Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Клинико-патогенетическое и прогностическое значение ферментативного антиоксидантного профиля сыворотки и эритроцитов у больных с впервые выявленным острым лейкозом

На правах рукописи

ХВОРОСТЕНКО ЛЕВ БОРИСОВИЧ

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО АНТИОКСИДАНТНОГО ПРОФИЛЯ СЫВОРОТКИ И ЭРИТРОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ С ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННЫМ ОСТРЫМ ЛЕЙКОЗОМ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Тюмень-2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Фролова Ольга Игоревна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Юшков Борис Германович,

Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения РАН

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Ястребов Анатолий Петрович, ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Мин-здравсоцразвития России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «Ж ,» 2011 г. в часов на заседании

диссертационного совета^Д 208.101.01 при ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия по адресу: 625023, г. Тюмень, ул. Одесская, 54.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменской медицинской академии.

Автореферат разослан «. 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Фролова О.И.

ОБЩАЯЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия проблема онкологических заболеваний становится все более значимой. В структуре смертности населения Земного шара смертность от злокачественных новообразований занимает 2-4-е место, в высокоразвитых странах - I-2-oe место (Якубовская, 2000). По данным Госкомстата в 2005 году в России этот показатель занял 2-ое место, уступая только заболеваниям системы кровообращения. Тюменская область и город Тюмень входят в число административных территорий, неблагоприятных по заболеваемости злокачественными новообразованиями, в том числе опухолями системы кроветворения. Рост случаев онкологических заболеваний выводит на передний план проблему их лечения. Основным методом лечения онкогематоло-гических заболеваний, в частности острых лейкозов, является интенсивная полихимиотерапия. Однако, несмотря на высокий процент ремиссий (до 80%) после начальной терапии, рецидив бывает очень часто, и только 20% пациентов достигают долгосрочного выживания (Подцубная, 2001; Thomas, 2003). Кроме того, интенсивная химиотерапия является причиной тяжёлых побочных эффектов, особенно у пожилых пациентов (Robak, 2004). То есть недолгосрочная эффективность химиотерапии и токсичность лечения являются главными проблемами, которые необходимо решать. Одним из препятствий для успешной химиотерапии опухолей является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - невосприимчивость популяции клеток опухоли одновременно к целому ряду химиоте-рапевтических препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия на клетку. Феномен МЛУ может быть обусловлен различными механизмами, в частности, снижением накопления лекарственного препарата в клетке, связанным с функционированием Р-гликопротеина, белка множественной лекарственной устойчивости и обезвреживанием препаратов в клетке, обусловленным функционированием систем ферментов метаболизма ксенобиотиков, в частности фермента глутатион-8-трансферазы (G-S-T) (Ставровская, 2000). Основными механизмами в метаболизме и распределении ксенобиотиков является функционирование ферментов первой и второй фазы биотрансформации ксенобиотиков, а также АТФ-зависимых транспортных. Фермент второй фазы G-S-T класса Р участвует в процессах детоксикации широкого спектра электрофильных соединений, включая мутагены и канцерогены окружающей среды (Salinas, 1999, Tsuchida, 1992). Многие цитостатики, применяемые для лечения острых лейкозов, такие как алкилирующие агенты, антрациклины, стероидные гормоны также являются субстратами глутатион-5-трансфераз (Clandinin, 1994; Pemble, 1994; Ставровская, 2000; Hayes, 2000). Накопление свободных радикалов в высоких концентрациях приводит к повреждению мембран, окислению мембранных структур жизненно важных органов - печени, сердца, почек, что в конечном итоге приводит к развитию полиорганной недостаточности. Защита от свободно-радикального окисления включает в себя неферментативные механизмы (витамины-антиоксиданты) и ферментативные (внутриклеточные ферменты, например супероксиддисмутаза, и внеклеточные, к которым относится церуло-плазмин (В. Ф. Чехун, Н. К. Берлинских, 2004)). В тоже время отмечается, что

эффективность лечения может быть повышена не за счет интенсификации химиотерапии, а в основном за счет усовершенствования тактики выхаживания пациентов после цитостатического воздействия и проведения комплексных мероприятий в ремиссии заболевания. В связи с этим современные исследования в лейкозоло-гии направлены на поиск и внедрение новых, порой не связанных с цитостатиче-скими эффектами способов воздействия на лейкемические клетки (Волкова М.А., 2001). Всё это определяет актуальность и социальную значимость исследований, направленных на дальнейшее изучение патогенеза и клинико-патогенетических механизмов развития и прогрессирования заболевания и разработку методов оптимизации не только химиотерапии, но и сопроводительной терапии острых лейкозов.

Цель работы

Выявить клиническую и прогностическую значимость показателей внутри- и внеклеточной ферментативной системы антиоксидантной защиты в крови у больных с впервые выявленными острыми лейкозами.

Задачи исследования

1. Исследовать особенности антиоксидантного профиля сыворотки крови и эритроцитов в дебюте острого лейкоза до начала лечения, а также в динамике программной полихимиотерапии и при достижении клинико-лабораторной ремиссии острого лейкоза.

2. Провести сравнительный анализ антиоксидативной активности сыворотки крови и эритроцитов больных с различными морфологическими вариантами острого лейкоза и с различной степенью выраженности основных клинико-лабораторных проявлений заболевания.

