Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение рецепторов интерлейкина-8 человека с помощью моноклональных антител и путем экспрессии к ДНК ретровирусным вектором

РГБ О Л

~ Г' :••'* ■■ ■

На правах рукописи

ТИХОНОВ Илья Иванович

ИЗУЧЕНИЕ РЕЦЕПТОРОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-8

ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ И ПУТЕМ ЭКСПРЕССИИ к ДНК РЕТРОВИРУСНЫМ ВЕКТОРОМ

(14.00.36 — Аллергология и иммунология.)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург — 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

Научный руководитель — доктор медицинских наук

Н. Н. Войтенок

Официальные оппоненты:

Кетлинский Сергей Александрович, доктор биологических наук, профессор, зам. директора по науке ГосНИИ ОЧ)Б.

Климович Владимир Борисович, доктор медицинских наук, руководитель лаборатории гибридомной технологии ЦНИРРИ.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт иммунологии РАМН.

Защита диссертации состоится АХ. » . . . . 1997 г.

в ../... . часов на заседании диссертационного совета Д.0()1.23.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН.

У> л О

Автореферат разослан « г? .»...............1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л. А. Бурова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Классические симптомы воспаления (отек, покраснение, жар и боль) являются результатом сложных биохимических процессов, возникающих в ответ на проникновение инфекции, чужеродного материала или повреждение тканей организма. Важнейшим признаком воспалительного процесса является проникновение лейкоцитов в очаг повреждения и инфильтрация ими пораженных тканей. Направленная миграция лейкоцитов в очаги воспаления опосредуется различными хемотаксическими факторами и их рецепторами В 19S6 году были впервые описаны члены семейства хемотаксических цитокинов (хемокинов)

низкомолекулярных консервативных белков, обладающих как структурным, так и функциональным сходством - способностью привлекать лейкоциты в очаг повреждения (Baggiolini et al, 1994).

Семейство хемокинов состоит из небольших (8-10 кДа), индуцибельиых белков, обладающих провоспалительной активностью и имеющих 20-50% гомоди! ии аминокислотной последовательности. Семейство хемокинов подразделяется на группу а-хемокинов, в молекуле которых между первым и вторым цистеиновым остатком содержится аминокислота (они также часто обозначаются как С-Х-С хемоктш), и Р-хемокинов, в структуре которых первый и второй цистеин связаны непосредственно между собой (обозначаются как С-С хемокины), (Ben-Baruch et al, 1995).

Одним из важнейших представителей семейства С-Х-С хемокинов является интерлейкин-8 (Ломакин И. и соавт., 1993). ИЛ-8 был открыт как хемотаксичесшй фактор для нейтрофнлов, продуцируемый моноцитами периферической крови в ответ на стимуляцию бактериальным липополисахаридом (ЛПС) (Yoshimura et al, 1989). Дальнейшие исследования показали, что ИЛ-8 не является продуктом исключительно моноцитарно-макрофагального происхождения В настоящее время ИЛ-8 рассматривается как центральный медиатор неспецифической защиты организма, продукция которого клетками различных типов очень быстро инициируется под действием неспецифических факторов, таких как травма, изменения парциального давления кислорода, а также бактериальных продуктов (Baggiolini et al, 1994). Кроме тою, синтез ИЛ-8 в клетках различных типов индуцируется под действием провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухолей-а и интерлейкин-1 (Mukaida and Matsushima,1992, Кетлинский С и соавт., 1992).

Способность ИЛ-8, как и других хемокинов, вызывать миграцию лейкоцитов обусловлена наличием на поверхности последних специфических рецепторов. В 1991г были клонированы

два различных рецептора ИЛ-8 человека, рецептор типа 1, или А, и рецептор типа 2, или В (Holmes et а/, 1991; Murphy and Tiffany, 1991). кДНК рецепторов кодируют белки размером 350 и 360 аминокислот, с гомологией аминокислотной последовательности в 77%. Последовательности обоих рецепторов содержат семь трансмембранных доменов по 20-25 аминокислот с вероятной а-спиральной структурой, что является характерным для рецепторов, связанных с G-белками. N-концевой участок и вторая экстраклеточная петля содержат потенциальные сайты гликозшшрования. .

В дальнейшем был описан выраженный полиморфизм рецепторных белков нейтрофилов, связывающих ИЛ-8, по молекулярной массе. Методом иммобилизации радиоактивно меченого лиганда на рецепторе при помощи перекрестно-сшивающих агентов было выявлено помеиьшей мере 4 комплекса лиганд-рецептор с различной молекулярной массой (Besemer et al, 1993). Причиной подобного полиморфизма может служить, с одной стороны, существование ранее не описанных рецепторных белков, связывающих ИЛ-8, с другой стороны различия в молекулярной массе комплексов могут объясняться различными 1юстгрш1сляпи0нныш1 модификациями известных рецепторных белков.

Рецептор ИЛ-8 первого тепа является основным рецептором, обеспечивающим хемотаксис нейтрофилов человека а ответ на ИЛ-8 (Hammond et al, 1995). Экспрессия этого рецептора на других типах лейкоцитов может являться маркером, указывающим на возможность хемотактического ответа этих клеток на данный цитокин. Изучение экспрессии рецептора ИЛ-8 на лейкоцитах позволит глубже понять механизмы формирования тканевых инфильтратов, процессов рециркуляции лимфоцитов. Изменение уровня экспрессии рецептора Ш1-8 на зрелых полиморфноядерных лейкоцитах может, по-видимому, служить одним из маркеров функционального состояния клеток - их способности реагировать на действие специфического агониста.

Не изучена экспрессия рецепторов ИЛ-8 на клетках-предшественниках кроветворения как в норме, так и при онкогематологической патологии. Известно, что клеточный состав воспалительного инфильтрата будет определяться спектром продуцируемых хемокинов с одной стороны и экспрессией специфических рецепторов и адгезивных молекул с другой. Важно отметить, что миграция и взаимодействие с основными группами адгезионных молекул лежит ■ основе процесса иегастазироваши. Можно предположить, что развитие лейкемнческих инфильтратов может определяться системой тканевых хемокинов, в частости, ИЛ-8 и хемокиновых рецепторов на лейкозных клетках. Не исключено, что рсцсшор ИЛ-8 первого типа может быть использован в качестве маркера дифферент!ровки клеток мнедошного ряда.

