Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Роль полиморфизма генов NO-синтаз в формировании атопического дерматита и бронхиальной астмы у детей

На правах рукописи У,

ФГ

СМИРНОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ РЮ-СИНТАЗ В ФОРМИРОВАНИИ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА И БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У

ДЕТЕЙ

14.00.09 - педиатрия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

104 1

Томск - 2009

003481041

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ

Огородова Людмила Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Нагаева Татьяна Александровна доктор медицинских паук, профессор Назаренко Людмила Павловна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого

диссертационного совета Д 208.096.02 при ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2

С диссертацией можно ознакомиться в паучпо-медицинской библиотеке ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

Автореферат разослан«/? » ОК Д 2009 г.

Защита состоится

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета

Тюкалова Л.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Широкая распространенность аллергических болезней является актуальной проблемой детского возраста, как в России, так и в других странах мира [Ревякина В.А., Филатова Т.А. 2006]. Основу развития аллергопатологии составляет «атонический марш», который представляет собой последовательную манифестацию аллергических симптомов и болезней у предрасположенных к атопии лиц [Spergel J.M., Paller A. S., 2003]. Атопический дерматит (АД) часто является началом «атопического марша», поэтому дерматит рассматривается в качестве фактора высокого риска развития бронхиальной астмы (БА) [Rhodes H.L., 2001]. Приблизительно у 50% детей, больных АД, в дальнейшем развиваются аллергические респираторные болезни: БА и аллергический ринит (АР) [Lau S., Nickel R., 2002].

Согласно результатам исследований, проведенных Dohi с соавт., 1990, Lack с соавт., 2003, Spergel J.M., 1998, Tincle S., 2003, фундаментальным механизмом «атопического марша» является эпикутанная сенсибилизация у больных АД, которая способна вызвать системный иммунный ответ, в том числе и в дыхательных путях, с последующим развитием аллергического воспаления и формированием БА.

У АД и БА имеется общая генетическая основа. Неблагоприятное сочетание полиморфных вариантов генов, белковые продукты которых являются ключевыми компонентами аллергического воспаления, определяют предрасположенность к формированию БА и АД. Многочисленные исследования объясняют значение определенных аллельных вариантов генов в развитии аллергии, но пи один из них пе может претепдовать на ведущую роль в формировании аллергических болезней [Саркисян Л.К., 2003, Blumenthal M.N., 2005]. Общие для АД и БА хромосомные группы сцепления идентифицированы па хромосомах 5q31-33, 1 lql3 и 13q 12-14 [Folster-Holst R., 1998, Beyer К., 2000].

Астма и дерматит имеют общие иммунологические характеристики, включая повышенный IgE, увеличение уровня эозипофилов в периферической крови и в очагах поражения, Th-2 профиль цитокинов, а также сходные аллергенные триггеры [Ellison-Loschmann L. с соавт., 2009]. Известно, что оксид азота (NO) и его метаболиты являются наиболее важными участниками аллергического воспаления, что отражается па изменении концентрации этого соединения в сыворотке крови и в выдыхаемом воздухе у больных АД и БА [Guzik T.J., 2002, Козырицкая Д.В., 2007, Katial R., 2007]. NO участвует в процессах вазодилатации, адекватной воздухонаполняемости легких, влияет на пролиферацию кератиноцитов, фибробластов, эпителия бронхов, эндотелиоцигов, является нейромедиатором периферических нервов. При низких концентрациях NO оказывает антиапоптотическое, а при высоких -проапоптотаческое действие па эозинофилы, макрофаги, моноциты [Fabio L., 2004, Филиппова H.A., 2006].

Ферменты, синтезирующие N0, существуют в трех изоформах: нейрональпая NO-синтаза (nNOS), эндотелиальная (eNOS), индуцибельная (iNOS). Эндотелиальная и нейрональная изоформы являются конститутивными, а активность индуцибельпой изоформы связана с внутренними стимулами (цитокины) и внешними (липополисахариды, аллергены). Для всех трех изоформ доказано изменение экспрессии их генов у больных БА и АД [Holla L.I., 2006, Martines В., 2007, Batra J., 2007]. Установлено, что гены eNOS и nNOS являются кандидатными по формированию БА [Фрейдин М.Б., 2001]. При этом отсутствуют данные о роли полиморфизма генов NOS в формировании АД, а также их роли в развитии «атопического марша».

Исследование полиморфизма генов фермептов, синтезирующих NO, у детей, больных АД и/или БА, позволит верифицировать генотип, определяющий подверженность к развитию аллергических болезней и риск реализации «атопического марша» у больных АД.

Цель исследования

Установить риск формирования и клинико-функциональные характеристики атопического дерматита и бронхиапьпой астмы во взаимосвязи с полиморфизмом генов NO-синтаз для обоснования подходов к профилактике прогрессирования «атопического марша» у детей.

Задачи исследования

1. На основании одномоментного обсервационного исследования установить клинико-функциональные особенности атопического дерматита и бронхиальной астмы в группах детей, больных атоническим дерматитом, бронхиальной астмой и атопическим дерматитом в сочетании с бронхиальной астмой в процессе реализации «атопического марша».

2. Оценить риск формирования атопического дерматита и бронхиальной астмы в зависимости от генотипа полиморфных вариантов генов nNOS (1173 С/Т, 276 С/Т), iNOS (G954C, (CCTTT)n, (TAAA)n), eNOS (893 C/G, VNTR).

3. Представить клинико-функциональные и патогенетические характеристики атопического дерматита, бронхиальной астмы и атопического дерматита в сочетании с бронхиальной астмой при различном генотипе полиморфных вариантов генов nNOS (1173 С/Т, 276 С/Т), iNOS (G954C, (CCTTT)n, (TAAA)n), eNOS (893 C/G, VNTR).

4. Установить особенности генотипа, способствующие реализации «атопического марша», у больных атопическим дерматитом - носителей различных вариантов полиморфизма генов nNOS (1173 С/Т, 276 С/Т), iNOS (G954C, (CCTTT)n, (TAAA)n), eNOS (893 C/G, VNTR).