3. Оценить влияние исходного уровня церулоплазмина, в-Б-Т в сыворотке крови и эритроцитах на результаты индукционной терапии больных впервые выявленными острыми лейкозами.

4. Изучить влияние исходного уровня церулоплазмина, й-Б-Т на выживаемость больных с впервые выявленным острым лейкозом.

Научная новизна работы

На клиническом материале получены новые данные о состоянии ферментативного звена антиоксидантной защиты сыворотки крови и эритроцитов больных с впервые выявленным острым лейкозом. Показано, что активация ферментитвной антиоксидантной защиты происходит на фоне изначального дефицита естественных неферментативных звеньев антиоксидантной защиты -ретинола и а-токоферола. Проведён сравнительный анализ активности ферментативного звена АОЗ на примере церулоплазмина и в-Б-Т у больных с различными морфологическими вариантами заболевания, с различной степенью выраженности основных клинико-лабораторных проявлений в период первой атаки, в ходе выполнения программной полихимиотерапии, в период становления ремиссии, в ходе поддерживающей терапии, а также при развитии рецидива острого лейкоза. Получены статистические данные о взаимосвязи изначального уровня активности глутатион-5-трансферазы в период манифестации острого лейкоза и долгосрочной выживаемости больных.

Практическая значимость работы

Для практического здравоохранения разработаны дополнительные критерии объективизации выраженности интоксикационного синдрома; предлагается определять уровень активности глутатион-Б-трансферазы в эритроцитах, це-рулоплазмина в сыворотке крови как в период первой атаки ОЛ, так и в период индукционной терапии и при рецидиве заболевания. Дополнительным критерием высокого риска летальных исходов и выживаемости больных предложено определение уровня активности глутатион-5-трансферазы эритроцитов. При рецидиве острого лейкоза в качестве дополнительного критерия неблагоприятного исхода обоснована целесообразность определения церулоплазмина в сыворотке крови до начала проведения противорецидивной химиотерапии.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Манифестация OJ1 сопровождается компенсаторным напряжением ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной зашиты клеток крови, которая сопряжена с нерегулируемой активацией процессов перокси-дации липидов и резким снижением концентрации субстрата окисления -мембранных фосфолипидов.

2. Все этапы программной полихимиотерапии ОЛ, в том числе при достижении клинико-гематологической ремиссии, характеризуются снижением и последующим истощением компенсаторных возможностей антиоксидантной защиты, в первую очередь её ферментативного звена.

3. Благоприятные результаты индукции ремиссии, а также долгосрочная выживаемость больных с впервые выявленным острым лейкозом статистически взаимосвязаны с умеренной активностью глутатион-5-трансферазы (214 - 752 мкмоль/мин*л) в дебюте заболевания.

Апробация результатов исследования

Результаты диссертационной работы докладывались:

• V терапевтический форум "Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов". Тюмень - 2008;

• Конгресс терапевтов. "Урал - 2009", Тюмень. - 2009;

• Российский национальный конгресс "Человек и лекарство. Урал - 2010". Тюмень-2010.

• VI терапевтический форум. Тюмень - 2011.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них входящих в перечень ВАК 4. Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, II рисунками. Работа состоит из введения, литературного обзора, главы «Материалы и методы», трех глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы. Указатель содержит 314 источников, из них 117 отечественных авторов и 197 - зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика пациентов в дебюте ОЛ.

Протокол исследования включает проспективное (5 лет) с 2006 по 2011гг. наблюдение 75 больных острым лейкозом с момента верификации диагноза ОЛ и в последующем при дальнейших этапах терапии. Комплексное обследование и проспективное наблюдение пациентов проводилось на базе гематологического отделения Тюменской областной клинической больницы Возраст пациентов составлял от 18 до 77 лет (средний возраст 44,3 лет), мужчин -41 (54,67%), женщин - 34 (45,33%).

В соответствии с РАВ-классификацией острых лейкозов, у 24 больных (32%) верифицировался диагноз острого лимфобластного лейкоза (Ь| вариант), у больных острого миелоидного лейкоза: М0 вариант - 3 (4%), М| вариант - 13 (17,33%), М2 вариант - 16 (21,34%), М3 вариант - 8 (10,67%), М4 вариант - 4 (5,33%), М5 вариант - 3 (4%), М6 вариант - 4 (5,33%),больных. В группе миелоидных лейкозов женщин 24 (32%), мужчин 28 (36%), лимфобластных лейкозов - женщин 10 (13,33%), мужчин 14 (18,67%). Больные других вариантов острого лимфобластного и миелоидного лейкозов, подтверждаемых в Тюменском областном гематологическом центре за наблюдаемый период, в настоящее исследование не включались.

Терапия проводилась в соответствии с протоколами Гематологического Научного Центра РАМН (директор - член-корреспондент РАМН, доктор мед. наук, профессор В.Г. Савченко.).

Ремиссия подтверждалась в соответствии с рекомендациями Гематологического Научного Центра перед каждым курсом консолидации ремиссии на основании нормо- или умеренно-клеточного костного мозга, содержании властных клеток не более 5% в костном мозге при нормальном соотношении других ростков, количества гранулоцитов не менее 1*109/л и тромбоцитов не менее 100* 109/л в периферической крови, а также отсутствием экстрамедуллярных очагов кроветворения.

Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц - доноров Тюменской областной станции переливания крови (16 мужчин и 14 женщин). Средний возраст контрольной группы составил 44,3±2,41 лет. Критериями включения в контрольную группу обследуемых лиц служили: отсутствие острых и хронических заболеваний, неотягощенная наследственность по заболеваниям крови и онкопатологии, отсутствие контакта с радиацией и мутагенами.

Специальные методы исследования

Экстракция липидов из крови методом Фолча-Блура, экстракция липидов из эритроцитарной массы (по Фолчу-Блюру), определение диеновых конъюга-тов полиненасыщенных жирных кислот (ДК) (метод И.Д. Стальной, 1977), определение содержания шиффовых оснований, флуориметрический метод О^.Я. В1с11аск, 1959), определение активности глутатион-з-трансферазы (0-5-Т) в эритроцитах, одновременное флюориметрическое определение витаминов А

и Е в сыворотке/плазме крови (Р.Ч. Черняускене с сотр., 1984), определение це-рулоплазмина в сыворотке крови иммунотурбидиметрическим методом (реактивы фирмы «SENTINEL», Италия).

Статистическая обработка результатов исследования

Для анализа данных использовались статистические пакеты STATISTICA (версия 6.0) и SPSS (версия 17.0). Практическое проведение расчетов и теоретическая интерпретация результатов осуществлялись согласно руководству О.Ю. Ребровой, 2002. При создании базы данных использован редактор электронных таблиц программы "Microsoft Excel 2000". Тестирование параметров распределения проводилось с помощью критериев Колмогорова-Смирнова, асимметрии и эксцесса. Непрерывные переменные представлены в виде М±т (среднее ± стандартная ошибка среднего) или Me (25-75%о) (медиана, интерк-вартильный размах (25 и 75 персентиль) в зависимости от вида распределения (параметрического или непараметрического). Для определения статистической значимости различий непрерывных величин в зависимости от параметров распределения использовались критерий U-критерий Манна-Уитни. Для оценки динамических изменений внутри групп применяли непараметрический критерий Вилкоксона (Wilcoxon) для парных величин. Для исследования зависимостей между переменными использовались коэффициент корреляции Пирсона и коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для проведения анализа выживаемости построены таблицы времен жизни и использованы оценки Каплана-Мейера и графики функции выживаемости. Для оценки факторов, влияющих на выживаемость в процессе терапии, проведен многомерный анализ соответствий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Особенности антиоксидантного профиля сыворотки крови и эритроцитов у больных с впервые выявленным острым лейкозом

Анализ результатов антиоксидантного профиля сыворотки и эритроцитов выявил снижение элементов антиоксидантной защиты (АОЗ) у больных с впервые выявленным OJ1 до начала программной полихимотерапии (ПХТ). В сравнении с контролем статистически достоверно снижаются показатели концентрации: общих фосфолипидов эритроцитов, ретинола, а-токоферола, церулоплазмина (р<0,05). В тоже время наблюдается достоверное повышение по отношению к контролю биохимических показателей: общего холестерина эритроцитов, диеновых коньюгат эритроцитов и мочи, Шиффовых оснований эритроцитов, активности Г-S-T (р<0,05), что свидетельствует об активации процесса пероксидации липидов (таблица 1).

При оценке показателей липидных компонентов мембран эритроцитов, процессов липопероксидации и АОЗ в зависимости от варианта ОЛ выявлено, что при всех изучаемых морфологических вариантах отмечается повышение процессов пероксидации и снижение в сыворотке крови витаминов, обладающих антиоксидантными свойствами (ретинол, а-токоферол). Проведенный сравнительный анализ выявил статистически достоверные

(р<0,05) различия концентрации общего холестерина мембран эритроцитов между вариантами заболевания. При ОЛЛ этот показатель выше, в то время как при ОМЛ он не имеет статистических различий с контролем. Так же не выявлено статистически значимых различий (р>0,05) показателя концентрации церулоплазмина в сыворотке у пациентов с не лимфобластными лейкозами, при лимфобластном варианте такие различия присутствуют (р<0,05) (Таблица 2).

Таблица 1

Показатели липидных компонентов мембран эритроцитов, процессов

липопероксндацни и АОЗ у больны» с впервые выявленными ОЛ

Показатели Контрольная группа (п=30) Больные ОЛ (п=75) Достоверность различий

Г-Б-Т (мкмоль/(мин*л)) 345±131 564,82±49,88 р<0,01

ЦП (мг/дл) 38,47±9,8 33,41 ±1,72 р<0,02

а-токоферол (мкМоль/л) 20,15±2,01 8,18±0,17 р<0,001

Ретинол (мкМоль/л) 1,78±0,1 0,89±0,02 р<0,001

ОФЛ эр. (мкмоль/мл) 4,02±0,05 2,2±0,08 р<0,001

ОХС эр. (мкмоль/мл) 2,99±0,1 3,57±0,13 р<0,03

ДК эр. (нмоль/мл) 47,39±2,51 142,13±4,52 р<0,001

ДК моча (нмоль/мл) 10,1 ±0,53 17,59±0,62 р<0,00[

ШО эр. (усл. ед.) 17,86±0,88 32,13±1,15 р<0,001

ШО моча (усл. ед.) 23,14±1,29 32,91 ±2,8 Н.д.