Поскольку ИЛ-8 является одним из важнейших медиаторов воспалительного процесса, поиск и разработка специфических и селективных ингибиторов этого цитокина будет иметь важное значение как для понимания механизмов воспалительного процесса, так и для целенаправленного воздействия на звенья его патогенеза. Разработка методов определения экспрессии рецептора иа клетках является необходимой для изучения функциональных характеристик клеток, их роли в формировании воспалительного инфильтрата. Специфичным инструментом, пригодным для выполнения указанных задач являются моноклональные антитела, пригодные для определения экспрессии рецептора методом проточной цитофлуориметрии и способные ингибировагь связывание ИЛ-8 с рецептором.

Цели настоящего исследования-.

а)изучить свойства поверхностных рецепторных белков ИЛ-8 на нейтрофилах человека и установить их возможное соответствие к продуктам экспрессии генов рецепторов ИЛ-8 первого и второит типа; б) получить моноклональные антитела, способные специфически распознавать рецептор ИЛ-8 первого типа; в) изучить экспрессию рецептора ИЛ-8 первого типа на клетках периферической крови человека к «а клетках некоторых форм миело- и лимфолейкозов.

Задачи работы:

1) Изучить спектр рецепторных белков, связывающих ИЛ-8, на поверхности нейтрофилов человека методом иммобилизации радиоактивно меченого лиганда на рецепторах с последующим электрофоретическим разделением комплексов лиганд - рецептор.

2) Используя ретровирусные векторы, получить линии клеток на основе мышиных фибробластов ВАЫЗЗТЗ, конститутивно экспресснрующие фунциональные рецепторы ИЛ-8 первого и второго типа человека.

3) Сравнить свойства поверхностных рецепторных белков ИЛ-8 на нейтрофилах человека в сравнении с рецепторными белками, полученными при экспрессии кДНК рецепторов ИЛ-8 первого и второго типов.

4) Получить моноклональные антитела к рецептору первого типа ИЛ-8, способные распознавать нативный рецептор на нейтрофилах человека.

5) Методом проточной цитофлуориметрии изучить экспрессию рецептора ИЛ-8 первого типа на клетках периферической крови человека и на клетках некоторых форм миело- и лимфолейкозов.

6) Изучить возможность получения специфического иммунного ответа при иммунизации мышей линии ВАЬВ/с сингенными продуцентами искусственно экспрессированного человеческого трансмембранного белка. Научная новизна

Полученные нами данные показывают, что рецептор первого типа ИЛ-8, синтезируется в эукариотических клетках в виде двух форм - основной 70 «Да и минорной 45 кДа. Впервые показано, что рецептор второго типа синтезируется в эукариотических клетках в виде двух форм - основной 58 кДа и минорной 45 кДа. Впервые показано, что продукты экспрессии кДНК рецепторов ИЛ-8 первого и второго типа в эукариотических клетках соответствуют по молекулярной массе трем основным формам рецепторов ИЛ-8, обнаруженным на нейтрофилах.

Полученные моноклональные антитела ЕЗ специфически связываются с М-концевой *

частью молекулы рецептора ИЛ-8 первого типа, пригодны для определения экспрессии рецептора ИЛ-8 первого типа человека методом проточной цитофлуориметрии на поверхности различных клеток и обладают способностью специфически ингибировать связывание лиганда.

Впервые изучена экспрессия рецептора ИЛ-8 первого типа на клетках различных форм -лимфо- и миелолейкоза. Показано, что рецептор ИЛ-8 первого типа не экспрессируется в определимых количествах на ранних клетках миелоидного ряда (миелоидная и миеломоноцитарная стволовая клетка) и может быть экспрессирован на более зрелых клетках -миелобластах, промиелоцитах и ыиелоцитах. Рецептор может также экспрессироваться на клетках некоторых форм лимфолейкоза, в частности, хронического В-клеточного лейкоза.

Практическая значимость

Получены линии клеток на основе линии мышиных фибробластов ВА1ЛЗТЗ, конститутивно экспрессирующие рецепторы ИЛ-8 первого и второго типа человека. Данные линии могут быть использованы для изучения особенностей взаимодействия рецепторов с лнгандами, а также получения специфических шггисыворогок и моноклональных антител к различным детерминантам рецепторов. Полученные ретровирусные векторные конструкции, несущие I своем составе кДНК рецепторов ИЛ-8 первого и второго типа могут быть использованы для экспрессии рецепторов в различных клетках-мишенях.

Получены моноклональные антитела, распознающие нативный рецептор ИЛ-8 первого тела, пригодные для изучения экспрессии рецептора ка клетках игтедем проточной цмгофлуоримсгрш и способные специфически ингибировать связывание Лиганда. Исподьюмние антител к рецептору ИЛ-8 представляется перспективным для дополнительной фенонишческой характеристики оейкозных клеток.

Положения, выносимые на защиту:

1. На поверхности иейтрофилов присутствует 3 основных белка, способных связывать ИЛ-8, с молекулярной массой 45, 58 и 70 кДа и минорный белок с молекулярной массой 37 кДа.

2. Продукты экспрессии кДНК рецептора ИЛ-8 первого типа в эукариотических клетках представляют собой два белка с мол. массами 70 и 45 кДа, а продукты экспрессии кДНК рецептора ИЛ-8 второго типа представлены двумя белками с мол. массами 58 и 45 кДа. Гетерогенность поверхностных белков нейтрофилов, связывающих ИЛ-8 связана с различными формами посттрансляционных модификаций известных генов рецепторов первого и второго типа.

3. Моноююнальные антитела ЕЗ специфически распознают рецептор ИЛ-8 первого типа на нейтрофилах человека и рецептор, экспонированный на фибробластах при переносе кДНК рецептора ИЛ-8 первого типа и обладают способностью специфически ингибироватъ связывание ИЛ-8 с рецептором.

4. Рецептор ИЛ-8 первого типа экспрессируется на нормальных периферических нейтрофилах, ЫК-клетках, небольшой субпопуляции моноцитов и Т-клеток.