5. Оценить динамику клинических симптомов, функцию внешнего дыхания, суточную лабильность бронхов у больных среднетяжелой бронхиальной астмой на фоне базисной терапии ингаляционными кортикостсроидами в зависимости от полиморфизма генов nNOS (1173 С/Т, 276 С/Т), iNOS (G954C, (ССТТТ)а, (TAAA)n), eNOS (893 C/G, VNTR).

Научная новизна

Впервые проведено исследование клинико-функциональных особенностей АД и БА с учетом полиморфных вариантов генов NOS у детей,

больных АД, БА, и АД в сочетании с БА в процессе реализации «атопического марша».

Установлено, что полиморфизмы 276 С/Т и 1173 С/Т 29 экзона гена nNOS ассоциированы с риском развития АД, БА и АД в сочетании с БА.

Для пациентов, страдающих АД, БА и АД в сочетании с БА, впервые показана взаимосвязь болезни с патологическим аллелем Т полиморфизмов 276 СЯ и 1173 СЯ 29 экзона гена nNOS; обнаружен гаплотип ТТ 1173С/Т / СТ 276С/Т гена nNOS, который увеличивает риск болезни более, чем в 15 раз.

Представлены результаты, свидетельствующие о наличии ассоциации 14 тандемных повторов (ССТТТ) промоторной области гена iNOS с ранним развитием БА и высоким содержанием IgE крови у больных АД, БА, АД в сочетании с БА.

Впервые установлена ассоциация клинико-функциональных особенностей БА (тяжесть БА, снижение ПСВ и ОФВ1, наличие более 2 эпизодов бронхообструктивного синдрома (БОС) в анамнезе у больных АД) с аллелем а полиморфизма VNTR 4 интрона гена eNOS. Посредством связи патологического аллеля полиморфизма VNTR гена eNOS с формированием БА показано, что eNOS играет важную роль в реализации «атопического марша» у детей.

Приоритетными являются результаты, свидетельствующие, что достижение полного контроля над БА в процессе проведения патогенетической терапии с использованием ингаляционных глюкокортикостеровдов связано с «диким» аллелем G полиморфизма G954C промоторной области гена iNOS.

Практическая значимость

В результате проведенного исследования установлены отличительные особенности структуры тяжести АД, БА у больных АД, БА и АД в сочетании с БА при реализации «атопического марша».

Установлено, что полиморфизм генов NOS (1173 С/Т, 276 СЯ гена nNOS, (ССТТТ)п гена iNOS) увеличивает подвержепность детей к формированию АД, БА, АД в сочетании с БА, что позволяет выделить группу детей, наиболее предрасположенных к формированию этих болезней. Наличие генотипа аа полиморфизма VNTR гена eNOS, у больных АД, определяет показания к назначению профилактики с целью предотвращения реализации «атопического марша».

Показано, что у детей, получающих базисную противовоспалительную терапию по поводу БА, генотип GG или GC полиморфизма G954C гена iNOS улучшает прогноз эффективности лечения.

Положения, выносимые на защиту

1. «Атопический марш» у детей характеризуется формированием бронхиальной астмы на фоне трансформации атопического дерматита в средпетяжелые и легкие формы. Реализация «атопического марша» связана с полиморфизмом VNTR гена эндотелиальной NO-синтазы. Клинико-патогенетические особенности атопического дерматита и бронхиальной астмы ассоциированы с полиморфизмами 276 С/Т, 1173 СЯ гена нейрональной NOS, (ССТТТ)п гена индуцибельной NOS.

2. Эффективность базисной противовоспалительной терапии бронхиальной астмы и возможность достижения полного контроля связаны с «диким» аллелем полиморфизма С954С гена ¡N08.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на VII межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных-педиатров «Здоровье детей - наше будущее» (Томск, 2009), на областной пульмонологической конференции (Томск, 2009), совещаниях кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета СибГМУ (Томск, 2008, 2009), на конкурсе молодых ученых Х1П Конгресса педиатров России «Фармакология и диетология в педиатрии», Томск 27-29 сентября, 2009г.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ, в том числе 2 полнотекстовые журнальные статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Внедрение результатов исследований

Полученные результаты используются в работе отделения клинической иммунологии и аллергологии ОГУЗ «Областпая детская больница» г.Томска, областного "Астма-центра" ОГУЗ «Областная детская больница». Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета для студентов педиатрического, лечебного и медико-биологического факультетов.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных наблюдений, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 рисунками и 45 таблицами. Список источников цитируемой литературы включает в себя 161 работу, из которых 26 отечественных и 135 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на базе кафедры факультетской педиатрии (с курсом детских болезней лечебного факультета) Сибирского государственного медицинского университета (зав. каф. - члеп-корр. РАМН, д-р мед. наук, профессор Л.М. Огородова), отделения клинической аллергологии и иммунологии ОГУЗ «Областная детская больница», г. Томск (гл. врач -В.А. Сальников).

В исследование включен 401 пациент, страдающий АД, Б А или их сочетаниями в возрасте от 1 до 17 лет. Все дети наблюдались в период с 2006 года по 2009 год на базе ОГУЗ «Областная детская больница».

Для решения задач диссертации спланированы следующие исследования: «случай-контроль» (401 пациент - случай, и 120 детей - группа контроля) и клинико-фармакологическое исследование, в котором приняли участие 65 больных среднетяжелой бронхиальной астмой. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом 30.10.2007, № 669. Родители (опекуны) всех включенных детей подписали информировапное согласие на участие в

настоящем исследовании.

