Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клинико-патогенетическое значение перемещения ионов кальция в лимфоцитах периферической крови у детей, больных бронхиальной астмой

2 7 Ш! —-

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

„МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ HHCTHTyf РГ6 ОД ПЕДИАТРИИ И ДЕТСКОЙ ХИРУРГИИ

На правах рукописи

ЧЕРНОВА Ольга Ивановна

УДК 616.248-053.2-071-092 : 616.155.32

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

ПЕРЕМЕЩЕНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14.00.09. Педиатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

.-. Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор С. Ю. Каганов; доктор медицинских наук, профессор О. Б. Святкина.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Г. М. Чистяков; доктор медицинских наук, профессор И. И. Балаболкин.

Ведущее учреждение — Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова.

Защита состоится « . » . О^^1 Г^Т*^, . . 1993 г. в « ¡3 . » час. на заседании специализированного ученого совета Д-084.15.01 при Московском научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ по адресу: Москва, 127412, Талдомская ул., д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « . » . Ч^^ ^ ^ . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета,

кандидат медицинских наук 3. К. Землянская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема бронхиальной астмы в тском возрасте чрезвычайна актуальна Это связано с ростом спространенности заболевания среди детей, увеличением'числа льных с тяжелыми формами болезни, учащением летальных исхо-в при ней. Все это побуждает к дальнейшему изучению различие аспектов клиники и патогенеза заболевания, к поиску новых тодов его лечения (Балаболкин И. И. , 1985; Мартыненко Г. А., 89; Jan M. А. и соавт. , 1990; Каганов С. Ю. и соавт., 1992).

Исследования последних лет направлены, в частности, на учение процессов транспорта ионов кальция через мембраны

г,2*

еток, его внутриклеточное распределение, высвобождения Са из

по, поскольку участию кальция отводят одно из вадных мест S

ализации аллергических реакций, в том числе, при бронхиаль-

й астме (Coburn R. , 1987; Арсентьев Ф. R и соавт., 1989; Ор-

в С. Е и соавт., 1991). Было отмечено, что при бронхиальной

тме имеет место повышение в клетках периферической крови

2+

нцентрации ионизированного Са в ответ на специфические и специфические стимулы ( Детипева И. С., 1989; Чучалин А. Г. и авт., 1991).

Известно, что использование при терапии больных бронхи-ьной астмой лекарственных средств, в частности, бета-2-адре-стимуляторов, существенно влияет на уровень кальция в клет-х (Khalifa A. et al., 1984). Установлено, что антагонисти-:ким свойством по . отношению к фармакологическим эффектам льция обладают интап (Coodman F., 1981), кетотифен raps. L-, 1982; Martin U. et. al., 1981) и геофшшт

(Mittzne^g A. et al. , 1974). Известно также, что транспорти ровка Ca в цитоплазму клетки может Сыть блокирована антаго нистами кальция - препаратами, избирательно влияющими на пере мещение этого катиона (Tan 1гаку V. et al,,1983; Jensen С et.al. , 1983; Elquindi A. et al., 1985).

В последние годы обоснованный интерес клиницистов выэыва ют препараты фосфонового ряда. Показано, что некоторые из них в частности ксидифон, обладают мембранотропным действие

ч

(Вельтищэв Ю.Е., Святкина О.Е, 1983). Возможно, что одной и сторон действия этих препаратов является изменение транспорт 'в клетки.Эта гипотеза требует практических подтверждений.

cir

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настояний работы является выявле ниэ клинико-патогенетической роли перемещения ионов кальция лимфоцитах периферической крови у детей, больных бронхиальнс астмой и обоснование применения препаратов, ингибирующих этс процесс.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ 1. Оценить у детей, больных атопическс бронхиальной астмой, уровень перемирия ионов кальция в ли* фоцитах периферической крови под воздействием специфически (аллерген) и неспэцифической (конканайалин А) стимуляции.

2. Определить показатели перемещения ионов кальция в ли» фоцитах периферической крови в зависимости от периода и тs жести бронхиальной астмы у детей.

3. Установить влияние in vitro блокаторов кальциевых каш лов (верапамил, нифедипин), в также мембранотролных препарате (ксидифон, сиклетанин) на трансмембранные перемещения ионе кальция в лимфоцитах периферической крови у детей, больт бронхиальной астмой.

- Б -

4. Определить в процессе лечения изменение показателей пе-емещения Са Я1 лимфоцитах периферической крови у детей; боль-ых бронхиальной астмой, при использовании блокагоров кальцие-ых каналов (коринфар), мембранотропных препаратов (вадитен, сидифон) и сочеганной терапии.

Работа выполнялась в отделе пульмонологии (руководитель -роф. С. Ю. Каганов) и в лаборатории клинической мембранологии руководитель - проф. О. Б. Святкина) Московского НИИ педиатрии детской хирургии (директор - академик РАМН, засдугвгнный дея-эль науки РФ, проф. Ю. Е. Вельтищев) Минздрава РФ.-: Часть био-даических исследований выполнена совместно с сотрудниками ла-эратории биофизических основ патологии (ругаводитель-проф. А. Азизова) Московского НИИ физико-химической медицины (ди-;ктор - академик РАМН, проф. Ю. М. Лопухин) Минздрава РФ. '

Автор диссертации выражает свою глубокую благодарность >оф. 0. А. Азизовой за консультативную помощь при выполнении стоящего исследования.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые у детей, больных атопической юнхиальной астмой, показано существенное усиление перемеще-1я ионов кальция в лимфоцитах периферической крови под воз-йствием in vitro специфической (причинно - значимый аллер-я) и неспецифической (конканавалин А) стимуляций. Увеличение держания ионов кальция в иммунокомлетентных клетках - необ-димое условие антиген-зависимого высвобождения медиаторов и звития аллергических реакций.