5. Рецептор ИЛ-8 первого типа не экспрессируется в определимых методом проточной цитофлуориметрии количествах на ранних клетках миелоидного ряда (миелоидная и миеломоноцитарная стволовая клетка) и в некоторых случаях экспрессируется на более зрелых клетках - миелобластах, промиелоцитах и миелоцитах.

6. Рецептор ИЛ-8 первого типа экспрессируется на СГ)5+/СП20 и клетках в некоторых случаях хронического В-лимфолейкоза. Рецептор ИЛ-8 первого типа экспрессируется также на минорной субпопуляции СО 19+ тонзиллярных В-клеток.

Апробация диссертации

Материалы работы были доложены на IV съезде иммунологов и аллергологов Республики

Беларусь (Гродно, 1995), Международной конференции "СПИД, рак и родственные

проблемы" (Санкт-Петербург, 1996).

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 10 работах.

Обьем и структура диссертации

Диссертация включает введение, главы "обзор литературы", "материалы н метолы",

результаты исследований в 4 главах, главу "обсуждение результатов исследований" н

выводы. Работа изложена на 94 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 3 таблицы и список использованных источников из ИЗ наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ НА ОСНОВЕ BALB3T3, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ РЕЦЕПТОРЫ ИЛ-8.

Нами были получены ретровирусные конструкции, содержащие кДНК рецептора первого и второго типа ИЛ-8 под контролем ретровирусного промотора/энхансера, расположенного в LTR, и ген устойчивости к G418 (neo) под контролем раннего промотора вируса SV40 (рис. 1).

pESVNco

Рис. 1. Структура рекомбинантного ретровирусного вектора pESVNeo, несущего кДНК рецептора первого или второго типа ИЛ-8. S'-UTR и З'-LTR - длинные концевые повторы, PBS - сайт связывания пролиновой тРНК, NEO - ген неомицинфосфотрансфераэы, РРТ - сайт праймирования синтеза плюс цепи ДНК провируса, Pr SV40 - ранняя область вируса SV40, содержащая экхшсер/промотор транскрипции, «у - область, ответственная за упаковку вирусных РНК в вирнон, Ш18Р тал 1 и ИЛ-8Р тип 2 - кДНК рецептора первого или второго типа ИЛ-8. Сайты рестрикции: В г ВшпИ; С - С1Л, Е - £coRl; EV - £coRV; Н - HrnAü, К -КрпЛ; Р - PslY, Se - SacI; S - Sail; X - Xhol.

Подученные койструю^к вгедшиз иетадаи Са-фесфатной преципитации в аыфотропиую упаковывающую линию РАЗ 17 с последующей селекцией на среде с антибиотиком G418. Подученные колонии устойчивых клеток объединяли и использовали дм сбора супернатантов, содержащих рекюмбннантные ретровирусные вирионы. Титр рекомбинантиых вирионов,

оцененный в тесте на клетках МН ЗТЗ, составил 1,2 х103 КОЕ/мл для вектора, содержащего кДНК рецептора 1 типа и 0,9х103 КОЕ/мл для вектора, содержащего кДНК рецептора второго типа. Клетки линии ВА1.В ЗТЗ инфицировали рекомбинантными вирионами с последующей селекцией колоний устойчивых клеток. Показано, что инфицированные клетки приобретали способность связывать радиоактивно меченый ИЛ-8. Специфичность связывания подтверждается подавлением связывания возрастающими концентрациями немеченого лиганда и отсутствием связывания лиганда в контроле (с неинфицированными клетками линии ВАЬВЗТЗ). Количество лиганд-связывающих сайтов на клетку, по нашим оценкам, составило 2x10* для рецептора первого типа и « 8x103 для рецептора второго типа. Матричную РНК рецепторов первого и второго типа ИЛ-8 в клетках, устойчивых к 0418, выявили методом Нозерн-блотинга.

Чтобы оценить молекулярную массу рецепторов ИЛ-8 на поверхности нейтрофилов человека, мы иммобилизировали меченный |251 ИЛ-8 на рецепторе при помощи перекрестно-сшивающего агента ОЭЭ, электрофоретически разделили полученные комплексы и оценили их молекулярные массы. Молекулярные массы комплексов лиганд-рецепчор, определенные по расположению полос на радиоавтографе относительно маркеров молекулярной массы, включают массу собственно белка рецептора и связанного с ним меченого лиганда. Далее по тексту во всех случаях будут указаны молекулярные массы рецепторных белков за вычетом массы лиганда (8 кДа).

На нейтрофилах было выявлено три основных белка, связывающих ИЛ-8, - 70, 58 и 45 кДа, а также минорный белок с мол. массой 37 кДа, который, по данным денситометрии, составлял не более 5 % общей интенсивности радиоавтографа (рис 2).

Используя указанный метод, мы показали наличие рецепторных белков 70 и 45 кДа на поверхности фибробластов ВАЬВЗТЗ, содержащих кДНК рецептора ИЛ-8 первого типа (рис. 2). При более короткой экспозиции отчетливо выявлялась лишь основная полоса, соответствующая рецепторному белку 70 кДа. Контролем служили исходные фибробласты ВАЬВЗТЗ, которые, по предварительным данным, не связывают специфически меченный |251 ИЛ-8. Стократный избыток немеченого ИЛ-8 полностью подавлял образование комплексов (не показано). Используя вышеописанную методику, мы оценили молекулярную массу рецептора ИЛ-8 2 типа, экспрессированного в клетках ВАЬВ ЗТЗ. На радиоавтографе были получена основная полоса соответствующая рецепторному белку массой 58 кДа и менее выраженная полоса, соответствующая белку массой 45 кДа (рис. 3). Таким образом, рецептор ИЛ-8 второго типа, экспрессированный. в эукариотических клетках, представлен в виде двух бслкоп различной молекулярной массы - 45 и 58 кДа, являющихся продуктом различной посттраснслянионной модификации одного исходного полипспгида Выявленные в клпкд*

ВАЦВЗТЗ, экспрессирукмцих известные рецепторы Ш1-8, формы рецептора соответствуют по молекулярной массе трем основным формам, обнаруженным на нейтрофилах.