Критерии включения больных бронхиальной астмой в исследование «случай-контроль» (п=168):

□ Амбулаторные и стационарные пациенты

□ Возраст пациентов от 1 до 17 лет

□ ^Е в сыворотке крови > 100 МЕ/мл

□ Пациенты, имеющие подтверждёшшй диагаоз бропхиальпой астмы:

о легкая персистирующая: симптомы чаще 1 раза в неделю, но реже 1 раза в день, обострения, нарушающие активность и сон, ночные симптомы чаще 2 раз в месяц ОФВ1 или ПСВ не менее 80% ог должных значений, вариабельность пиковой скорости выдоха (ПСВ) или объем форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1) не более 30% о персистирующая средпетяжелая: симптомы ежедневно, обострения, нарушающие активность и сон, ночные симптомы более 1 раза в педелю, ежедневный прием ингаляционных ¡32-агонистов короткого действия, ОФВ1 или ПСВ 60-80% от должных значений, вариабельность ПСВ или ОФВ1 более 30%

о тяжелая персистирующая: симптомы ежедневно, частые обострения, частые ночные симптомы БА, ограничения физической активности, ОФВ1 или ПСВ не превышает 60% от должных зпачений, вариабельность ПСВ или ОФВ1 не менее 30%) (ОМА 2006)

Критерии включения больных атопическим дерматитом в исследование «случай-контроль» (п=118):

□ Амбулаторные и стационарные пациенты

□ Возраст пациентов от 1 до 17 лет

□ 1§Е в сыворотке крови >100 МЕ/мл

□ Пациенты, имеющие подтверждённый диагноз атопического дерматита: легкий АД — индекс БСОНАБ - 0-20 баллов; средней степени тяжести АД - индекс БСОЯАО - 21-40 баллов; тяжелый АД - индекс ЗОЖАО - 41 и более баллов) («Атопический дерматит и инфекции кожи у детей: диагностика, лечение и профилактика», Москва, 2004 г)

Критерии включения больных атопическим дерматитом и бронхиальной астмой в исследование «случай-контроль» (п=115):

□ Амбулаторные и стационарпые пациенты

□ Возраст пациентов от 1 до 17 лет

□ в сыворотке крови > 100 МЕ/мл

□ Пациенты, имеющие подтверждённый диагноз бронхиальной астмы (включение по тяжести см. выше)

□ Пациенты, имеющие подтверждённый диагноз атопического дерматита (включение по тяжести см. выше)

Критерии включения больных бронхиальной астмой в клинико-фармакологическое исследование (п=65):

□ Амбулаторные и стационарные пациенты

□ Возраст пациентов от 5 до 17 лет

□ ^Е в сыворотке крови >100 МЕ/мл

□ Пациенты, имеющие подтверждённый диагноз бронхиальной астмы средней степени тяжести (GINA 2006), имеющие на момент включения в исследование один и более следующих признаков: симптомы ежедпевно, обострения, парушающие активность и сон, ночные симптомы более 1 раза в неделю, ежедневпый прием ингаляционных р2-агонистов короткого действия, ОФВ1 или ПСВ 60-80% от должных зпачепий, вариабельность ПСВ или ОФВ1 более 30%. (GINA 2006)

□ Больные БА, не получающие базисной противовоспалительной терапии адекватной степени тяжести болезни в течение последних 4-х последовательных недель до включения в исследование

□ Пациенты, умеющие правильно пользоваться ингалятором, пикфлоуметром, способные адекватно оцепивать своё состояние, а также своевременно и верно заполнять дневники самоконтроля (ПСВ - утро, вечер; оценка дневных и ночных симптомов)

□ Отсутствие острых респираторных заболеваний в течение 4-х недель до включения в исследование

Критерии включения в контрольную группу (п=120):

□ Возраст от 5 до 17 лет

□ Отсутствие аллергических болезней на момент включения и в анамнезе

□ Отсутствие острых респираторных заболеваний в течение 4-х недель до включения в исследование

□ отрицательные результаты кожных аллергопроб;

□ IgE в сыворотке крови < 100 МЕ/мл;

Клинико-анамнестический метод

При включении в исследование у всех детей был детально изучен апамнез заболевания, проведено обследование соответственно медицинским стандартам как относительно БА, АД, так и в отношении сопутствующей патологии. На протяжении всего периода исследования у больных, включенных в клинико-фармакологическое исследование, осуществлялся мониторинг количества и тяжести симптомов БА посредством заполпения дневников самоведения.

Исследование функции легких

Оценка функции впешнего дыхания проведена у всех пациентов старше 5 лет, включённых в исследование, на оборудовании MasterScope фирмы Erich Jaeger GMBH (условия проведения теста ATS Standardization of Spirometry, 1995). Пиковая скорость выдоха измерялась пикфлоуметрами Mini-Wright в утренние и вечерние часы до приёма любых лекарственных препаратов.

Определение общего IgE в сыворотке крови

Определение общего IgE в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью стандартного набора реагентов «Вектор БЕСТ IgE - ИФА - БЕСТ - стрип» согласно приложенной инструкции.

Для проведения кожных аллергопроб (КАП) использовали стандартные наборы аллергенов в прик-тестах (бытовые, эпидермальпые, пыльцевые) производственного объединения "Биомед" им. И.И.Мечникова и "Immunoteach", Испания.

Выделение геномной ДНК

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводили методом фенол-хлороформной экстракции.

Амплификация ДНК в ПЦР

Реакцию амплификации проводили в микроцентрифужных пробирках типа «Eppendorf» объемом 0,5 мл на автоматическом амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Москва) в составе реакционной смеси, пар специфических праймеров и исследуемой геномной ДНК; (ДНК - Технология, г. Москва). Рестрикцию проводили с помощью специфических рестриктаз («Сибэнзим», г. Новосибирск), детекцию - в 2% агарозном геле. Электрофорез выполняли при напряжении 20 В/см в течение 25 мин. Результаты электрофореза визуализировали с помощью трапсиллюминатора.