Усиление перемещения мембраносвязанного кальция в лимфо-тах периферической крови у детей с атопической бронхиальной тмой при воздействии причинно-значимым аллергеном (домдшняя ль) in vitro моявг служить тестом для выявления специФи-

- б -

ческой сенсибилизации Сольных.

Установлено, что блокаторы кальциевых каналов (вералам

нифедипин) in vitro угнетают процесс перемещения ионов калы

в лимфоцитах,активированных конканавалином А и аллергеном

детей» больных атопической бронхиальной астмой.

Впервые выявлено, что у детей, больных бронхиальной ас

мой, мембранотропные препараты (ксидифон, сиклетанин) in vit

2+

ингибируют процесс перемещения Са в лимфоцитах, стимулирова

;-:ых причинно - значимым аллергеном и конканавалином А.

Установлено, что влияние ксидифона in vitro на трансме*

ранные перемеврния ионов кальция в лимфоцитах, стимулированн

причинно-значимым аллергеном, является наиболее значительны

ш сравнений с другими препаратами, уменьшающими перемешен

ионов кальция в клетках ( нифедипин, верапамил, сиклетанин )

Впервые показано, что ксидифон обладает свойствами инг

2+

бировать процесс перемещения мембраносвязанного Са в лимфой так периферической крови у детей с атопической бронхиальн астмой, что следует рассматривать как один из механизмов е фармакологического действия.

Показано, что улучшение функциональных показателей вне него дыхания у детей, больных бронхиальной астмой под влияни лекарственной терапии, в частности, при использовании коринф ра, сопровождается ингибированмем процесса перемещения ион кальция в лимфоцитах.

Уменьшение перемеиэния ионов кальция в иммунокомпетентн; клетках при лечении детей, больных бронхиальной астмой эадтч : ном, , ксвдифоном, сочетании их с другими препаратами (эуфи. лйн) / обусловливает в значительной мере антиаллергический 31 . фект этих средств.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Определение in vitro перемещения

2+

а в лимфоцитах периферической крови у детей, больных атопи-эской астмой, при воздействии причинно-значимого аллергена озволяет установить наличие специфической сенсибилизации у эльных, что можно использовать в диагностических целях,- При гом обследование можно проводить в любом периоде заболевания.

Изменения перемещения Са ^в лимфоцитах периферической крои под влиянием различных препаратов могут быть использованы в ачестве контроля за эффективностью лечения.

фактические рекомендации, изложенные з диссертации, спользуются в клинике пульмонологии Московского научно -сследовательского института педиатрии и детской хирургии инздрава РФ.

Результаты работы представлены на конференции молодых' ченых Московского НИИ педиатрии и детской хирургии .Минздрава S (1986), заседании пульмонологической секции (Московского об-эства детских врачей (Москва, 1989), XV симпозиуме социа-истических стиран по проблемам детской пульмонологии (Киев, 389), на совместной конференции с болгарскими пульмонологами 1989) и на совместном совещании с американскими педиатрами в ышеназванном институте (1990), представлены на 2 Всесоюзном энгрессе по болезням органов дыхания (Челябинск, 1991), ! ьезде иммунологов Азербайджана (Баку, 1992), XY конгрессе Ев-эпейской Академии по клинической аллергологии и иммунологии Париж, 1992), 3 Национальном конгрессе по болезням органов ахания (Санкт-Петербург, 1992), на объединённом методическом эвещании отдела пульмонологии и лаборатории клинической мемб-анологии Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Мин-црава РФ (1992).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на & страни цах машинописного текста и включает следующие разделы: введе ние, обзор литературы, 3 главы собственных наблюдений и иссле дований, заключение, выводы, практические рекомендации и ука аатель литературы. Работа иллюстрирована •/? рисунками, вы писками ка истории болезни. Указатель литературы содержит ^ источников, мз них С 3 отечественных, '^^ иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Под нашим наблюдением находилось 98 детей в возрасте от до 14 лет, больных атопической бронхиальной астмой. При диаг ностике заболевания использовали общепринятый комплекс обсле дования больных, включавший сбор анамнеза, клинические наблю дения, функциональные и рентгенологические исследования Последние осуществляли в отделе функциональных и рентгенологи ческих методов исследования (зав. - проф. В.Ю, Босин) институ та. Доводили общеклинические исследования крови и мочи.

У подавляющего большинства детей отмечалась наследствен 'ная отягощенность аллергическими заболеваниями, в 'раннем воз , расте каблодались колиьге проявления аллергического диатеза нередко имела место пишэвая и медикаментозная аллергия.

У всех детей, больных бронхиальной астмой,приступы затруд ненного дыхания возникали, главным образом, в домашней обета новке и ослабевали или полностью прекращались вне дома,т. е наблюдался эффект элиминации. При проведении аллергологическо

о обследования выявлялась сенсибилизация к аллергену из до-ашней пыли.

Для оценки гуморального иммунитета осуществляли определе-ие уровня сывороточных иммуноглобулинов А, М, G методом ради-' . льной иммунодиффузии, содержание общего иммуноглобулина Е с омощыо иммуноферментного метода ElISA, циркулирующих иммунных омплексов методом осаждения их в 3,5% растворе полиэтиленгли- ' оля (fligeon М. , 1977).

Определение общего числа Т-лимфоцитов проводилось о по-ощью спонтанного розеткообразования (Петров P. R ' и соавт., 976).

Иммунологические исследования проводили в лаборатории им-[унологии и иммунохимии (зав. - проф. Д. R Сте^йи) Московского ИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ.

