Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клинико-патогенетическое значение полиморфизма генов при гломерулярных болезнях у детей

На правах рукописи

□ОЗОБЭЭ45

ПЕТРОСЯН ЭДИТА КОНСТАНТИНОВНА

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ПРИ ГЛОМЕРУЛЯРНЫХ БОЛЕЗНЯХ У ДЕТЕЙ

14.00.09. - Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-2007

003069945

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования « Российский Государственный Медицинский Университет» Федерального Агентства по Здравоохранению и Социальному Развитию и в НИИ педиатрии ГУ Научного центра здоровья детей РАМН

Научные консультанты:

Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Л И. Ильенко Доктор медицинских наук, профессор А Н Цыгин

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А Г Румянцев

Доктор медицинских наук, профессор В В Длин

Доктор медицинских наук, профессор В Г Пинелис

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический универси гет

Защита состоится « »_2007г в_ч на заседании Диссертационного Совета Д 208 072 02 при Российском Государственном Медицинском Университете (117997, г Москва, ул Островитянова, д 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Государственного

Медицинского Университета

Автореферат разослан « »_2007г

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Н П Котлукова

Памяти дорогого учителя, Альберта Вазгеновича Папаяна посвящаю Актуальность проблемы Развитие и прогрессирование хронического гломеруло-

нефрита остается одной из актуальных проблем в нефрологии

Гломерулонефрит являясь многофакторным заболеванием, характеризуется высокими темпами роста заболеваемости и инвалидизации детского населения в современных популяциях (Игнатова М С , 2005)

За последнее десятилетие приложены огромные усилия по изучению этиологии и патогенеза гломерулонефрита Зарубежными и отечественными исследованиями было показано, что в основе возникновения лежат сложные взаимодействия генетических факторов (Kaplan J and PollakM R et al,2001, Игнатова M С ,2005)

Для многофакторных заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды Однако для каждого конкретного заболевания можно выделить группу, так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии

Так, анализ многочисленных работ по ассоциациям различных классов генов ренин-ангиотензиновой системы с предрасположенностью развития гломерулонефрита продемонстрировал противоречивые данные, обусловленные характером сформированных групп ХГН Однако до сих пор не изучено влияние наиболее известного полиморфного маркера I/D гена ангиотензинпревращающего фермен-та(АСЕ) на особенности клинических и морфологических форм гломерулонефрита

До сих пор неустановленна причина гипергомоцистеинемии у больных хронической почечной недостаточностью(Висс1апИ G et al, 2002) Важной генетической определяющей уровня Нсу(гомоцистеина) плазмы в общей популяции является С677Т полиморфизм гена MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктазы) Наличие ТТ-генотипа ведет к закономерному повышению уровня Hey примерно в 2 раза по сравнению с СС-субьектами

( Jasques PF et al, 1996, Fodmger M et al, 1997) По данным японских ученых ТТ генотип может быть ассоциирован с ранним развитием и прогрессиронанием у детей с <PCrC(Zou С et al, 2002) Liangos О et al, 1998, проводя анализ выживаемости почечного трансплантата, обнаружили, что генотип ТТ обуславливал раннее отторжение почки Таким образом, несмотря на значительные успеш в изучении проблемы, до сих пор не получены окончательные ответы на целый ряд вопросов, касающихся роли, причин возникновения, а также необходимости и способов коррекции гипергомоцистеинемии у больных с почечной патологией

Недостаточно изучено влияние полиморфизмов ряда генов других систем, к числу которых относятся система гемостаза, иммунная система, система апопто-за

Изучение полиморфного маркера 4G/5G гена ингибитора активатора плаз-миногена-1 (PAI-1), кодирующего одноименный белок, концентрация которого в ткани почек коррелирует с процессами фиброза в ней (Grandahano G et al, 2000,Tang W W et al, 2003 ), не установило однозначной роли данного маркера в развитии и прогрессировании заболевания почек По данным Wang AY и соавт с генотипом 4G4G гена PAI-1 ассоциируется активность люпус- нефрита, но не его хронизация Напротив Suzuki H И соавт рассматривают генотип 4G4G как фактор прогрессирования IgA-нефропатии Согласно исследованиям Gilles Р et al, 2004, частота встречаемости генотипов данного полиморфного маркера у больных хронической почечной недостаточности мало отличалась от популяционной группы, что исключает его роль в прогрессировании заболеваний почек

Не до конца определена роль полиморфизма генов некоторых маркеров иммунной системы (IL-4, IL-13 и CTLA-4) в патогенезе отдельных форм гломеруло-нефрита В немногочисленных исследованиях по изучению полиморфного маркера С-590Т гена IL-4 у детей с НСМИ выявило кардинально расходящиеся данные (Kobayachi Y Et al, 2003 , Parry RG et al ,1999)

В литературе недостаточно данных о влиянии полиморфных маркеров генов ТР53 и Mdm2, кодирующие одноименные белки апоптоза, на развитие и течение

отдельных клинических и морфологических форм гломерулонефрита, а также его прогрессирование

Малоизученным остается роль полиморфизма генов нефрина(КРШ1) и по-доцина(КРН82), структурных белков подоцита в развитии нефротического синдрома и особенно его клинических форм при различных морфологических вариантах Более того, до сих пор не проводился анализ зависимости комплекса генетических полиморфных маркеров на формирование клинических и морфологических форм, особенности развития, течения и прогрессирования хронического гломерулонефрита И, наконец, в доступной нам как отечественной, так и зарубежной литературе мы не встретили данных по изучению эффективности иммуносупрессив-ной терапии в зависимости от носительства различных генотипов патогенетических генов-кандидатов

Изложенное выше позволяет считать, что комплексное изучение генетических маркеров, клинико-морфологических особенностей, может расширить представление о прогностических факторах, отдельных патогенетических механизмах, особенностях течения и подходах к лечению гломерулонефритов

Цель исследования: Установить комплексное влияние полиморфизма генов на формирование клинических и морфологических форм хронического гломерулонефрита и эффективность иммуносупрессивной терапии Задачи исследования:

1 Изучить ассоциацию полиморфных маркеров генов ангиотензинпревращающе-го фермента (.ГЮ-АСЕ'), ингибитора активатора плазминогена -1 (40/5С-РА[-1) метилентетрагидрофолатредуктазы (С677ТА1298С-МТНРК) с дебютом и развитием хронического гломерулонефрита(ХГН), а также с его клиническими и морфологическими формами

2 Определить роль аутоиммунного механизма в патогенезе ХГН посредством изучения ассоциации морфологических форм гломерулонефрита с полиморфным маркером гена антигена цитотоксических лимфоцитов (049А - СТЬА-4)

3 Установить значение полиморфных маркеров генов интерлейкина -4 и 13 (С-590Т-И-4, 04257А-И-13) в патогенезе нефротического синдрома с минимальными изменениями и фокально-сегментарного гломерулосклероза

4 Выявить влияние полиморфных маркеров генов белков апоптоза ТР53 (049С) и Мс1ш2 (Т309Сг) на развитие и прогноз ХГН

5 Проанализировать зависимость формирования НС при различных морфологических формах ХГН от генотипов полиморфных маркеров ггнов нефрина (<3349А-№НБ1) и подоцина (0755А-№Ж2)

6 Оценить скорость прогрессирования ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов АСЕ, РАМ, МПШ, ТР53,Мс1т2, ЫРНБ' и АГРШ2

7 Оценить эффективность иммуносупрессивной терапии у больные ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов АСЕ, РА1-1, ТР53, Мс1т2, ИРНБ! иЫРЖ2

Научная новизна:

На основании комплексного изучения полиморфизма ] енов ренин-ангиотензиновой системы, иммунной и свертывающей систем, системы апоптоза и структурных белков подоцита сформулирована новая концепция по формированию клинических и морфологических форм хронического гломерулодефрита

Доказано, что особенности дебюта заболевания (возраст больного к началу заболевания, клиническая форма манифестации нефрита, наличие артериальной гипертензии), его течения и прогрессирования зависят от носительства комбинации генотипов различных полиморфных маркеров генов выше указанных систем

Впервые продемонстрировано, что формирование морфологических форм обусловлено альянсом генотипов полиморфных маркеров различных систем Более того, особенность клинической картины в рамках одной и той же морфологической формы определяется различными генотипами одного и того же полиморфного маркера

Проведенное комплексное исследование генетических маркеров ренин ан-гиотензиновой системы и свертывающей системы, системы апоптоза, а также мар-

керов кодирующих фермент метилентетрагидрофолатредуктазы и структурных белков подоцита у детей с хронической почечной недостаточностью установило, что сочетанное носительство генотипа 4040 полиморфного маркера 40/50 гена РА 1-1 и ВВ полиморфного маркера 1Ю гена АСЕ является фактором неблагоприятного прогноза ХГН

Впервые проведен анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, РА1-1, ТР53, Мйт2, МРНБ1 и ЫРН32 с эффективностью стероидной терапии Установлено, что носительство генотипа (7(? полиморфного маркера Т3090 гена Мс1т2 обуславливает чувствительность больных ХГН к глюкокортикоидам, тогда как генотип полиморфного маркера 0755А гена АФЖ2 достоверно ассоциирован со стероидрезистентностью

Аналогичный анализ проведен у больных, иммуносупрессивная терапия, которых включала в себя комплексное применение глюкокортикоидов и цитостати-ков Было показано, что характер распределения аллелей и генотипов у больных чувствительных к иммуносупрессии мало отличался от такового в контрольной группе Однако резистентность к иммуносупрессивной терапии ассоциирована с генотипом 5050 полиморфного маркера 40/50 гена РА1-1, генотипами АА полиморфного маркера 0349А гена А'РНБ! и (24 полиморфного маркера 0755А гена А'РНБ2

Практическая значимость:

Комплексное изучение полиморфных маркеров генов различных систем, имеющих патогенетическое значение в формировании и прогрессировании гломе-рулонефрита, рекомендуется использовать в клинических условиях для определения особенностей клинической и морфологической формы гломерулонефрита и предполагаемой эффективности лечения

Носительство комбинации генотипа ПО полиморфного маркера 1Ю геяаАСЕ и генотипа 4040 полиморфного маркера 40/50 гена РА1-1 является независимым

фактором прогрессирования хронического гломерулонефрита и яв!яется показанием для раннего проведения нефропротективной терапии

Оригинальный способ прогнозирования эффективности стероидной и имму-носупрессивной терапии, основанный на использовании изучения полиморфных маркеров 4<?/5С7 гена РА1-1, Т309в гена Мс1т2, в349А гена МРШ1, в!55А гена ИРШ2 позволяет выявлять группы больных с различной чувствительностью к проводимой терапии

Носительство генотипа <л4 полиморфного маркера 0755А гена ЫРШ2 у ребенка с нефротическим синдромом, характеризующийся резистентностью к имму-носупрессивной терапии, может служить косвенным признаком наличия аутосом-но-рецессивного стероидрезистентного нефротического синдрома

Внедрение результатов исследования и апробация работы. Основные результаты проведенных исследований внедрены в лечебную практику нефрологиче-ских отделений детской клинической городской больницы № 13 им Н Ф Филатова и ГУ Научного центра здоровья детей РАМН, нефро-урологическэм центре при КДЦ ДКГБ №13, используется в материалах лекций и практических занятий для студентов, интернов и ординаторов Российского государственного медицинского университета