Примечание: р - достоверность различий с контрольной группой, двусторонний непараметрический V критерий Манна-Уитни

Таблица 2

Показатели липидных компонентов мембран эритроцитов, процессов липопероксндацни н АОЗ у больных с различными вариантами впервые

выявленных ОЛ

Показатели Контрольная группа (п=30) Больные ОЛ

ОМЛ (п=51) ОЛЛ (п=24)

Г-Б-Т (мкмоль/(мин*л)) 345±131 596,98±57,52* 496,46±97,14

ЦП (мг/дл) 38,47±9,8 33,79±1,81 32,63±3,84*

а-токоферол (мкМоль/л) 20,15±2,01 8,22±0,21* 8,1±0,28*

Ретинол (мкМоль/л) 1,78±0,1 0,87±0,02* 0,93±0,02*

ОФЛ эр. (мкмоль/мл) 4,02±0,05 2,1 ±0,08* 2,43±0,16*

ОХС эр. (мкмоль/мл) 2,99±0,1 3,41 ±0,15 3,89±0,21* **

ДК эр. (нмоль/мл) 47,39±2,51 140,25±4,85* 146,04±9,72*

ДК моча (нмоль/мл) 10,1 ±0,53 17,64±0,76* 17,49±1,09*

ШО эр. (усл. ед.) 17,86±0,88 33,08±1,39* 30,13±2,05*

ШО моча (усл. ед.) 23,14±1,29 32,47±3,38* 33,83±5,14

Примечание: * - достоверность различий с контрольной группой, двусторонний

непараметрический и критерий Манна-Уитни (р<0,05); ** — достоверность различий между независимыми группами, непараметрический метод сравнения Краске ла-Уоллиса (р<0,05).

Сравнительный анализ показателей липидных компонентов мембран эритроцитов, процессов липопероксидации и АОЗ в зависимости от пола больных ОЛ не выявил каких-либо различий по тендерному признаку (р>0,05). Наиболее выраженный дефицит липидных компонентов мембран эритроцитов зарегистрирован в возрастной группе от 36 до 50 лет, а наиболее высокая активность Г-Б-Т в старшей возрастной группе (старше 51 года), тогда как в других возрастных группах достоверных различий с контролем по данному показателю не наблюдалось.

Используемый в клинической гематологии индекс Карновского позволяет достаточно четко и с большой степенью объективности определить тяжесть проявлений опухолевой интоксикации (Переводчикова Н.И., 2005). В связи с этим нами был проведен сравнительный анализ показателей липидных компонентов мембран эритроцитов, процессов липопероксидации и АОЗ у больных впервые выявленным ОЛ с умеренной и значительной выраженностью интоксикационного синдрома (индекс Карновского соответственно 100-70 и менее 70 баллов). В обеих группах наблюдалось статистически значимое (р<0,05) изменение всех показателей кроме: общего холестерина мембран эритроцитов, Шиффовых оснований мочи. Данные показатели были достоверно выше (р<0,05) в группе с умеренной выраженностью интоксикационного синдрома относительно к группе контроля, так и к группе, где индекс Карновского был менее 70 баллов.

Учитывая высокую значимость геморрагического синдрома для продолжительности жизни больных с впервые выявленным ОЛ в изучаемой группе, был проведен анализ показателей липидных компонентов мембран эритроцитов, процессов липопероксидации и АОЗ при различной степени выраженности геморрагического синдрома. Наблюдалось достоверное снижение (р<0,05) показателей антиоксидантной защиты в обеих группах по отношению к контрольным показателям, однако достоверного отличия между группами не наблюдалось. В группе пациентов без проявления геморрагического синдрома выявлены статистически значимые различия (р<0,05) показателя общего холестерина эритроцитов с группой контроля и пациентов с проявлениями геморрагического синдрома, в то время как между этими группами различий не было.

Проявления вторичного иммунодефицита часто являются одним из первых клинических симптомов заболевания ОЛ, которые являются причиной обращения пациентов за медицинской помощью. В связи с этим нами проанализированы показатели липидных компонентов мембран эритроцитов, процессов липопероксидации и АОЗ у больных с наличием и отсутствием инфекционно-септического синдрома в дебюте ОЛ. Изменения показателей носят однонаправленный характер в анализируемых группах. Однако, необходимо отметить, что нами получены статистически значимые различия показателей активности Г-Б-Т и диеновых конъюгат мочи, в группе пациентов с инфекционно-септическим синдромом достоверно выше (р<0,05), чем при его отсутствии.

При проведении сравнительного анализа у пациентов с изолированной костномозговой пролиферацией и выраженным пролиферативным синдромом изучаемых показателей АОЗ с различной выраженностью пролиферации, выявлено, что высокая активность Г-Б-Т эритроцитов также была статистически значимо выше у больных с бластемией (р<0,05), которая отражает распространённость опухолевого процесса.