С) ¡J, (2)

78кДа-... ЯЙ^р 78 «Да—

6« «Да — И 66 кД»—

Í3-55 «Да Ар S3 35 «Да —

«»Да- 45 *Д«- —

ы

к

Рис. 2. Радиоавтографы гелей после электрофоретического разделения солюбилизированных ^-40 белков мембран нейтрофилов и клеток ВАЬВЗТЗ, предынкубированных с 10 нг [|251]-1Ь-8 и обработанных 088. Полосы соответствуют расположению комплексов лиганд-рецептор. а -нейтрофилы, б - клетки ВАЬВЗТЗ, зкспрессирующие рецептор ИЛ-8 первою типа, в -исходные клетки ВАЬВЗТЗ. Экспозиция 5 сут. (1) и 14 сут. (2). Представлены результаты двух независимых опытов. Стрелками указано расположение маркеров молекулярной массы (ЦСВ).

12 3

' Ш Ш ччр

45 кДа_____________ .Ml Яр

29кДи ....... .....J:

. .! -t. Já I-I ДЬ »á Г . ... * . '

Рис. 3. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения солюбилизированных NP-40 белков ыембран нейтрофилов и клеток ВАЬВЗТЗ предынкубированных с 10 нг [I251J-U.-S ы о5р-5огашцх DSS. Полосы соответствуют расположению комплексов лиганд-рецептор. 1 -ней1рофили, 2 - клетки BALB ЗТЗ, зкспрессирующие рецептор ИЛ-8 второго типа, 3 -иидиденис сишиаши (w5l|-IL-8 а присутствии 1000 нг немеченого ИЛ-8 Стрелками указано ршиижшсиис маркеров молекулярной кассы ("Serva").

ИММУНИЗАЦИЯ МЫШЕЙ ЛИНИИ BALB/c СИНГЕННЫМИ ПРОДУЦЕНТАМИ РЕЦЕПТОРА ИЛ-8.

При получении антител к поверхностным антигенам клеток человека используется несколько подходов. В некоторых случаях используют иммунизацию целыми живыми клетками. Однако этот подход осложняется наличием большого числа посторонних антигенов, часто более иммуногенных, чем нужный исследователю. Иногда выделение чистого антигена невозможно из-за нарушения его структуры и изменения антигенных свойств. Избежать перечисленных затруднений теоретически возможно при иммунизации клетками, генетически идентичными для иммунизируемых животных, экспрессирующими искомый антиген Мы иммунизировали мышей инбредной линии BALB/c сингенными фибробластами линии BAI.B3T3, экспрессирующими рецептор ИЛ-8 первого типа (BAI.B3T3T1).

Процедура иммунизации состояла из 5 инъекций по 12-15 млн клеток BALB3T3T1, обработанных митомицином С внутрибрюшинно с интервалом 2-2,5 нед. Сыворотку крови иммунных животных получали на 10 день после последней иньекции Иммунный ответ оценивали в прямом ИФА с fusion-белком, содержащим N-концевой пептид рецептора первого шла (GST-Type 1), а также методом проточной цитофлуориметрии . с использованием нейтрофилов человека.

Показано, что мышиные сыворотки реагировали с GST-Typel с титром более чем 1:5000 и не реагировали с контрольным антигеном (GST) (рис 4). Кроме того, антигела сыворотки иммунных животных связывались с нейтрофнлами человека по данным проточной цитофлуориметрии.

Рис. 4. Прямой ИФА с сыворотками мышей, иммунизированных сингенными продуцентами 1 и 2 -иммунные животные; а - титровка сывороток на GST -Typel, Ь - ттропка на кон ¡рольном белке GST. Значения но оси X соответствуют рачвелениям образцов сыворотки niai ом в 2, начиная с ра (ведения 1.80. .

Полученные данные указывают на возможность применения описанного подхода для-эффективной иммунизации с целью получения антител к поверхностным антигенам клетки.

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОПАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К РЕЦЕПТОРУ I ТИПА ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ЧЕЛОВЕКА.

При скрининге около 1200 гибридом, полученных при слиянии спленоцитов мышей, иммунизированных Лвшп-белками, содержащими Ы-концевые .последовательности рецепторов к Ш1-8 первого и второго типа (08Т-Туре1 и С8Т-Туре2), было выявлено 8 клонов, продуцирующих антитела, реагирующие с Н-концевыми пептидами рецепторов первого и второго типа и 2 клона, продуцирующих антитела к глютатион-8-трансферазе. Гибридомы были клонированы и охарактеризованы по специфичности .

Как видно из таблицы 1, антитела, продуцируемые гибридомой ЕЗ, способны распознавать нативный рецептор, экспрессированный на поверхности нейтрофипов человека. Специфичность взаимодействия подтверждена данными прямого ИФА, в котором антитела ЕЗ распознают исключительно йшоп-белок, имеющий в своем составе 30 аминокислот Ы-концевой части молекулы рецептора первого типа (не показано).

Табл.1

Клон Специфич- Изотип Связывание с Связывание с

гибридомы ность трансфектантами нейтрофнламн

в ИФА (ВАГВЗТЗТ1и

ВАЬВЗТЗГС)

F12 GST-Type2 IgGl.K нет нет

118-1. GST-Type2 IgGl.K нет нет

F-8 GST-Type2 IgGl.K нет нет

D9 GST-Type2 и.о.* нет нет

Е6 GST-Type2 HO. нет н.о.

DI2 GST-Type2 lgG2b,K** ВАШЗТЗТ2 нет

ВЗ-П11 GST и.о. и.о. но.

F6 GST-Type 1 и.о. н.о. нет

ЕЗ GST-Type 1 IgGl.K ВА1ВЗТЗТ1 да

* но- не определяли.

** Данная гибридома продуцировала тяжелые цепи двух изотипов - и В

сшиьшнни ашшеиа (Ов Г-Гуре2), но данным ИФА, участвует ¡ц<32Ь цепь, но не цепь.

. Антитела НЗ и 012 способны распознавать соответствующий иммуноген в иммуноблоттинге, что свидетельствует о том, что они связываются с неконформационныш детерминантами белка, образованными первичной аминокислотной последовательностью

По данным проточной цитофлуориметрии, антитела ЕЗ связываются с клетками ВАЬВЗТЗТ1, но не клетками ВАШЭТЗТ2. Они также не взаимодействуют с клетками ВА1ЛЗЗТЗ, содержащими "пустой" ретровирусный вектор без кДНК рецептора (не показано).