Материалы диссертации обсуждены на II региональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы детской уронефрологии» (г Владивосток, 1998г), международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы детской нефрологии и урологии» (Алматы,1998г), IV ежегодном Санкт-Петербургском нефрологическом семинаре( Санкт-Петербург, 1998г), на IX, X и XI Съездах педиатров России « Современные проблемы педиатрии» (Москва 2004г, 2005г, 200бг), 39- и 40- Конгрессах Европейского общества педиатров нефрологов (Стамбул 2005г, Палермо 2006г), XI Конгрессе Педиатров России « Актуальные вопросы педиатрии» (Москва 2006г), V Российском конгрессе по детской нефрологии (Воронеж, 2006г ), VI Съезде научного общества нефрологов России

(Москва, 2005г), XII Российском ежегодном национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005г) Апробация диссертации состоялась на научно-практической конференции кафедры госпитальной педиатрии московского факультета РГМУ, совместно с врачами ДКГБ №13

Объем и структура диссертации: диссертационная работа изложена на 280 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования , шести глав собственного исследования, главы обсуждения собственных исследований, выводов и практических рекомендаций Список литературы включает 404 источников, в том числе 37 отечественных и 367 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 109 таблицами и 63 рисунками

Содержание работы

Материалы и методы обследования

Работа выполнена на кафедре госпитальной педиатрии московского факультета Российского государственного медицинского университета( зав кафедрой -д м н, проф Л И Ильенко) на базах отделений нефрологии детской клинической больницы № 13 им Н Ф Филатова (зав отд М Б Бояджян, главный врач - д м н В В Попов), ГУ научного центра здоровья детей РАМН (зав отд - д м н , проф А Н Цыгин, директор - академик РАМН, проф А А Баранов), отделения нефрологии и внутренних и профессиональных болезней им Е И Тареева (зав отд - к м н Мирошниченко Н Г, директор - член - корр РАМН, проф Н А Мухин) нефроуроло-гическом центре при КДЦ ДГКБ №13(зав центром - дмн С ННиколаев, глав врач- дмн проф С А Байдин)

Всем больным проводилось стандартное комплексное клинико-лабораторное обследование, включающее в себя сбор анамнеза, физикальный осмотр больного, лабораторно-инструментальные исследования

Морфологическое исследование ткани почки, полученной с помощью чрез-кожной биопсии, проводилось на кафедре патологической анатомии (зав кафед-

рой - академик РАН и РАМН, проф М. А Пальцев) ММА им. ИМ Сеченова проф В А Варшавским и к б н Е П Проскурневой В отделе патологической анатомии НИИТиИО МЗ РФ

AB Сухановым

При определении морфологического варианта ХГН использов.али классификацию В В Серова (1977 г)

Молекулярно - генетическое исследование предусматривало выделение геномной ДНК из венозной крови человека методом фенол-хлороформной экстракции В работе использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq®, которая была получена от НПО «Биотех» (Москва) Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ООО «Синтол» (Москва) Амплификацию полиморфного участка генов ACE, MTHFR, PAI-1, IL-4, IL-13, CTLA-4, р53, Mdm2, NPHS1 и NPHS2 с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР) на проводили на термоциклере РНС-2 («TECHNE», Великобритания) или PolyChainll («Polygen», Германия) «Терцик» (ДНК-технология) с последующим расщеплением рестриктазами и электрофорети-ческим разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии(зав лабораторией - д б н проф В В Носиков) Государственного научного центра «ГосНИИ генетика»(директор -чл корр РАН, проф В Г Дебабов)

Таким образом, всего в работе выполнено и проанализировано более 4200 исследований (биохимических, молекулярно-генетических, ультразвуковых, морфологических и иммуногистохимических)

Характеристика обследованных больных Обследовано 280 человек. 200 больных ХГН и 80 (44 мужчины и 36 женщин) в возрасте от 37 до 72 лет (средний возраст 50,1±16,5 лет) без хроник-еских заболеваний почек и АГ, составивших контрольную группу Структура обследования представлена на рисунке 1

Среди больных ХГН мальчиков было 116, девочек-84, в возрасте от 4 мес до 17 лет (средний возраст дебюта ХГН - 11,06±4,53 лет) Длительность заболевания с момента установления диагноза ХГН составила в среднем 6,38±6,21 лет

Оценка клинических особенностей ХГН обследованным больным проводилась ретроспективно на основании данных анамнеза и по архивному материалу Она включала в себя анализ дебюта ХГН, клинических и морфологических вариантов нефрита с характеристикой лабораторных показателей на момент первого и последующих обследований в клинике, а также анализ течения ХГН

Клинические синдромы в дебюте ХГН оценены у 196 пациентов У большинства больных заболевание манифестировало нефротическим синдромом -63,3%(п=124) случаях, второе место занимал изолированный мочевой синдром в виде умеренной протеинурии и/или гематурии разной степени (п=58(29,6%)), дебют в виде нефритического синдрома наблюдался в 7,1%(п=14)

Повышение уровня креатинина крови в дебюте ХГН имело место у 21(10,7%) пациентов из 196 пациентов, данное повышение было расценено как проявление активности заболевания

Синдром АГ в дебюте ХГН встречался у 86(43,8%)больных из 196

Данные об уровне протеинурии в дебюте ХГН удалось получить у 184 пациентов У 67,4%(п=124) больных протеинурия превышала 1 г/м2/сут, у 17,4 %(п=32) - имела место умеренная протеинурия менее 1г/м2/сут, у оставшихся пациентов (15,2%-п=28) протеинурия не достигала 0,5г/сут Наличие гематурии в начале ХГН оценено также у 184 больных, из которых только у 89(48,3%) детей наблюдалась гематурия Среди них у 13 (14,6%) отмечались эпизоды макрогематурии У 14 (15,7%) отмечалась гематурия от 50 до 200 в поле зрения и у 62(69,7%) пациентов в мочевом осадке регистрировалось наличие эритроцитов от 5 до 50 в поле зрения

Клинические варианты нефрита в момент генетического обследования оценены у 200 больных ХГН Распределение их было следующим ХГН с нефротическим синдромом диагностирован у 172(86%) детей, у 91(52,9%) из которых нефро-тический синдром сочетался с гематурией и/или гипертензией (67- 38,95% пациентов имели гематурию разной степени выраженности, артериальная гипертензия наблюдалась у 66 -38,4% детей), ХГН с нефритическим синдромом - у 8(4%)пациентов, больных ХГН с изолированным мочевым

Анализ дебюта ХГН

Анализ клинических вариантов ХГН

Анализ течения ХГН

Анализ морфологических вариантов ХГН

Ш Оценка скорости п регрессирования ХГН 1

IV Оценка эффективности терапии ХГН 1 3 1

Рисунок 1 Структура обследования

Т7Г* Г"*м*д

[1 Возраст дебюта заболевания

Биохимические показатели крови

Уровень протеинурии

Уровень гематурии

аазаь.

Уровень АД

Л Функция почек

синдромом было 20(10%), 17(8,5%) из которых были дети с персистирующей гематурией в сочетании с микропротеинурией, у троих пациентов(1,5%) в мочевом синдроме, напротив, отмечалась умеренная протеинурия с или без гематурии

Чрескожная пункционная биопсия почки с гистологическим, иммунофлюо-ресцентным и электронно-микроскопическим исследованием биоптатов была произведена у 130 пациентов с ХГН (65%) Средний возраст больных на момент биопсии был 7,53± 4,8 лет Показанием для проведения биопсии почек являлось сте-роидрезистентность, дебют заболевания в подростковом возрасте, длительно пер-систирующая протеинурия или гематурия

Выявлены следующие морфологические варианты гломерулонефрита • мезангио-пролиферативный (МезПГН) у 55(27,5%) больных, мембранопролиферативный (Mill Н) гломерулонефрит у 19(9,5%) пациентов, мембранозный (МГН)у 5 (2,5%) больных, минимальные изменения (МИ) у 86(43%) детей, (установленные у 70 пациентов на основании клинико-лабораторной картины НС и быстрому положительному ответу на стероидную терапию, и у 16 (4 -со стероидрезистентной формой НС, у 2 отмечалась острая форма НС в подростковом возрасте, 10 больных бли со стероидзависимой формой НС) НСМИ установлен при нефробиопсии), фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) у 29(14,5%) пациентов, фибро-пластический гломерулонефрит (ФПГН) у 5(2,5%) пациентов Экстракапиллярный гломерулонефрит диагностирован у 1 (0,5%)больного

Формирование почечной недостаточности отмечалось у 19(9,5%) больных Диагноз хроническая почечная недостаточность устанавливался на основании повышения уровня креатинина выше возрастной нормы и/или снижение клиренса креатинина ниже 60 мл/мин, рассчитанная по формуле Шварца Средний уровень креатинина составил 144,1+76,4 ммоль/л, клиренс креатинина - 45,52+14,65 мл/мин Среди обследуемых детей с ХПН мальчиков было 10(52,63%), девочек-9(47,37%) Средний возраст формирования почечной недостаточности составил

12 мл/мин Среди обследуемых детей с ХПН мальчиков было 10(52,63%), девочек-9(47,37%) Средний возраст формирования почечной недостаточности составил,36+5,23лет Формирование почечной недостаточности отмечалось спустя 4,52+3,56 лет от начала развития ХГН (от 0,6 года до 14,1 лет)

Трое(15,7%) детей (из 19) достигли терминальной стадии почечной недостаточности У одной девочки была диагностирована ^А-нефропатия с экстракапиллярным компонентом Через 6,3 лет от дебюта заболевания девочка достигла терминальной почечной недостаточности и ей успешно проведена пересадка почки Мальчик с врожденным НС (диагностирован в 4мес) достиг терминальной почечной недостаточности через 1,1 год от начала заболевания, что привело к назначению заместительной терапии Спустя четыре месяца от начала замес гательной терапии ребенок умер И третьим пациентом с ХПН в терминальной стадии была девочка с экстракапиллярным гломерулонефритом, манифестация, которого наблюдалась в возрасте 15,2 лет и заместительная терапия проводилась изначально совместно с иммуносупрессивной терапии Однако спустя 0,9 года девочка умерла Анемический синдром наблюдался у троих детей, средний уровень гемоглобина составлял 94,3+ 9,1 г/л У остальных детей отмечалась только азотемдя Гипертен-зионный синдром отмечался у 15(78,9%)больных, у 9(60%) детей и:: которых отмечалась умеренная гипертония, а у остальных 40% (п=6)-выраженная Среди детей достигших почечной недостаточности -17 больных были с НС, двое с нефритическим синдромом Спектр морфологических изменений у больных с почечной недостаточностью представлен на рисунке 2

26,3%

10,5%

5,3%

5,3%

21.0%

26,3%

ШФПГ

□ ФСГС еамезпгн

■ мпгн

□ МГН

□ нем и

НЗкстракап

Рисунок 2. Морфологические формы хронического гломерулонефрита у больных сХПН.

Статистический анализ

При статистической обработке данных для протяженных переменных рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (а).Для проверки статистической значимости различий частотных показателей использовали двусторонний критерий Фишера, критерий %2 по Пирсону{ с поправкой Yates для малочисленной выборки). Достоверными считались различия при р < 0,05.

Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями, применялся непараметрический анализ ANOVA. О силе и направленности связи судили по величине и знаку коэффициента F. Достоверными считали корреляции с р<0,05.