Статистическая обработка результатов

Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет программ "Statistica for Windows 6.0". Данные представлены в виде Х±х, где X - среднее арифметическое, х - ошибка среднего. Для оценки различия средних в попарно не связанных выборках применяли U-критсрий Манна-Уитни, в связанных - критерий Вилкоксона. Степень взаимосвязи между призпаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Разницу значений считали значимой при р<0,05. Для сравнения частот качественных признаков использовали критерий Данные

группировались в соответствии с задачами исследования. Для оценки вероятности развития события использован метод отношения шансов и относительного риска посредством программного продукта «Statcalc".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На момент включения в исследование средний возраст больных АД составил 4,82±0,45 лет, у больных БА - 10,0±0,32 лет, у больных АД в сочетапии с БА 9,7±0,3 лет. В группах пациентов с БА и АД в сочетании с БА преобладали мальчики (р<0,05). Среди больных АД пациентов с тяжелым течением болезни было значительно больше, чем среди больных АД в сочетании с БА, где преобладал легкий АД (р<0,05). В группе больных АД в сочетании с БА пациентов с тяжелым или среднстяжелым течением БА было достоверно больше, чем больных с тяжелым или среднетяжелым АД (р=0,01). Среди больных АД преобладали дети в возрасте от 1,5 до 3 лет, больных эритематозно-сквамозпой формой болезни; в группе АД в сочетании с БА значимо больше оказалось пациентов от 7 до 12 лет, страдающих лихеноидной формой АД. Более тяжелое течение АД отмечено у пациентов в возрасте до 2 лет (SCORAD=30,39±4,02 балла), менее - у детей с детской и подростковой формами (SCORAD=22,4±4,3 балла). Между возрастом пациентов и индексом SCORAD установлена отрицательная корреляция (г=-0,58; р=0,04). Полученные результаты согласуются с современными представлениями об атопии, как о системном заболевании, в рамках которого вновь появившиеся симптомы

являются доминирующими по тяжести и в жалобах больных, а ранее имеющиеся идут на убыль [Spergel J.M., Palier A.S., 2003].

Манифестация болезпи у большинства больных АД (82%) произошла в возрасте до 1 года. У пациептов, страдающих БА, возраст появления первых симптомов составил 5,3±0,47 лет. Больные, у которых БА сформировалась на фоне АД, возраст пачала клинических проявлений БА составил 4,16±0,32 лет.

Уровень IgE крови составил в среднем 368,23±53,48 ME/мл и значимо не различался в исследуемых группах. По результатам кожных аллергопроб, которые проведены у 79,8% пациентов (п=320), поливалентная сенсибилизация обнаружена у 56,87% (п=182) больных. В структуре сенсибилизации больных БА преобладали бытовые аллергены (п=64, 38%), при легкой БА - пыльцевые (п=74; 83,14%). У большинства больпых АД (84,7%) имела место сенсибилизация пищевыми аллергенами.

Наследствешхый атопический анамнез зарегистрирован у 62% пациентов (№=251).

Согласно анамнезу, среди всех больных АД (включая больных АД в сочетании с БА) 37,3% получали неадекватное лечение (длительное применение антигистаминных препаратов 1-го поколения, эпизодическое использование ТГКС, увлажняющих средств), у этих детей были признаки обострения дерматита при включении в исследование. Регулярную базисную терапию получали 44,6% (п=104), которая включала прием цетиризина, местное применение увлажняющих средств, топических кортикостероидов (элоком, адвантан) (п=74) или ингибитора кальционеврина - пимекролимуса (п=30). У этих пациентов в 82,6% случаев (п=86) зафиксирована ремиссия, все эти пациенты страдали легким и среднетяжелым АД.

Среди больных БА (включая больпых АД в сочетании с БА) регулярное, адекватное степени тяжести лечение получали 67,1% (п=192) пациентов, которые имели ремиссию при включении в исследование. У других пациентов, включенных в исследование, отсутствовала адекватная базисная

противовоспалительная терапия, у них зарегистрированы симптомы БА (кашель, одышка, удушье) и нарушение ФВД (снижение ПСВ, ОФВ1).

Исследовшше полиморфизма генов NO-синтаз у больных АД, БА, АД в сочетании с БА позволило установить ассоциацию болезни и ее клинико-патогенетических проявлений со всеми изоформами генов NOS (табл. 1).

Как представлено в табл. 1, формирование АД ассоциировано с мононуклеотидными заменами 1173 С/Т и 276С/Т гена nNOS. Что касается астмы, то для ее клинико-фупкциональных проявлений также обнаружена достоверная взаимосвязь с патологическим аллелем полиморфизма 1173 С/Т и 276С/Т гена nNOS, G954C гена iNOS и VNTR гена eNOS. Высокий уровень IgE крови связан с полиморфными вариантами гена iNOS; тяжесть болезни, степень нарушения ФВД - с эпдотелиалыюй изоформой NOS.

Наименьшее количество больпых АД имело гомозиготу TT в положении 1173 гена nNOS, однако достоверно больше, чем в группе контроля, что нашло отражение при расчете относительного риска: достоверно выше вероятность формирования АД у пациентов-гомозигот TT (RR=1,4; CI95% - 1,05-1,87;

р=0,027) Наименее вероятен АД у пациентов, гомозиготных по аллелю С (Ы1=0,42; С195% - 0,23-0,75; р=0,004). Риск формирования АД увеличен более, чем в 12 раз при наличии гомозиготы ТТ полиморфизма 276 С/Т гена пЖ)8 (Ш1=12,7; С195% - 1,7-95,34; р=0,002), и в 6 раз - у гетерозигот (Ш1=6,45; С195% - 2,8-16,74; р<0,001). Исследование гаплотипов аллельных вариантов гена пЫОЗ показало, что значимо больший риск формирования АД отмечен у болышх, имеющих сочетание СТ 276 С/Т / ТТ 1173 С/Т гена пЖ)8 (Ш1= 11,00; С195%- 1,45- 83,34; р<0,001).

Таблица 1

Ассоциация клинико-лабораторных характеристик АД и БА с полиморфными __вариантами генов NOS_

Болезнь

АД БА АДиБА

Риск развития болезни 1173С/Т nNOS 276СЛГ nNOS 1173С/Т nNOS 276С/Т nNOS G954C iNOS VNTR eNOS 276C/T nNOS G954C iNOS VNTReNOS

Тяжесть болезни 1173 С Я nNOS VNTReNOS VNTReNOS

Сенсибилизация - G954C iNOS (TAAA)n iNOS VNTReNOS 276C/T nNOS

Возраст начала болезни - (CCTTT)n iNOS -

№ (CCTTT)n iNOS (CCTTT)n iNOS (CCTTT)n iNOS

ФВД (ПСВ, ОФВ1) - VNTReNOS VNTReNOS

Эозинофшшя крови - - -

ЗССЖАО 1173 С Я nNOS - -

БОС VNTReNOS - -

Примечание: указаны полиморфизмы для тех признаков, для которых установлены достоверные результаты (р<0,05).