Для выявления специфической сенсибилизации у больных осу-рствляли постановку кожных проб с небактериальными аллергена-и. В сыворотке крови определяли специфические иммуноглобулины ; к аллергенам небактериальной природы иммуноферментным мето-;ом ELISA. Исследования проводили в лаборатории аллергии (зав. -|роф. Е Б. Гервазиева ) Московского НИИ вакцин и сывороток im. И. И. Мечникова.

Для определения перемещения ионов кальция в лимфоцитах [ериферической крови был использован биофизический метод. Объектом исследования служили лимфоциты периферической крови. Слетки выделяли из гепаринизированной венозной крови в гради-(нте фиколл-верографина р = 1,078.

Перемещение мембраносвязанного кальция в лимфоцитах

!сследовали с помощью флуоресцентного зонда хлортетрациклина g

ХТЦ). Лимфоциты (10 клеток/мл при жизнеспособности 95-98 2)

окрашивали в конечной концентрации Х1Ц (2 х 10 М). Флуоресце> цию ХГЦ в суспензии лимфоцитов регистрировали в термостатируе мой кюзете на спектрофлуориметрб "Hitachi" МРР-4 (Япония) согласно методу, описанному Mikkelsen R.E , Schmidt- Ulrich R (1986).

В процессе исследования лимфоциты активировали нативны аадергеком из домашней пыли, специально приготовленным сотруд никама лаборатории аллергодиагностики (зав.- доит. мед. нау

s

ЕЙБермэц) и нами, в Московском НИИ вакцин и сывороток им. И. Е Мечникова или конканавалином А 20 мкг/мл фирмы "Sigma1 (США) и определяли изменение интенсивности флуоресценции ХГЦ i течение 5 мин. При активации лимфоцитов наблюдается уменьшение интенсивности ' флуоресценции ХГЦ ( ИФХ), что отражает процесс перемещения мемЗраносвязанного Са+в клетках.

2+

Данные о перемещении мембраиосвязанного Са в клетках, полученные с помощь» ХГЦ, коррелируют с увеличением концентрации

2+ 2+ цитопдаэматического Са , регистрируемой другим Са - чувствительным 8ондом Квин-2 (Thompson N. Т., 1985).

Расчет изменения ИФХ производили в относительных процентах по фор^ле: (ïj - F¿ ) : F, x 100, где Fs ~ начальная, a ?z -конечная интенсивность флуоресценции ХГЦ.

Для определения влияния фармакологических препаратов' in vitro на процесс перемещения мембраиосвязанного Са2! лимфоцитах использовали антагонисты кальция - верапамил фирмы " LEK " (Югославия) и нифедипин фирмы " Germed " (ГДР), а также мемб-рансЯролный прелараг-ксидафон (НПО " Мэсхимфармпрепараты "

им. H. L Семашко). В работе проводили таюке исследование эффекта

2+

воздействия in vitro на перемещение Са , препарата пиридинового ряда-сиклетанина (институт Н. Бофур» г. Париж), который об-

- 11 -

адает мембранотропным свойством.

После инкубации лимфоцитов с препаратом регистрировали »менение интенсивности флуоресценции ХТЦ при воздействии на четки крови причинно-значимого аллергена и конканавалдаа А.

Эффективность действия лекарственных средств выражали в »центах при сравнении показателей изменения ИФХ в пробах без >епарата и при его добавлении.

Исследование перемещения ионов кальция в лимфоцитах пери-Фической крови детей, больных бронхиальной астмой, осущест-шли в динамите заболевания, в различные его периоды, при значении различных лекарственных препаратов (блокатор каль-1евых каналов, мембранотропные препараты), а такие при соченной терапии.

Результаты специальных исследований статистически обраба- ' [вали с вычислением средней величины, средней ошибки. Досто-рность одноименных показателей вычисляли по формулам пара-трической статистики с использованием критерия Стьюдента рбах Е Ю., 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Среди наблюдавшихся нами больных, тяжёлая атоническая онхиальная астма была у 39 детей, среднетяяйлая - у 69 боль-х,согласно классификации, принятой на пленуме Научного Сове-по педиатрии АМН и Президиума общества детских врачей Э81).

Среднетяжёлая астма характеризовалась частыми приступами груднённого дыхания, купировавшихся бронхолятическими препа-гами. Все дети со среднетяжёлой бронхиальной астмой поступи-

т в клинику в межпристутшом периоде заболевания. У части и них имели место аускультативные изменения в лёгких - прослуши вались сухие свистящие хрипы.

Рентгенологическая картина характеризовалась усиление сосудистого рисунка, При исследовании функции внешнего дыхани; у большинства больных обнаруживали снижение объемно-скорости показателей форсированного выдоха (пиковая скорость выдоха максимальная объемная скорость потока воздуха на выдохе Hi урозлэ 75% , BOX , 25% форсированной жизненной ёмкости легких; на 20-35% по сравнению с нормальными значениями. Показатед. обадма форсированного выдоха за 1 сек (ОФВ,) был снижен Hi 10-20 Z.

В периферической крови отмечалась эовинофшшя (5-17Z). Эозикофилы выявлялись также в мокроте, при её наличии. Уровен] общего иммуноглобулина Б в сыворотке крови был повышен от 12( до 1500 ME /мл. У ряда детей выявлялись специфические JgE ■ антитела к аллергену из домашней пили. При исследовании клеточного авена иммунитета выявлено снижение количества Т-димфо-цнтове преимущественно ва счёт уменьшения теофиллинчувстви-тельных клагок, обладаю дах супрессорной активностью. При определении уровня циркулирующих иммунных комплексов отмечалоо его повышение от 0,120 до 0,220 ед. опт. .плотности. '

Из наблюдавшихся нами 39 больных с тяжелой бронхиально* астмой, 11 детей поступили в клинику в астматическом состоянии, которое сопровождалось экспираторной одышкой, мучительны» сяае*ическим кашлем. В лёгких у этих детей на фойе ослабленного дыхания прослушивались рассеянные сухие хрипы. Рентгенологически регистрировали признаки острого эмфизематозного вздутия лёгких. Исследования функции внешнего дыхания свидетельст-

вовали о резкой снижении объёмно-скоростных показателей форсированного выдоха. При исследовании кислотно-щелочного состояния отмечался ацидоз смешанного характера, иногда показатели рС(£ достигали 48 мм. рт. ст. , pQ, - 66 мм. рт. ст.