Почечную выживаемость оценивали моментным методом Каплана-Мейера с учетом времени от начала заболевания (соответствует моменту появления мочевого синдрома) до исхода. В качестве исхода рассматривали увеличение концентрации сывороточного креатинияа выше возрастной нормы и снижение клиренса креатишна ниже 60 мл/мин (по формуле Шварца), Кривые выживаемости разных групп больных сравнивали с помощью теста log rank. Для опенки влияния одного или нескольких факторов на прогноз проводили соответственно монофакторнъш анализ с помощью регрессионной модели Кокса. Статистическая обработка результатов проводилась на персональном компьютере IBM в программе STATIS-TICA версия 6.0- статистический анализ и обработка в среде Windows (фирма производитель StatSoft Inc., USA).

Результаты исследований

I. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, МТНЕК, РА1-1, 1Ь-4, П.,-13, СТЬА-4, ТР53, ММт2, NPHS1 и с клиническими и

морфологическими формами ХГН и с особенностями его развития и течения.

Для проведения анализа ассоциации полиморфных маркероЕ генов АСЕ, МТНР11, РАМ, р53, Мс1т2, 1Ь-4, 1Ь-13, СТЬА-4, КРШ1 и КТРНБ2 с развитием и течением хронического гломерулонефрита сформированы четыре группы, основанных на морфологических вариантах нефрита НСМИ, ФСГС МезПГН и МПГН.

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров гена АСЕ в контрольной группе и среди больных ХГН с различными морфологическими формами статистически значимых различий не выявил(табл 1), что свидетельствует об отсутствии ассоциации гистологических изменений с данным полиморфным маркером Полученные нами результаты согласуются с данными ЕСКамышевой и соавт, 2005, Е Бегс1аго£1и et а1, 2005 и РОЙеш й а1,2004

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Ш) гена АСЕ у больных с разными морфологическими формами ХГН в сравнении с _контрольной группой_

Морфологические формы Аллели/ Генотипы гена АСЕ

I И II ГО

НСМИ,%(п=86) 47,1 52,9 18,6 57 24,4

ФСГС,% (п=29) 48,25 51,75 27,6 41,3 31,1

МезПГН,% (п=55) 55,55 44,45 30,9 49,1 20,0

МПГН,% (п=19) 52,63 47,37 21,05 63,15 15,8

Контроль,0/» (п=80) 50 50 27,5 45 27,5

Р нд нд нд нд нд

Анализ зависимости возраста больных, при котором наблюдалась манифестация НСМИ от генотипа полиморфного маркера И), выявил влияние Б аллеля

16

на более раннее начало заболевания ( рис 3) Аналогичные данные получены в работах Б У Ьее е! а1,1997 и А А1-Е1Ба й а1, 2001 16

0 12 X

X 10 -о

1

- 8 О

«о с

О. 4

1D

II

DD АСЕ

F(2,60) = 3,19839146, р = 0,0479

" Médian I I 25%-75% ~Т~ min-max

Рисунок 3 Возраст дебюта НСМИ в зависимости от генотипов гена АСЕ Носительство D аллеля также влияло на уровень протеинурии в дебюте НСМИ Была выявлена достоверная ассоциация между уровнем суточной потери белка и генотипами полиморфного маркера I/D гена АСЕ (II - 3,12+1,49г/с, ID-3,43±1,7г/с, DD - 5,46+2,73г/с, F(2, 29)=3,3841, р=,04622) Наибольшая потеря белка в сутки отмечалась у пациентов с генотипом DD Среди 86 пациентов НСМИ, 45(52,3%) больных имели стероидзависимую форму, для которой характерно длительное часторецидивирующее течение и требующие применения иной терапевтической тактики в частности, использования цитостатических препаратов У больных стероидзависимой формой НСМИ отмечалась достоверное повышение доли аллеля D( 64,5 % пр 50% %2=4,86, р=0,027)

Кроме того, аллель D влиял на клиническую манифестацию МезПГН, у 36 больных, из которых диагностирована IgA-нефропатия Нами выявлено, что дети, дебютировавшие НС при МезПГН, достоверно чаще были носителями аллеля D (59,1% пр 29,43%, Х2=5,18, р=0,029), чем дети, манифестация заболевания у которых наблюдалась в виде гематурической формы Наоборот, для пациентов гемату-рической формы при МезПГН отмечается достоверное повышение доли аллеля 1

(70,57% пр 50%, %г=5,7, р=0,017, в сравнении с контролем) Более того из 44 детей, дебютировавших изолированным мочевым синдромом ( в том числе и гемату-рической формой) 25 пациентов в последующем развернули НС и и этой группе больных частота генотипа DD было значимо выше, что вероятно и обусловило развитие НС( 44% пр 18,2%, %2=4,11, р=0,042)

Рассмотрев характер распределения полиморфного маркера I/D у детей, в дебюте заболевания у которых была зафиксирована АГ, мы обнаружили ассоциацию D аллеля ( 71,87% пр 50%, у>4,5 р=0,038) и генотипа DE( 56,25% пр 27,5%, х2=5.04 р=0,024) с АГ только у больных ФСГС Таким образом, мы продемонстрировали, что аллель D по-разному ассоциирована с клиничес-сими особенностями ХГН, такими как возраст и клиническая форма дебюта ХГН, наличие АГ при различных клинических и морфологических формах нефрита

Влияние D аллеля на риск развития ХГН, его раннюю манифес гацию и формирование АГ в дебюте может быть обусловлено более высоким уровнем циркулирующего и тканевого АПФ, ассоциированным с D-аллелем (В Rigat et al, 1990) Самым простым и логичным выглядело бы объяснение, основанное на ассоциации D аллеля гена АСЕ с более высокой концентрацией, как самого фермента, так и агиотензина-2, в образовании которого он участвует, и эффектами последнего на тонус сосудов, мезангиальную пролиферацию, активность фибробластов, а также на нуклеарный фактор - kB (S Klahr et al, 1995, J.Mornssey et al, 1996) основного фактора, регулирующего транскрипцию целого ряда генов, в первую очередь, генов, отвечающих за формирование воспалительного ответа (A S Baldwin et al, 1996)

Наши данные лишь подчеркнули разнонаправленное действие ренин-ангиотензиновой системы, как при клинических, так и морфологических формах хронического гломерулонефрита, тем самым, обуславливая фенотипические особенности ХГН

С полиморфными маркерами С677Т и А1298С гена МТНРК связывают снижение функции фермента метилентетрагидрофолатредуктазы, участвующего в метаболизме гомоцистеина, в результате чего увеличивается его концентрация в крови (Ро&пдег М е1 а1, 2001, \Vrone Е М еЬ а1, 2001) Гомоцистеин в настоящее время рассматривается как эндотоксин, обуславливающий токсическое действие на эндотелий сосудов, результатом которого является тромбоз и атеросклероз сосудов (ЬоБсаЪ 1 йа1, 1996, 'ШсЪ в й а! 1998)

Сравнительный анализ частоты встречаемости полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена МТНРК между морфологическими вариантами ХГН с контрольной группой показал отсутствие статистически достоверных различий между изученными группами Исключением является обнаруженная ассоциация МПГН с аллелем С и генотипом СС полиморфного маркера А1298С (57,9% пр 37,5%, Х2=5,26 р=0,02 и 26,3% пр 7,5%, %2==5,5 р=0,02 соответственно)(табл 2)

Таблица 2

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров С677Ти А1298С гена МТНРЯ у больных с разными морфологическими формами ХГН в __сравнении с контрольной группой_

Морфологические формы Аллели/ Генотипы гена МТНР1*

С Т СС СТ тт А С АА АС СС

НСМИ,% (п=8б) 68,05 31,95 38,4 59,3 2,3 58,15 41,85 27,9 60,5 11,6

ФСГС,% (п=29) 68,9 31,1 41,4 55,2 3,4 58,15 41,85 24,2 65,5 10,3

МезПГН,% (п=55) 72,7 27,3 54,54 36,36 9Д 56,35 43,65 23,6 65,5 10,9

мпгн,% (п=19) 71,05 28,95 47,4 47,3 5,3 42,1 57,9* 10,5 63,2 26,3*

Контроль,% Сп=80) 70 30 51,2 37,5 11,3 62,5 37,5 32,5 60 7,5

Р ид ВД нд НД нд нд нд нд нд нд

*- р<0,05 в сравнении с контролем

Более того, по характеру распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена МШРЛ стероидзависимая форма НСМИ отличалась от общей популяции больных НСМИ Так для нее характерным было увеличение частоты встречаемости гетерозигот СТ полиморфного маркера А1298С гена МТНРК (66,7% пр 37,5%, %2=11,8 р=0,006) Также отмечалось зависимость вариабельности протеинурии от распределения генотипов полиморфного маркера С667Т у больных ФСГС в дебюте заболевания (Б-критерий =23,37, р=0,00005) Генотип ТТ коррелировал с максимальным значением протеинурии(8,2+1,37г/с), а генотип СС - с минимальным (1,3 + 0,53г/с) Полученные данные позволяют нам предположить наличие ассоциации генотипа ТТ ( ассоциированного с повышенным уровнем гомоцистеина) полиморфного маркера С677Т гена МТНРЯ с развитием НС при манифестации ФСГС у детей

Подводя итог полученными нами результатам, можно сделать вывод, что полиморфные маркеры Сб77Ти А1298С в целом мало ассоциированы 1: развитием и клинической картиной нефрита Исключением является ФСГС, при котором полиморфный маркер С677Т обуславливает развитие НС в дебюте заболевания

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера 40/50 гена РА1-1 у больных ХГН с разными морфологическими формами продемонстрировал существенную вариабельность в характере распределения генотипов при пролиферативных (МезПГН, МПГН) и непролиферативных (НСМИ,ФСГС) (табл 3) Определяя характер распределения генотипов и аллелей у больных НСМИ и ФСГС, мы обнаружили ассоциацию этих морфологических форм с генотипом 5050(-/2=9,85 р=0,002 и "/2=8,5 р=0,004 соответственно) и аллелью 5С(х2=10,53 р=0,001 и х2=9,18 р=0,0025 соответственно)

Однако стероидзависимая форма НСМИ по характеру распределения данного маркера мало отличалась от контрольной группы, тем самым, противопоставляя себя основной группе(НСМИ)(рис 4)

Таблица 3

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера 40/50 гена РА1-1 у больных с разными морфологическими формами ХГИ «

Морфологические формы Аллели/ Генотипы гена АСЕ

5С 4С4С 4С5С 5в5С

НСМИ,% (11-86) 41,8 58^2* 19,76 44,2 36,04*

! ФСГС,% (п-29) 36,2 63,8* 17,24 37,93 44,82*

: МсэПГН,% (п=55) 72,75* 27,25 56,4* 32,7 10,9

МПГН,%(п=19) 73,68 26,32 52,63 42,11 5,26

Конгроль,% (п=80) 59,35 40,65 36,25 46,25 17,5

* - р<0,05 в сравнении с контролем

Таким образом, особенность клинической картины стероидзавиеимой формы НС МИ, обусловлена генетическими маркерами, в том числе и гена РА1-1.

¡0

ш □ 5050

44,1 В 405С

_

■ 4040

311

100% 80% 60% 40% 20% 0%

контроль НСМИ СЗНСМИ

*- р<0,05 в сравнении с контролем

Рисунок 4. Частота генотипов полиморфного маркера 4С/5С гена РА1-1 у больных НСМИ(п=86) н стероидзависимой форой НСМИ(п=4$) в сравнении с контролем

В то же время для больных Мез!И Н было характерно наиболее частое носи-тельство ¡-енотипа 4040 (56,4% пр. 36,25%; х2=534 р=0,02) и аллеля 40 (72,75% пр. 59,35%; х2"5,1 р=0,024;.