При проведении сравнительного анализа больных острым лейкозом в дебюте заболевания вне зависимости от тяжести анемического синдрома отмечается статистически достоверное (р<0,05) снижение по отношению к контролю биохимических показателей концентрации: общих фосфолипидов эритроцитов, ретинола, а-токоферола, в тоже время наблюдается достоверное (р<0,05) повышение по отношению к контролю биохимических показателей: диеновых коньюгат эритроцитов и мочи, Шиффовых оснований эритроцитов, что свидетельствует об активации процесса пероксидации липидов в обеих фуппах. В группе пациентов, не требующих гемотрансфузий, отмечается достоверное повышение (р<0,05) общего холестерина мембран эритроцитов как по отношению к контролю, так и к группе с уровнем гемоглобина менее 70 г/л. В то же время в группе пациентов с уровнем гемоглобина менее 70 г/л отмечалось статистически значимое снижение (р<0,05) уровня а-токоферола по отношению к контролю и группе, не требующей гемотрансфузий.

Особенности антиоксидантиого профиля сыворотки и эритроцитов на различных этапах химиотерапии ОЛ

Выявлена достоверная недостаточность уровня ферментативной АОЗ в сыворотке крови больных впервые выявленными острыми лейкозами в различные периоды заболевания острого лейкоза за счет статистически достоверного снижения уровня церулоплазмина по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,05), наибольшее снижение концентрации церулоплазмина в сыворотке наблюдалось у пациентов в период рецидива заболевания достоверно ниже по отношению к пациентам с первичной ремиссией (р<0,05) см. рис. I.

В то же время отмечается напряженность работы клеточного звена ферментативной АОЗ за счет статистически достоверного увеличения уровня активности Г-Б-Т по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,05), достигая дика активности в период индукционной терапии. Статистически достоверные изменения уровня активности Г-Б-Т (р<0,05) у больных с первичной ремиссией наблюдались в группах пациентов в период верификации диагноза и консолидационной терапии, что может быть связанно с постепенным компенсаторным увеличением активности Г-Б-Т с достижением пика в период индукционной терапии, с последующим постепенным исчерпанием компенсаторных резервов ферментативной активности.

В сыворотке крови больных ОЛ обнаружено статистически значимое снижение уровня антиоксидантов ретинола и а-ТФ по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,05). Снижение уровня антиоксидантов наблюдалось во все периоды течения ОЛ.

Рис. I. Ферментативный антиоксидантный профиль сыворотки крови и эритроцитов у больных ОЛ в различные периоды заболевания Примечание: * - достоверность различий с контролем (р<0,05);

**- достоверность различий по отношению к больным с первичной ремиссией (р<0,05).

Вместе с тем, в мембранах эритроцитов больных ОЛ в период верификации диагноза отмечается высокий, значительно превышающий показатели здоровых лиц (р<0,05), уровень концентрации первичных продуктов пероксидации липидов (ПОЛ) - диеновых конъюгат (ДК), обладающих наибольшими высокотоксичными свойствами в плане повреждения внутриклеточных органелл, мембранных липопротеидов, белков, ферментов трансмембранного транспорта. В период достижения первичной ремиссии ОЛ во время индукционной, консолидационной терапии, рецидива заболевания и противорецидивной терапии отмечается сохранение достоверно высоких показателей токсичных диеновых конъюгат (р<0,05). Также достоверно увеличивается элиминация почками диеновых конъюгат (р<0,05) с постепенным снижением этой способности.

Уровень конечных продуктов липопероксидации липидов - оснований Шиффа (ШО) у больных ОЛ во все периоды заболевания достоверно выше показателей контрольной группы (р<0,05). С одной стороны, непрерывное накопление в мембранных структурах ШО, представляющих собой необратимые «сшивки» диальдегидов со свободными аминогруппами мембранных белков, характеризует стадию дегенеративных изменений клеток. С другой стороны, высокий уровень ШО можно рассматривать как адаптивный процесс, направленный на элиминацию из клеток более токсичных метаболитов ПОЛ - ДК и МДА. В период консолидационной терапии ОЛ отмечается увеличение деструктивных процессов мембран эритроцитов, подтверждаемое достоверно высоким уровнем ШО, который выше показателей группы с первичной ремиссией (р<0,05). Во время проведения противорецидивной терапии деструктивные процессы наиболее выражены.

Элиминация с мочой конечных продуктов пероксидации липидов -оснований Шиффа у больных ОЛ во все периоды заболевания достоверно выше показателей контрольной группы (р<0,05). В период консолидационной терапии, рецидива ОЛ отмечается увеличение элиминации конечных продуктов пероксидации липидов мембран эритроцитов, подтверждаемое высоким уровнем ШО в моче, который достоверно выше показателей группы с первичной ремиссией (р<0,05) с незначительным снижением в период терапии рецидива заболевания. Полученные данные свидетельствуют об увеличении активности процессов липопероксидации мембранных липидов с наибольшей выраженностью в период рецидива ОЛ.

Основной точкой приложения нерегулируемой интенсификации процессов липопероксидации являются мембранные фосфолипиды, в связи с чем одновременно был исследован уровень основных структурных параметров мембран клеток - общих фосфолипидов и общего холестерина.

При манифестации ОЛ наблюдается резкое снижение пула общих фосфолипидов мембран эритроцитов больных (р<0,05). При достижении первичной ремиссии заболевания, во время проведения индукционной, консолидационной терапии, развитии рецидива заболевания и противорецидивной терапии сохраняется дефицит общих фосфолипидов (ФЛ). Отмечается достоверное снижение концентрации общего холестерина (ХС) мембран эритроцитов больных ОЛ во время консолидационной терапии, а также увеличение концентрации общего ХС мембран эритроцитов больных ОЛ во время рецидива заболевания и противорецидивной терапии (рис. 2).

