Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Клинико-патогенетический анализ значения повреждений структуры ДНК и апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных острыми кишечными инфекциями в динамике заболевания

На правах рукописи

КРАСАВИНА Эмилия Николаевна

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЗНАЧЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ СТРУКТУРЫ ДНК И АПОПТОЗА ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ КИШЕЧНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ В ДИНАМИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

14.00.10 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва-2006

003067518

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова Росздрава

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Малов Валерий Анатольевич Белушкина Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Беляева Наталья Михайловна

Токмалаев Анатолий Карпович

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится у/Лл

2007 г. в часов, на заседании диссертационного совета Д.208.040.05 в Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова (119992, г. Москва, Трубецкая ул., дом 8, строение 2).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной медицинской библиотеке ГОУ ВПО Московской Медицинской академии им. И.М. Сеченова Росздрава (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, дом 49). Автореферат разослан

» 4 ¿Ь 2006 г.

Учёный секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Волчкова Елена Васильевна

Актуальность исследования

Острые кишечные инфекции (ОКИ) остаются одной из актуальных проблем практического здравоохранения во всех без исключения странах мира в связи с высоким уровнем заболеваемости и возможностью развития осложнений [Ющук Н.Д. и соавт., 2002; Лобзин Ю.В. и соавт., 2001].

Общеизвестно, что у больных ОКИ, несмотря на полиэтиологичность, в патогенезе инфекционного процесса тяжесть состояния обуславливается совокупностью проявлений диарейного и интоксикационного синдромов [Пак С.Г и соавт. 1986; Покровский В.И. и соавт., 1983]. В клинической картине инфекционных болезней синдрому интоксикации (СИ) отводится первоочередное значение.

СИ является универсальным клиническим синдромокомплексом, развитие которого типично для большинства инфекционных заболеваний, а степень его выраженности определяет тяжесть и, соответственно, исход заболевания [Пак С.Г, 2005].

На сегодняшний день установлена ведущая роль эндогенных медиаторов (ЭМ) и в частности цитокинов в регуляции ответной реакции организма на бактериальную инвазию, однако механизмы, определяющие жизненный цикл ре-гуляторных и эффекторных клеток организма все еще находятся на стадии активного изучения. Поэтому регуляция процесса клеточной гибели или апоптоза в норме и при патологии в настоящее время является одной из центральных проблем медико-биологической науки и интенсивно изучается во всем мире.

Появление новых методических возможностей позволило регистрировать биохимические показатели клеток, находящихся на самых ранних стадиях программированной гибели (ПГ) Так, по опубликованным данным [Змызгова A.B., Москалева Е.Ю, 1999] апоптоз лейкоцитов периферической крови при ряде заболеваний, в том числе и инфекционной природы, связан с накоплением повреждений структуры ДНК клеток, представленных преимущественно в виде однонитевых разрывов (ОР), являющихся ранними проявлениями этого процесса.

При инфекционной патологии апоптоз может играть ключевую роль в исходе системной воспалительной реакции, поскольку посредством ПГ угнетается локальная тканевая деструкция, уменьшаются дальнейшие воспалительные реакции, рекрутирование иммунных клеток, а также облегчается конечный этап формирования врожденного иммунного ответа, обусловленный ограничением провоспалительного ответа. В частности, регуляция апоптоза полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) устанавливает тонкий баланс между их эффективным функционированием в качестве одного из звеньев врожденного иммунитета и своевременным безопасным удалением этих потенциально опасных клеток [Maianski N.A.et al., 2003; Parker L.C. et al., 2005].

Целью настоящего исследования явился комплексный клинико-патогенетический анализ значения повреждений структуры ДНК, представленных в виде однонитевых разрывов, и апоптоза лейкоцитов периферической крови в развитии синдрома интоксикации у больных ОКИ в динамике инфекционного процесса.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Изучить динамику показателей ОР ДНК и апоптоза ПМЯЛ и лимфоцитов периферической крови в зависимости от тяжести и варианта течения ОКИ.

2. Исследовать состояние показателей ОР ДНК и апоптоза ПМЯЛ, лимфоцитов периферической крови у больных гастроинтестинальной формой сальмонел-леза в динамике заболевания.

3. Изучить динамику показателей ОР ДНК и апоптоза ПМЯЛ и лимфоцитов периферической крови у больных пищевой токсикоинфекцией неуточненной этиологии.

4. Оценить динамику состояния показателей ОР ДНК и апоптоза ПМЯЛ и лимфоцитов периферической крови у больных острой дизентерией.

5. Провести корреляционный анализ значений ОР ДНК и апоптоза лейкоцитов с клинико-лабораторными параметрами синдрома интоксикации в динамике ОКИ.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование показателей апоптоза и степени повреждения ДНК лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови у больных ОКИ различной этиологии в динамике развития инфекционного процесса.

Впервые у больных ОКИ обнаружены закономерные изменения показателей повреждения ДНК, представленных в виде ОР, и апоптоза лейкоцитов периферической крови в зависимости от тяжести течения и периода заболевания.

Впервые показано, что у больных ОКИ различной этиологии во все периоды заболевания наблюдаются достоверно более высокие показатели повреждения структуры ДНК ПМЯЛ периферической крови по сравнению с контрольной группой.

Впервые выявлено, что у больных ОКИ нейтрофилы периферической крови в острый период заболевания в большей степени, чем лимфоциты подвержены апоптозу.

Установлено, что у пациентов выявляются однотипные изменения в показателях программированной гибели лейкоцитов периферической крови независимо от этиологии ОКИ.

У больных ОКИ в стадии реконвалесценции установлена достоверная корреляция между параметрами начальных и завершающих проявлений программированной гибели лейкоцитов периферической крови, что свидетельствует о наличии в циркуляторном русле как клеток в состоянии апоптоза, так и коммитированных к нему.

Впервые отмечено, что у больных ОКИ на высоте клинических проявлений интоксикации получена достоверная корреляция между начальными проявлениями программированной гибели (ОР ДНК) нейтрофилов и лейкоцитарным индексом интоксикации (ЛИИ).

Практическая ценность работы

На основании проведенных исследований выявлена взаимосвязь между показателями начальных проявлений апоптоза лейкоцитов периферической крови больных ОКИ различной этиологии в виде ОР ДНК и объективным критерием выраженности интоксикационного синдрома, представленным в виде интегрального показателя - ЛИИ.

Результаты исследования ОР ДНК и апоптоза лейкоцитов периферической крови больных ОКИ определили возможность их использования в качестве дополнительного критерия при оценке тяжести и длительности течения инфекционного процесса.

Полученные результаты позволяют расценивать регистрацию повреждений ДНК, представленных в виде ОР, в качестве доступного и адекватного теста для выявления клеток на ранних стадиях апоптоза у больных ОКИ.

Применение используемых нами методик может быть рекомендовано при изучении особенностей патогенеза СИ и при других инфекционных нозологиях, в качестве дополнительного инструмента, в том числе для определения роли и значения функциональной активности ПМЯЛ, как важнейшего показателя системы неспецифического иммунитета.

Положения, выносимые на защиту

У большинства больных независимо от этиологии ОКИ отмечалось возрастание показателей ОР ДНК нейтрофилов периферической крови в зависимости от периода заболевания.

