 6). Не исключено, что образование этих фрагментов является следствием возникновения в результате спонтанных мутаций дополнительных сайтов рестрикции ЕсоШ в одном из аллелей гена СЭ23 в этих линиях клеток. С другой сторо ны, особенности самого фермента ЕсоШ (например "звездная" активность), которые проявляются при длительных инкубациях, также могут привести к появлению дополнительных рестриктных фрагментов.

Количество фрагментов гена ЕсЕРШ, образующихся под действием ВатН1 у всех линий (искл.ОаисЮ одинаково. Однако размер их варьирует, что может быть связано со вставками или делениями ДНК как в соответствующих участках самого гена, так и в прилегающих областях. В геномной ' ДНК линии ОаисП нам не удалось обнаружить каких-либо последовательностей, гибридизующихся с к ДНК СЭ23. Принимая во внимание хорошо известный факт, что клетки таких линий никогда не обладают нормальным

диплоидным кариотипом, этот факт легко объяснить потерей данной линией 19 хромосомы или делецией ее соответствующего участка.

Таким образом проведенное изучение поверхностной экспрессии РсЕШ! и структуры гена этого рецептора в различных клеточных линиях позволяет сделать заключение о том, что отсутствие поверхностной экспрессии в одном из исследованных случаев - линии БаисИ вызвано потерей геномных последовательностей, кодирующих этот гликопротеин. Однако, несмотря на выявленные различия в структуре гена СВ23 в остальных исследованных линиях, для однозначного заключения о причинах отсутствия или снижения уровня поверхностной экспрессии РсЕИП необходимы дополнительные исследования.

-И 3 У Ч Е Н И Е—СП О Н ТА Н Н ОЙ И И Н Д У Ц И Р О ВАН НОЙ

ИНТЕРЛЕЙКИНОМ-4 ТРАНСКРИПЦИИ СБ23 В В-ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ.

Как отмечалось выше, на поверхности В-лимфоцитов периферичской крови атопиков, и В-лимфоцитов, трансформированных вирусом ЭБ, РсЕШ1 экспрессируется постоянно. В норме, В-лимфоциты периферической крови экспрессируют небольшое количество С023 и лишь на определенной стадии дифференцировки. Ранее, нами и другими с помощью моноклональных антител было показано, что культивирование мононуклеарных клеток крови в присутствии экзогенного 11.-4 приводит к повышению уровня экспрессии РсЕКП как на поверхности В-лимфоцитов, так и на поверхности других кле-ток крови, что было подтверждено методом проточпой цитофлюориметрпи с моноклональными антителами к СП23 при выполнении настоящей работы (рис. 7). Поскольку функции СВ23 па различных типах клеток могут быть различными (Табл 1), а присутствующие в культуре Т-лнмфоциты и мопо-

Таблица 4. Регуляция поверхностной экспрессии С023.

Фактор В-клетки Моноциты Влияние на синтез 1дЕ

Цитокины и др. факторы

1Ь2 + 0 +

1Ь-4 ++ ++ ++(СЭ40)

+<1Ь4> 0 + (1Ь-4)

П.-9 0 +ИЬ4)

1ЫЗ ++ ++(С040?)

1КЫ-У - /+(и937) -

ШВ-а - -/+Чи 9.17) -

ТОК-п

ьтв, +

витамин и.) 0 -

глюкокорги-коиды

мембранные молекулы

СОЮ -

0040 +■ ++(1Ь-4)

СЭ72 +

> не влияет на высвобождение 5СВ23. О не влияет на уровень мРНК

(1Ь4) - имеете с интерлекином 4,(и937) - только для клеточной линии Ш37

Рисунок 7. Индуцированная интерлейкином 4 экспрессия СЭ23 на попсрхкости моионуклеарных клеток крови здоровых доноров.

Точки - инкубация беи добавления 1Ь-4. Сплошная линия - + 10 нг, мл 1Ь4.

циты могут оказывать влияние на экспрессию СБ23, либо путем секреции каких-либо цитокинов, либо через межклеточные контакты (Табл. 4), для изучения влияния 1Ь-4 на экспрессию РсЕШ1 памп использовались препараты высокоочищенмых В-клеток. Кроме того, использование различных мкАТ к СВ23, постоянное расщепление мембранной молекулы и действие различных факторов, усиливающих или ингибирующих протеолитическое расщепление этой молекулы мешает однозначно оценить уровень индуцированной интерлейкином-4 экспрессии СБ23 пммунохимическими или иммунофлюоресцентными методами. Поэтому в настоящей работе детекция осуществлялась на уровне РНК с помощью клонированной кДНК в качестве зонда.