Среди больных АД риск формирования болезни является равным при разных аллельных вариантах полиморфизма гена iNOS (таядемяые повторы (ССТТТ)п, (ТААА)п и промоторный SNP G954C), гена eNOS (VNTR, 893 C/G).

Значение индекса SCORAD значимо различалось (р=0,03) у больных с разными вариантами полиморфизма 1173 С/Т и оказалось наибольшим у пациентов-гомозигот ТТ (36,44±4,21 балла) по сравнению с носителями варианта СС (22,13±2,91 баллов).

Вклад нейрональной изоформы NOS у больных АД, вероятно, обусловлен нарушением экспрессии гена в кератиноцитах и образованием N0 в количествах, меньших, чем физиологические, что приводит к дисбалансу пролиферация / дифференцировка и влечет за собой нарушение барьерной

функции кожи, способствуя эпикутанной сенсибилизации [Cals-Grierson М., Onnerod A.D., 2004].

Высокое содержание IgE в сыворотке крови среди больпых дерматитом ассоциировано с 14 повторами (ССТТТ) промотора гена iNOS (р=0,03).

Количество эпизодов бронхообструкции у больных АД за последний год наибольшим было у пациентов-гомозигот по мутантному аллелю а полиморфизма VNTR, несколько ниже - у гетерозигот, и наименьшим - у гомозигот по аллелю Ь. Полученные данные имеют достоверные различия (р<0,05). Вероятность формирования бронхообструктивного синдрома выше в 13 раз у больных-гомозигот по аллелю а по сравнению с другим гепотипом, и достоверно ниже - у гомозигот по аллелю b (табл.2).

Таблица 2

Частота бронхообструктивного синдрома за последний год у больных

Генотип п Количество БОС Р БОС «+» БОС «-» OR С195% Р

ВЪ 98 0,19±0,04 0,0045 (ab) 18 80 0,16 0,05-0,52 0,0043

Ab 14 0,64±0,19 0,015 (аа) 7 7 3,68 1,02-13,3 0,031

Аа 5 1,7±0,4 <0,001 (ЬЪ) 4 1 13,92 1,36-342,69 0,046

Примечание: ЪЬ - гомозигота по аллелю Ъ, Ьа - гстерозигота по аллелю Ь, аа - гомозигота по аллелю а, БОС«+» - количество больных с БОС за последний год, БОС«-» - количество больных без БОС за последний год, р - достигнутый уровень значимости.

Риск формирования БА достоверно выше у пациентов-гомозигот ТТ полиморфизма 1173 С/Т гена пШ8 (И1=12,42; С195% - 4,0-38,4; р=0,002). Гомозигота по «дикому» аллелю С более характерна для группы контроля, и значительно уменьшает вероятность формирования болезни (1111=0,24; С195% -0,12-0,31; р<0,001). В целом, носительство аллеля Т ассоциировано с увеличением риска развития астмы (Ш1=5,88; С195% - 3,67-9,42; р=0,003), что свидетельствует о вероятном влиянии гена пМЭБ на развитие болезни. Формированию БА наименее подвержены носители гомозиготы СС полиморфизма 276 С/Т (Ш=0,18; С195% - 0,18-0,46; р<0,001). Гетерозигота СТ описываемого полиморфизма встречается значительно чаще, чем другие генотипы у больпых БА, и увеличивает риск возникновения болезни более, чем в 9 раз (1111=9,4; С195% - 3,93-22,45; р<0,001). Гаплотип ТТ 1173 С/Т / СТ 276 С/Т гена пИОБ увеличивает вероятность формирования БА более, чем в 30 раз (Ш1=32,23; С195%- 4,54-229,67; р<0,001).

Известно, что у больных БА экспрессия пМЭБ снижается, вследствие чего уменьшается синтез N0 в КАИН рецепторах, которые осуществляют бропходилатацию [ШсйапМо Р. Ь., 81егс Р., 2004].

Исследование полиморфизма гена ¿N08 показало, что для больпых БА риск формирования болезни является равным при разных аллельных вариантах тапдемных повторов (ССТТТ)п, (ТААА)п. Носительство аллеля С

промоторного полиморфизма G954C гена iNOS значительно чаще зарегистрировано у больных БА и значимо увеличивает вероятность формирования болезни (RR=1,67; С195% - 1,08-2,59; р=0,024).

Среди пациентов, страдающих БА, не обнаружено ассоциации болезни с полиморфизмом 893 C/G eNOS. Что касается VNTR, то генотипы аа и ab встречались чаще при БА по сравнению с контролем и увеличивали подвержепность к болезни (RR=2,89; С195% - 1,22-7,08; р=0,01; RR=4,11; С195% - 1,43-11,57; р=0,007). Выявлепо, что гомозигота аа связана с тяжестью болезни: риск формирования тяжелой астмы в 11 раз выше, чем при других генотипах (OR=l 1,27; С195% - 2,48-51,74; р=0,0004).

Установлено, что возраст первых клинических проявлений астмы зависит от количества повторов пентануклеотида (ССТТТ)п. Наиболее раннее начало болезни (до 2 лет, р=0,02) характерно для пациентов, имеющих гомозиготу по 14 повторам ССТТТ, значительно позже (после 5 лет, р=0,04) дебют БА отмечен у пациентов, у которых число повторов было не 14 по обеим аллелям. Установление генотипа, характерного для больных с манифестацией БА до 5 лет, может способствовать ранней постановке диагноза БА и своевременному назначению базисной противовоспалительной терапии, так как известно, что у детей до 5 лет диагностическое исследование функции внешнего дыхания затруднено [Wilson N.M., 1998].