У больных ОКИ отмечено снижение показателей апоптоза ПМЯЛ в период разгара заболевания по сравнению с показателями группы контроля. В период ранней реконвалесценции у пациентов ОКИ выявлено повышение показателей ОР ДНК и апоптоза ПМЯЛ не только по сравнению с показателями в группе контроля но, также в сопоставлении с начальными величинами.

Отмечено различие в регистрируемых показателях (ОР ДНК и апоптоза) ПМЯЛ в зависимости от тяжести инфекционного процесса у больных ОКИ.

В период ранней реконвалесценции, при купировании основных проявлений заболевания показатели апоптоза нейтрофилов периферической крови у

больных ОКИ достигали своего пика, свидетельствуя о сохраняющихся пато-морфологических реакциях.

Отмечено достоверно значимое увеличение значений апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов ОКИ при среднетяжелом течении в период разгара, заболевания, с последующим достоверным снижением в период реконвалесценции, но с сохраняющимся превышением этого показателя от группы контроля.

Определена взаимосвязь объективного интегрального показателя СИ -ЛИИ с показателями повреждения структуры ДНК нейтрофилов, в виде ОР у больных ОКИ.

' Внедрение результатов работы

Результаты настоящего исследования используются в работе 11 инфекционного отделения ГКБ № 4. Материалы работы включены в учебный курс кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова и используются в учебном процессе при преподавании данного раздела.

Апробация работы

Основные положения и результаты исследования представлены на юбилейной научно-практической конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное-обеспечение инфек-тологии», посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова (Москва 22-23 мая 2003г.); III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 20-24 января 2004г.); 1-ой Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва 26-28 октября 2004г.); VII Российском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Нижний Новгород, 25-27 октября 2006г.); Российском Медицинском Форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва 18-20 октября 2006г.), а также неоднократно обсуждались на научно-практических конференциях кафедры инфекционных болезней. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекцион-

ных болезней, лаборатории по изучению токсических и септических состояний и кафедры биохимии ММА им. И.М. Сеченова 29 июня 2006г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на'/^-^лраницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, У глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 182 источника. Полученные результаты иллюстрированы 31 таблицей, 9 диаграммами и 12 рисунками, 6 выписками из историй болезни.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клиническое обследование больных проводилось в период с 2003 по 2004 гг. включительно на базах кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова (зав. кафедрой - д.м.н., профессор С.Г. Пак) в отделениях острых кишечных инфекций в КИБ № 2 (глав, врач - В.А. Мясников), в ГКБ № 4 (глав, врач - С.К. Романов). Исследование ОР ДНК и апоптоза лейкоцитов периферической крови больных проводилось в лаборатории молекулярной биологии и биохимии НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова.

В соответствии с целью исследования под нашим наблюдением находился 81 пациент ОКИ: 43 женщины (53,1%) и 38 мужчин (46,9%). Все пациенты были в возрасте от 16 до 80 лет, из них в возрасте от 20 до 40 лет - 52 пациента (64,2%), до 20 лет - 11 больных (13,6%), от 40 до 65 лет - 12 больных (14,8%), лица старше 65 лет составили 7,4%. Средний возраст обследованного контингента составил 34 года.

Сопутствующие заболевания на основании анамнестических данных выявлялись у 28 больных (34,6%), из них у 23 пациентов обнаруживалась патология со стороны желудочно-кишечного тракта, вне стадии обострения.

Критериями исключения больных из исследования служили

ВИЧ-инфекция, хронические вирусные гепатиты, сопутствующие терапевтические заболевания в стадии обострения, а также прием больными противовирусных, иммуномодулирующих и гормональных препаратов в течение последнего года.

Этиология заболевания и клинический диагноз устанавливались на основании данных клинического наблюдения, эпидемиологического анамнеза, лабораторных исследований, включавших бактериологические и серологические (РИГА с шигеллёзными и сальмонеллёзными диагностикумами) анализы. Определение степени тяжести ОКИ проводили согласно разработанным клинико-диагностическим критериям в зависимости от установленной нозологии [Покровский В.И.,1978]. Нами было обследованы пациенты с легким и среднетя-желым течением ОКИ.

Распределение наблюдаемых больных по нозологическим формам, вариантам течения и тяжести заболевания ОКИ представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Распределение наблюдаемых больных по тяжести течения заболевания.

Варианты тяжести течения (абс/отн)

Нозологическая форма легкое среднетяжелое

Сальмонеллез, гастроинтести- 6 25

нальная форма (ГФС), п=31 (19,4%) (80,6%)

Пищевые токсикоинфекции 15 13

(ПТИ), п=28 (53,6%) (46,4%)

Острая дизентерия (ОД), п=22 7 15

(31,8%) (68,2%)

Итого, п= 81 28 53

(34,6%) (65,4%)

У обследованных нами больных было диагностировано три варианта течения ОКИ: гастроэнтеритический (ГЭ), гастроэнтероколитический (ТЭК) и ко-литический (таблица 2).

Таблица 2. Варианты течения ОКИ у наблюдаемых больных.

Нозологическая форма Варианты течения (абс/отн)

ГЭ ГЭК колитический

ГФС (п=31) 14 (17,3%) 17(21,0%) -

ПТИ (п=28) 20 (24,7%) 8 (9,9%) -

ОД (п=22) - 12 (14,8%) 10(12,3%)

Итого 34 (42%) 37 (45,7%) 10 (12,3%)

Лечение больных осуществляли в соответствии с общепринятыми рекомендациями [Бродов Л.Е., Ющук Н.Д., 1997].

Группа контроля, состоящая из 20 человек, была представлена практически здоровыми донорами, сопоставимыми по полу и возрасту с обследованными пациентами, в соответствии с критериями исключения.

Забор крови для выполняемых исследований осуществляли дважды: при поступлении больных в стационар, в период разгара заболевания (1-3 сутки от начала болезни) и в период ранней реконвалесценции (на 5-7 сутки заболевания), после проведенного лечения. Забор венозной крови у пациентов производился утром, натощак, до начала лечебно-диагностических процедур.

Выделение моионуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов из периферической крови больных ОКИ.

Лимфоциты выделяли из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования в растворе фиколла-пак (р=1,077 г/мл). Гранулоциты получали из фракции клеток, оседающих на дно пробирки, при центрифугировании в градиенте фиколла—пак. Гранулоциты очищали от эритроцитов методом осмотического шока в ледяной бане [Ferrate A., Thong Y.,1978].

Оценка степени повреждения ДНК лейкоцитов проводилась с помощью модифицированного прямого флуориметрического метода с бромистым этидием в качестве флюорофора [Birnboim Н.С., 1981]. Измеряли интенсивность флуоресценции ДНК - лизатов проб: (Т) - не подвергшихся щелочной денатурации, (Р) - после ограниченного щелочного лизиса в стандартных условиях (1 час инкубации лизата клеток в щелочном растворе при температуре 15°С), а также (В) - фоновую флуоресценцию проб с полностью денатурированной ДНК.

В дальнейшем рассчитывали величину (Д), в %, соответствующую доле двунитевой ДНК в стандартных условиях лизиса, по формуле: Д = (Р-В)/(Т-В)х100%, где Т, Р и В - средние показатели интенсивности флуоресценции соответствующих проб. Повреждение структуры ДНК, представленное в виде однонитевых разрывов (ОР) ДНК, в % определяли по формуле: ОР=ЮО-Д. Величина ОР использовалась в качестве непосредственного показателя для количественной оценки степени повреждения ДНК клеток; при этом (ОР1)- показатели однонитевых разрывов ДНК клеток периода разгара заболевания, (ОР2)-показатели однонитевых разрывов ДНК клеток периода реконвалесценции.