Для выделения фракции В-лимфоцитов препараты генаринизлрованной крови от 4 здоровых доноров инкубировали на пластике для удаления фракции моноцитов/макрофагов, а Т лимфоциты удаляли двумя циклами розеткообразования с эритроцитами барана предварительно обработанными гидробромидом бромистого 2-аминоэтилизотиурония (АЕТ). Полученные препараты содержали не менее 90% В-клеток, как было показано с помощью проточной цитофлюориметрии с применением моноклональных антител к С020, меченых ИТС. Затем, по 20 млн. В-лимфоцитов обрабатывали различными дозами рекомбинантного человеческого интерлейкина-4 (конечная концентрация в инкубационной среде составляла 0, 2, 10, 50 нг/мл). Суммарную РНК из В-клеток выделяли после 4 часов инкубации при 37° С. Равные аликвоты полученной РНК разделяли электрофоретически в присутствии формальдегида (рис.8а), переносили на нитроцеллюлозу и гибридизо-вали с радиоактивно меченой ДНК клона ИЕ121 (рис.86). Было показано, что в препаратах РНК, выделенной из В-лимфоцитов всех четырех доноров, инкубировавшихся в присутствии 10нг/мл рекомбинантного П.-4, клониро-

л с«

I ^ щ ^

ШГ^1

■ ««-¿с-;

.-¿--.-у

Рисунок 8. Анализ суммарной РНК из В-клсток, инкубировавшихся без добавления (1) или в присутствии 2 (2), 10 (3) и 50 (4) нг/ил рекомбинантного 1Ь-4.

А - эдектрофоретическое разделение.Б - назерн гибридизация с кДНК FcER.II (клоп RE121). Стрелками отмечено положение 188 и 28Б рРНК. "

ванная кДНК гибридизуется с одной дискретной полосой размером около 2000 нуклеотидов. Специфичность использованного зонда свидетельствует, что эта полоса соответствует мРНК, кодирующей С023. Это заключение подтверждается опубликованным сообщением Юкоты с соавторами, показавшими, что кДНК, кодирующая С023, гибридизуется примерно с такой же по размеру РНК из трансформированной вирусом ЭБ В-клеточной линии КРМ18866 . Повышение концентрации 1Ь-4 в инкубационной среде до 50 нг/мл приводит к дальнейшему накоплению С023-снецифической РНК. В то же время, при инкубации В-клеток в отсутствие или в присутствии 2

нг/мл интерлейкина-4 специфической гибридизации использовавшегося зонда не обнаруживалось. С учетом опубликованных данных о низком уровне спонтанной экспрессии CD23, эти результаты, по-видимому, свидетельствуют о том, что количество СБ23-специфической мРНК в таких условиях ниже чувствительности детекции. Полученная дозовая зависимость позволяет сделать заключите о том, что данный эффект вызван внесенным в культуру рекомбинантным шггерлейкином-4.

Интересно, что в отличие от синтеза IgE - другого процесса, в регуляции которого центральную роль играет IL-4, этот эффект не зависит от пр]1сутствия_^с}[л;щф_е_^ было показано~Вёрцел7пГ

с соавторами, синтез IgE В-лимфоцитами периферической крови индуцируется интерлейкином-4 только при наличии второго сигнала, предоставляемого Т-клетками (возможно и некоторыми другими) в процессе контактного взаимодействия. Как предполагается, главную роль в передаче этого сигнала играет другая трансмембранная молекула В-лимфоцитов CD40. Эти данные и полученные нами результаты позволяют предположить, что в физиологических условиях усиление экспрессии FcERlI под действием IL-4 может предшествовать изотшшческому переключению на IgE. Такой порядок процессов, индуцированных интсрлекином-4, открывает гипотетическую возможность тонкой регуляции синтеза IgE, поскольку кросс-сшивка CD23 на поверхности В-клеток, например посредством аггрегированного IgE, может супрессировать пролиферацию и дифференцировку этих клеток в ответ на ряд стимулов, и, таким образом, может препятствовать развитию новых ^Е-иродуцирующих плазматических клеток. Это предположение косвенно подтверждается опубликованными данными Боннефуа с соавт., показавшими, что некоторые мкАТ к CD23 способны супрессировать in vitro продукцию иммуноглобулина Е. Однако

для подтверждения нашего предположения о возможном механизме этой супрессии необходимы дополнительные экспериментальные данные.

ВЫВОДЫ.

1. Клонирована кДНК и проведено изучение экспрессии ¡шзкоаффшшого рецептора ^Е человек а.