Максимальная флюоресценция нейтрофилов достигается при соотношении 2,5 мкг антител ЕЗ на 1 млн. нейтрофилов. Антитела ЕЗ ингибировапи более 95% специфического связывания ИЛ-8 с клетками ВА1.ВЗТЗТ1 при молярном соотношении 1:625 ИЛ-8 к антителам (рис. 5).

Ингибироваине связывания меченого Иг8 с клетками ВАЬВЗТЗ И монокпоиальными антителами КЗ.

Концентрация ЕЗ, мкг/мл. Рис. 5. Ингибирование связывания радиоактивно меченого ИЛ-8 в клетками ВА1ВЗТЗТ1 Клетки преинкубировали с возрастающими концентрациями антител, затем добавляли радиоактивно меченый ИЛ-8 до конечной концентрации 10 нг/мл; после" инкубации отмывали и оценивали связанную с клетками радиоактивность на у-счетчике.

Мы оценили также способность антител ЕЗ ингибировать связывание меченого ИЛ-8 с нормальными нейтрофилами человека. Антитела ЕЗ не вызывали ожидаемого эффекта подавления связывания лиганда при использовании нейтрофилов человека. В 6 независимых эклериментах удалось добиться подавления связывания не более чем на 28 % (17,8 ± 8%) Способность антител ЕЗ ингибировать миграцию нейтрофилов в ответ на интсрлейкин-8 была изучена методом хемотаксиса под агарозой по Ые1ьоп е! а!., 1975. Моноклоналыш^, игпгтеш ЕЗ обладали способностью практически полностью ингибировать миграцию нейтрофилов в ответ па интерлейкин-8, но не на ГМ1.Р

Таким образом, полученные антитела ЕЗ специфически связываются с N-концевой частью мплехулы рецептора ИЛ-8 первого типа, пригодны для определения экспрессии рецептора ИЛ-8 первого типа человека методом проточной цитофлуориметрии на поверхности различных «легок н обладают способностью специфически ингибировать связывание лиганда.

ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРА ИЛ-8 ПЕРВОГО ТИПА ПА НОРМАЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И КЛЕТКАХ НЕКОТОРЫХ ФОРМ ЛЕЙКОЗА.

Экспрессия рецептора первого типа ИЛ-8 человека на различных типах лейкоцитов была изучена методом проточной цитофлуориметрии с применением моноклональных антител ЕЗ и панели моноклональных антител к различным маркерам дифференцировки клеток.

Наибольший уровень экспрессии рецептора ИЛ-8 первого типа наблюдается на полиморфнонуклеарных лейкоцитах человека (рис. 6). Во фракции лимфоцитов выявляется слабоположительная субпопуляция, составляющая 4-25 % клеток (не показано).

По данным двуцветного окрашивания, слабоположительно окрашивается до 64% CD56+ клеток (рис. 7), и 7-10% CD8+ Т-лимфоцитов (не показано). Антитела ЕЗ выявляют минорную субпопуляцию моноцитов, несущих низкое количество рецепторов,- составляющую не более 12% клеток.

Нами также исследована экспрессия рецептора ИЛ-8 первого типа на клетках периферической крови человека при некоторых злокачественных заболеваниях кроветворной системы. Для анализа отобраны образцы, в которых при анализе на проточном цитофлуориметре возможно выделение региона, содержащего не менее 80% клеток определенного фенотипа. Фенотип клеток определялся с использованием панели моноклональных антител к иммунологическим маркерам дифференцировки лимфоидных и миелоидных клеток, рекомендуемой Becton Dickinson (van Dongen et al, 1988).

Клетки, соответствующие по фенотипу миелоидной стволовой клетке (МО, 1ILA-OR t, CD34+, CD13±, CD7±, CD33±, CD15-) не экспрессировали определимое количество рецепторов на поверхности (п=3).

Клетки, имеющие фенотип миеломоноцитарной стволовой клетки (Ml, HLA-DR+, CD34 f , CD13+, CD33+, CD14±, CD15±) не экспрессировапи рецептор (п=3). Однако следует отметить, что во всех трех исследованных случаях ОМЛ Ml в периферической крови и костном мозге содержалось аномально высокое количество клеток феншинически соответствующих моноциту (HLA-DR+, CD34 -, CD13+, CD33+, CD14+, CD11Ы).

Рис. 6. Экспрессия рецептора ИЛ-8 первого типа на нормальных моноцитах и полиморфнонукпеарных лейкоцитах (ПМЛ) периферической крови. А - распределение клеток периферической крови по прямому (Р8С-Н) и боковому (ввС-Н) светорассеиванию. Выделенные регионы соответствуют Ш - лимфоциты, К2 - моноциты, НЗ -полиморфнонуклеарные лейкоциты. В - гистограмма, отражающая экспрессию рецептора ИЛ-8 на моноцитах; 1 - контрольные антитела, 2 - антитела ЕЗ. С - гистограмма, отражающая экспрессию рецептора ИЛ-8 на ПМЛ; 1 - контрольные антитела, 2 - антитела ЕЗ.

А В

Рис. 7. Двуцветное окрашивание лимфоцитов периферической крови антителами ЕЗ и анти-CD56. А - распределение клеток по прямому и боковому светорассеиванию и выделение анализируемого региона, В - распределение по интенсивности флуоресценции. Ось FL1 -интенсивность флуоресценции по ФИТЦ (ЕЗ), FL2 - по ФЭ (CD56) в регионе R1 (лимфоциты). В правом верхнем квадрате части В находятся клетки положительные по обоим маркерам ( 14% от лимфоцитарного региона или 72% от CD56+клеток).

Они составили 37% - 49% лейкоцитов периферической крови у обследованных пациентов. Моноклональные антитела ЕЗ окрашивали 40-60% клеток моноцитарного фенотипа • трех случаях.

На лейкемических клетках, соответствующих миелобласту по набору феиошпичестгх маркеров (М2, HLA-DR± , CD34+, CDI3<-, CD33+, CDI5+) обнаружена экспрессия ИЛ-»

рецептора в одном из двух случаев. Более 50% (по отношению к контролю) субпопуляции клеток с данным фенотипом связывало антитела ЕЗ.