Уровень общего I&E в сыворотке крови был значительно повышен и достигал у ряда детей 1500-2000 UE/мл.

Таким образом, под нашим наблюдением находились дети, Имевшие среднетяжёлую и тяжелую атопическую бронхиальную астму. Клинико-лабораторные данные свидетельствовали об участии в развитии болезни у наблюдавшихся нами детей, аллергической реакции [ (реагинзависимого) типа по классификации Gell и Coombs (1969),

Известно, что реализация реакции немедленного типа осуществляется только при участии ионов кальция (Trjgglö Д., ' 1983). Б формировании аллергического процесса ведущая роль отводится лимфоцитам (Петров Р. В ,1976). В этой связи определяли изменение интесивности флуоресценили ХГЦ в лимфоцитах периферической крови, стимулированных различными факторами, in vitro у детей с тяжёлой и среднетяжелой астмой. В приступном периоде было обследовано 8 детей с тяжёлой бронхиальной астмой. Контрольную группу составили 7 детей, больных хронической пневмонией, не имевших в анамнезе указаний на аллергические реакции.

Были обследованы также 24 взрослых донора. Известно, что зако-

2+

номерности транспортных процессов Ca через клеточные мембраны у взрослых и детей аналогичны (Горбатенкова Е. А. и соавт., 1989; Кириллов М.А. и соавт., 1990).

У всех детей,больных бронхиальной астмой, независимо от периода и тяжести заболевания, в стимулированных конканавали-иом А (КонА) лимфоцитах имело место уменьшение интенсивности

флуоресценции ХГЦ, что свидетельствовало об усилении перемещэ-2+

ния катиона Са в клетках. Учитывая, что взаимодействие конка-навалина А с лимфоцитами вызывает разупорядочение мембранных липидов в области распределения зонда, можно предположить, что при этом усиливается перемещение ионов кальция из мембраны внутрь клетки, при этом интенсивность флуоресценции зонда падает (Ситковский И В. и соавт., 1981). Известно, что повышение

2+

внутриклеточной концентрации Са при воздействии Кон А является

ч

результатом усиления входа и мобилизации внутриклеточного кальция (Сергеева Н. С. и соавт,, 1980; Mitsumoto Y. et al., 1688).

У больных со среднетяхйлой астмой в межприступный .период стимуляция КонА лимфоцитов периферической крови in vitro соп-ровоздалась уменьввнием ИФХ в среднем на 10,77+0,47Х (п-66). В ' медлриступном периоде заболевания у детей с тяжйлой астмой при ¡воздействии КонА на клезки крови этот показатель составил в среднем 11,2Ш,43Х (п-30). У детей с тяжёлой бронхиальной астмой в приступном периоде заболевания уменьшение флуоресценции ХГЦ было в среднем равно 14,42+1,6Х (п«8Х).

При сравнении показателей изменения ИФХ у детей в приступном и межприсгулном периоде Заболевания существенной разницы выявлено ке было (Р> 0,05). В то' же время' отменено достоверное различий в показателях изменения ИФХ в лимфоцитах, стимулированных КонА, у детей, Сольных атонической астмой (независимо от тяжести болезни) и хронической пневмонией (Р<0,"001), при которой снижение ИФХ составляло в среднем лишь ■ 6.92+1,542 (п°5). Обнаружено такяе существенное различие в по-,'казателях изменения ИФХ в лимфоцитах, стимулированных КонА, у больных бронхиальной астмой и здоровых доноров (Р<0,001).

По данным терапевтов (Чучалин А. Г. и соавт. ,1985) у больных бронхиальной астмой обнаруживалось увеличение числа лимфо-

2+

цитов, связывающих комплекс Са - ХГЦ, что объяснялось повышенным содержанием ионов кальция в мембране. Известно, что по-

2+

верхностные запасы ионов Са в мембране могут регулировать транспорт этого катиона в цитозоль (Truneh A. et al. ,1981).

Таким образом, в ответ на воздействие in vitro КонА, имеет место усиление перемещения ионов кальция в иммунокомпетент-ных клетках детей, больных атопической бронхиальной астмой.

Как известно, основным звеном в пагогзнезе аллергических реакций является наличие специфической сенсибилизации к различным аллергенам.

У больных бронхиальной астмой, сенсибилизированных к домашней пыли, воздействие in vitro причинно-значимого аллергена' на лимфоциты периферической крови приводило к уменьшению ИФХ,

что свидетельствовало об усилении перемещения мембраносвязан-2+

ного Са в клетке. У детей со среднетяжёлой астмой (вне приступов) уменьшение ИФХ составило в среднем 9,93±1,07Х (п-58). У детей с тяжёлой астмой этот показатель составил 10,37*1,40Х (п»31) - в межприступном периоде заболевания, при приступах' астмы - 12,31+1.01^ (п=8). У детей, больных хронической.пневмонией (обследовано 6 человек), не отмечалось снижение ИФХ при воздействии in vitro аллергеном из домашней пыли на лимфоциты периферической крови.

Здесь следует указать на исследования М. А. Кириллова и ;оавт. (1991), обнаруживших у детей с аллергическими заболева-*иями увеличение концентрации Са в гранулоцитах периферической срови при воздействии in vitro аллергеном.