Причем достоверное учащение встречаемости генотипа 4040 наблюдалось у больных ^А-нефропатией и у детей с гематурической формой МезПГН. В то пре-

мя как НС при МезГГГН характеризовался другим распределением аллелей и генотипов, мало отличающееся от контрольной группы.

100%

80%

60% — 46,3—

20% ■

40%

0%

контроль [дА-неф. Гем.ф-ма НС

*- р<0,05 в сравнении с контролем

Рисунок 5. Частота генотипов полиморфного маркера 40/50 гена РА1-1 у больных ¿разными клиническими формами при МезПГН в сравнении с контролем

Следовательно, было установлено влияние полиморфного маркера 40/50 гена РА1-1 на клинический фенотип мезангиопролиферативного нефрита. Наибольшая ассоциация генотипа 4С40 отмечалась с гематурической формой(64,7% пр. 36,25%; х2=4,69 р=0,03) нефрита и ^А- нефропатией ( в состав которой входило 14 больных с гематурической формой) (58,3% пр. 36,25%;уг=4,94 р=0,03). Для больных НС специфичен другой тип распределения генотипов, что вероятно и определяло его формирование, (рис.5).

Характер распределения генотипов и аллелей гена РАМ у больных МПГН был подобен характеру распределения у больных МезПГН (4С4в: 52,63% пр. 36,25%; х2-! ,73 р=0,18; 40: 73,68% пр. 59,35%; х3=2,53 р=0,09), но полученные результаты оказались не достоверны. Более того, только для этой формы было присуще влияние генотипов гена РАМ на возраст дебюта заболевания. Более раннее начало МПГН наблюдалось у детей-носителей генотипа 4040 (рис.6).

4g4g 4g5g 5g5g PAI-1

F(2,14) = 3,96934961, p = 0,0431

0 Median

I 125%-75%

1 min-max о Outtiers

Рисунок 6 Возраст дебюта мембранопролиферативного гломерулонефрита(п=19) в зависимости от генотипов гена PAI-1

Проведенный корреляционный анализ между уровнем фибриногена и распределением генотипов исследуемого гена не выявил достоверных ассоциаций

Существующий характер распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера 4G/5G гена PAI-1 при различных морфологических и клинических формах определено степенью ассоциацией различных генотипов с уровнем и активностью PAI-1 Известно, что аллельный вариант 4G ассоциирован с повышенным уровнем и активностью PAI-1 (Margaglione М ,et al 1998, Bensen J Т et al, 2004 ) , тем самым характеризуя функцию эндотелия, играющего существенную роль при про-лиферативных нефритах В то же время в развитии нефротического синдрома при НСМИ и ФСГС решающую роль играет подоцит, мало связанный со свертывающей системой Поэтому формирование этих морфологических форм может происходить ири носительстве другого генотипа - 5G5G, с которым связывают более низкую концентрацию PAI-1

В группе больных с НСМИ и ФСГС нами проведен анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров С-590Т в промоторной области гена IL-4 и G4257A гена IL-13 Выбор данных групп больных был основан

на сходных патогенетических механизмах (активация Т- клеточного звена) и морфологических изменениях - диффузное сглаживание «ножек» подои итов

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов различных полиморфных маркеров выявил следующие тенденции- в целом у больных НСМИ отмечалось снижение доли ТТ генотипа (29,1% пр 45%,у_2=4,53 р=0,С34) У детей с наличием атопических реакций в анамнезе и со стероидзависимой формой НСМИ отмечалось достоверное повышение С аллеля (44,05% пр 30,6%,"/2=4,93 р=0,02б и 43,4% пр 30,6%,%2=4,08 р=0,043 соответственно), что совпадает с данными Y Ко-bayashi et al 2003, и определено влиянием С аллеля на выраженность экспрессии гена IL-4 Кроме того, НСМИ достоверно был ассоциирован с генотипом АЛ и ал-лелем А гена IL-13 (77,9% пр 53,75%, %2= 10,73 р=0,001 и 84,31 пр 73,13, х2=6,22 р=0,013 соответственно), ассоциированные с повышенной сывороточной концентрацией IL-13 (Arima К Et al 2002) и IgE (Graves РЕ et al 2000, Kabesch M et al 2006), что совпадает с данными полученными Acharya et al 2005

У больных ФСГС характер распределения генотипов и аллелей гена IL-4 практически совпадал с распределением генотипов и аллелей у больных НСМИ Очевидно более выраженное снижение доли аллеля Т и достоверное повышение доли генотипа СС и аллеля С (34,5% пр 6,25%, %2 =14,3 р=0,0002 и 48,3% пр 30,6%, %2=5,81 р=0,02, соответственно) Однако, частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера гена IL-13 у больных ФСГС практически совпадала с контрольной группой (GG-10,3%, GA-41,3% и АА-48,2% пр. CG-7,5%, GA-38,75% и АА-53,75%, р>0,05) Схожие частоты встречаемости генотипов и аллелей полиморфного маркера IL-4 у больных НСМИ и ФСГС позволяют предположить единую роль IL-4 в развитии данных форм нефрита (активация Th21 Но именно выявленные расхождения в распределении полиморфного маркера гена IL-13, обозначили патогенетическую разницу, обнаруженную при этих морфологических формах

Для определения роли аутоиммунного генеза в развитии гломерулонефрита нами исследован характер распределения аллелей и генотипов полиморфного мар-

кера G49A гена CTLA-4, с GG генотипом которого связывают предрасположенность к развитию аутоиммунных заболеваний (Donner H et al, 1997, Ikegarm H et al, 2005)

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера G49A гена CTLA-4 проведенный при всех морфологических формах гломерулонефрита вновь сформировал две группы схожие по характеру частоты встречаемости генотипов и аллелей в них Так было выявлено, чт НСМИ и ФСГС достоверно ассоциированы с аллелем А (56,35% пр 43,1%, у.2=5,84 р=0,02 и 65,53% пр 43,1, Х2=8,54 р=0,0035 соответственно) и генотипом А А (27,9% пр 5%, %2 =15,51 р=0,001 34,5% пр 5%, х2 =16,53 р=0,0001 соответственно) А у больных с мезангиопроли-феративным и мембранопролиферативным гломерулонефритами характер распределения аллелей и генотипов мало отличался от контрольной группы ( табл 4)

Таблица 4

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G49A гена CTLA-4 j' больных с разными морфологическими формами ХГН в сравнении с контрольной группой

Морфологические формы Аллели/ Генотипы гена CTLA-4

G А GG GA АА

НСМИ,%(п=86) 43,65 56,35* 15,20 56,90 27,90*

ФСГС,% (п=29) 34,47 65,53* 3,44 62,06 34,50*

МезПГН,% (п=55) 53 47 23,60 58,80 17,60

МПГН,% (п=19) 60,50 39,50 26,30 68,40 5,30

Контроль,% (п=80) 56,90 43,10 18,75 76,25 5

* - р< 0,05 - в сравнении с контролем Сложность интерпретации полученных данных определено неоднозначностью имеющихся в литературе результатов В ряде работ аутоиммунные заболевания ассоциированы с генотипом GG, носительство которого коррелирует с повышением уровня sCTLA-4 (Liu W et al, 2005, Tapirdamaz О et al, 2006) В то же время другими авторами обнаружена ассоциация аутоиммунных заболеваний к числу которых относятся синдром IIIorpeHa(Downie-Doyle S Et al, 2006), болезнь Грависа (Donner H et al, 1997) и диабет типа LADA (Caputo M. Et al, 2005) с A аллелем С данным аллелем также ассоциировано острое отторжение почек (Wisniewski A et

а1, 2006) и печени, сочетающееся со снижением $СТЪА-4 (Taplrdamaz О е1 а1, 2006)

Противоречивые данные в выше изложенных работах и отс /тствие собственных данных об ассоциации генотипов полиморфного маркера в49А гена СТЬА-4 с функцией одноименного пептида не позволяют нам сделать однозначный вывод Однако наше исследование позволяет установить разнонаправленную роль изученного полиморфного маркера при разных морфологических формах, привнося тем самым свою «генетическую» лепту в формировании морфологической формы нефрита

В нашем исследовании изучены два полиморфных маркера сопряженных с системой апоптоза й72С гена ТР53 и Т3090 гена Мс1т2

Сравнительный анализ частоты встречаемости указанных полиморфных маркеров при различных морфологических формах показал следующие отличия у больных НСМИ характер распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера (772С гена ТР53 мало отличался от контрольной группы, в отличие от такового полиморфного маркера Т3090 гена Мс!т2(таб 5)

Таблица 5

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С72С гена ТР53 и Т3090 гена Мс1т2 у больных с разными морфологическими формами ХГН в сравнении с контрольной группой

Морфологические формы Аллели/ Генотипы генов ТР53 и Мс1т2

в С Св сс СС Т в тт ТС СС

НСМИ,% (п=86) 71,9 28,1 48,75 46,25 5 55,2* 44,8 27,9* 54,65 17,45

ФСГС,% (п=29) 66,6 33,4 44,8 44,8 10,4 65,5 34,5 41,4 48,3 10,3

МеэПГН,% (п=55) 67,25 32,75 41,8 50,8 7,3 65,5 34,5 45,5 40 14,5

мпгн,% (п=19) 71 29 52,6 36,8 10,6 52,65 47,35 31,6 42,1 26,3

Контроль,% (п=80) 65 35 38,3 53,4 8,1 66,8 33,2 46,25 41,25 12,5

*- р< 0,05 - в сравнении с контролем

Нами выявлено увеличение доли Т аллеля и генотипа ТТ гена Mdm2 ( 55,2% пр 66,8%, х2=4,72 р=0,03 и 27,9% пр 46,25%, '/=6,0 р=0,01 соответственно) у больных НСМИ Для стероидзависимой формы НСМИ характерным было увеличение доли аллеля G и генотипа GG гена Mdm2( 53,4% пр 33,2, у_2=4 81 р=0,03 и 31,1% пр 12,5%, %2=6,43 р=0,01 соответственно), ассоциированные с повышенной концентрацией одноименного белка с антагонистическими функциями по отношению p53(Bond G L et al, 2004) Вероятно, снижение апоптоза в подоци-тах у этой когорты больных определяет клиническую картину стероидзависимой формы НСМИ, характеризующейся часторецидивирующим течением

У больных ФСГС распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров обоих генов не отличалось от контрольной группы, что косвенно свидетельствует об отсутствии влияния исследуемых маркеров на апоптоз при данном заболевании Известно, что для данной морфологической формы характерно усиление апоптоза, которое и приводит к развитию фокального склероза (Takemura Т et al 1995, Ortiz A et al,1999) Но даже столь незначительная разница, полученная нами при определении характера распределения полиморфных маркеров G72C гена ТР53 и T309G гена Mdm2 при НСМИ и ФСГС, дала возможность нам продемонстрировать отличия этих морфологических форм

Определяя частоту встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров G72C гена ТР53 и T309G гена Mdm2 у больных МезПГН, была выявлена разница между гематурической формой заболевания и другими клиническими формами МезПГН Так для гематурической формы было характерно увеличение доли аллеля С(82,4% пр 35%,yMl,86 р=0,0006) и генотипа СС(35,3 пр 8,1%,х2=13,92 р=0,0002) гена ТР53, с которыми связывают снижение функции белка р53 и тенденцию к пролиферативным процессамфитоп! Р et al 2003, Pirn D et al,2004) Отсутствие такой ассоциации с НС при МезПГН, позволило нам рассмотреть данный генотип как нефропротективный маркер Следует отметить, что наши данные во многом перекликаются с данными Lee Y, et al, 2005, которые предположили, что

С аллель может быть маркером повышенного риска развития люпус-нефрита при красной волчанке, но не его п ро гресс и ро в ан и я. Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Т3090 гена Мс1т2 у детей с МезПГН не выявило никаких отличий от данных в контрольной группе.