Для больных БА обнаружено, что подверженность к формированию сенсибилизации к эпидермальным аллергенам заметно выше у носителей генотипа TT полиморфизма 1173 С/Т nNOS (для больных БА - OR=5,47; С195% - 1,21-28,01; р=0,031; для больных БА в сочетании с АД - OR=2,15; CI 95% -1,34-3,47; р=0,003).

Высокое содержание IgE в сыворотке крови у больных БА, также как и у больных АД, ассоциировано с 14 повторами (ССТТТ) промотора гена iNOS

(Р=0,02).

Как показано в табл. 3, наименьшие значения показателей ПСВ и ОФВ1 у больных БА установлены у носителей генотипа аа. Для пациентов, страдающих легкой астмой, наиболее низкие значения ПСВ также отмечены у пациентов-гомозигот по аллелю а (83,56±1,12%; р=0,008).

Таблица 3

Показатели функции впешнего дыхания у больных с различным

генотипом полиморфизма УШИ гена еЖ)3 _

Генотип п ПСВ,% Р ОФВ1,% Р

ВЬ 106 92,85±12,18 0,3 {ab) 92,22+1,17 0,17 (ab)

АЪ 29 90,84±12,8б 0,003 (аа) 87,38±2,23 0,34 (аа)

Аа 13 78,98±8,53 0,001 (bb) 79,73+3,61 0,04 (bb)

Примечание: bb — гомозигота по аллелю Ь, Ъа — гетерозигота, аа - гомозигота по аллелю а, р - достигнутый уровень значимости.

У больных БА в сочетании с АД, также как у пациентов, страдающих АД или БА, уровень гетерозиготности полиморфизма 276 С/Т достоверно выше по сравнению с группой контроля, что увеличивает вероятность формирования болезни более, чем в 4 раза (Ш1=4,17; С195% - 1,63-10,63; р=0,004). Распределение генотипа полиморфизма 1173 С/Т гена пКЮБ пе различались в группе больных БА в сочетании с АД и контрольной. Однако, установлен гаплотип СТ 276 С/Т / СТ 1173 С/Т гена пШБ, который зпачительно увеличивает вероятность болезни (И1=4,45; С195% - 1,31 -15,11; р=0,015).

Таким образом, носительство аллеля Т исследуемых БОТ пТЧОБ является фактором риска реализации «атопического марша» у больных АД.

Для больных, имеющих сочетание БА с АД, носительство гетерозиготы и гомозиготы по аллелю а \TviTR гена еИОБ является более характерным, как и для больных, страдающих БА, но не АД. Расчет показателя относительного риска свидетельствует, что вероятность формирования БА и АД почти в 3 раза выше при гетерозиготе (М1=2,95; С195% - 1,39-6,28; р=0,004), а при гомозиготе по аллелю а - более, чем в 6 раз (1111=6,2; С195% - 1,43-26,89; р=0,01), по сравнению с другим генотипом. Получепный результат указывает па то, что в формировании БА участвуют дополнительные механизмы, связанные с функциональными нарушениями эндотелия. Это подтверждается исследованиями, в которых установлено, что у больных БА имеет место дисфункция эндотелия, вследствие чего развивается легочная гипертензия, степень которой коррелирует с тяжестью БА [Иванов С.Н., Старовойтова Е.А., 2005]. Учитывая, что аллель а полиморфизма \T4TR связан с развитием БОС у больных АД, формированием БА, его носительство также может быть фактором риска реализации «атопического марша» у больных АД.

Проведено изучение сочетания различных вариантов полиморфизма нейрональпой, индуцибельной и эндотелиальной N08 у больных БА и АД и в группе контроля. Достоверные различия установлены для полиморфизма 1173 С/Т гена пЮЙ и полиморфизма УШИ гена еЖ)8. Наиболее неблагоприятным является сочетапие ТТ 1173 С/Т гена пШв / аа УШИ гена еШБ, увеличивающее вероятность развития болезни в 6 раз (С1 95% - 1,36-26,53; р=0,014).

Риск формирования АД в сочетании с БА не зависит от количества тандемных повторов (ССТТТ)п, (ТААА)п гена ¡N08. Пациенты-гстсрозиготы и гомозиготы по аллелю С полиморфизма в954С гепа ¡N08 достоверно чаще встречались в группе больных БА в сочетании с АД по сравпепию с контрольной, что достоверно увеличивает риск формирования болезни: при наличии гетерозиготы - в 1,54 раза (С1 95% - 1,11-2,15; р=0,04), а при наличии гомозиготы по аллелю С - в 6,94 раза (С195% - 1,59-30,2; р=0,006).

Больные БА в сочетании с АД, как и пациенты, страдающие только БА, носители гомозиготы Т полиморфизма 1173 С/Т пЖ)8, более подвержены сенсибилизации эпидермальными аллергенами (011=2,15; С1 95% - 1,34-3,47; р=0,003).

Высокое содержание ^Е в сыворотке крови в группе больных АД в сочетании с БА ассоциировано с 14 повторами (ССТТТ) промотора гена ¿N08 (р=0,02). Аналогичный результат получен и для пациентов, страдающих БА или АД. Подобный результат получен Коппо Э., Нкауа N. (2001).

Распределение генотипов полиморфизма 893 СЮ £N05 у пациентов с АД и БА, также как у больных с АД или БА, не имело значительных отличий от группы контроля.

Риск развития БА и АД не зависит от вариантов полиморфизма 893 СЮ гена cNOS.

В клинико-фармакологическое исследование включено 65 больных, страдающих среднетяжелой БА (средний возраст 10,36±4,16 лет, 36 мальчиков (56%) и 29 девочек (44%).

При включении пациептов в исследование частота дневных симптомов, использования короткодействующих р2-агопистов были почти ежедневными, а частота ночных симптомов за последние 7 дней составила 1,7±0,26 (табл. 4), концентрация ^Е в сыворотке крови - 387±97,91 МЕ/мл. Показатели функции внешнего дыхания (ОФВ1) были нарушенными у 20% больных и составили 72,8±2,08%. Мониторирование пикфлоуметрии показало, что ПСВ превышал 60% от должпого значения (в пределах «желтой зоны»). Суточная лабильность бронхов в среднем составила 23,29±0,71% за последние 7 дней до начала базисной терапии.