Можно предполагать, что причинно-значимый аллерген, как и

митоген КоцА, у детей, больных бронхиальной астмой, усиливает

транспорт мембршюешзаяного кальция внутрь клеток, что повы-

2+

шает в них внутриклеточную концентрацию Са »способствующего реализации аллергического процесса.

Работы Е. Е Middletc-r) (1080,1983,1986), свидетельствуют о ключевой роли повшекной концентрации Са в развитии аллергического прсдасеа. Индуцированный аллергеном вход ионов кальция в клетки-митии нриводит к напуску каскада реакций как на уровне мембраны, та« и ьиутрй клэгки и, в частности,4« высвобождению из кяегки таких биологически активных веществ как гистамин, еерогояш, а тйкжв к синтезу вновь образующихся ме-диа'горов-лййкотриенов, прсст&гландинов, фактора активации тромбециюй (ФАГ) { Ishizaka Т., 1982),

Следке*'подчеркнуть, что выраженное усиление перемещения ионов Са в лимфоцитах периферической крови у детей с атонической астмой Яри воздействии яричишю-значимым аллергеном (домадяяй пыль) ывтт служить тестом для выявления специфической сенсибилизации больных,

2+

Процесс выделения медиаторов начинается с накопления Са в клетке iEnnig М. &t ai,, 1983). Блокада поступления нона кальция в клетку тормозит освобождение биологически активных веществ и это явлений ^ожет быть использовано в лечебных целях, Пээтому.предетамнлоеь вашм оценить влияние блокаторов кальциевых каналов- коринфара (нифедипин) и верапамила ка процесс 2+

перемещения Оа in vitro i лимфоцитах у детей с атопнчеокой бронхиальной шзтдай. Ш шне® существенным было установление кальций-антегоииетичееких аффектов таких мемЗранотрошшх препаратов как ксидифон и еиклэтанин.

Влияние фармакологических препаратов на процесс перемеще-

ия ионов кальция в лимфоцитах определяли у 25 детей, больных топической бронхиальной астмой. Контрольную группу составили t взрослых доноров.

У больных бронхиальной астмой (6 детей) исследовали ействие нифедипина на процесс перемещения Са^в лимфоцитах. В онтрамиых исследованиях, проведенных без нифздкпина, воз-ействие Кона на клетки крови in vitro сопровождалось ymuime-ием КФХ в среднем i|a 10,61t2,23X. Поело инкубации лимфоцитов кифедипиком (2x10 М > стимуляция клеток КонА in vitro умень-ала флуоресценцию ХТД лишь на 2,21.1,42*, что достоверно отли-алось от показателя в контрольных пробах (F<0,00t). Это сви-,эгр.!ьствует об уменьшении под воздействием нифедипина переме-(эния ионов кальция в лимфоцитах.

Подобные тенденции отмечены и у здоровых лиц-При воэ-¡ейсгвии КонА на лимфоциты, инкубирование с «шфэдипином, пока-агель уменьшения ИФХ составил в среднем 6,78i2,34X и суизст-leimo отличался (Р<0,001) от такового при контрольных исслодо-шиях (13,81^2,05), Стимуляция аллергеном из домашней пыли мифоцитов больных атонической астмой приводило к уменьшений Ш1в среднем на 12,6043,52Х, Тогда как в пробах с нифедипииоМ 1ТИ яначения били в среднем равны 2,08*1,671. При сопоставле-tKK ft показателем яри контрольна исследованиях обнаружено су-ЧбСТВенвоэ различив (?<0,01),

Таким образом,у больных бронхиальной астмой нифедипин су-црегдошо иигибир^вал процесс перемещения мембракосаязаного cl

j иммунокомп8т0нткых клетках крови при воздействии КонА - на

Л * •

Э1Ж7 при воздействии причинно-значи»юго аллергена - на 65Х.

У здоровых д&короа нкфедипин кнгибнрояал процесс переш-aeiiwi! Са в лимфоцитах, стимулированных КонА, иа 55%.

+

- 18 -

Мы исследовали также влияние верапамила на транспортяь* процессы Са+в лимфоцитах периферической крови у больных атопи-ческой астмой (у б детей) и здоровых доноров (у 11 человек). ] •исследованиях, проведенных без верапамила, воздействие КонА н; клетки крови сопровождалось снижением ИФХ в среднем н; 8,63+0,83Х. При добавлении в инкубационную среду верапамш (5x10 IS) этот показатель составил 2,98±0,95X и существенно отличался от контрольных значений (Р<0,001).

У здоровых доноров воздействие КонА на клетки крови приводило к уменьшению ИФХ в среднем на 7,57+0,65Z. В присутствш верапамила-на 1,91+0,64%. При сравнении с показателем в контрольных пробах различие было достоверным (Р<0,001).

Стимуляция аллергеном из домашней пыли лимфоцитов детей, Сольных атопической астмой, сопровождалась уменьшением ИФХ i среднем на 6,84+1,49Х. При добавлении в инкубационную срещ верапамила изменение ИФХ было меньше и. составило 2,11+1,32 X. . Полученные результаты достоверно отличались от контрольные значений (Р<0,05). \

Таким образом,у Сольных атопической астмой верапамил ir

2+

vitro ингибировал трансмембранные перемещения Са в лимфоцитах, стимулированных КонА, на 69Z, при воздействии причинно-значимого аллергена на 75%. У здоровых доноров препарат блокировал поступление кальция в клетки, индуцированные КонА, па 76Х.