Характер распределения полиморфных маркеров генов р53 и Мс1т2 у пациентов с МПГН мало отличался от такового в контрольной группе.

Роль подоцита в формировании нефротического синдрома продемонстрирована в экспериментальных и клинических работах (Кпг е{ а!.,1998; КецаксЫа О. е1 в1. 2001), что обусловило пристальное изучение генов, кодирующих основные белки структуры клетки.

В нашем исследовании проведено изучение полиморфных маркеров С349А гена ДО/Ш (нефрина) и С 755А гена МРНБ2(подоцина), кодирующие одноименные белки структуры подоцита.

контроль НСМИ СЗНСМИ

Рисунок 7 Частота генотипов полиморфного маркера С349А гена ¡\PIlSJy больных с НСМИ(н=86) и стероидзависимой формой НСМИ (п=45) в сравнении с контрольной группой

Анализ распределения полиморфного маркера С349А гена у пациентов с НСМИ не выявил разницы в частоте встречаемости аллелей и генотипов у данной группы больных в сравнении с контрольной группоЙ(рис.7).

Наши результаты совпадают с выводами Ьапбепкап А е1 а!, 2005, которые провели анализ анамнестических, катам н ест и ческ их и генетических данных паци-

ентов с НС при минимальных изменениях, позволивший им сделать вывод, что генетический фактор имеет наименьшую значимость у этих пациентов. В то же время отмечалась достозерная ассоциация аллеля А (55,25% пр. 31,0%;"/2=4,68; р=0,03) и генотипа АА( 37,9% пр. 13,7%;х2=7,73; р=0;005) с ФСГС. Причем данная ассоциация наблюдалась в группе детей, дебют ФСГС у которых отмечался в раннем возрасте (1 -блет) ( А А: 38,46% пр. 13,75%; х3=4,28; р=0,03).

При МезПГН характер распределения данного маркера не отличался от такого в контрольной группе. Но интересными оказались данные при определении частоты встречаемости полиморфного маркера О349А гена №#¿7 у больных МПГН-При этой форме была выявлена достоверная ассоциация с аллелем С ( 88,95% пр. 69,0%; Х2=11,01; р=0,0009) и генотипом вв (78,9% пр. 36,25%; Х!=1 1=34; р=0,0008) (рис.8). Совершенно противоположные результаты получены при двух морфологических формах - ФСГС и МПГН, характеризующиеся неблагоприятным прогнозом определили, что полиморфный маркер С349А гена А'РНЗ! не влияет на прогноз нефрита, а скорее определяет морфологическую форму гл о меруло нефри-

та.

контроль МезПГН МПГН

* - р<0,05 в сравнении с контролем

Рисунок 8. Частота генотипов полиморфного маркера С349А гена ¡\PHSly больных МезПГН(п—34) и МПГН(п-19) в сравнении с контрольной группой

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера G755A гена NPHS2 в группе больных ХГН обнаружил широкий спектр ассоциаций с различными морфологическими формами Следует отметить неоднозначность данного маркера Как известно, считается что данный маркер определяет нарушение функции подоцина, которое не всегда может приводить к развитию НС, но отчасти влиять на его течение (Candi G et al, 2003)

Определяя характер распределения полиморфного маркере G755A гена NPHS2 у больных НСМИ мы обнаружили, что стероидзависимая форма НСМИ достоверна ассоциирована с генотипом GA (13,4% пр 3,75%, %2=3,9í р=0,046), в то время как НСМИ в целом не ассоциирован с данным генотипом Однако более интересными оказались данные по характеру распределения полиморфного маркера G755A гена NPHS2 у детей НСМИ, дебют заболевания которых отмечался в разных возрастных категориях Было обнаружено, что НСМИ манифес тировавший в школьном возрасте был достоверно ассоциирован с гетерозиготным генотипом GA( 18,2% пр 3,75%, %2=5,62 р=0,02) полиморфного маркера G755A гена NPHS2 Таким образом, несмотря на то, что в развитии НСМИ определяющую роль играют такие цитокины, как IL-13 и IL-4, тем не менее, развитие НСМИ в подростковом возрасте может быть обусловлено сниженной функцией подоцина Несколько другая картина выявлена у больных ФСГС Нами выявлена ассоциация ФСГС с аллелем А (8,62% пр 1,9%; "/2=5,37 р=0,02) и гетерозиготным генотипом GA(\1,25% пр. 3,75%, %2=5,7 р=0,017) данного маркера Более того, эта ассоциация более выраженная была с ФСГС, манифестировавшим в раннем возрасте(1-блет) (аллель А 11,55% пр 1,9% '/>6,03 р=0,009 и генотип GA 23,1% пр 3,75%, х2=6,92 р=0,008), в период, когда в большей степени проявляются наследственные заболевания, что не совсем согласуется с данными зарубежных работ, обнаружившие ассоциацию ФСГС во взрослом состоянии с гетерозиготным полиморфизмом R229Q(G/!) Авторы полагали, что поздняя манифестация заболевания обусловле-

на относительной сохранностью функции подоцина в детском возрасте, и ее утратой в дальнейшем (Ruf RG, et al, 2004 )

Интересными оказались данные по характеру распределения данного маркера у больных НС при МезПГН Увеличение доли аллеля А(11,8% пр 1,9%, X,2—10,16 р=0,001) и генотипа GA( 23,6% пр 3,75%, Х2=Ю,71 р=0,001) было более выраженными в сравнении с предыдущими результатами

Следует подчеркнуть, что МПГН как морфологическая форма в нашем исследовании была наименее презентабельной с точки зрения его ассоциаций с выбранными нами полиморфными маркерами Такая же картина наблюдалась при определении частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера R229Q(G755A) у больных МПГН Характер распределения данного маркера практически совпадал с таковым в контрольной группе

II. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов ACE, MTHFR, PAI-1, ТР53, Mdm2, NPHS1 и NPHS2 со скоростью прогрессирования ХГН.

Скорость прогрессирования хронического гломерулонефрита оценивали ретроспективно в группе из 200 больных В качестве конечной точки наблюдения рассматривали снижение клиренса креатинина ниже бОмл/мин, рассчитанной по формуле Шварца

Из 200 больных у 19(9,5%) пациентов отмечалось нарушение функции по-чек(10(52,63%)мальчиков, девочек-9(47,37%)) Формирование почечной недостаточности отмечалось спустя 4,52+3,56 лет

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ACE, MTHFR, PAI-1, TP53,Mdm2,NPHSl и NPHS2 не выявил достоверных различий в сравнении с группой больных ХГН, что соответствует данным многоцентрового обследования проведенного в Италии, Франции и Швейцарии по изучению ассоциаций хронической почечной недостаточности с генами А СЕ, MTHFR, PAI-1 (Gilles Р et al, 2004)

Рисунок 9 Почечная выживаемость у больных ХГН в зависимости от генотипа полиморфного маркера 4й/5С гена РА1-1

Однако у носителей генотипа 4040, по методу Каплана-Мейера, отмечалась тенденция к более выраженному прогрессированию почечной недостаточности 0с2=5,79, р=0,055)(рис 9)

Более того, данный эффект усиливался при сочетанном носительстве генотипов 4040 гена РА1-1 и ОБ гена АСЕ (х2=9,1, р=0,008)(рис 10)

Complete о Censored

2 4 6 8 10 12 14 16 18 ,

Длительность ХГН,годы

DD+4G4G II,ID+4GiG,5G5G

Рисунок 10 Почечная выживаемость у больных ХГН в зависимости от сочетания генотипов полиморфных маркеров Ш) гена АСЕ и 4в/5С гена РА1-1

Для выявления факторов быстрого прогрессирования почечной недостаточности был проведен монофакторный анализ почечной выживаемости с помощью регрессионной модели Кокса(таб б)

При монофакторном анализе обнаружено, что носительство каждого из «неблагоприятных аллелей не влияет на прогноз заболевания, но сочетание неблагоприятных генотипов гена АСЕ и РА1-1 ассоциировано с более быстрым прогресси-рованием нефрита Были выделены и другие прогностически неблагоприятные факторы Ими оказались возраст начала заболевания(старше 9 лет), длительно сохраняющаяся протеинурия (более 6 месяцев) нефротического уровня

Таблица 6

Монофакторный анализ влияния клинических и генетических факторов на почечную выживаемость у больных ХГН (регрессионная модель Кокса)

'* Фактор- ' J . , • 5* , t -' , - * . Влияние факто-, ' ра на выАивае-моеть, ' Ц1,

Наличие алтеля D гена А СЕ 0

Наличие эллечя Ги С гена,MTHFR ( . ; ' - __ " ; 0 ; , -'* :

Наличие генотипа 4G4G гена PAI-1 0

• ' Наличие комбинации аллелей D^4G ' „. ■ . ; : 4-'(6,о ю)

Наличие генотипа СС гена р53 0

/ Наличие генотипа GG re»a Шт2. •> *, *" 1 • • • ."» , , 0 * ' . '

Наличие генотипа/L4 гена NPHS1 0

г Наличие гевотига GA TtmflPH&l;rr" " '- .*,' "»

Мужской /женский пол 0

■ Возраст началй заболевания (старше" 9йет) ' •<" ; ¿(0,029)

Наличие АГ на момент первого обследования 0

; Уровень,протеинурим'в дебюте заболеваний/ '* • ,

Персистирование протеинурии в течение 6 и более месяцев 1 (0,001)

, , Отсутствие ДГ на протяжении ХГН .. • - -«'*,!. "" ' ' ; \ I " -

О - показатель не влияет на выживаемость, 4 - показатель ухудшает выживаемость, Т - показатель улучшает выживаемость

III. Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов Л СЕ, PAI-1, р53, Mdm2,NPHSl и NPHS2 с эффективностью иммуносунрессивной терапии.