Таблица 4

Динамика клинико-функциональных показателей на фоне лечения

Показатели До лечения На фоне лечения

Через 12 недель Через 24 недели

Количество дневных симптомов / нед. 5,85±0,55 1,00±0,95* 0,76±0,42*

Количество ночных симптомов / нед. 1,7±0,26 0,2±0,43 0,12±0,08*

Количество используемых Рг-агонистов короткого действия ) нед. 6,4±0,28 0,72±0,67 0,22±0,16*

ОФВ1,% 89,33±3,07 95,4±4,21 100,08±2,67*

ПСВ,% 90,94.12,99 93,54^2,17 104,1б±2,73*

СЛБ,% 24,45±0,89 17,2±0,82 12,34±1,01*

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с показателями до лечения

Основными триггерами астмы были физическая нагрузка, острые респираторные заболевания, бытовые и эпидермальные аллергены. До включения в исследование ни один из пациентов не получал адекватной базисной терапии ИГКС.

Все пациенты (п=65), включенные в клипико-фармакологическое исследование, получали в течение 24 недель базисную противовоспалительную терапию ингаляционным кортикостероидом бекламетазона дипропионатом (Беклазон Эко Легкое Дыхание, П № 014096/01-2002) 200мкг 2 раза в депь и короткодействующий р2-агонист сальбутамол (Саламол Эко Легкое Дыхание, № П014097 /01-2002) 100-200 мкг по требовапию. В рамках дагаюй работы адекватная степени тяжести противовоспалительная терапия НГКС была назначена также с целью оцепки вклада полиморфизма генов NOS в достижение контроля над болезнью.

На фоне базисной противовоспалительной терапии отмечена положительная динамика клинико-функциональных параметров болезни у детей, включенных в исследование. Полного контроля над болезнью через 24 педели от момента начала базисной терапии достигли 58% больных (n=38), у которых на фопе лечения отсутствовали симптомы БА и потребность в использовании (32-агонистов короткого действия. Хороший контроль над симптомами зарегистрирован у 32,3% (п=21) больных, у которых отсутствовали ночные симптомы, но сохранялись симптомы астмы в течение недели (до 3 раз), отмечались ограничения в физической нагрузке (у 2 больных). Показатели функции внешнего дыхания нормализовались у 95,3% (п=62) больных. Контроль над БА пе достигнут у 6 пациентов.

Стратификация больпых проведена таким образом, чтобы ответить па вопрос: связана ли вероятность достижения полного контроля над болезнью с каким-либо из исследуемых полиморфизмов NOS?

Для конститутивных изоформ NO-синтаз подобной ассоциации пе выявлено: распределение генотипов не различалось у больных, достигших полного или частичпого контроля над болезпью.

Что касается индуцибельной NOS, то для тандемных повторов (ССТТТ)п и (ТААА)п также не обнаружено достоверной взаимосвязи. Распределение генотипа полиморфизма G954C гена iNOS значимо различалось у больных с разным контролем пад БА. Вероятность достижения полного контроля значимо выше у гомозигот по «дикому» аллелю G (OR=4,03; CI95% - 1,1412,78; р=0,003). Наличие «мутантного» аллеля С более, чем в 4 раза увеличивает вероятность неконтролируемой БА (OR=4,13; С195% - 1,05-1,44; р=0,03).

До назпачегаш лечения количество дневных симптомов в неделю достоверно пе различалось у больных с разными генотипами полиморфизма G954C (табл.5), однако через 24 недели у носителей генотипа GG дневных симптомов было существенно меньше по сравнению с больными-носителями генотипа СС.

У всех больных, пезависимо от генотипа исследуемого полиморфизма, через 24 недели лечепия ИКС произошло значимое уменьшение СЛБ (р<0,05), инициальные показатели которого также не зависели от полиморфизма G954C гена iNOS. Через 24 недели базисной противовоспалительной терапии у больных-гомозигот по аллелю G суточные колебания ПСВ были достоверно пиже по сравнению с пациентами-носителями аллеля С (р<0,05).

Таблица 5

Количество дневных симптомов БА в зависимости от генотипа полиморфизма в954С _гена ¿N05 до лечения и после_

Генотип Кол-во симптомов до лечения Кол-во симптомов через 24 нед. лечения

Кол-во ± Р Кол-во ± Р

GG 5,78 0,38 (CG) 0,59 0,14* 0,09 (СС) 0,01

CG 6,12 0,39 (СС) 0,67 0,66* 0,50 (СС) 0,32

СС 5,66 0,88 (GG) 0,84 1,50* 0,66 (GC) 0,34

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с количеством симптомов до лечения.

Таким образом, в проведенном исследовании установлено, что «атопический марш» у детей характеризуется формированием БА на фоне легких и среднетяжелых форм АД. Повышенный риск формирования аллергических болезней связан с полиморфными вариантами генов nNOS и iNOS, что указывает на вклад этих генов в развитие болезни. Однако для реализации «атопического марша» необходимо вовлечение эндотелиалыюй NOS, и, как установлено в нашем исследовании, риск формирования БА значительно повышен у больных-носителей аллеля а полиморфизма VNTR гена eNOS.

Проведение базисной терапии ИКС у больных БА позволяет достичь контроля над болезпью. Эффективность лечения и вероятность достижения полного контроля больше у больных-носителей аллеля G в положении 954 промоторной области гена iNOS (для среднетяжелой БА у детей).

ВЫВОДЫ:

1. Реализация «атопического марша» у детей, больных атопическим дерматитом, сопровождается развитием бронхиальной астмы с уменьшением тяжести клинических проявлений атопического дерматита: частота тяжелой формы атопического дерматита снижается в три раза (в сравнении с детьми, у которых не произошла реализация «атопического марша» в бронхиальную астму), при этом количество пациентов, страдающих тяжелой или среднетяжелой формой бронхиальной астмы, значительно преобладает над количеством пациентов, страдающих тяжелой или среднетяжелой формой атопического дерматита.