Итак, результаты исследования показали, что блокаторк кальциевых Каналов - нифедипин и верапамил in vitro существенно ингибируют транспорт с!+в иммунокомпетентвых клетках, стимулированных различньпш факторами как у детей, больных бронхиальной астмой, так и у здоровых доноров. Эти данные совпадают с таковыми других авторов, исследовавних влияние антагонистов

альция на перемещение С§*в клетках. Tanizaki У. et al. (1983)

зблюдал отчётливую блокаду нифедшином вхождения изотопа

2*

зльция в клетки. Уменьшение поступления Са под действием Оло-

аторов кальциевых каналов приводит к подавлению высвобождения

истамина из базофильных лейкоцитов, индуцированных иммуногло-

улияом Б (Хофмаи Е. и соавт,, 1991).

Касаясь влияния ксидифона - мембрамотропного препарата на

еремеаэние ионов кальция в лимфоцитах детей, больных бронхи-

льной астмой, следует ваметить, что в присутствии препарата

Бх10"\) наблюдалось уменьшение ИФХ в клетках,стимулированных

¡онА, э среднем на 6,47*1,421, Стимуляция лимфоцитов КонА (без

[обавлеякя ксидифона) приводила к уменьшению ИФХ tra

1,78+2,107. (п-б). Различие было существенным (Р<0,05), При

¡содействии аллергена из домашней иыли наблюдалось полное кн- pi

'ибирование перемещения Па з «легко (отсутствие уменьиеккя

МСО, тогда как в контрольны* исследованиях этот показатель

.•оставил 10,9016,1U (Р<0,001).

Таким образом, кеи/чфон in vitro ингибиросал перемещение 2ч-

*S*5paMocBrtsaH!toro Са а клетках, стимулированных КонА, на 4Ъ%, з Стййулировамш прйчйийо-аначихми аллергеном, на loox. В исследованиях О. S. Святкиной (1985) было показано, что ксидкфон обладает выраженным мембранотропкыы действием, которое проявляется в изменении текучести мембран, увеличении Т-супрессор-НЬ!Ж популяций лкмфошггов. ингибировании высвобождения липидннх меду.ьторов - лейготриенов и ФАТ. Мэжно допустить, что стабилизация биофизического состояния мембран под действием ксидифона

I

яъ.'гяется. сснойой ингибируюшэго влияния трансмембранных переме-Ca.g де^оцитах у детей с атопической бронхиальной астмой.

У 9 детей, Сольных бронхиальной астмой, было исследова!

2+

влияние на процесс перемещения Са в лимфоцитах сиклеташна

.препарата пиридинового ряда, обладающего блокируюцим boj

действием на ФАТ, предупреддаюце!'о дегрануляцию баэофили

(Святкина О, Б. и соаэт., 19923.

Воздействие КонА на клетки крови ссгарововдаяоеь уигньт

нием ИФХ в средней'га 15,31+3,191. Добавление в иниубацйоинз

-5

среду сиклетанина (5 х J0 Ю суврственно из пеняло ШХ(б,&О

+ 2,42%, Р<0,05). Стимуляция лимфоцитов аллергеном из домашне

пыли приводила к снижению флуоресценции ХР£? в среднем на 14,6

+ 3,54%. В присутствии препарата - на 4,84 ± 1,19%. Полученнь

результаты с высокой степенью достоверности отличались о

контрольных значений (Р<0,001). Таким образом, сиадетанин ин

2*

гибировал процесс перемещения мембраносвязанного Са в лимфоци

тах,стимулированных КонА, на 67%, в лимфоцитах, стимулирован

ных причинно-значимым аллергеном, на 59%.

Итак, мембранотропиые препараты ксидифон и сиклетанин ин

24

гибируют процесс перемещения Са в лимфоцитах у детей с атопи

ческой бронхиальной астмой при воздействии на клетки кров

КонА и причинно-значимого аллергена. Причём in vitro ксидифо

оказывал наибольшее, подавление транспорта Са^в лимфоцитах

стимулированных аллергеном. Шгибирование перемещения в лимфо 2+

цитах Са .участвующего г развитии аллергических реакций, явля

ется одним из механизмов фармакологического действия этоп

препарата. Представленные дашше о влиянии ксидифона на пере-2+

мещения Са в лимфоцитах, могут тють клиническое значение npi использовании его » терапевтических целях при бронхиально! астме у детей. При этом особого внимания заслуживает факт наибольшего подавления ксидифзяом трансмембранных перемещений с;

2.1

з лимфоцитах, стимулированных причинно-значимым аллергеном.

Определение влияния лекарственных средств на процесс пе-2-1-

земещения Са н лимфоцитах, проводилось при лечении детей, 5ольннх атопической астмой блокаторами кальциевых каналов (ко-зинфар) и мембранотропными препаратами (задитен, ксидифон), Одновременно было изучено влияиие комллексной терапии на этот процесс в иммунокомпетентных клетках. Следует заметить, что мело больных в каждой из групп было невелико, однако однотил-юсгь и однонаправленность полученных данных позволили их сум-даровать и высказать суждения о влиянии иоследованниых препаратов на процесс перемещения ионов кальция в лимфоцитах.

Под нашим наблюдением находилась группа детей в возрасте М4 лет (10 больных),которым бил назначен коринфар (нифядн-шО. Этот фрагмент исследования осуществляли совместно с 3. Я Добрыниной.

У всех детей была атопическая бронхиальная астма средней гя.чвсги. Курс лечения включал приём препарата внутрь по 10 ыг 2 рапа в день в течение V дней. Дети были свободны ог приступов, Однако в отв&т на дозированную физическую нагрузку у всех ЭоД'Ьных определялся посленагрувочный бронхоспаэм. После прове-цэС|Юго курса лечения коринфаром были отмечена положительные зд&ири, в показателях функции внешнего дыхания. Причём значения эбъйио-скоростнцх показателей после пробы с дозированной физической нагрузкой, проведенной после терапии коринфаром, возрастали на 25- ЗВ Такое же влияние коринфара на функционал Ьйое состояние внешнего дыхания у детей, больных бронхиальной догмой, отеетили Л А. Безруков и соавт. (1988).