Первым этапом в нашем исследовании было определение частот аллелей и генотипов перечисленных генов у стероидчувствительных и стероидрезистентных больных Оценка эффективности стероидной терапии проведена у 179 пациента, из которых у 109 ребенка гормональная терапия была эффективной, а у 70 больных - нет Среди стероидчувствительных пациентов 80 детей были с НСМИ, 17 больных с МезПГН, с МПГН -5, с ФСГС-2, МГН -3, фибропластическим гломеру-лонефритом - 2 Из 70 детей со стероидрезистентностью 21 ребенок был с МезПГН, 6 - с НСМИ, 14 - с МПГН, 27- с ФСГС, по 1 ребенку был? с МГН и фиб-ропластическим гломерулонефритом

Проведенный анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов генов АСЕ, PAI-1, р53, Mdm2,NPHSl и NPHS2 обнаружил, что стероидчувст вительность у больных ассоциирована с генотипом GG гена Mdm2 ( 28,4% пр 12,5% , х2=3,96, р=0,046) Обнаруженная ассоциация вполне объяснима, т к с генотипом GG гена Mdm2 ассоциировано увеличение уровня одноименного белка, обладающего про-тивоапоптозным действием посредством ингибирования проапопгозного белка р53 Вышеизложенным обусловлена тенденция к пролиферативным процессам в тканях Основным свойством глюкокортикоидов является подавление клеточной пролиферации, в том числе посредством усиления клеточного апоптоза Таким образом, генетически детерминированная склонность к пролиферативным процессам легко подавляется действием стероидов Однако наши данные не совсем согласуются с данными Concm N et al, 2005, обнаруживших снижение эффективности химиотерапии у онкологических больных-носителей генотипа СС полиморфного маркера G72C гена ТР53, с которым также связывают склонность к пролиферативным процессам

Для стероидрезистентных больных была характерна более частая встречаемость аллеля А (11,45% пр 1,9, х2=11>49 р=0,0007) и генотипа GA (22,9% пр 3,75,

%2=12,32 р=0,0004) гена NPHS2 Ассоциацию стероидрезистентности с генотипом GA гена NPHS2 можно объяснить как дисфункцией подоцина, определенным данным генотипом (Weber S et al, 2004), так и, возможно, наличием других мутаций у данной категории больных, часто сочетающихся с полиморфным маркером G755A гена NPHS2 (Ruff G et al 2004)

Отсутствие эффективности стероидной терапии, определяло использование других иммуносупрессивных препаратов В группу больных получавших иммуно-супрессивные препараты входило 62 ребенка Препаратами выбора для усиления иммуносупрессии были циклоспорин А (сандимун-неорал), циклофосфамид (эн-доксан), микофенолат мофетил (селсепт), хлорамбуцил (лейкеран) Следует отметить, что у обследуемых детей отмечалась различная комбинация иммуносупрес-сивной терапии В ряде случаев один и тот же больной получал в течение лечебного курса последовательно два цитостатических препарата в сочетании с приемом глюкокортикоидов Отсутствие достижения ремиссии при длительной иммуносу-прессивной терапии определило образование двух групп Первая группа(п=32) состояла из детей чувствительных к иммуносупрессивной терапии (МезПГН-8, МПГН-9, ФСГС-14, МГН-1), а у детей второй (п=30) группы сохранялась резистентность (МезПГН-13, МПГН-5, ФСГС-11, фибропластический нефрит-1)

Проанализировав характер распределения аллелей и генотипов выше указанных полиморфных маркеров в группе больных чувствительных к иммуносупрессивной терапии, нами не выявлен какой-либо маркер, ассоциированный с чувствительностью к терапии В то время как резистентность к иммуносупрессии была ассоциирована с генотипами 5G5G полиморфного маркера 4G/5G гена PAI-1, АА полиморфного маркера G349A гена NPHS1 и GA полиморфного маркера G755A гена NPHS2(ja5n 7)

Таблица 7

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров 4 О/Кг гена РА1-1 С349А гена МРН81 и (775ЗА гена №НБ2у больных резистентных к иммуносу-прессивной терапии в сравнении с контрольной группой

Ген/ Больные резистент- Контрольная >2 Р

генотипы ные к иммуносу-прессии % (п-30) группа % (п=80)

4G/5G ген PAI-1

4G4G 46,7 36,25

4G5G 16,6 46,25

5G5G 36,7* 17,5 оо Г? rf 0,043

G349A ген NPHS1

GG 36,7 36,25

GA 26,6 50

АА 36,7* 13,75 5,''.2 0,02

G755A ген NPHS2

GG 76,7 96,25

GA 23,3* 3,75 11,21 0,0008

* - р< 0,05 - в сравнении с контролем

Аналогичный анализ мы провели в группе больных ФСГС(п=21), которые получали в качестве иммуносупрессивной терапии циклоспорин А (габл 8)

Таблица 8

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров 40/50 гена РА1-1 в349А гена МРШ1 и в755А гена Ъ'РШ2 у больных ФСГСрезистентных к терапии циклоспорином А в сравнении с контрольной группой

Ген/ Больные ФСГС, ре- Контрольная Р

генотипы зистентных к ЦСА (п=11) группа % (п=80)

4а$С ген РА1-1

4С40 18,2 36,25

18,2 46,25

5С5С 63,6* 17,5 11,6 0,0007

С349А ген Ь'РШ1

сс 18,2 36,25

вА 27,з 50

АА 54,5* 13,75 10,59 0,011

С755Л ген МРП5'2

во 54,5 96,25

СА 45,5* 3,75 20,98 0,00001

*- р< 0,05 - в сравнении с контролем

Среди детей, получавших циклоспорин А, эффективность от проведенной терапии наблюдалась только у 10 больных, тогда как 11 пациентов сохраняли резистентность к лечению Наше исследование выявило, что резистентность к циклоспорину А, также ассоциирована с генотипами 5<?5(? полиморфного маркера 4С/5С гена РА1-1, АА полиморфного маркера 0349А гена ЫРШ! и <3/1 полиморфного маркера 0755А гена ЫРНБ2 Но данная ассоциация была более выраженная

Возможно, что резистентность к терапии ассоциированная с полиморфными маркерами генов нефрина(МРН8 1) и подоцина(ЫРН82), обусловлена либо функциональными нарушениями одноименных белков, либо данные маркеры ассоциированы с мутациями этих генов Неожиданностью оказалась ассоциация резистентности к терапии с генотипом 5050 гена РА1-1 Полученные данные можно объяснить противоположными действиями полиморфного маркера 5050 гена РА1-1 и иммуносупрессивной терапии Вероятно профибринолитический генотип 5050 гена РА1-1 (Затейщиков ДА и соавт,2005) противодействует иммуносупрессивной терапии, обуславливающей усиление синтеза РА1-1 (ассоциированное с генотипом 4040) (ЗЖаЬ Р Б е1 а1, 1996, БЖаЬ Б Б Ы а1, 1997) Аналогичный взгляд имеет Сопст N « а1, 2005, выявивший отсутствие чувствительности к химиотерапии у онкологических больных - носителей антиапоптозного генотипа СС гена ТР53

Таким образом, наше исследование показало, что как клиническая, так и морфологическая форма заболевания обусловлена комплексом определенных генов, продукты экспрессии которых, ассоциированы с системами, играющими важную патогенетическую роль в развитии нефритов Нами также продемонстрировано, что независимо от морфологической и клинической формы нефрита существуют единые генетические факторы, определяющие неблагоприятный исход болезни Более того, носительство определенных генетических маркеров может обуславливать резистентность к иммуносупрессивной терапии

выводы

Особенности клинических и морфологических форм хронического гломе-рулонефрита определены комплексом генотипов полиморфных маркеров ренин-ангиотензиновой, иммунной и свертывающей систем системы апоп-тоза и структурных белков подоцита

Нефротический синдром с минимальными изменениями характеризуется ассоциацией с генотипами АА(проатопический генотип) гена 1Ь-13, 505в гена РА1-1, АА гена СТЬА-4 Носительство аллеля Б (обуславливающего вазоконстрикцию) у больных НСМИ определяет более ранний дебют заболевания и степень выраженности протеинурии ( увеличение уровня) Поздняя (школьный возраст) манифестация НСМИ ассоциирована с генотипом ОА(обуславливающим функциональные изменения подоцинэ.) гена №Н52

Отличительной особенностью стероидзависимой формой нефротического синдрома с минимальными изменениями является ассоциац ля с аллелем Б гена АСЕ, генотипами СС(противоапоптозный генотип) гена Мс1т2 и вА гена №НБ2

Формирование ФСГС обусловлено носительством генотипов 5050 гена РА1-1, СС гена 1Ь-4, АА гена СТЬА-4, АА гена NPHS1 и СЛ гена ЫРШ2 Наличие аллеля Б способствует развитию артериальной гилертензии в дебюте заболевания

Гематурическая форма МезПГН характеризуется ассоциации й с генотипом II гена АСЕ 4040(прокоагулянтный генотип) гена РА1-1, СС (противо-апоптозный генотип) гена ТР53 Повышение доли аллеля Э гена АСЕ и генотипа вА гена КРШ2 обуславливало развитие нефротической формы МезПГН

Носительство генотипа 404в гена РА1-1 у больных мембранопролифера-тивным гломерулонефритом обуславливало более раннюю манифестацию

нефрита Отличительной особенностью МПГН являлась его ассоциация с генотипами СС(ассоциированный с повышенной концентрацией гомоци-стеина) полиморфного маркера А1298 гена МТЫБЯ и вО гена №>Н81

7 Носительство комбинации генотипов ББ гена АСЕ и 4040 гена РА1-1 является самостоятельным независимым фактором прогрессирования почечной недостаточности

8 Носительство генотипа вй гена Мс1т2 ассоциировано с стероидчувстви-тельностью Стероидрезистентность характеризуется ассоциацией с генотипом йА гена ЫРШ2 У больных резистентных к иммуносупрессивной терапии отмечается повышение доли генотипов 5С50(профибринолитический генотип) гена РА1-1, АА гена №НБ1 и вА гена КРН82

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для определения особенностей клинической и морфологической формы нефрита рекомендуется изучение полиморфных маркеров генов, ассоциированных с различными системами, имеющими патогенетическ ое значение как в развитии, так и в прогрессировании гломерулонефрита

Для определения характера прогрессирования хронического гломерулонефрита следует определить генотипы полиморфного маркера I/D гена АСЕ и полиморфного маркера 4G/5G гена РА 1-1

Для прогнозирования эффективности стероидной и иммуносупрессивной терапии рекомендовано изучение полиморфных маркеров 4G/5G гена PAI-1, T309G гена Mdm2, G349A гена NPHS1, G755A гена NPHS2

Наличие у ребенка с нефротическим синдромом генотипа Gä полиморфного маркера G755A гена NPHS2 в сочетании с резистентностью к иммуносупрессивной терапии служит основанием для проведения дорогостоящего генетического обследования по выявлению мутаций гена NPHS2, для исключения аутосомно-рецессивного стероидрезистентного нефротического синдрома, характеризующегося отсутствием эффективности иммуносупрессивной терапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Петросян Э К, Наточииа Н ГО Характеристика воспаления по оценке клеточного звена иммунитета и внутрисосудистой активации тромбоцитов у больных гломерулонефритом // Материалы II региональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы детской уронефроло-гии» Владивосток 22-23 октября 1998г с 87

2 Петросян Э К, Папаян А В Клинико-морфологическая характеристика ка-пилляротоксического нефрита // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы детской нефрологии и урологии» Алматы, 13-14 октября 1998г, с 18-19

3 Петросян Э К Клинико-иммунологическая характеристика капилляротокси-ческого нефрита// Сборник трудов IV ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара, Санкт - Петербург, 23-26 июня, РЕНКОР-1998г, с 164-165

4 Петросян Э К , Генералова Г А Дозы ингибитора ангиотензинпревращаю-щего фермента (АПФ) в терапии детей с рефлюкс - нефропатией(РН) // Материалы XII Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство» -Москва-2005г-с 68

5 Петросян Э К , Генералова Г.А, Филиппова Н.А, Бояджян М Б , Федин А В , Кузнецова 3 Ю Роль генетического полиморфизма ангиотензинпревращаю-щего фермента в прогрессировании рефлюкс-нефропатии// Материалы III Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - Москва,2005г -с 284