2. Показано, что клонированная кДНК из В-клеточной линии 1В кодирует полную аминокислоту п последовательность "а"-формы рецептора, идентичную опубликованной из линии КРМ18866.

3. Изучена структура гена и мембранная экспрессия рецептора в пяти различных линиях клеток человека.

4. Показано, что отсутствие мембранной экспрессии FcER.II в одной из исследованных линий клеток - ОаисН вызвано потерей последовательностей, кодирующих рецептор, в геноме клеток этой линии.

5. Показано, что в культуре высокоочшценных В-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров усиливает экспрессию FcERП, влияя на уровень специфической мРПК.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Низкоаффинный рецептор 1дЕ человека: клонирование кДНК и изучение его экспрессии в В клетках периферической крови. -Молекулярная биология. 1994, №4, с. 840-845. (соавт. Челидзе Л.К., Марцен Л.О., Цыциков Э.Н., Василов Р.Г.)

2. Рестрикционное картирование гена СЭ23 человека из клеточных линий ЯРМ18866,1)937, ОаисК, №та№а. - Вестн. Моск. Ун-та. Сер.16. Биология. 1993. N.3. с. 54-57. (соавт. Кайгородов В.А.,

-22-

KoHflpaTbeBa M.A., Bacw/iOB P.r. )

3. Biotechnological approaches for diagnosis and treatment of allergic diseases. - in Advances in New Drug Development, eds. B.-K., Kim, E. B. Lee, C.-K., Kim, Y. N., Han, The Pharmaceutical Society of Korea, 1991. pp. 142-157. ( coaBT. Vasilov R., Tsitsikov E., Chelidze L., Raudla L., Lebedin Y., Chuchalin A.)

4. Further Progress in IgE Research via Recombinant Cytokines and Monoclonal Antibodies. - Allergy & Clinical Immunology News. 1992. Vol.4, No.5, pp.144-147. (coaBT. Vasilov R.,Smimova E., Serdyuk O., Chelidze L., Lebedin Y., Tsitsikov E..)____

'5rlL^4Tncluced in vitro IgE synthesys by human PBMC: relation to cell proliferation and phenotype. - Abstr. of the Annual Meeting of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Zurich, Switzerland, May 25-29, 1991 p.31. (coaBT. Tsitsikov E.N., Lebedin Yu.S, Chukanov S.V., Chelidze L.K., Vasilov R.G)

6. Cloning of gene of the human low-affinity IgE receptoor (FcERII/ CD23). - Abstr. of the International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE". Moscow, December 1990r. P 58. (coaBT. Tsitsikov E.N., Chelidze L.K., Marzen E.O., Vasilov R.G.)

7. Role of II4 in the regulation of the IgE response. - Abstr. of the Annual Scientific Meeting of the Biochemical Society of the Republic of Korea. Ansan, Korea. November, 1-2, 1991. P 43. (coaBT. Tsitsikov E.N., Vasilov R.G., Chelidze L.K.)

8. Immunobiopreparations for allergy diseases diagnostics. - Abstr. of the XIV International Congress of Allergology and Clinical Immunology. Kyoto, Japan, October 13-18, 1991, p. 381. (coaBT. Vasilov R.,

Tsitsikov E., Smimova E., Serdjuk 0., Vlasov G., Chelidze L.)

9. Study of CD23 gene expression in different systems using biotinylated CD23 probe. - Abstr. of the XVth Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Paris, France, 10-15 May, 1992, p. 277. (соавт. Vasilov R.G., Kaigorodov V.A., Tsitsikov E.N.)

10. Possible association of antigen CD23 with surface immunoglobulins, and antigen CD19 on human В cells. - Abstr. of the 8th International Congress of Immunology Budapest, Hungary, August 23-28, 1992. p. 231. (соавт. Lebedin Y.S.,Chukanov S.V.,Tsitsikov E.N.)

11. Клонирование и экспрессия гена CD23 антигена -регуляторного фактора аллергии. - Тез. докл. Ill Всероссийской планово-отчетной конференции "Генная и клеточная инженерия", Пущино-на-Оке, Ноябрь - декабрь 1992г. с. 31. (соавт. Кайгородов В.А., Фадеев М. О., Василов Р.Г.)

12. Establishment of mouse cell line wich constitutively express human low affinity IgE receptor/CD23. - Abstr. of the Annual Meeting of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Rotterdam, The Netherlands, 12-15 September, 1993. p. 317. ( соавт. Kaigorodov V.A., Tsitsikov E.N., Vasilov R.G.)