У больных до назначения коринфара при воздействии КонА на лимфоциты периферической крови уменьшение ИФХ составляло в

среднем 12,44±1,36Х. После лечения - 4,09+1,21 Г. (Р<0,001), Уменьшение ИфХ в лимфоцитах, стимулированных аллергеном ив домашней пыли до лечения составляло в среднем 13,92±1,63%, после •лечения - 8,13±0,94Х (Р<0,01).

Таким образом, назначение коринфара детям с атонической бронхиальной аотмой приводило к ингибированию перемещения Са в лимфоцитах, стимулированных КонА на 71%, в лимфоцитах, стимулированных причинно-значимым аллергеном на 35Z.

Антагонисты кальщя, и прежде всего нифедипнн (коринфар), как было показано при исследовании in vitro, ингиСируют высвобождение медиаторов из тучных клеток и баеофилов (Ennis М, et al., 1983; Siraganian R., 1983; Хофман E. и соавт., 1991). Клинические наблюдения свидетельствовали о том, что нифедипин снимает спазм бронхов после физического усилия (Cerrina J. et al,, 1981; Barnes P. , 1986; Дидковский Ji А. и соавт., 1987). Можно предположить, что благоприятный клинический эффект Сло-каторов кальциевых каналов при бронхиальной астме связан с ин-гибированием высвобождения медиаторов '- аллергии, ослаблением

сокращения гладких мшац бронхов, увеличением толерантности к

t

физической нагрузке.

Ряд наблюдавшихся нами детей (5 больных) получали задитен

(кетотифен). Все дети были обследованы в мехпристулиом периоде

заболевания. Препарат назначали в дозе 1 мг 2 раза в день в

течение 3 месяцев. '

Дэ назначения задитена при воздействии КонА на лимфоциты

уменьшение ИФХ составляло в среднем 1Б,5±5,40Х. Через 2 недели

от начала лечения этот показатель составил В.90+3.14Х

(Р<0,05). Уменьшение ИФХ в лимфоцитах, стимулированных специ-

t

фическим аллергеном, до лечения вадитеном составляло о среднем

- 23 -

15,9415,37%, после лечения - 2,79£1,32Х (Р>0,05).

Таким образом, применение вадигена в течение Z недель у

5ольных атонической астмой приводило к ингибированию перемевр-

2+

1ия Са в лимфоцитах, стимулированных КонА, на 64%, при воздействии причиннозначимого аллергена - на 82 X. Сходный эффект действия задитена продемонстрировал Martini U. и Romer D. [1978) на изолированных тучных клетках. Кетотифен, как показано «давними исследованиями (Эмирова А.С. и соавт. , 1990), in vi--го оказывает мембранотропное влияние, регулирует каль-;ий-мембранный механизм в клетках, вовлекаемых в аллергический зтвет.

Препарат ксидифон был применён нами у группы детей с ато-■шческой бронхиальной астмой (5 больных). Все дети находились з меяприступном периоде заболевания. Препарат назначали в виде IX раствора по 5-15 мл (75-100 миг/кг массы тела) з раза в цепь.

У всех больных до назначения ксидифона при воздействии на зимфоциты периферической крови КоиА уменьшение ИФХ составляло з бреднем 12,84±0,72%. Назначение ксидифона в течение 2 недель mrfiTHO изменяло ИФХ (6,35il,29X, Р< 0,001).

Уменьшение ИФХ в лимфоцитах, стимулированных причиню -значимым аллергеном до лечения ксидифоном, составляло в :р<зднем 11,82*1,87%, после лечения - 2,14±1,35% (Р< 0,001).

Таким образом,при использовании ксидифона в течение 2 недель у детей, бочьных атопической астмой, наблодалось ингибн-эовзние гпоцесса перемещения ионов кальция в лимфоцитах, стимулированных КонА, на 52%, при воздействии причинно-значимого ияэргека ' на 71%. Результаты исследования дает еп£ одно объ-1сйеяие механизму действия ксидифона. Воздействуя ка лимфоци-

2+

ты, ксидифон препятствует трансмембранному перемещению Са в иммунохомпетектных клетках и тем самым оказывает антиаллергическое действие. Полученные нами данные указывают на целесообразность использования ксидифона при атонической астме у детей (Святкина О. Б. и соавт., 1989).

Наиболее выраженной эффективностью при бронхиальной астме обладает комбинированная терапия (Алексеев В. Г. и соавт., 1989; Пыцкий Е Ш. а соаьг. „ 1091).

Мы проводили исследование перемещений ионов кальция в хлмфоцитах у 5 детей с атопической бронхиальной астмой, полу-чавимх сочетанную терапию. Больным назначали эуфиллин (внутрь в дозе 10-16 мг/кг массы тела) в комплексе с мембраностабили-вируювдми препаратами (задитен, ксидифон). У всех детей был достигнут отчетливый терапевтический эффект.

У больных бронхиальной астмой до назначения сочетанной терапии при воздействии КонА на лимфоциты периферической крови уменьшение ИФХ составляло в среднем 1Б, 88+4,171. Через 2 недели от начала лечения этот показательч составил 4,3111,957. (Р<0,05).

При воздействии аллергена из домашней пыли на лимфоциты уменьшение ИИ до лечрния составляло в среднем 14,84+2,10%, после лечения - 3,90±1,73Х (Р<0,001).

Таким образом, назначение в течение 2 недель комбинированной терапии приводило к ингибированию перемещения са^в лимфоцитах, стимулированных КонА, на 65Х, в лимфоцитах, стимулированных специфическим аллергеном, иа 76%.