6. Петросян Э К, Белянская Т В , Горашко НА// Полиморфизм гена ангио-тензинпревращающего фермента у детей с нефротическим синдромом Материалы VI съезда научного общества нефрологов в России- Москва,2005 г, с40

7. Белянская Т.В , Петросян Э К , Ильенко JIИ Полиморфизм гена PAI-1 у детей с хроническим гломерулонефритом // Материалы IV Всероссийского

конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - Москва, 2005г -с 179

8 Белянская Т В , Петросян Э К , Ильенко Л И, Бабунова Н Б , Бровкин А Н Генетический полиморфизм метилентетрагидрофолатредуктазы у больных хроническим гломерулонефритом // Материалы IV Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - Москва, 2005г -с 180

9 Петросян Э К , Генералова Г А , Ильенко JIИ Полиморфизм ангиотензин-превращающего фермента как фактор риска развития артериальной гипер-тензии у детей с рефлюкс - нефропатией// Материалы IV Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - Москва,2005г -с 179

10 Е Petrosyan, М Bojadjyan Genetic polymorphism NPHS1 and NPHS2 in not nephritic syndrome//39th Annual Meeting of European Society Pediatric Nephrology -Istanbul, 2005 -P 99

11 Белянская T В , Петросян Э К , Цыгин А Н, Ильенко JIИ , Шестаков А Е , Носиков В В Гипергомоцистеинемия у детей с хроническим гломерулонефритом // Материалы V Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - Москва,200бг -с 254

12 Петросян Э К , Цыгин А Н, Ильенко JIИ, Шестаков А Е , Носиков В В Ген подоцина при стероидрезистентном нефротическом синдроме // Материалы V Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - Москва,2006г -с 261

13 Петросян Э К, Цыгин А Н, Врублевский С Г, Шестаков А Е Ген белка су-прессора раковых опухолей (ТР53) у больных хроническим гломерулонефритом // Материалы X конгресса педиатров России « Актуальные проблемы педиатрии»-Москва,2006 Вопросы современной педиатрии-2006 - т 5 №2 -с 98

14 Петросян Э К , Цыгин А Н, Ильенко JIИ, Врублевский С Г, Шестаков А Е Генетический полиморфизм антагониста рецептора интерлейкина-1 у боль-

ных хроническим гломерулонефритом // Материалы X конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии»- Москва,2006 Вопросы современной педиатрии-2006 - т 5 №2 -с 99

15 Петросян ЭК, Цыгин АН, Ильенко ЛИ, Шестаков А Е Полиморфизм ИЛ-13 у детей при стероидчувствительном нефротическом синдроме// Материалы X конгресса педиатров России « Актуальные проблемы педиатрии»-Москва,2006 Вопросы современной педиатрии- 2006 - Т 5 №2 -с 99

16 Белянская Т В , Петросян Э К, Чудакова Д А, Шестаков А Е Ильенко Л И Полиморфизм гена ингибитора активатора плазминогена-1, как маркер активности эндотелия у детей с разными формами гломерулонефрита // Материалы V Российского конгресса по детской нефрологии - Воронеж,2006г-с 34

17 Петросян Э К , Белянская Т В , Цыгин А Н, Ильенко Л И, Шестаков А Е Полиморфизм гена антигена цитотоксического Т-лимфоцита (CTLA-4) у больных хроническим гломерулонефритом // Материалы V Российского конгресса по детской нефрологии- Воронеж,2006г -с 171

18 Петросян Э К , Белянская Т В , Цыгин А Н, Ильенко Л И, Шестаков А Е Полиморфизм гена белка апоптоза MDM2 у детей со стероидчувствитель-ным и стероидрезистентным нефротическим синдромом// Материалы V Российского конгресса по детской нефрологии -Воронеж,2006г -с 171

19Петросян ЭК, Цыгин АН, Шестаков АЕ, Носиков В В Полиморфизм NPHS1 (гена нефрина) у детей с нефротическим синдромом // Материалы V Российского конгресса по детской нефрологии - Воронеж,2006г -с 172

20 Е Petrosyan, A Tsygin, A Shestakov Polymorphic marker R229Q m children with nephritic syndrome // 40th Annual Meeting of European Society Pediatric Nephrology -Palermo, 2006 -P 1618

21 Петросян Э К Подоцит строение и роль в развитии нефротического синдрома // Нефрология и диализ -2006 -Т 8 №2 - С 112-121

22 Петросян Э К , Цыган А Н , Шестаков А Е , Носиков В В Генетические маркеры нефротического синдрома у детей // Нефрология -2006 -Т 10 №3 - С 48-54

23 Петросян Э К.1, Ильенко ЛИ1, Цыгин АН2, Шестаков А Е 3, Носиков В В Влияние полиморфизма гена Р53 в 72 кодоне на лечение и исходы ХГН у детей и подростков// Педиатрия -2006 -№5 - С 4-7

24 Петросян Э К , Цыгин А Н , Шестаков А Е , Носиков В В Роль генетического полиморфизма интерлейкина-4 и интерлейкина-13 у детей с нефротиче-ским синдромом с минимальными изменениями // Педиатрия -2006 -№5 -С 7-10

25 Петросян Э К , Цыгин А Н, Ильенко Л И, Шестаков А Е , Носиков В В Полиморфный маркер 11229(2 гена подоцина у детей с нефротическим синдромом // Нефрология и диализ -2006 -Т 8 №3 - С 268-271

26 Петросян Э К, Белянская Т В , Ильенко Л И, Цыгин А Н, Носиков В В , Камышова Е С Полиморфный маркер 40/50 гена РА1-1 у детей с хроническим гломерулонефритом // Нефрология -2006 -Т 10 №4 - С 56-61

27 Петросян Э К, Ильенко Л И, Цыгин А Н, Шестаков А Е , Носиков В В Полиморфизм гена СТЪА-4 у детей с хроническим гломерулонефритом // Иммунология -2007 -Т 28 №1 - С 7-10

28 Шестаков А Е , Камышова Е С, Петросян Э К, Кутырина И М, Савостьянов К В , Носиков В В Изучение ассоциации полиморфных маркеров Уа1762А1а и Ьеи54Р11е гена АОРЯН с хроническим гломерулонефритом у русских пациентов города Москвы // Генетика -2007 -Т 43 № 2 -С 261-264

29 Петросян Э К Фокально-сегментарный гломерулосклероз-этиопатогенетические, клинические и морфологические особенности //Педиатрия-2007 - №3 - С 4-7

30 Петросян Э К Врожденные формы фокально-сегментарного померулоскле-роза // Российский вестник неонатологии и перинатологии-200 7 - №3 -С 8-11

Список сокращений

АГ - Артериальная гипертензия

МИ - Минимальные изменения

МезПГН - Мезангиопролиферативный гломерулонефрит

МГН - Мембранозный гломерулонефрит

МПГН - Мембранопролиферативный гломерулонефрит

НС - Нефротический синдром

НСМИ - Нефротический синдром с минимальными изме-

нениями

СЗНСМИ - Стероидзависимая форма НСМИ

ФПГН - Фибропластический гломерулонефрит

ФСГС - Фокально-сегментарный гломерулосклероз

ХГН - Хронический гломерулонефрит

ЦСА - Циклоспорин А

АСЕ - Ген ангиотензинпревращающего фермента

Нсу - гомоцистеин

1Ь-4 - Интерлейкин-4

1Ь-13 - Интерлейкин-13

МТНРЯ - Ген метилентетрагидрофолатрезуктаза

- Ген нефрина

МРШ2 - Ген подоцина

РАМ - Ингибитор активатора плазминогена -1

ТР53 - Ген р53

ТЬ2 - Т-хелперы 2

Диссертант выражает благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП «Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов», возглавляемой д б н профессором В В Носиковым за оказанную помощь в проведении генетического обследования в рачках данной научной работы

Подписано в печать 16 04 2007 г Исполнено 18 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 370 Тираж 100экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Развитие и прогрессирование хронического гломерулонефрита остается одной из актуальных проблем в нефрологии.

Гломерулонефрит являясь многофакторным заболеванием, характеризуется высокими темпами роста заболеваемости и инвалидизации детского населения в современных популяциях (Игнатова М.С., 2005).

За последнее десятилетие приложены огромные усилия по изучению этиологии и патогенеза гломерулонефрита. Зарубежными и отечественными исследованиями было показано, что в основе возникновения лежат сложные взаимодействия генетических факторов (Kaplan J and Pollak M.R. et al,2001, Игнатова M.C.,2005).

Для многофакторных заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. Однако для каждого конкретного заболевания можно выделить группу, так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Так, анализ многочисленных работ по ассоциациям различных классов генов ренин-ангиотензиновой системы с предрасположенностью развития гломерулонефрита продемонстрировал противоречивые данные, обусловленные характером сформированных групп ХГН. Однако до сих пор не изучено влияние наиболее известного полиморфного маркера I/D гена ангиотензинпревращаю-щего фермента(АСЕ) на особенности клинических и морфологических форм гломерулонефрита.

До сих пор неустановленна причина гипергомоцистеинемии у больных хронической почечной недостаточностыо(Висс!апи G. et al, 2002). Важной генетической определяющей уровня Нсу(гомоцистеина) плазмы в общей популяции является С677Т полиморфизм гена MTHFR (метилентетрагидрофолатре-дуктазы). Наличие ТТ-генотипа ведет к закономерному повышению уровня Нсу примерно в 2 раза по сравнению с СС-субьектами ( Jasques PF et al, 1996,

Fodinger M. et al,1997). По данным японских ученых ТТ генотип может быть ассоциирован с ранним развитием и прогрессированием у детей с OCrC(Zou С. et al, 2002). Liangos О. et al, 1998, проводя анализ выживаемости почечного трансплантата, обнаружили, что генотип ТТ обуславливал раннее отторжение почки. Таким образом, несмотря на значительные успехи в изучении проблемы, до сих пор не получены окончательные ответы на целый ряд вопросов, касающихся роли, причин возникновения, а также необходимости и способов коррекции гипергомоцистеинемии у больных с почечной патологией.

Недостаточно изучено влияние полиморфизмов ряда генов других систем, к числу которых относятся система гемостаза, иммунная система, система апоптоза.

Изучение полиморфного маркера 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1), кодирующего одноименный белок, концентрация которого в ткани почек коррелирует с процессами фиброза в ней (Grandaliano G. et al, 2000,Tang W.W. et al, 2003), не установило однозначной роли данного маркера в развитии и прогрессировании заболевания почек. По данным Wang AY и соавт. с генотипом 4G4G гена PAI-1 ассоциируется активность люпус-нефрита, но не его хронизация. Напротив Suzuki Н. et al., 2004, рассматривают генотип 4G4G как фактор прогрессирования IgA-нефропатии. Согласно исследованиям Gilles P. et al, 2004, частота встречаемости генотипов данного полиморфного маркера у больных хронической почечной недостаточности мало отличалась от популяционной группы, что исключает его роль в прогрессировании заболеваний почек.

Не до конца определена роль полиморфизма генов некоторых маркеров иммунной системы (IL-4, IL-13 и CTLA-4) в патогенезе отдельных форм гломе-рулонефрита. В немногочисленных исследованиях по изучению полиморфного маркера С-590Т гена IL-4 у детей с НСМИ выявило кардинально расходящиеся данные (Kobayachi Y. et al., 2003 , Parry RG et al.,1999)

В литературе недостаточно данных о влиянии полиморфных маркеров генов ТР53 и Mdm2, кодирующие одноименные белки апоптоза, на развитие и течение отдельных клинических и морфологических форм гломерулонефрита, а также его прогрессирование.