Клетки с фенотипом, соответствующим промиелоцигу (МЗ, HLA-DR- , CD34±, CD13+.CD33+, CD15±, CD11Ь±) в 2 из 4 случаев выявлена экспрессия рецептора ИЛ-8 (20% и 27% окрашенных клеток то отношению к контролю). В одном случае монобластного лейкоза на CD 14+ клетках не было выявлено экспрессии рецептора ИЛ-8 первого типа.

При хроническом миелолейкозе (п=Э) на клетках с фенотипом миелоцита (CD13+, CD33+, CD15+, CD11Ы-) в двух случаях выявлена экспрессия рецептора (29% и 38% окрашенных клеток по отношению к контролю). На клетках острого В-лейкоза с фенотипом пре-пре-В клетей (HLA-DR+, CD34+, CDU>+, CD19+.CD20-) (п=3) экспрессии рецептора не было выявлено.

Экспрессия ИЛ-8 рецептора первого типа обнаружена на 80% анализируемых клеток в двух случаях хронического В-лимфолейкоза из восьми исследованных (рис.9). Как показывают наши исследования и данные других авторов, нормальные CD19+ В- лимфоциты периферической крови не экспрессируют рецептор ИЛ-8 первого типа

Мы предположили, что рецептор ИЛ-8 может экслрессироваться на нормальных клетках В-лимфондного ряда. С этой целью мы проанализировали экспрессию рецептора W1-8 первого типа на тонзюшяряых лимфоцитах, используя метод двуцветного окрашивания.

Показано, «гто тонзиллярные лимфоциты содержат фракцию CD194 В-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор ИЛ-8 первого типа (п~5) Размер этой субпопуляции составлял 2,4 - 15,2 % анализируемых лимфоцитов.СТ)19 негативные лимфоциты, т.е. не В-клетки не связывали антитела ЕЗ (рис. 8).

А В

М1И

Яг"

flHWlHWttftl

Г^.Ч^ЧС-ИИаМ ->

Рис. 8. Экспрессия рецептора ИЛ-8 первого типа на тонзиляярньгх лимфоцитах. А -анализируемый регион (К I, лимфоциты), В - гистограмма, отражающая экспрессию рецептора ИЛ-8 на лимфоцитах. С - точечная диаграмма, отражающая результаты окрашивания тонзиллярных лимфоцитов по двум маркерам - СО 19 (фикоэритрин) и ЕЗ (ФИТЦ).

Пациеит 1 А 'В

Пациент 2 А

Рис. 9. Экспрессия рецептора ИЛ-8 первого типа на клетках В-ХЛЛ. Представлены данные исследования лимфоцитов периферической крови двух пациентов. А- анализируемый лимфоцитарный регион, В - гистограмма, отражающая интенсивность флуоресценции клеток. 1 - клетки, окрашенные контрольными антителами, 2 - клетки, окрашенные антителами ЕЗ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В настоящее время в литературе имеются противоречивые данные о молекулярной массе белков, связывающих ИЛ-8 на поверхности нейтрофилов человека. В работе Grab et al. (1990)описан предполагаемый рецептор с мол. массой равной- 58 кДа. Moseret al. (1991) обнаружили два белка, связывающих ИЛ-8, с мол. массой 44 и 70 кДа, из которых белок 70 кДа, вероятно, представляет собой рецептор первого типа, связывающий ИЛ-8 с более высоким сродством, чем другие хемокины. Сходные результаты были получены Samanta et al. (1989). В работе Besemer et al. (1993) описаны четыре белка нейтрофилов - 73,70,57 и 47 кДа, из которых белки 73 и 70 кДа имеют высокое сродство к ИЛ-8, тогда как белок с мол. массой 47 кДа имеет высокое сродство и к ИЛ-8 н к NAP-2 . Schumacher et al..(1992) показали, что низкомолекулярный рецептор (44-59 кДа, по данным этих авторов) соответствует, по-видимому, рецептору первого типа ИЛ-8. В более поздней работе Schnitzel et al. (1991), используя перекрестно-сшивающие агенты показали, что иол. месса рецептора второго типа ИЛ-8, синтезированного в клетках COS-1, составляет 45 кДа. Сходные данные получены Mueller et al. (1995), которые выделили рецептор второго типа, продуцируемый клетками линии 3ASubE, методом иммунопрецилитации.

Полученные нами данные показывают, что рецептор первого типа ИЛ-8, синтезируется в эукариотических клетках в виде двух форм - основной 70 кДа и минорной 45 кДа, а рецептор второго типа - основной 58 кДа и минорной 45 кДа. Учитывая наличие в рецепторах потенциальных сайтов гликозилирования, можно предположить, что гетерогенность связана со степенью гликозилирования (исходя из последовательности кДНК, оба рецептора должны иметь мол. массу около 40 кДа (Holmes et al., 1991; Murphy and Tiffany, 1991).

Выявленные в настоящей работе формы рецептора соответствуют по молекулярной массе трем основным формам, обнаруженным на нейтрофилах. Минорный белок нейтрофилов с мол. массой 37 кДа может представлять собой негликозилированную форму рецептора, либо являться продуктом деградации более высокомолекулярных белков (Brandt et al. 1991).

Нельзя исключить, что выявленный рецепторный белок нейтрофилов с мол. массой 37 кДа не относится к известным типам рецептора. Последнее предположение косвенно подтверждается тем фактом, что полученные недавно высоконейтрализующие моноклональные антитела к обоим известным типам рецептора при совместном применении подавляют связывание ИЛ-8 с нейтрофилами человека не более чем на 70 % (Chuntharapai et al., 1994).