Регистрация апоптоза лейкоцитов осуществлялась с помощью проточной цитофлуориметрии после окрашивания ДНК йодистым пропидием в качестве флуорохрома и измерения процента клеток в состоянии апоптоза на ци-тофлуориметре Epics XL-2 [Gahon A J. et al., 1995].

Клетки в концентрации 1 млн./мл фиксировали в 70% ледяном этаноле в течение 30-60 мин. при 4°С. Затем клетки дважды отмывали от этанола в фос-фатно-солевом буфере и ресуспендировали в 1 мл ДНК-окрашивающего реагента в течение 1 часа при комнатной температуре. Окрашенные клетки немедленно анализировали на проточном цитофлуориметре при длине волны возбуждения 488 нм и длине волны эмиссии 680 нм. Процент клеток в состоянии апоптоза (гиподиплоидных клеток со сниженной по сравнению с диплоидными флуоресценцией) подсчитывали по программе STAT PACK, анализируя флуоресценцию не менее 20 000 клеток в каждом образце.

Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) рассчитывали по формуле: ЛИИ = (4М+ЗЮ+2П+С) * (Пл + 1) / (Л+МО) * (Э+1) [Кальф-Калиф Я.Я., 1950] на основании результатов общего анализа крови. Где (М)-миелоциты, (Ю)-юные нейтрофилы, (П)-палочкоядерные нейтрофилы, (С)-сегментоядерные нейтрофилы, (МО)-моноциты, (Э)-эозинофилы, (Л)-лимфоциты, (Пл)-плазматические клетки.

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы «Epi Info 5,0», с использованием метода дисперсионного анализа. Для протяженных переменных рассчитывали минимальное и

максимальное значения, средние величины, их ошибки и выборочное среднеквадратичное (стандартное) отклонение. Полученные результаты представлены в диссертации в таблицах в виде средних значений (М) ± ошибка среднего, %. Достоверность различия средних значений оценивалась с помощью теста One Way ANOVA. Уровень значимости менее 0,05 рассматривался как статистически достоверный (вероятность критерия р более 95%). Взаимосвязь оцениваемых параметров характеризовалась с использованием коэффициента корреляции Пирсона (г), статистически значимыми считали значения при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что у всех обследованных больных ОКИ в период разгара заболевания на высоте проявлений СИ отмечалось статистически достоверное возрастание показателей ОР1 ДНК нейтрофилов, по сравнению с показателями ОР ДНК клеток группы контроля.

У больных при легком течении заболевания показатели ОР1 ДНК составили 15,31±1,21%, при среднетяжелом течении ОКИ - 21,24±1,13%, в группе контроля соответственно -10,79±1,25%, р<0,05.

Одновременное исследование апоптоза нейтрофилов у пациентов ОКИ в 1-3 дни болезни выявило, что на высоте проявлений клинических симптомов заболевания показатели апоптоза у больных, как с легким (4,39±0,34%), так и среднетяжелым течением ОКИ (4,58±0,24%) оказывались на достоверно более низких значениях, чем в группе контроля (5,88±0,38%), р=0,039.

В динамике заболевания на 5-7 день болезни у реконвалесцентов ОКИ нами было отмечено дальнейшее увеличение значений ОР2 ДНК ПМЯЛ до 22,79±1,39% при легком течении и до 28,71±1,4% при среднетяжелом течении заболевания, с достоверным превышением показателей ОР ДНК группы контроля и значений начального периода в каждой из групп (р<0,001).

При этом показатели апоптоза ПМЯЛ у реконвалесцентов ОКИ также возрастали по сравнению с начальными значениями и величинами группы контроля (р<0,001). У больных ОКИ легкого течения эти показатели составили-9,71 ±0,22%,тогда как при среднетяжелом течении заболевания отмечались максимальные значения ПМЯЛ в состоянии апоптоза - 14,12±0,18%.

При изучении ОР ДНК лимфоцитов пациентов получено, что величины ОР ДНК клеток и в период разгара заболевания и при ранней рекон-валесценции независимо от тяжести течения ОКИ регистрировались практически на одних цифрах с контрольными значениями. Так при легком течении ОКИ ОР1 ДНК лимфоцитов составили 14,77±1,8%, ОР2 ДНК - 14,52±1,28%,; при среднетяжелом течении заболевания ОР1 ДНК лимфоцитов достигали 18,62±1,48%, ОР2 ДНК - 14,59±0,67, в контрольной группе - 14,22±1,48% (р=0,128).

При изучении показателей апоптоза лимфоцитов получено, что в начальном периоде ОКИ у пациентов и при легком, и при среднетяжелом течении заболевания отмечалось увеличение клеток в состоянии апоптоза (3,25± 0,52% и 5,11±0,62%, соответственно) по сравнению с показателями контрольной группы (1,03±0,15%), р=0,002. Интересно, что в динамике заболевания у реконвалес-центов ОКИ легкого течения средние значения показателей апоптоза лимфоцитов регистрировались практически на тех же цифрах (3,23±0,61), что и в 1-3 день болезни, тогда как у больных при среднетяжелом течении снижались до 2,51±0,38, однако превышали значения группы контроля в 2 раза.

На основании полученных данных можно предположить, что несмотря на выявляемую общую закономерность в изменении изучаемых показателей, у пациентов при среднетяжелом течении ОКИ отмечались достоверно более высокие показатели ОР ДНК ПМЯЛ, по сравнению с соответствующими значениями у больных ОКИ легкого течения как в период разгара, так и при ранней ре-конвалесценции. Следовательно, степень повреждений структуры ДНК ПМЯЛ может зависеть от интенсивности и длительности инфекционного процесса. Поскольку известно, что активные молекулы кислорода, эндогенно продуцируемые гранулоцитами и моноцитами, при воспалении могут вызывать повреждения ДНК клеток, приводя к образованию ОР ДНК.

Полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что спонтанный апоптоз нейтрофилов при тяжелой инфекции снижается ниже показателей, регистрируемых у здоровых доноров [Кее1 М.и.,е1 а1. 1997; ОЬегЬо!-гег С.А, е1 а!., 2001]. Интересно, что фагоциты не только сами подвергаются повреждающему воздействию окислительного взрыва, но также способны индуцировать апоптоз лимфоцитов.

Таким образом, снижение апоптоза ПМЯЛ в период разгара инфекционного заболевания на высоте клинических проявлений СИ, может объясняться пролонгированием жизненного цикла нейтрофилов при действии ЭМ. Провоспалительные цитокины, секретируемые макрофагами и нейтрофи-лами при праймировании их ЛПС, могут содействовать ингибированию программированной гибели ПМЯЛ [Brannigan А.Е. et al., 2000; Asensi Е. et al., 2004]. Так, ингибирование апоптоза ПМЯЛ периферической крови пациентов ОКИ в 1-3 день болезни, по - видимому связано с действием ЭМ, в частности провоспалительных цитокинов, задерживающих спонтанный апоптоз нейтрофилов. Выявленное увеличение апоптоза нейтрофилов в период реконвалес-ценции у больных ОКИ может быть связано с увеличением в данные сроки заболевания ЭМ, в частности IL-10.

По данным литературы [Byrne А., Reen DJ., 2002], в условиях эксперимента, было установлено, что IL-10 является одним из основных регуляторов жизненного цикла нейтрофилов при воспалительном ответе и, в частности способствует индукции апоптоза в исходе воспаления.