Малоизученным остается роль полиморфизма генов нефрина(КРН81) и подоцина(>1РН82), структурных белков подоцита в развитии нефротического синдрома и особенно его клинических форм при различных морфологических вариантах. Более того, до сих пор не проводился анализ зависимости комплекса генетических полиморфных маркеров на формирование клинических и морфологических форм, особенности развития, течения и прогрессировать хронического гломерулонефрита. И, наконец, в доступной нам как отечественной, так и зарубежной литературе мы не встретили данных по изучению эффективности иммуносупрессивной терапии в зависимости от носительства различных генотипов патогенетических генов-кандидатов.

Изложенное выше позволяет считать, что комплексное изучение генетических маркеров, клинико-морфологических особенностей, может расширить представление о прогностических факторах, отдельных патогенетических механизмах, особенностях течения и подходах к лечению гломерулонефритов.

Цель исследования: Установить комплексное влияние полиморфизма генов на формирование клинических и морфологических форм хронического гломерулонефрита и эффективность иммуносупрессивной терапии.

Задачи исследования:

1. Изучить ассоциацию полиморфных маркеров генов ангиотензинпревра-щающего фермента (I/D-ACE'), ингибитора активатора плазминогена -1 (■4G/5G-PAI-1) метилентетрагидрофолатредуктазы (С677ТA1298C-MTHFR) с дебютом и развитием хронического гломерулонефрита(ХГН), а также с его клиническими и морфологическими формами.

2. Определить роль аутоиммунного механизма в патогенезе ХГН посредством изучения ассоциации морфологических форм гломерулонефрита с полиморфным маркером гена антигена цитотоксических лимфоцитов (G49A

CTLA-4).

3. Установить значение полиморфных маркеров генов интерлейкина -4 и 13 {C-590T-IL-4; G4257A-IL-13) в патогенезе нефротического синдрома с минимальными изменениями и фокально-сегментарного гломерулосклероза.

4. Выявить влияиие полиморфных маркеров генов белков апоптоза ТР53 (G49Q и Mdm2 (T309G) на развитие и прогноз ХГН.

5. Проанализировать зависимость формирования НС при различных морфологических формах ХГН от генотипов полиморфных маркеров генов нефрина оG349A-NPHS1) и подоцина (G755A-NPHS2).

6. Оценить скорость прогрессирования ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов АСЕ, PA 1-1, MTHFR, TP53,Mdm2, NPHS1 и NPHS2.

7. Оценить эффективность иммуносупрессивной терапии у больных ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов АСЕ, PAI-1, ТР53, Mdm2, NPHS1 и NPHS2.

Научная новизна:

На основании комплексного изучения полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы, иммунной и свертывающей систем, системы апоптоза и структурных белков подоцита сформулирована новая концепция по формированию клинических и морфологических форм хронического гломерулонефрита

Доказано, что особенности дебюта заболевания (возраст больного к началу заболевания, клиническая форма манифестации нефрита, наличие артериальной гипертензии), его течения и прогрессирования зависят от носительства комбинации генотипов различных полиморфных маркеров генов выше указанных систем.

Впервые продемонстрировано, что формирование морфологических форм обусловлено альянсом генотипов полиморфных маркеров различных систем. Более того, особенность клинической картины в рамках одной и той же морфологической формы определяется различными генотипами одного и того же полиморфного маркера.

Проведенное комплексное исследование генетических маркеров системы РАС, свертывающей системы, системы апоптоза, а также маркеров кодирующих фермент метилентетрагидрофолатредуктазы и структурных белков подо-цита у больных хронической почечной недостаточностью установило, что со-четанное носительство генотипа 4G4G полиморфного маркера 4G/5G гена PAI-1 и DD полиморфного маркера I/D гена АСЕ является фактором неблагоприятного прогноза ХГН.

Впервые проведен анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, PAI-1, ТР53, Mdm2, NPHS1 и NPHS2 с эффективностью стероидной терапии. Установлено, что носительство генотипа GG полиморфного маркера T309G гена Mdm2 обуславливает чувствительность больных ХГН к глюкокортикоидам, тогда как генотип GA полиморфного маркера G755A гена NPHS2 достоверно ассоциирован со стероидрезистентностью.

Аналогичный анализ проведен у больных, иммуносупрессивная терапия, которых включала в себя комплексное применение глюкокортикоидов и цито-статиков. Было показано, что характер распределения аллелей и генотипов у больных чувствительных к иммуиосупрессии мало отличался от такового в контрольной группе. Однако резистентность к иммуносупрессивной терапии ассоциирована с генотипом 5G5G полиморфного маркера 4G/5G гена PAI-1, генотипами АА полиморфного маркера G349A гена NPHS1 и GA полиморфного маркера G755A tq\ivlNPHS2.

Практическая значимость:

Комплексное изучение полиморфных маркеров генов различных систем, имеющих патогенетическое значение в формировании и прогрессировании гломерулонефрита, рекомендуется использовать в клинических условиях для определения особенностей клинической и морфологической формы гломеруло-нефрита и предполагаемой эффективности лечения.

Носительство комбинации генотипа DD полиморфного маркера I/D гена АСЕ и генотипа 4G4G полиморфного маркера 4G/5G гена PAI-1 является независимым фактором прогрессирования хронического гломерулонефрита и является показанием для раннего проведения нефропротективной терапии.

Оригинальный способ прогнозирования эффективности стероидной и иммуносупрессивной терапии, основанный на использовании изучения полиморфных маркеров 4G/5G гена PAI-1, T309G гена Mdm2, G349A гена NPHS1, G755A гена NPHS2 позволяет выявлять группы больных с различной чувствительностью к проводимой терапии.

Носительство генотипа GA полиморфного маркера G755A гена NPHS2 у ребенка с нефротическим синдромом, характеризующийся резистентностью к иммуносупрессивной терапии, может служить косвенным признаком наличия аутосомно-рецессивного стероидрезистентного нефротического синдрома.

Внедрение результатов в практику. Основные результаты проведенных исследований внедрены в лечебную практику нефрологических отделений детской клинической городской больницы № 13 им. Н.Ф. Филатова и ГУ Научного центра здоровья детей РАМН, нефро-урологическом центре при КДЦ ДКГБ №13, используется в материалах лекций и практических занятий для студентов, интернов и ординаторов Российского государственного медицинского университета.

Гпава 1. Современные представления о значении полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов в развитии и прогресси-ровании ХГН

Быстрое развитие молекулярной биологии и генетики заложило основу для успешного изучения молекулярной генетики широко распространенных заболеваний. Благодаря накоплению новых данных о структурной организации генома человека и обнаружению в нем полиморфных маркеров (вариабельных участков ДНК в различной степени ассоциированных с каким-либо признаком) стало возможным изучение роли генетических факторов в возникновении и прогрессировании целого ряда заболеваний человека.

В настоящее время основной концепцией молекулярной генетики заболеваний является представление об ассоциации полиморфного маркера гена с предрасполоэ/сенностыо или устойчивостью к развитию патологии [14]. При этом под ассоциацией понимают достоверно различающуюся частоту встречаемости аллеля/генотипа исследуемого полиморфного маркера среди лиц с различными фенотипами (с наличием и отсутствием патологии). Более высокая распространенность маркера у больных по сравнению со здоровыми, указывает на предрасположенность (повышенный риск), а более низкая - на устойчивость (пониженный риск) к данному заболеванию.

Особое внимание уделяется изучению полиморфных маркеров генов-кандидатов, т.е. генов, продукты экспрессии которых (например, фермент, гормон, рецептор, структурный или транспортный белок) могут прямо или косвенно участвовать в возникновении и прогрессировании патологии.

выводы

1. Особенности клинических и морфологических форм хронического гло-мерулонефрита определены комплексом генотипов полиморфных маркеров ренин-ангиотензиновой, иммунной и свертывающей систем, системы апоптоза и структурных белков подоцита.

2. Нефротический синдром с минимальными изменениями характеризуется ассоциацией с генотипами АА(проатопический генотип) гена IL-13, 5G5G гена PAI-1, АА гена CTLA-4. Носительство аллеля D (обуславливающего вазоконстрикцию) у больных НСМИ определяет более ранний дебют заболевания и степень выраженности протеинурии ( увеличение уровня). Поздняя (школьный возраст) манифестация НСМИ ассоциирована с генотипом ОА(обуславливающим функциональные изменения подоцина) гена NPHS2.

3. Отличительной особенностью стероидзависимой формой нефротиче-ского синдрома с минимальными изменениями является ассоциация с аллелем D гена АСЕ, генотипами СС(противоапоптозный генотип) гена Mdm2 и GA гена NPHS2.

4. Формирование ФСГС обусловлено носительством генотипов 5G5G гена РАМ, СС гена IL-4, АА гена CTLA-4, АА гена NPHS1 и GA гена NPHS2. Наличие аллеля D способствует развитию артериальной гипер-тензии в дебюте заболевания.

5. Гематурическая форма МезПГН характеризуется ассоциацией с генотипом II гена АСЕ . 404С(прокоагулянтный генотип) гена PAI-1, СС (про-тивоапоптозный генотип) гена ТР53.Повышение доли аллеля D гена АСЕ и генотипа GA гена NPHS2 обуславливало развитие нефротиче-ской формы МезПГН.

6. Носительство генотипа 4G4G гена PAI-1 у больных мембранопролифе-ративным гломерулонефритом обуславливало более раннюю манифестацию нефрита. Отличительной особенностью МПГН являлась его ассоциация с генотипами СС(ассоциированный с повышенной концентрацией гомоцистеина) полиморфного маркера А1298 гена MTHFR и GG гена NPHS1.

7. Носительство комбинации генотипов DD гена АСЕ и 4G4G гена PAI-1 является самостоятельным независимым фактором прогрессирования почечной недостаточности.

8. Носительство генотипа GG гена Mdm2 ассоциировано с стероидчувст-вительностью. Стероидрезистентность характеризуется ассоциацией с генотипом GA гена NPHS2. У больных резистентных к иммуносупрессивной терапии отмечается повышение доли генотипов 5С5С(профибринолитический генотип) гена PAI-1, АА гена NPHS1 и GA гена NPHS2.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для определения особенностей клинической и морфологической формы нефрита рекомендуется изучение полиморфных маркеров генов, ассоциированных с различными системами, имеющими патогенетическое значение как в развитии, так и в прогрессировании гломерулонефрита.

2. Для определения характера прогрессирования хронического гломерулонефрита следует определить генотипы полиморфного маркера I/D гена АСЕ и полиморфного маркера 4G/5G гена PAI-1.

3. Для прогнозирования эффективности стероидной и иммуносупрессивной терапии рекомендовано изучение полиморфных маркеров 4G/5G гена PAI-1, T309G гена Mdm2, G349A гена NPHS1, G755A гена NPHS2.

4. Наличие у ребенка с нефротическим синдромом генотипа GA полиморфного маркера G755A гена NPHS2 в сочетании с резистентностью к иммуносупрессивной терапии служит основанием для проведения дорогостоящего генетического обследования по выявлению мутаций гена NPHS2, для исключения аутосомно-рецессивного стероидрезистентного нефротического синдрома, характеризующегося отсутствием эффективности иммуносупрессивной терапии.