Рис. 2. Липидный спектр мембран эритроцитов ОЛ в различные периоды заболевания

Примечание: * - достоверность различий с контролем (р<0,05);

** - достоверность различий по отношению к больным с первичной ремиссией (р<0,05).

12

Полученные данные в период рецидива заболевания и противорецидивной терапии свидетельствуют о снижении механизмов эстерификации ХС, направленных в норме на выведение из мембранных структур избытков ХС и сохранение агрегатных свойств липидного бислоя клеточных мембран в связи с дефицитом мембранных фосфолипидов. Увеличение концентрации ХС в липидном бислое клеточных мембран можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на поддержание стабильности липидного матрикса в условиях дефицита фосфолипидов. Однако, обогащение мембран эритроцитов ХС ведет к значительному возрастанию ригидности клеточных мембран, ухудшая основные параметры клеток, в частности кислородно-транспортную функцию красных клеток крови, их деформируемость, а следовательно и реологические свойства крови, а также функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Данный факт демонстрирует компенсаторное увеличение концентрации ХС в липидном бислое мембран эритроцитов, направленное на поддержание стабильности липидного матрикса в условиях глубокого дефицита мембранных фосфолипидов.

Таким образом, в разные периоды течения ОЛ можно констатировать наличие глубоких изменений липидной архитектоники мембран эритроцитов, проявляющихся дефицитом общих фосфолипидов в условиях нерегулируемой интенсификации процессов пероксидации липидов. У больных наблюдается достоверно избыточное накопление первичных продуктов липопероксидации мембранных липидов - диеновых конъюгат на всех этапах с наибольшей выраженностью в период консапидационной терапии ОЛ и постепенным снижением компенсаторных механизмов элиминации. При развитии рецидива заболевания наблюдается наиболее выраженное снижение активности ферментативного антиоксидантного профиля сыворотки и эритроцитов на фоне сохраняющегося глубокого некомпенсированного дефицита неферментативного звена антиокси-дантной защиты.

Прогностическая значимость активности глутатион-в-трансферазы эритроцитов при остром лейкозе

Одной из важнейших характеристик, описывающих течение острого лейкоза, является продолжительности жизни пациентов с момента поступления в специализированный стационар, где начинается самый важный и ответственный этап лечения - программная полихимиотерапия, которая сопряжена с высокой летальностью больных.

С целью изучения этого показателя проводился анализ выживаемости. Для оценки выживаемости использовалось построение таблиц времён жизни и эквивалентный им критерий Каплана-Мейера, достоверность различий определялась с помощью критерия Гехана-Вилкоксона. В оценку включено 75 допустимых наблюдений. Из них 50 - это полные, завершённые исследования (67,57%) и 24 -неполные, цензурированные наблюдения (32,43%). На сроке наблюдения до 100 дней отмечается максимальная смертность, обусловленная прежде всего ранней летальностью на фоне проведения индукционной полихимиотерапии (до 6 недель

от момента начала лечения), первичной резистентностью к проводимой химиотерапии, геморрагическими осложнениями и развитием инфекционно-септических осложнений в период миелотоксичеекого агранулоцитоза. Ранее нами было установлено, что в дебюте острого лейкоза у больных выявлено статистически достоверное увеличение активности Глутатион-Б-трансферазы в эритроцитах периферической крови, превышающее норму практически вдвое по отношению к контрольной группе. Однако в ходе исследования выявлено, что у 18 больных повышение активности Глутатион-5-трансферазы превышало 95%-й доверительный интервал средних величин (>752 мкмоль/мин*л) для группы больных острым лейкозом, у 27 больных этот показатель не превышал 214 мкмоль/ мин*л, что является нижней границей 95%-го доверительного интервала, но только для контрольной группы, у 30 больных показатель активности Глутатион-8-трансферазы находился в пределах от 214 до 752 мкмоль/мин*л. Сравнение времён жизни больных с впервые выявленным острым лейкозом показало статистически значимое отличие продолжительности жизни в группах, в которых в дебюте заболевания отмечалось превышение активности Глутатион-Б-трансферазы >95% доверительного интервала средних величин, как в большую, так и в меньшую сторону, а также в группе больных, у которых этот показатель не выходил за указанные пределы.

I"

со

к 0.6 §

I"

|м

0.3

Кумулятивная доля выживших (Каплам-Мвивр) = 6.05316 сс о 3 р . .04850 " Зааеци. - Цвкэурир.

1 1 1 ' 1>:-1..........

.................