2. Подверженность к развитию бронхиальной астмы, атопического дерматита повышена у детей-носителей патологических аллелей полиморфизма 1173С/Т гена нейрональной NO-синтазы, 276С/Т гена нейрональной N0-синтазы.

3. Тяжелое течение бронхиальной астмы, снижение показателей пиковой скорости выдоха, объема форсированного выдоха у больных бронхиальной астмой ассоциированы с аллелем а полиморфизма VNTR гена эндотелиальной NO-синтазы.

4. Предикторами развития бронхиальной астмы у больных атопическим дерматитом является рецидивирующий бронхообструктивный синдром и носительство аллеля а полиморфизма VNTR гена эндотелиальной NO-синтазы.

5. Высокое содержание IgE крови у больных бронхиальной астмой, атопическим дерматитом, а также формирование бронхиальной астмы до 5 лет ассоциировано с 14 повторами (ССТТТ) гена индуцибелыюй NO-синтазы.

6. Достижепие полного контроля пад бронхиальной астмой на фоне проведения базисной противовоспалительной терапии ипгаляциоппыми глкжокортикостероидами связано с носительством аллеля G полиморфизма G954C гена индуцибелыюй NO-синтазы (для срсднетяжслой бронхиальной астмы у детей).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для определепия подверженности к формированию атопического дерматита и бронхиальной астмы у детей, находящихся в группе риска по формированию аллергических болезней (отягощенпый семейный анамнез по аллергическим болезням), а также с целью прогнозирования развития бронхиальной астмы у детей, страдающих атопическим дерматитом, рекомендовано изучепие полиморфных вариантов 1173 С/Т, 276 С/Т гена нейрональпой NO-синтазы, (ССТТТ)п гена индуцибельной NO-синтазы, VNTR гена эндотелиальной NO-синтазы, наличие неблагоприятного генотипа которых определяет показания к назначению цетиризипа с целью профилактики реализации «атопического марша» у детей.

2. Для диагностики причин неконтролируемого течения бронхиальной астмы на фоне базисной противовоспалительной терапии ингаляционными глкжокортикостероидами рекомендовано изучение полиморфизма G954C гена индуцибелыюй NO-синтазы.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Смирнова, И.Ю. Ассоциация полиморфизма VNTR гена эндотелиальной NO-синтазы с клинико-функциональными проявлениями бронхиальной астмы [Текст] / И.Ю. Смирнова, И.В. Петрова, И.А. Деев, Е.В. Деева // Здоровье детей - наше будущее!: материалы VII межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров (Томск, 26-27 марта 2009). - Томск: Изд-во СибГМУ, 2009. - С. 98 - 100.

2. Смирнова, И,Ю. Изменение состава поверхностной гидролипидной плепки при атопическом дерматите у детей па фоне разных фармакотерапевтических режимов [Текст] / И.Ю. Смирнова, Е.В. Деева, К.В. Якушева // Здоровье детей - наше будущее! Материалы VII межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров (Томск, 26-27 марта 2009). - Томск: Изд-во СибГМУ, 2009. - С. 139 - 142.

3. Смирнова, И.Ю. Роль полиморфизма гена нейрональной NO-синтазы в формировании атопического дерматита у детей и чувствительности к терапии [Текст] / И.Ю. Смирнова // Педиатрическая фармакология - 2009. -Т. 6, №2.-С. 17-19

4. Смирнова, И.Ю. Роль оксида азота в развитии заболеваний кожи [Текст] / И.Ю. Смирнова, JIM. Огородова, И.А. Деев // Вопросы современной педиатрии. - 2009. - Том 8, №4. - С. 90 - 94

5. Смирнова, И.Ю. Роль полиморфизма генов NO-синтаз в формировании атопического марша у детей [Электронный ресурс] / И.Ю. Смирнова, И. В. Петрова, В.А. Стояк, Е.В. Деева, И.А. Деев // Сборник материалов ХШ Конгресса педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии». - Электрон, дан. - Томск, 2009. - 1 CD-ROM.

6. Смирнова, И.Ю. Выбор противовоспалительной терапии при легком и среднетяжелом атоническом дерматите у детей [Электронный ресурс] / Смирнова И.Ю., Деева Е. В., Деев И.А., Якушева К.В. // Сборник материалов XIII Конгресса педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии». - Электрон, дан. - Томск, 2009. - 1 CD-ROM.

7. Смирнова, И.Ю. Возможности достижения контроля бронхиальной астмы у детей в зависимости от полиморфизма гена индуцибельной NO-синтазы [Электронный ресурс] / Смирнова И.Ю., Петрова И.В., Стояк В.А. // Сборник материалов ХП1 Копгресса педиатров России «Фармакотерапия и диетология в педиатрии». - Электрон, дан. — Томск, 2009. - 1 CD-ROM.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - атопический дерматит

АР - аллергический ринит

Б А - бронхиальная астма

БОС - бронхообструктивный синдром

ИГКС - ингаляционные глюкокортикостеровды

ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 секунду

ПСВ - пиковая скорость выдоха

ПЦР - полимеразная цепная реакция

С JIB - суточная лабильность бронхов

С195% - 95% доверительный интервал

eNOS - эндотелиальная NO-синтаза

iNOS - индуцибельпая NO-синтаза

IgE - иммуноглобулин Е

NO - оксид азота

nNOS - нейрональная NO-синтаза

OR - отношение шансов

RR - относительный риск

SNP - single nucleotide polymorphism - однонуклеотидный полиморфизм VNTR - variable number of tandem reapeat

Подписано в печать: 16.10.2009 г. Бумага: офсетная Тираж: 100 экз. Заказ: № 545

Печать: трафаретная Формат: 60x84/16

Издательство ООО «Дельтаплан» 624041, г. Томск, ул. Тверская, 81. Тел. (3822) 435-400,435-600