Способность ионоклоналышх антител ЕЗ подавлять связывание ш1-меченого ИЛ-8 с рецептором была изучена с использованием клеток BALB3T3T1 и нейтрофилов человека. Показано, что моноклональные антитела ЕЗ подавляли связывание ИЛ-8 с клетками BALB3T3T1 более чем на 95 % при молярном соотношении лиганд-антитело 1:625. В тоже время антитела ЕЗ не вызывали,ожидаемого эффекта подавления связывания лиганда при использовании нейтрофилов человека. По данным литературы, соотношение двух типов рецептора на поверхности нейтрофилов человека 1:1, или сдвинуто в сторону преобладания рецептора первого типа (Lee, J. et al., 1992; Hammond et al., 1995). Таким образом, ожидаемое подавление связывания ИЛ-8 антителами ЕЗ с нейтрофилами человека должно достигать 50% или выше. Однако в 6 независимых экперимснтах удалось добиться подавления связывания не более чем на 28 % (17,8 ± 8 %). Сходный результат (10 - 30% подавления связывания с нейтрофилами) был описан Chuntarapai et al., (1994), которые использовали моноклональные антитела сходной специфичности, способные более чем на 95 % мигрировать связывание с клетками К293, трансфецированными кДНК рецептора 1 типа. Подобное расхождение может быть обусловлено взанмодейтвием рецептора нейтрофилов человека с другими, специфичными для нейтрофило» мембранными Селкаит, exasusaгош:;.и.ч влияние на связывание лиганяэ и/или антител. Антитела ЕЗ вызывали почти полное подавление хемотактического ответа на ИЛ-S. Эти данные указывают на несоответствие подавления

функциональных свойств рецептора й подавления физического связывания ИЛ-8 с нейтрофилами.

Изучение механизмов миграции лейкоцитов играет важнейшую роль в понимании патогенеза многих патологических состояний. Биологическая активность цитокинов в отношении клеток-мишеней определяется наличием на поверхности последних функциональных специфических рецепторов.

Методом проточной цитофлуориметрии мы изучили экспрессию основного хемотактического рецептора к ИЛ-8 ( рецептора 1 типа) на поверхности нормальных лейкоцитов периферической крови человека. Наибольшее количество рецепторов, как и ожидалось, экспрессируется на поверхности полиморфноядерных лейкоцитов человека. С меньшей интенсивностью окрашивались лимфоциты (не более 25% клеток лимфоцитарного региона). Методом двуцветного окрашивания было показано, что основную часть окрашенных лимфоцитов составляют ЫК-клетки и субпопуляци* Т-клеток. Эти наблюдения подтверждают ранее полученные данные о наличии у ИЛ-8 хемсггахсической активности в отношении Т-и ШС-клеток (Ьагееп М а!.. 1989; ЭеЬок е1 в1. (1993). Антитела ЕЗ выявляют минорную субпопуляцию моноцитон, несущих низкое количество рецепторов, составляющую не более 12% клеток.

На периферических В-лимфоцитах экспрессии рецептора ИЛ-8 первого типа не было выявлено, что подтверждает ранее полученные данные СЪшиагара] й а1. (1994) и МогоЬа5М с! а1 (1995).

Нами также исследована экспрессия рецептора ИЛ-8 первого типа на клетках периферической крови человека при некоторых злокачественных заболеваниях кроветворной системы. Показано, что рецептор ИЛ-8 первого типа не экспрессируется в определимых количествах на ранних клетках миелоидного ряда (миелоидная и миеломоноцитарная стволовая клетка) и может был. экспрессирован на более зрелых клетках - миелобластах, промиелоцитах и миелоцитах. Уровень экспрессии рецептора ИЛ-8 первого типа на этих клетках значительно ниже по сравнению с зрелыми нейтрофилами. Интересным представляется факт обнаружения выраженной экспрессии рецептора ИЛ-8 первого типа на мембране клеток с моноцитарным фенотипом в условиях патологии (ОМЛ.М1) в отличие от моноцитов здоровых доно^юв.

Значительный интерес представляет обнаруженная нами экспрессия рецептора ИЛ-8 на клетках некоторых случаев хронического В-лимфолейкоза (В-ХЛЛ), причем уровень экспрессии в двух случаях был высоким Полученные данные указывают на

возможную роль ИЛ-8 в регуляции В-лифопоуза, которая до настоящего времени не исследована. Показано, что у трансгекных мышей, у которых отсутствует рецептор.

гомологичный рецептору ИЛ-8, развивается лимфаденопатия с увеличением В-зон лимфоузлов

и количества В-лимфоцитов (Shuster et al.., 1995), Сообщалось также, что ИЛ-8 уменьшает

спонтанный и индуцированный дексаметазоном апоптоз в культуре клеток В-ХЛЛ (Francia-di-

Celíe, 1996). Таким образом, можно предположить, что ИЛ-8 рецептор может

зкспрессироватъся на определенной стадии развития клеток В-лимфоидного ряда и играть

роль в регуляции созревания клеток а также, возможно, процессов рециркуляции лимфоцитов.

Альтернативным объяснением может служить аберрантная экспрессия ИЛ-8 рецептора

первого типа как миелоидного маркера на лимфоидных клетках. (Morabito et al., 1987).

Мы предположили, что рецептор ИЛ-8 может экспрессироваться на нормальных клетках В-

лимфоидного ряда. Показано, что тонзиллярные лимфоциты содержат фракцию CD19+ В-

лимфоцитов, экспрессирующих рецептор ИЛ-8 первого типа. Размер этой субпопуляции

составлял 2,4 - 15,2 % анализируемых лимфоцитов.

Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения, что ИЛ-8 играет роль в

нормальном В-лимфопоэзе. Рецептор ИЛ-8 экспрессируется на небольшой субпопуляции

тонзиллярных В-лимфоцитов, что может говорить о стадиеспецифической экспрессии.

Экспрессия рецептора на малигнизированных клетках может, вероятно, служить

дополнительным маркером дифференцировки клеток.

Таким образом, нами впервые показана возможность экспрессии . основного

хгмотактического рецептора к ИЛ-8 на нормальных В-клстках и клетках В-ХЛЛ. В настоящее

время не известны специфические хемокины, опосредующие миграцию В-лимфоцитов.

Можно предположить, что ИЛ-8 является хемотаксическим фактором для В-клеток на

определенной стадии дифференцировки. При хроническом В-лимфолейкозе имеет место

аномальная рециркуляция патологических CD5+ В-лимфоцитов (Caligaris-Capio et al., 1996).

Эта может быть связано с измененной экспрессией рецепторов к хемотаксическим факторам

на злокачественных клетках.

i

ВЫВОДЫ

1. Показано существование трех основных" поверхностных белков на иейтрофилах человека, способных связывать ИЛ-8, с молекулярной массой 45-47, 58 и 70 кДа. Кроме того, показано существование минорного белка, связывающего ИЛ-8, с молекулярной массой 37 кДа.