В соответствии с проведенным анализом у всех больных с ГЭ и ГЭК, а также с колитическим вариантом ОКИ во все периоды заболевания отмечались однонаправленные изменения изучаемых показателей: увеличение значений ОР ДНК ПМЯЛ по сравнению со значениями группы контроля, как на высоте клинических проявлений, так и при ранней реконвалесценции (р=0,003). При этом статистически значимо показатели ОР ДНК между группами с различными клиническими вариантами ОКИ в соответствующие периоды заболевания не различались (р=0,384), что может свидетельствовать о едином механизме, приводящем к повреждению ДНК независимо от варианта течения ОКИ.

При всех вариантах ОКИ в период разгара заболевания было отмечено уменьшение нейтрофилов в состоянии апоптоза при ГЭ и ГЭК вариантах до 4,52±0,29% и 4,55±0,30% соответственно, при колитическом варианте до 4,35±0,61% в группе контроля - 5,88±0,38%, р=0,039.

В период ранней реконвалесценции у пациентов ОКИ отмечалось значительное увеличение апоптотических ПМЯЛ по сравнению с контрольными величинами и начальными значениям в соответствующих группах: при ГЭ варианте ОКИ до 12,22±0,29%, при ГЭК до 12,65±0,40%, у больных с колитическим

вариантом ОКИ до 13,69±0,39%, р<0,05. Достоверных различий по показателям апоптоза между группами больных с различными вариантами ОКИ, как в период разгара заболевания, так и при ранней реконвалесценции выявлено не было (р>0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что независимо от варианта течения заболевания, каждый из которых имеет свои клинические особенности, прослеживается единая тенденция изменения показателей ОР ДНК и апоптоза ПМЯЛ.

При анализе ОР ДНК лимфоцитов у пациентов с различными вариантами течения ОКИ в период разгара болезни и при регрессе основных клинических симптомов, к 5-7 дню болезни нами было установлено, что средние значения ОР ДНК лимфоцитов при всех вариантах течения заболевания оставались в пределах доверительных границ контрольной группы (р>0,05).

При анализе параметров апоптоза лимфоцитов у больных с различными вариантами ОКИ в период разгара заболевания обнаружено, что значения апоптоза лимфоцитов достоверно значимо превышали соответствующие показатели контрольной группы и составили: у больных с ГЭ вариантом ОКИ -3,94±0,87%, у пациентов с ГЭК - 3,84±0,45%, с колитическим вариантом -7,87±0,61%, в группе контроля соответственно -1,03±0,15%, р<0,001.

Нами отмечено, что на 5-7 день болезни показатели апоптоза лимфоцитов больных с колитическим вариантом ОКИ практически достигали величин группы контроля (1,99±0,45%), тогда как у больных ГЭ и ГЭК вариантами заболевания показатели апоптоза несколько снижались до 2,72±0,55% и 3,13±0,52% соответственно, но оставались повышенными статистически достоверно не различаясь с начальными значениями в соответствующих группах (р>0,05).

Исходя из полученных данных, можно заключить, что изменения показателей ОР ДНК нейтрофилов и лимфоцитов носили разнонаправленный характер, при этом выраженность изменений ряда показателей в большей степени зависела от тяжести течения заболевания, чем от клинического варианта ОКИ.

При корреляционном анализе показателей апоптоза и ОР ДНК ПМЯЛ у больных ОКИ в 1-3 сутки от начала заболевания полученная взаимосвязь меж-

ду исследуемыми величинами оказалась статистически

малозначимой, вне зависимости от тяжести заболевания (г=0,075, р=0,512).

Интересно, что на 5-7 сутки болезни у пациентов ОКИ доля ПМЯЛ в состоянии апоптоза с высокой значимостью коррелировала со степенью повреждения ДНК нейтрофилов, в соответствующий период заболевания (г=0,331, р=0,003). Таким образом, нами было установлено, что в период ранней рекон-валесценции у больных ОКИ вместе с высокими показателями апоптоза ПМЯЛ регистрировались и более высокие значения повреждений структуры ДНК клеток. Взаимосвязь исследуемых показателей (ОР ДНК и апоптоза клеток) подтверждается литературными данными [Буеверов А.О. и соавт., 2000] о том, что накопление ОР ДНК пря ряде заболеваний свидетельствует о начальных проявлениях апоптоза клеток.

При изучении взаимосвязи показателей ОР ДНК и апоптоза лимфоцитов у больных ОКИ с различной тяжестью течения заболевания нами было установлено, что у реконвалесцентов ОКИ (5-7 день болезни) доля лимфоцитов в состоянии апоптоза оказывалась пропорциональна показателям ОР2 ДНК в соответствующий период заболевания.

Регистрируемые показатели апоптоза и ОР ДНК лимфоцитов реконвалесцентов, были достоверно взаимосвязаны: у больных с высокими значениями апоптоза лимфоцитов выявлялись и большие значения ОР2 ДНК (г=0,440, р<0,001).

Из полученных результатов следует то, что в остром периоде заболевания у больных ОКИ ПГ лейкоцитов может регулироваться при лиганд - рецептор-ном взаимодействии и внутренний путь индукции апоптоза, обусловленный накоплением ОР ДНК, не всегда играет ведущую роль в качестве пускового механизма при реализации программы гибели клеток.

При динамическом изучении ОР ДНК и апоптоза клеток в зависимости от этиологии ОКИ были получены следующие результаты.

Гастроинтестинальная форма сальмонеллёза (ГФС) была диагностирована у 31 пациента, находившегося под нашим наблюдением: у 16 мужчин и 15 женщин. Диагноз ГФС устанавливался на основании клинико-анамнестических данных и во всех случаях сопровождался бактериологическим подтверждени-

ем. В 71,0% случаев в качестве этиологического штамма высевалась культура Б.е^егШсИз группы Б.

У больных ГФС, как при легком, так и при среднетяжелом течении заболевания на высоте клинических проявлений СИ нами было отмечено повышение ОР1 ДНК нейтрофилов. В период разгара заболевания отмечалось достоверно значимое возрастание показателя ОР1 ДНК ПМЯЛ при легком течении ГФС в 1,6 раза, при среднетяжелом в 1,9 раза по сравнению с показателями группы контроля (р<0,001). Несмотря на отчетливую тенденцию к более высоким значениям ОР1 ДНК ПМЯЛ у больных ГФС среднетяжелого течения (24,34±1,68%), достоверных различий по данному показателю с соответствующими значениями ОР1 ДНК ПМЯЛ пациентов с легким течением заболевания (17,67±2,47%) получено не было, р=0,074. Необходимо отметить, что показатели апоптоза на высоте клинических проявлений у больных ГФС легкого течения (4,30±0,81%) и среднетяжелого течения (4,63±0,32%) оставались в пределах доверительных границ контрольной группы (5,88±0,38%, соответственно, р>0,05).

В стадии реконвалесценции у больных при среднетяжелом течении ГФС были диагностированы максимальные значения ОР2 ДНК ПМЯЛ -29,71±2,04%, в 1,4 раза превышавшие соответствующие значения (20,58±2,69%) больных с легким течением ГФС, р=0,044. При этом в период ранней реконвалесценции у больных ГФС было также документировано увеличение показателей апоптоза ПМЯЛ, в зависимости от тяжести течения заболевания (р<0,001). На 5-7 день болезни наибольшие значения апоптоза грануло-цитов (14,35±0,25%) регистрировались у больных ГФС среднетяжелого течения.