Итак, при лечении детей, больных бронхиальной астмой, за-дитеном, ксидифоном, сочетании их с другими препаратами имеют место принципиально однотипные изменения - уменьшение переда-

эний мембраносвязанного в цитоплазму иммунокомпетентных леток, что в значительной мере обусловливает их антиаалерги-1ескую эффективность.

ВЫВОДЫ

1. У детей, больных атонической бронхиальной астмой, под воздействием специфической (причинно-значимый) аллерген и неспецифической (конканавалин А) стимуляции лимфоцитов пери-«рической крови in vitro наблюдается существенное усиление юремещения мембраносвязанного d+B клет!сах.

2. Усиление перемещения ионов кальция в лимфоцитах перифэ-1ИЧ0СКОЙ крови у детей, больных атапической бронхиальной ыст-юй, при воздействии in vitro конканавалииа А и аллергена от-вчено при различной тяжести и периодах заболевания.

3. Определение in vitro выраженного усиления перемещения ¡а' в лимфоцитах периферической крови у детей с атонической 1роцхиальной астмой при воздействии причинно-значимым аллерге-юу (домашняя пыль) мода? служить тестом для выявления специ-тзакой сенсибилизации больных.

4. У детей, больных бронхиальной астмоЯ.бхокаторы кальцие-* ¡ы* каналов (верапашл, нифздилии) in vitro ингибкруот процесс ¡ере^ещения ионов кальция з лимфоцитах, .стимулированных хонка-

аБэ)1Иком а и аллергеном.

!

5. При бронхиальной астме у детей мембранотропкые препара-ы исмифон и сию"?танин in vitro ингибируют процесс лерэшщэ-:ия Цюмбраносвязачного кальция в лимфоцитах периферической :poejf, . при воздействии на них конканавалином А и причикнозня-imsm; аллергеном. Ксидифон' in v.ltro оказывал более выраженное «давление перемещений коков кальция з лимфоцитах, стимулиро-

- 26 - . ванных причинно-значимым аллергеном.

6. Назначение коринфара детям с атомической бронхиально! астмой приводило к ингибированию трансмембранного перемещзкю

. Са в сенсибилизированных лимфоцитах и нормализации показателе! внесшего дыхания, изменения которых были вызваны дозированно! физической нагрузкой.

7. Щ>я лечении детей,больных бронхиальной астмой, задите-

ном, ксидифоиом, сочетании их с другими препаратами (эуфиллин)

имеют место принципиально однотипные изменения-уменыаение гге-2+

ремепр-ний Са в лимфоцитах, что в значительной мере обусловливает их ант«аллергическую эффективность.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОШЩАЦИИ

1. Определение усиления перемещения Сймв лимфоцитах периферической крови in vitro у детей, больных атопической бронхиальной астмой при воздействии' причинно-значимым аллергеном, позволяет выявить наличие специфической сенсибилизации. Это исследование южно проводить % любом периоде заболевания.

2. В терапию детей, больных бронхиальной астмой, целесообразно включение препаратов, шгиОиружщих перемещение ионов кальция в имыунокомпетевтных клетках.

■ а Определение процесса леренецгния ионов кальция в лимфоцитах у детей, болышх бронхиальной астмой, с помощью хлортет-раинкллшового зонда in vitro шлет быть использовано при оценке эффективности дачешш.

- 27 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Применение лекарственных средств, блокирующих кальци«->ые каналы при бронхиальной астме у детей. //Волр. охр. мат. -989.- N. 5. - с. 65 - 69.

2. Влияние нифедипина на мобилизацию внутриклеточного альция при активации лимфоцитов здоровых доноров и детей, ¡ольных атонической бронхиальной астмой. - В кн. : "Острые и хро-шческие заболевания лёгких неспецифической и специфической фироды". - Саратов, 1989. - с. 54 - 35. (п соавторстве с L JL Бориным).

3. Влияние нифедипина на мобилизацию внутриклеточного сальция в лимфоцитах у детей, больных бронхиальной астмой. - В ш, : "Материалы к Xi симпозиуму социалистических стран по цюблемам детской пульмонологии". - Киев, 1089. - с. 90 - 91.

<ч

[в соавторстве с U. Л Бориным ),

4. Использование коринфера при бронхиальной астме у детей. Гезисы докладов 2 Всесоюзного конгресса по болезням органов цыкания. - Челябинск, 1Э91. - с. Э05. (в соавторстве с Э. (|. Азизовой, Е. Я Добрыниной). .

5. Лечение фосфоновыки соединениями мембракотропногй действия атонической бронхиальной астмы и поллиноэа у детей. Ге^исы I съезда иммунологов Азербайджана. - Баку,1б92. - с. 185-18?, (в соавторстве с К&Пэгошй, А, Т.Гусейновым, .

Я. Ц Тулуевской, Е. К Васозой, С. П Кагановым, 0. Б. Святкиной, О, Ё| Вэдьтищевым). ; ., ;,„, '

6. ячгнбироэание инфлккса иоков кальция в лимфоциты у де-больных атонической бронхиальной астмой новым препаратом :

ксодифонсм. тезисы 3 Национального Конгресса по болезням орга-ноа дыхания. - С. - Штэрбург, 1S92. -гмп. (в соавторстве с 0.6. Сзят^иномУ

- 28 -

7. Pathocenetical role of structural and functional alterations »reirbrane of inrnmocompetent cells and possibility their correction in children with atopic bronchial asthma .(ABA), J. Allergy. Suppl. - 1992. - n. 12. - v.47, - p. 230. (в соавторстве с О. Б. Святкиной, Н. Н. Погомий, 1Q Е. Вельтищэвым, Я. М. Тулуевской,. С. XX Кагановым,' А. Колтай, Е Браке).