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1000

- (ЗБТ<214

-- <35Т214.752 ••■■ вЭТ» 752

Время, дни

Рис. 3. Влияние исходной активности глутатион-Б-трансферазы в эритроцитах в дебюте ОЛ на общую выживаемость В первые сто дней от момента поступления в стационар, что соответствует времени проведения индукционной полихимиотерапии и развитию ранних осложнений ХТ, кумулятивная доля выживших во всех группах не отличается. Однако, начиная с этого момента (от 100 дней и далее), выявляется статистически значимое (р<0,05) отличие продолжительности жизни в группах больных с

изначально "очень низкой" и "крайне высокой" ферментативной активностью Глутатион-Б-трансферазы в сравнении с группой больных, у которых активность в-Б-Т составляла от 214 до 752 мкмоль/мин*л, что трактовалось нами как "умеренная ферментативная активность". Следует отметить, что шансы дожития были значительно выше в группе больных с "умеренной" ферментативной активностью. Из 30 больных, вошедших в эту фуппу 19 человек живы (цензурируемые случаи), 11 умерло, тогда как из 27 больных с низкой ферментативной активностью 16 человек к моменту окончания исследования умерло, а в группе больных (18 человек) с высокой ферментативной активностью умерло 10 больных. Таким образом, процент выживания в группе больных с уровнем С8Т<214 мкмоль/мин*л составил 37,25. В группе с уровнем Б8Т 214 - 752 мкмоль/мин*п -62,71% и в группе с уровнем 0-8-Т>752 мкмоль/мин*л - 44,44% соответственно.

Гистограмма суммы «младое

Число допустимы. нлОлш.кийі т*

и»ц«н . і 51 [ 6B.SC«! I "4 ( ?:.00%|

Ки-»Ы|«т - й.С^іЬЧ сс ш 2 в • .ОАЙЬО

500 400 ЭСО 200 100 О -100 -200 -300

1

GST<214 GST 214-752 GST>752

Рис. 4. Гистограмма суммы вкладов выживаемости в группах больных ОЛ в

зависимости от различной активности глутатион-8-трансферазы. Примечание: гистограммы вычисляются с помощью процедуры Ментела, Mantel, 1967

Наибольший вклад в долю выживших вносит группа больных умеренной ферментативной активностью и, наоборот, явный отрицательный вклад в общую выживаемость вносят больные как с очень низкой, так и с крайне высокой ферментативной активностью Глутатион-8-трансферазы.

Таким образом, активность О-Б-Т тесно взаимосвязана с клиническими проявлениями ОЛ. Высокие показатели исследуемого фермента, отмечающиеся ещё в период манифестации заболевания до выполнения программной полихимиотерапии, могут играть определённую роль в предопределении результата индукции ремиссии, а также долгосрочной выживаемости больных с впервые выявленным острым лейкозом. При оценке функции выживания установлено, что наибольшие шансы выживания имеются у пациентов с умеренной активностью глутатион-Б-трансферазы эритроцитов (214 - 752 мкмоль/мин*л) в дебюте заболевания.

Одновременно проведено сравнение времён жизни больных с впервые выявленным ОЛ до начала выполнения ПХТ в группах больных, у которых в дебюте заболевания отмечалась крайне низкая концентрация церулоплазмина, выходящая за рамки 95% доверительного интервала средних величин (< 18,5 мг/дл и >48,3 мг/дл соответственно) и в группе больных, у которых концентрация церулоплазмина находилась в пределах 18,5 -48,3 мг/дл.

Кумулятивная доля выживт« (Каппан-Мвйвр) Р=0.06

о Зав ерш. + Цвнэурир.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Время, дж

----18.5-48,3

Рис. 5. Влияние исходного уровня Церулоплазмина в сыворотке крови в дебюте ОЛ на общую выживаемость Достоверного различия выживаемости пациентов от исходного уровня церулоплазмина не выявлено, хотя можно отметить различия, близкие к статистически значимым (р=0,06) в промежутке времени от 100 до 600 дня. Далее эти различия нивелируются, что можно связать с нарастающей токсической нагрузкой на печень с последующим снижением ее функций, в том числе белковосинтетической.

ВЫВОДЫ

1. Ферментативное клеточное звено АОЗ у больных с впервые выявленными острыми лейкозами в период манифестации заболевания характеризуется избыточной активностью глутатион-8-трансферазы эритроцитов на фоне глубокого дефицита токоферола и ретинола и снижения уровня сывороточного звена АОЗ церулоплазмина, как при лимфобластном, так и при мие-лобластном варианте острого лейкоза.

2. Нарастание активности глутатион-Б-трансферазы тесно взаимосвязано с прогрессированием инфекционно-септического и пролиферативного синдрома. Наиболее значимое угнетение активности сывороточного ферментативного компонента АОЗ церулоплазмина при этом отмечается у больных острыми лейкозами в возрасте старше 51 года.

3. В период индукционной полихимиотерапии при развитии миелотоксического агранулоцитоза наблюдается дальнейшее нарастание активности G-S-T в эритроцитах периферической крови на фоне неконтролируемой активации процессов липопероксидации.

4. Рецидив ОЛ характеризуется одновременным снижением активности G-S-T и глубоким дефицитом церулоплазмина в сыворотке крови.

5. В ходе проспективного анализа установлено в равной степени неблагоприятное влияние как глубины исходного дефицита активности ферментативного клеточного звена АОЗ в дебюте заболевания, так и его чрезмерной активности у больных острым лейкозом на результаты индукционной терапии, что проявляется ассоциированием развития ранних летальных исходов и первичной резистентности OJ1 к проводимой противоопухолевой терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве дополнительных критериев объективизации выраженности пролиферативного и инфекционно-септического синдрома предлагается определять концентрацию церулоплазмина в сыворотке крови и активность глутатион-Б-трансферазы в эритроцитах в дебюте заболевания.

2. При рецидиве острого лейкоза в качестве дополнительного критерия неблагоприятного исхода рекомендуется считать низкий уровень церулоплазмина в сыворотке крови.