Таким образом, результаты настоящего исследования показывают, что у больных и при легком, и при среднетяжелом течении ГФС на высоте клинических проявлений СИ отмечается возрастание показателей ОР ДНК при близких к контрольным значениях апоптоза ПМЯЛ, тогда как в период реконвалесценции выявляется увеличение количества нейтрофилов в состоянии апоптоза при высоких значениях ОР ДНК (в соответствии с тяжестью течения инфекционного процесса).

Нами отмечено, что у больных ГФС мы не получили статистически значимой корреляции между показателями ОР ДНК и апоптоза ПМЯЛ, как в период разгара заболевания (г=0,204, р=0,280), так и при ранней реконвалес-ценции (1=0,310, р=0,096).

При изучении ОР ДНК лимфоцитов у больных ГФС в острый период заболевания отчетливо выявлялись различия по данному показателю в зависимости от тяжести течения заболевания. При легком течении ГФС нами отмечался несущественный процент повреждений ОР1 ДНК лимфоцитов (7,46±1,54%), тогда как при среднетяжелом течении ГФС в период разгара заболевания регистрировалось статистически значимое увеличение ОР1 ДНК до 21,48±1,88%, что уже в 1,5 раза превышало контрольные значения (14,22±1,48%), р<0,05. Показатели апоптоза лимфоцитов больных ГФС в 1-3 день болезни возрастали независимо от тяжести течения заболевания.

У реконвалесцентов ГФС показатели ОР2 ДНК лимфоцитов оказывались в пределах доверительных границ контрольной группы, тогда как показатели апоптоза зависели от тяжести течения ГФС.

Интересно, что у реконвалесцентов с легким течением ГФС значения апоптоза лимфоцитов регистрировались на более высоких цифрах (5,74±2,47%), чем у больных при среднетяжелом течении заболевания (2,21 ±0,42%), р<0,05.

Среди обследованных больных, с диагнозом пищевая токсикоинфекция (ПТИ) неуточненной этиологии наблюдались 13 мужчин (46,4%) и 15 женщин (53,6%), диагноз у которых устанавливался на основании клинико-анамнестических данных и подтверждался отрицательными бактериологическими и серологическими анализами.

По полученным данным, показатели ОР1 ДНК ПМЯЛ у больных ПТИ в 1-3 сутки от начала заболевания статистически значимо превышали значения контрольной группы и составляли при легком -16,53±1,52% и при среднетяжелом - 21,97±2,28%, в группе контроля 10,79±1,25% соответственно, р<0,001. При этом величины ОР1 ДНК нейтрофилов больных со среднетяжелым течением ПТИ, достигая максимальных значений, достоверно превышали соответствующие показатели в группе больных с легким течением ПТИ в этот период заболевания (р<0,001).

На пике проявлений СИ у больных ПТИ легкого течения высокий процент повреждений ДНК ПМЯЛ (16,53±1,52%) регистрировался при «нормальных» значениях апоптоза нейтрофилов (4,88±0,51%), тогда как у больных ПТИ среднетяжелого течения в период разгара заболевания при высоком среднем показателе ОР1 ДНК (21,97±2,28%) значения апоптоза клеток статистически достоверно снижались до 3,89±0,36%, по сравнению с контрольными величинами (р=0,013).

В динамике заболевания нами было документировано увеличение показателей ОР2 ДНК нейтрофилов у больных как с легким, так и среднетяжелым течением ПТИ по сравнению с контрольными величинами в 2,1 и 2,6 раза соответственно, также с одновременным увеличением ПМЯЛ в состоянии апоптоза.

Так в группе больных с легким течением заболевания значения апоптоза ПМЯЛ превысили контрольные в 1,6 раза и составили 9,68±0,37%, тогда как у пациентов ПТИ среднетяжелого течения эти значения (13,78±0,36%) превышали контрольные уже в 2,3 раза, р<0,001.

При анализе динамики изучаемых показателей лимфоцитов пациентов ПТИ неуточненной этиологии мы обнаружили, что величины ОР ДНК лимфоцитов, как при легком, так и при среднетяжелом течении ПТИ в 1-3 дни болезни, а также в период ранней реконвалесценции статистически достоверно не различались с показателями группы контроля (р>0,05). Тогда как при регистрации апоптоза лимфоцитов у больных с различной тяжестью течения ПТИ нами получена иная динамика исследуемых величин: у больных ПТИ легкого течения на высоте клинических проявлений заболевания отмечалось увеличение количества апоптотических лимфоцитов до 4,20±0,90% по сравнению с показателями группы контроля - 1,03±0,15%, р=0,011. У больных при среднетяжелом течении заболевания нами наблюдалась аналогичная тенденция, но показатели апоптоза лимфоцитов достигали более высоких значений 6,55±2,21%, по сравнению с контрольными величинами, р<0,05.

В периоде ранней реконвалесценции на 5-7 день болезни мы отметили снижение показателей апоптоза лимфоцитов в обеих группах: с легким течением ПТИ до 2,48±0,64%, со среднетяжелым до 3,96±1,58%. Таким образом, показатели апоптоза реконвалесцентов снижались, но оставались повышенными по сравнению со значениями контрольной группы (р=0,078).

При проведении корреляционного анализа у больных

ПТИ отмечалась взаимосвязь между показателями ОР2 ДНК лимфоцитов и показателями апоптоза лимфоцитов периода реконвалесценции (г=0,710, р=0,001), так у пациентов с высоким процентом повреждений ДНК (в виде ОР) выявлялись и большие значения апоптотических лимфоцитов.

Острая дизентерия (ОД) была диагностирована у 9 мужчин и J3 женщин. Диагноз ОД устанавливался на основании клинико-анамнестических данных и во всех случаях сопровождался бактериологическим подтверждением: в 86,3% случаев в качестве этиологического штамма высевалась культура Shigella sonnei.

В остром периоде заболевания показатели ОР1 ДНК ПМЯЛ у больных зависели от тяжести течения ОД.

У больных с легким течением ОД значения ОР1 ДНК ПМЯЛ в 1-3 день болезни регистрировались практически на тех же цифрах (10,69±2,39 %), что и в контрольной группе (10,79±1,25%, соответственно р>0,05), а при среднетяже-лом течении заболевания у пациентов выявлялись достоверно более высокие показатели ОР1 ДНК (15,73±1,19%) по сравнению с величинами группы контроля (р<0,05).

Также у больных с легким течением ОД в период разгара заболевания было обнаружено уменьшение количества гранулоцитов в состоянии апоптоза до 3,43±0,28% по сравнению со значениями контрольной группы (р<0,05). Тогда как в группе больных ОД среднетяжелого течения апоптоз нейтрофилов регистрировался практически на тех же цифрах (5,09±0,59%), что в контрольной группе (5,88±0,38%), соответственно р>0,05.

В динамике инфекционного процесса, на 5-7 сутки при купировании основных клинических проявлений ОД, у наблюдавшихся пациентов обеих групп были отмечены высокие показатели ОР2 ДНК ПМЯЛ по сравнению с начальными и контрольными значениями. В частности, при легком течении ОД эти показатели составили 24,63±2,31%, при среднетяжелом течении ОД -27,66±2,17% (р<0,001). Также у реконвалесцентов ОД регистрировалось существенное увеличение количества нейтрофилов в состоянии апоптоза в соответствии с тяжестью течения заболевания по сравнению, как с контрольными, так и начальными значениями в группах. При легком течении ОД апоптоз нейтро-

филов реконвалесцентов достигал показателей 10,18±0,30%, при среднетяжелом 14,03±0,35%, р<0,001.