2. С использованием ретровирусных векторов кДНК обоих типов рецептора ИЛ-8 человека Экспрессированы в мышиных фибробластах BALB3T3.

3. Продукты экспрессии кДНК рецептора ИЛ-8 первого типа в эукариотичсских клетках представляют собой два белка с мол. массами 70 и 45 кДа, а продукты экспрессии кДНК

рецептора ИЛ-8 второго типа представлены двумя белками с мол. массами 58 и 45 кДа. Гетерогенность поверхностных белков нейтрофилов, связывающих ИЛ-8, связана с различными формами посттрансляционных модификаций известных генов рецепторов первого и второго типа.

4. Получены моноклональные антитела ЕЗ против N-концевой части молекулы рецептора ИЛ-8 первого типа, специфически распознающие нативный рецептор на нейтрэфилах человека и рецептор, экспрессированный на фибробластах BALB3T3 при переносе кДНК рецептора первого типа, и обладающие способностью специфически ингибировать связывание ИЛ-8 с рецептором.

5 Показана экспрессия основного хемотактического рецептора ИЛ-8 первого типа на нормальных периферических нейтрофилах, NK-клетках, небольшой субпопуляции моноцитов и Т-клеток. Рецептор ИЛ-8 первого типа не экспрессируется в определимых методом проточной цитофлуориметрии количествах на ранних клетках миелоидного ряда (миелоидная и миеломоноцнтарная стволовая клетка) и в некоторых случаях экспрессируется на более зрелых клетках - миелобластах, промиелоцитах и миелоцитах.

6. Экспрессия рецептора ИЛ-8 первого типа обнаружена на CD5+/CD20+ клетках в некоторых случаях хронического В-лимфолейкоза. Рецептор ИЛ-8 первого типа экспрессируется также на минорной субпопуляции CD19+ тонзилляриых В-клеток.

7. Показана принципиальная возможность получения специфического иммунного ответа при иммунизации мышей лИнии BALB/c сингенными. продуцентами искусственно экспрессированного человеческого трансмембранного белка.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории клеточной и молекулярной иммунологии НИИ ГПК МЗ РБ г.Минск: Фомину И.К, Дорошенко Т.М., Смольниковой В. за помощь, оказанную при выполнении работы.

Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю, доктору медицинских наук Войтенку Н.Н., сделавшему возможным выполнение згой работы, за научное руководство и большую помощь при выполнении работы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. И. К. Фомин, ИИ. Тихонов, B.C. Прасолов, Н.Н. Войтенок. Перенос доминантных селективных генов при помощи ретровирусных векторов - простой и быстрый способ

получения гибридов гибридом// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология,-1993.-№8.-С. 31-34.

2. 1.1. Tikhonov, I.K. Foniin, Т.М. Doroshenko, Yu. V. Chaly, and N.N. Voitenok. Expression of human type 1 interleukin-8 receptor cDNA in fibroblasts BALB3T3 and characterization of the expression products// Molecular Biology.-1996.- V. 30,-№5-P. 600-604.

3. A.C. Чиж, А.Ж. Ребенок, И.И. Тихонов. Содержание, интерлейкина-8 в сыворотке крови, моче и отечной жидкости при нефротическом синдроме и хронической недостаточности кровообращения// Здравоохранение. -1997.-№2,- С.9-Ю.

4. I. Tikhonov, 1. Fomin, T. Doroshenko, Y. Chaly, N. Voitenok. Characterization of human receptor type I expressed in murine fibroblasts// Eur. Cytokine Netw.- 1996.-V.7- №3: 1-st Meeting of International Cytokine and Interferon Research Society, Geneva, Switzerland, October 10-16.

5. Тихонов И.И., Матсушима К., Войтенок Н.Н. Получение и характеристика моноклональных антител к N-концевым пептидам рецепторов Ш1-8 типа 1 и типа 2. // Тез. докл. Ill съезда Белорусского науч. общества иммунологов и аллергологов. Гродно, 7-9 июня 1995 г. / М-во здравоохр. Респ. Беларусь и др. - Гродно, 1995. с. 186-187.

6. Петевка Н. В., Лях Л.А., Тихонов И.И.,. Войтенок Н.Н. Иммуноферментное определение олигомерных форм цитокинов// Тез. докл. III съезда Белорусского науч. общества иммунологов и аллергологов. Гродно, 7-9 июня 1995 г. / М-во здравоохр. Респ. Беларусь и др. - Гродно, 1995. с. 168-169.

7. Тихонов И. И., Фомин И.К., Чалый Ю.В., Войтенок Ш1. Экспрессия двух типов рецептора ИЛ-8 в мышиных фибробластах BALB3T3 при помощи ретровирусных векторов. // Тез. докл. 111 съезда Белорусского науч. общества иммунологов и аллергологов. Гродно, 7-9 июня 1995 г. / М-во здравоохр. Респ. Беларусь и др. - Гродно, 1995. с. 187-188.

8. Фомин И.К., Тихонов И.И., Лобанова Л.Б., Харитончик С. А. ДНК-провирус может быть синтезирован только на одной матрице РНК диплоидного ретровирусного генома // Тез. докл. III съезда Белорусского науч. общества иммунологов и аллергологов. Гродно, 7-9 июня 1995 г. / М-во здравоохр. Респ. Беларусь - Гродно, 1995. с. 190-191.

9. A. Rebenok, I. Tikhonov, A. Chyzh. Discrepancies between urinary IL-8 leveKs in patients with glomerulonephritis and pyelonephritis// XXXIUrd Congress of the European Renal Association, European dialysis and Transplant Association June 18-21,1996, Amsterdam, The Netherlands.

10. 11. Tikhonov, I K. Fomin, T.M. Doroshenko, Yu. V. Chaly, and N N. Voitenok. Expression of human IL-8 receptor type 1 in murine fibroblasts and characterization of the expressed proteins// 4th'international Conference "AIDS, Cancer and Related Problems. St. Peters»™™ Russia M.™

21-25,1996

Локграфйгаеское притрите У времени« левами Г!

За*./№Ут»р. -iCi