3. Дополнительным критерием высокого риска летальных исходов и долгосрочной выживаемости больных является в равной степени как крайне высокий, так и крайне низкий уровень активности глутатион-Б-трансферазы эритроцитов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оценка качества жизни больных в ремиссии острого лейкоза / Юмачиков А.Н., Фролова О.И., Платицын В.А., Делиханова М.Н., Ксензова Т.И., Хворостенко Л.Б.. Салов P.M. // Сборник тезисов, докладов «Человек и лекарство Урал-2007». - Тюмень, 2007, с. 114.

2. Характеристика синдрома эндогенной интоксикации у больных с впервые выявленным острым лейкозом / Делиханова М.Н., Платицын В.А., Фролова О.И., Юмачиков А.Н., Хворостенко Л.Б. // Материалы V терапевтического форума "Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов". -Тюмень, 2008, с.28.

3. Прогностическая значимость выраженности синдрома эндогенной интоксикации у больных с впервые выявленным острым лейкозом / Юмачиков А.Н., Хворостенко Л.Б.. Делиханова М.Н., Фролова О.И., Платицын В.А. // Материалы V терапевтического форума "Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов". - Тюмень, 2008, с.70.

4. Клинико-патогенетические особенности синдрома эндогенной интоксикации в дебюте острого лейкоза / Делиханова М.Н. Фролова О.И., Платицын В.А., Юмачиков А.Н., Хворостенко Л.Б.. Иларионова Л.А. // Материалы Конгресса терапевтов "Урал - 2009" к 100-летнему юбилею Российского научного медицинского общества терапевтов "Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов". - Тюмень 2009, с. 45.

5. Влияние параметров сиццрома эндогенной интоксикации на исход острого лейкоза / Де-лиханова М.Н., Фролова О.И., Юмачиков А.Н., Хворостенко Л.Б.. Платицын В.А. // Материалы Конгресса терапевтов "Урал - 2009" к 100-летнему юбилею Российского научного медицинского общества терапевтов "Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов". - Тюмень 2009, с. 92.

6. Сравнительная характеристика клинической манифестации острых лейкозов в Тюменской Области в 1996-2009гт. / Фролова О.И., Платицын В.А., Ксензова Т.И., Юмачиков А.Н., Хворостенко Л.Б.. Делиханова М.Н. // Материалы Конгресса терапевтов "Урал -2009" к 100-летнему юбилею Российского научного медицинского общества терапевтов "Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов" - Тюмень 2009, с. 123.

7. Особенности синдрома эндогенной интоксикации у больных с впервые выявленными острыми лейкозами / Делиханова М.Н., Хворостенко Л.Б.. Платицын В.А., Фролова О.И. // Медицинская наука и образование Урала. №1 - 2010, с. 7 - 12.

8. Роль синдрома эндогенной интоксикации в формировании осложнений индукционной полихимиотерапии у больных впервые выявленным острым лейкозом / Платицын В.А., Фролова О.И., Юмачиков А.Н., Делиханова М.Н., Хворостенко Л.Б. // Российский национальный конгресс «Человек и лекарство. Урал- 2010», с. 74-75.

9. Характеристика ферментативной активности глутатион^-трансферазы у больных острым лейкозом / Платицын В.А., Хворостенко Л.Б. // Российский национальный конгресс «человек и лекарство Урал- 2010» с. 153.

10. Влияние выраженности синдрома эндогенной интоксикации на развитие осложнений индукционной программной полихимиотерапии у больных впервые выявленным острым лейкозом / Делиханова М.Н., Хворостенко Л.Б.. Платицын В.А., Фролова О.И. // Медицинская наука и образование Урала. №3 - 2011, с. 64 - 67.

11. Прогностическая значимость активности глутатион-5-трансферазы эритроцитов при остром лейкозе / Делиханова М.Н., Хворостенко Л.Б.. Платицын В.А., Фролова О.И. // Медицинская наука и образование Урала. №3 - 2011, с. 94 - 97.

12. Особенности антиоксидантного профиля сыворотки и эритроцитов при острых лейкозах / Делиханова М.Н., Хворостенко Л.Б.. Платицын В.А., Фролова О.И. // Российский биотерапевтический журнал №4 - 2011, с. 71 -76.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОЗ - антиоксидантная защита

ДК - диеновые коньюгаты

МДА - малоновый диальдегид

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ОЛ - острый лейкоз

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ОФЛ - общие фосфолипиды

ОХС - общий холестерин

ПОЛ - перекисное окисление липилов

СОД - супероксидаисмутаэа

ШО - Шиффовы основания

ЦП - церулоплазмин

G-S-H - восстановленный глутатион

GSSG - окисленный глутатион

G-S-T - глутатион-Б-трансфераза

ХВОРОСТЕНКО ЛЕВ БОРИСОВИЧ

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО АНТИОКСИДАНТНОГО ПРОФИЛЯ СЫВОРОТКИ И ЭРИТРОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ С ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННЫМ ОСТРЫМ ЛЕЙКОЗОМ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 18 ноября 2011 г. Уел .печ. л. 1.0 Бумага Гознак №1 Тираж 100 экз. Заказ № 6687 Отпечатано в ОАО «НИИПлесдрев» г. Тюмень, ул. Одесская, 52А

2011248221

2011248221