При анализе значений ОР ДНК лимфоцитов больных ОД нами были документированы следующие изменения: у больных с легким течением ОД в 1-3 день болезни отмечалась тенденция к увеличению ОР1 ДНК лимфоцитов, хотя статистически достоверно эти показатели у больных как с легким, так и средне-тяжелым течением заболевания не превышали значений группы контроля, р>0,05.

Нами выявлено, что при легком течении ОД апоптоз лимфоцитов в начальный период заболевания незначительно увеличивался до 1,80±0,28%, а при среднетяжелом возрастал до 7,21±0,52%, значимо превышая контрольные значения (1,03±0,15%) и показатели апоптоза лимфоцитов больных с легким течением ОД, р<0,001.

В динамике заболевания на 5-7 день болезни, у реконвалесцентов ОД показатели ОР2 ДНК лимфоцитов оказывались сопоставимыми со значениями группы контроля независимо от тяжести течения заболевания, тогда как апоптоз лимфоцитов у больных с легким течением ОД составил 2,92±0,24%, а при среднетяжелом течении ОД - 2,12±0,35%, достоверно превышая контрольные величины (р<0,05).

Нами проводился корреляционный анализ лейкоцитарного индекса интоксикации с показателями апоптоза и ОР ДНК лейкоцитов больных ОКИ, поскольку, на наш взгляд ЛИИ является наиболее универсальным интегральным параметром, отражающим своеобразие системных проявлений синдрома интоксикации. По данным литературы увеличение ЛИИ зависит от тяжести и длительности инфекционного процесса [Лобзин Ю.В. и соавт., 2005].

Нами выявлена достоверно значимая положительная корреляция между ЛИИ и показателем ОР1 ДНК нейтрофилов у больных ОКИ. Так, у пациентов с высокими значениями ЛИИ (при среднетяжелом течении заболевания) в период разгара ОКИ регистрировались и более высокие показатели однонитевых разрывов ОР1 ДНК ПМЯЛ (г=0,253, р=0,025).

Таким образом, в группе больных ОКИ различной этиологии при максимальных проявлениях СИ отмечается большая степень повреждения ДНК

ПМЯЛ, что может приводить к увеличению их апоптоза в период реконвалесценции и сказываться на функциональной активности этого типа клеток.

Интересно отметить взаимосвязь ЛИИ с параметрами периода реконвалесценции у больных ПТИ. Так у пациентов ПТИ с более высокими значениями ЛИИ в 1-3 день болезни, в период ранней реконвалесценции отмечался больший процент повреждений ОР2 ДНК ПМЯЛ (г=0,640, р<0,001), а также большие значения апоптоза нейтрофилов в период реконвалесценции (г=0,441, р=0,019),

В динамике заболевания у пациентов с высокими значениями ЛИИ регистрировались высокие показатели лимфоцитов в состоянии апоптоза (г=0,635, р=0,002)

Положительная статистически значимая корреляция была нами отмечена между ЛИИ и ОР1 ДНК ПМЯЛ больных ОД на высоте клинических проявлений СИ (г=0,638, р=0,001), так больший процент повреждений ДНК сопровождался высокими значениями ЛИИ.

Полученные нами данные позволяют расценивать динамические изменения апоптоза нейтрофилов как естественный и высокорегулирующийся феномен, отражающий закономерности развития и исхода инфекционного процесса, что соответствует литературным данным [Simon H.U., 2004; Зигангирова H.A., Гинцбург А.Л., 2004].

Известно, что сложный механизм регуляции апоптоза Т-лимфоцитов при системном воспалительном ответе необходим для предотвращения неконтролируемой активации лимфоцитов [Roth G. et. al., 2003]; однако, апоптоз этих клеток, индуцированный на поздних стадиях заболевания, наблюдаемый у наших пациентов приводит к ослаблению иммунного ответа, что соответствует клиническому выздоровлению на фоне сохраняющихся патоморфологических реакций.

ВЫВОДЫ

1. Комплексное применение в динамике заболевания у больных ОКИ прямого флуориметрического метода и проточной цитофлуориметрии с определением показателей однонитевых разрывов ДНК и апоптоза позволяет регистрировать процесс программированной гибели клеток на разных стадиях развития.

2. Установлено, что показатели программированной гибели клеток у больных ОКИ зависят от тяжести заболевания, тогда как этиология и клинический вариант течения не оказывают существенного влияния на значения изучаемых параметров.

3. Изменения параметров программированной гибели полиморфно-ядерных лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови в динамике ОКИ определяются типом клеток и зависят от тяжести инфекционного процесса.

4. Изучение показателей программированной гибели полиморфно-ядерных лейкоцитов у больных ОКИ показало, что в острый период заболевания на высоте интоксикации регистрируется статистически значимое накопления однонитевых разрывов ДНК, тогда как показатели апоптоза определяются на значениях достоверно более низких, чем в контрольной группе.

5. Изучение показателей программированной гибели полиморфно-ядерных лейкоцитов в периоде ранней реконвалесценции, показало, что на фоне продолжающегося накопления однонитевых разрывов ДНК клеток происходит достоверно значимое увеличение количества клеток, подвергшихся апоптозу.

6. На высоте клинических проявлений синдрома интоксикации и в периоде ранней реконвалесценции у больных ОКИ показатели однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов не отличались от контрольных значений, тогда как параметры апоптоза достоверно возрастали в острый период, имея лишь тенденцию к снижению на 5-7 дни болезни.

7. В периоде разгара ОКИ независимо от этиологии больший процент однонитевых разрывов ДНК полиморфно-ядерных лейкоцитов определялся у пациентов с высокими значениями лейкоцитарного индекса интоксикации

Практические рекомендации

Определение однонитевых разрывов ДНК полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови, может быть рекомендовано для использования в практическом здравоохранении, в качестве дополнительного критерия объективной оценки тяжести течения ОКИ различной этиологии.

Учитывая универсальность механизмов развития синдрома интоксикации у больных с бактериальными инфекциями, определение апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови в стадии реконвалесценции может использоваться для определения полноты клинико-патоморфологического выздоровления пациентов.

Метод регистрации апоптоза нейтрофилов с помощью проточной цитоф-луориметрии может быть использован с целью выявления пациентов с латентно протекающей кишечной инфекцией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Красавина Э.Н., Белушкина H.H., Полуэктова В.Б., Дмитриева Е.В., За-маева Н.Ю., Пак С.Г. Апоптоз и повреждение ДНК лейкоцитов периферической крови у больных гастроинтестинальной формой сальмонеллеза // В кн.: «VI российский съезд врачей инфекционистов». Материалы съезда (29-30 октября 2003 года). СпБ, 2003.- С. 188-189.

2. Красавина Э.Н., Мартынова H.H., Пак С.Г. Апоптоз лейкоцитов периферической крови у больных пищевой токсикоинфекцией // В кн.: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Тезисы докладов III конференции молодых ученых России с международным участием, посвященных 60-летию Российской Академии Медицинских наук (20-24 января 2004 года). М., 2004. С. 117.

3. Красавина Э.Н., Белушкина H.H., Замаева Н.Ю, Полуэктова В.Б., Пак С.Г. Роль апоптоза лейкоцитов периферической крови в патогенезе пищевых токсикоинфекций // В кн.: «I Международная конференция молекулярная медицина и биобезопасность». Материалы научно-практической конференции с международным участием. (Москва, 26-28 октября 2004 г.), С. 109-110.

4. Красавина Э.Н., Пак С.Г., Белушкина H.H., Малов В.А., Полуэктова В.Б., Горобченко А.Н., Дмитриева JI.H. Изменение структуры ДНК нейтрофилов периферической крови у больных острым шигеллёзом // В кн.: «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». Тезисы докладов юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (22-24 марта 2006 года), Санкт-Петербург, 2006.- С. 171.

5. Красавина Э.Н., Пак С.Г., Белушкина H.H., Малов В.А., Замаева Н.Ю., Дмитриева JI.H., Фадеева O.A. Показатели апоптоза полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у больных острым шигеллёзом // В кн.: «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». Тезисы докладов юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (22-24 марта 2006 года), Санкт-Петербург, 2006,- С. 170-171.

6. Красавина Э.Н., Серебряков М.Ю., Воронов A.B., Белушкина H.H., Малов В.А., Пак С.Г., Полуэктова В.Б., Дмитриева JI.H., Нечаева И.П., Цинцадзе A.A. Апоптоз гранулоциов периферической крови при острых кишечных инфекциях II Сборник трудов сотрудников Медицинского центра Российского государственного медицинского университета. Москва 2006. С. 276-280.

7. Пак С.Г., Малов В.А., Красавина Э.Н., Белушкина H.H. Особенности изменения структуры ДНК гранулоцитов периферической крови у больных острыми кишечными инфекциями // Российский Медицинский Форум «Фундаментальная наука и практика», 18-20 октября 2006. С. 110.

8. Красавина Э.Н., Пак С.Г., Малов В.А., Белушкина H.H., Горобченко А.Н., Полуэктова В.Б. Повреждение структуры ДНК нейтрофилов как критерий тяжести у больных острыми кишечными инфекциями // Ремедиум. Спец. выпуск: «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней». (Материалы VII Российского съезда инфекционистов, Нижний Новгород 25-27 октября 2006г.) С. 254.

9. Красавина Э.Н., Пак С.Г., Белушкина H.H., Полуэктова В.Б., Мартынова H.H., Городнова Е.А., Айвазян С.Р., Дмитриева JI.H., Малов В.А. Апоптоз полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови и его начальные проявления у больных при заболеваниях, вызванных энтеропатогенными бакте-

риями. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии.-2006. •№ 4. - С 42-45.

Перечень сокращений

ГЭ гастроэнтеритический

ГЭК гастроэнтероколитический

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛИИ лейкоцитарный индекс интоксикации

ОД острая дизентерия

ОР однонитевые разрывы ДНК клеток

ОР1 показатели однонитевых разрывов ДНК клеток периода

разгара заболевания

ОР2 показатели однонитевых разрывов ДНК клеток периода

ранней реконвалесценции

ОКИ острые кишечные инфекции

ПГ программированная гибель

ПМЯЛ полиморфно-ядерные лейкоциты

ПТИ пищевая токсикоинфекция

ЭМ эндогенные медиаторы

Принято к исполнению 22/12/2006 Исполнено 23/12/2006

Заказ № 1075 Тираж 100 эк.з

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495)975-78-56 У/У/УУ ацщ^ега! щ

Актуальность работы. Острые кишечные инфекции (ОКИ) в течение длительного времени продолжают оставаться одной из самых актуальных проблем практического здравоохранения во всех без исключения странах мира [20, 62, 80).

Несмотря на достигнутые успехи в изучении ряда практических аспектов этиолатогеиеэа ОКИ» многие ключевые вопросы пока остаются малоизученными. В частности, общеизвестно, что несмотря на различия а этиологии ОКИ, клинические проявления и тяжесть развивающегося инфекционного процесса обусловливаются совокупностью проявлений интоксикационного и днарейного синдромов [9, 16, 22,28» 29, 31),

Синдром интоксикации (СИ) в клинике инфекционных болезней имеет уникальное значение, поскольку с одной стороны представляет универсальный клинический снндромокомплскс, развитие которого типично дня большинства инфекционных заболеваний, независимо от этнологического фактора» а с другой, степень его выраженности определяет тяжесть н исход конкретного заболевания [27]. На сегодняшний день не вызывает сомнения ведущее значение цигокинов в индукции и регуляции ответной реакции организма на бактериальную инвазию, однако механизмы, определяющие жизненный цикл регулиторных и ->ффекторных клеток организма пока остаются не достаточно ясными,

Регуляция процесса клеточной гибели в норме и при патологии является одной нз центральных проблем медико-биологической науки и интенсивно изучается в настоящее время но веси мире [1,3, 35, 83J. Подобный интерес обусловлен появлением новых методических возможностей регистрации различных проявлений данного феномена н анализа его молекулярных механизмов, тесно связанных с активацией клеток и биологической передачей сигнала (25,26, 55,40, 76,93,120].

Ранее были опубликованы данные [2. 5, 13, 36) об обнаружении высокой степени повреждения ДИК лимфоингов и гранулоцитов периферической крови при ряде заболеваний, в том числе и бактериальной природы» в которых авторы предположили взаимосвязь между повреждением структуры ДИК и развитием апонтоза.

Очевидно, что аггоптоз может играть ключевую роль прн инфекции в исходе системной восшшсльной реакции, поскольку посредством апоптоза угнетается локальная тканевая деструкция, уменьшаются дальнейшие воспалительные реакции н рекрутирование иммунных клеток, а также облегчается терминальная стадия врожденного иммунного ответа, обусловленная ограничением провоспалнтельиого ответа. Регулирование продолжительности жизни нейтрофнлор путем апоптоза улавшшюг тонкий баланс между их эффективным функционированием в качестве одного in звеньев врожденного иммунитета и своевременным н безопасным удалением »тих потенциально опасных клеток [64,70, 74, 89, 114].

Целью настоящего исследования явился комплексный клннико-п иго генетический анализ значенид повреждений структуры ДНК, првдрпшкшпа в виде однонитсвых разрывов (ОР), и а пои год! лейкоцитов периферической крови в развитии синдрома интоксикации у больных ОКИ в динамике инфекционного процесса.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследовании

1. Изучить динамик)' показа гелей ОР ДНК н анопгоза полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) и лимфоцитов периферической крови н зависимости от тяжести и варианта течения ОКИ

2. Исследовать состояние показатели ОР ДНК и алопгоза ПМЯЛ, лимфоцитов периферической крови у больных гаетроиитестинальной формой сальмонелле» в динамике заболевания.

3. Изучить динамику показателей ОР ДНК и аионтозл ПМЯЛ и лимфоцитов периферической крови у большак пищевой юкенконнфекцией неуточненной этиологии,

4. Оценить динамику состояния показателей ОР ДИК и апонтоза ПМЯЛ. лимфоцитов периферической крови у больных осгрой дизентерией.

5. Провести корреляционный анализ значений ОР ДНК н алоптоза лейкоцитов с клннико-лабораторныын параметрами синдрома интоксикации в динамике ОКИ.

Научная пони ]ни

Впервые проведено комплексное исследование показателей апашоза н степени повреждения ДНК лимфоцитов н некрофилов периферической кроен у больных ОКИ различной этиологии а динамике развит» инфекционного происсса.

Впервые у больных ОКИ обнаружены закономерные изменения показателей повреждения ДНК, представленных в виде ОР, и алоптоза лейкоцитов периферической крови в зависимости от тяжсстн течения Н периода заболевания,

Впервые показано, что у больных ОКИ различной этнологии во все периоды заболевания наблюдаются достоверно более высокие показатели повреждения структуры ДНК ПМЯЛ нернферн'геской кровн по сравнению с контрольной грушюй

Впервые выяаяено. что у больных ОКИ нейтрофнлы периферической кровн в острый период заболевания в больнзей степени, чем лимфоциты подвержены апоптозу,

Установлено, что у пациентов выявляются однотипные изменения а показателях программированной гибели лейкоцитов периферической кровн независимо от этиологии ОКИ.

У больных ОКИ в еталии реконвалееценцни установлена достоверная корреляций между параметрами начальных и завершающих проявлений программированной гибели лейкоцитов периферической крови. что свидетельствует о наличии в цнркулаториом русле как клеток в состоянии алопгоэа, так и коммигированных к нему.

Впервые отмечено, что у больных ОКИ на высоте клинических проявлений интоксикация получена достоверная корреляция между начальными проявлениями программированной гибели (ОР ДНК) иейтрофнлов н лейкоцитарным индексом интоксикации (ЛИИ).

Практическая ценность работы.

На основании проведенных исследований выявлена взаимосвязь между показателями начальных проявлений апоптоза лейкоцитов периферической крови больных СЖИ различной этнологии в виде ОР ДНК и объективным критерием выраженности интоксикационного синдрома, представленным в виде интегрального показателя - ЛИИ.

Результаты исследования ОР ДНК и апоптоза лейкоцитов периферической крови Сольных ОКИ определили возможность их использования в качестве дополнительного критерия при оценке тяжести и длительности течения инфекционного процесса.

Полученные результаты позволяют расценивать регистрацию повреждений ДНК, представленных а виде ОР, в качестве доступного н адекватного теста для выявления клеток на ранних стадиях апоптоза у больных ОКИ.

Применение используемых нами методик может бьпь рекомендовано При изучении особенностей патогенеза СИ и при других инфекционных нозология«, в качестве дополнительного инструмента, в том числе для определения роли и значения функциональной активности ПМЯЛ, как важнейшего показателя системы неспецнфического иммунитета.

Положения, выноенчые на »пилу,

У большинства больных независимо от этнологии ОКИ отмечалось возрастание показателей ОР ДНК нейтрофилов периферической крови в зависимости от периода заболевания.

У больных ОКИ отмечено снижение показателей апоптоза ПМЯЛ в период разгара заболевания но сравнению с показателями группы контроля. В период ранней реконвалесценцни у пациентов ОКИ выявлено повышение показателей ОР ДНК и апоптоза ПМЯЛ не только по сравнению с показателями в группе контроля но, также в сопоставлении с начальными величинами.

Отмечено различие в регистрируемых показателя* СОР ДНК н апоптоза) ПМЛЛ в зависимости от тяжести инфекционного процесса у больных ОКИ.

В период ранней реконвалссцснцнн, при купировании основных проявлений заболевания показатели апоптоза нейтрофилов периферической кроен у больных ОКИ достигали своего пика, свидетельствуя о сохраняющихся патоморфологнческнх реакциях.

Отмечено достоверно значимое увеличение значении апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов ОКИ при среднетяжелом течении в период р л i ара заболевания, с последующим достоверным снижением в период рекоивалссценцнн, но с сохраняющимся превышением лого показателя от группы контроля.

Определена шшощк объективного интегрального показателя СИ - ЛИИ с показателями повреждения структуры ДИК нейгрофилов, в виде ОР у больных ОКИ

Внедрение результатов работы.

Результаты настоящего исследования используются в работе ] I инфекционного отделения ГКБ К-: 4. Матери a.'i ы работы включены в учебный курс кафедры инфекционных болезней M МЛ uol И M Сеченова и используются в учебном процессе при преподавании данною раздела.

Апробации раЕклы.

Основные положен ид и результаты исследования представлены на юбилейной научно-практической конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение ннфекгалогнн», посвященной 80-легию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова (Москва 22-23 мая 2003г.Ш Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 20-24 января 2004г.); 1-ой Международной конференции «Молекулярная медицина и биобсзоласность» (Москва 26-28 октября 2004г.); VU Российском съезде инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Нижний Новгород, 25-27 октября 2006г.); Российском Медицинском Форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва (8-20 октября 2006г.), В также неоднократно обсуждались на научно-практических конференциях кафедры инфекционных болезней, Диссертация япробкровино на совместном заседании кафедры инфекционных болезней, лаборатории по изучению токсических и септических состояний и кафелры биохимии ММА им. И М Сеченова 29 нюня 2006г.

Публикации, По теме лисссртаннн опубликовано 9 научных работ

ВЫВОДЫ

1. Комплексное применение в динамике заболевания у бальных ОКИ прямого флуоримсгрического метода и проточной цнтофлуорнметрнн с определением показателей одноннтевых разрывов ДИК н апоптоза позволяет регистрировать процесс программированной гибели клеток на разных стадиях развития.

2. Установлено, что показатели программированной гибели клеток у больных ОКИ зависят от тяжести заболевания, тогда как этнология н клинический вариант течения не оказывают существенного влияния на значения изучаемых парамстров

3. Изменения параметров программированной гибели полиморфно-ядерных лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови в динамике ОКИ определяются типом клеток и зависят от тяжести инфекционного процессз

4. Изучение показателей программированной гибели полиморфно-ядерных лейкоцитов у больных ОКИ показало, что в острый период заболевания на высоте интоксикации регистрируется статистически значимое накопления одноннтсвых разрывов ДНК, тогда как показатели апоптоза определяются на значениях достоверно более низких, чем в контрольной группе

5. Изучение показателей про|раммированной гибели полиморфно-ядерных лейкоцитов в периоде ранней реконвалеспенцнн, показало, что на фоне продолжающегося накопления одноннтевых разрывов ДНК клеток происходит достоверно значимое увеличение количества клеток, подвергшихся алогпоэу.

6. На высоте клинических проявлений синдрома шггокенкацин н в периоде ранней рсконвалссиснцнн у больных ОКИ показатели одноннтевых разрывов ДНК лимфоцитов не отличались от контрольных значений, тогда как параметры апоптоза достоверно возрастали в острый период, имея лишь тенденцию к снижению на 5-7 дни болезни,

7. В периоде разгара ОКИ независимо от этологии больший процент одноннтсвых разрывов ДНК полиморфно-ядерных лейкоцитов определялся у пашнилов с высокими значениями лейкоцитарного индекса интоксикации,

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Определение одной итевых разрывов ДНК полиморфно-ядерных лейкоцитов периферической крови, может быть рекомендовано для использования в практическом здравоохранении. в качестве дополнительного критерия объективной оценки тяжести течения ОКИ различной этнологии.

Учитывая универсальность механизмов развития синдрома интоксикации у больных с бактериальными инфекциями. определение впоптоза нейтрофнлов и лимфоцитов периферической крови в стадии реконп&лесценцнн может использоваться для определения полноты кл и н и ко- па гоморфолошческого выздоровления пациентов,

Метод регистрации алоптоза нейтрофнлов с помощью проточной шпофлуориметрин может быть использован с целью выявления пациентов с латентно протекающей кишечной инфекцией.