Автореферат и диссертация по медицине (14.00.47) на тему:Апоптоз гепатоцитов и лейкоцитов периферической крови при хронических гепатитах В и С

0034В3686

На правах рукописи

БУЕВЕРОВ Алексей Олегович

Апоптоз гепатоцитов и лейкоцитов периферической крови при хронических гепатитах В и С

Специальность: 14. 00. 47 — гастроэнтерология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 ЗпОл25СЗ

Москва - 2009

003483686

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

Научные консультанты

Доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор

Доктор биологических наук, профессор

ИВАШКИН Владимир Трофимович

БЕЛУШКИНА Наталья Николаевна

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор

КАЛИНИН Андрей Викторович

НИКИТИН Игорь Геннадьевич

ПЛЮСНИН Сергей Вениаминович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития России

Защита состоится «_»___ 2009 г. в__ ч. на

заседании диссертационного совета Д 208.040.10 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова(117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49)

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Эрдес

доктор медицинских наук, профессор Светлана Ильинична

Актуальность проблемы

Хронические гепатиты В и С (ХГ В и С) в последние два десятилетия относятся к числу наиболее интенсивно изучаемых проблем внутренней медицины. Эти болезни характеризуются высокой медицинской и социальной значимостью ввиду широкого распространения, тенденции к росту заболеваемости, особенно среди лиц молодого возраста, нередкого развития тяжелых осложнений — цирроза печени и ге-патоцеллюлярной карциномы и недостаточной эффективностью существующих методов лечения [Ивашкин В.Т., 2005, 2009, Kuntz Е., Kuntz H.-D., 2006, Jacobson I.M., 2007, Maylin S., 2008]. Применение современных методов молекулярной и клеточной биологии позволило значительно расширить имеющиеся представления о биологии вирусов гепатита В и С (HBV, HCV). Так, установление факта репликации HBV и HCV помимо печени в мононуклеарных и полиморфноядер-ных лейкоцитах периферической крови больных ХГ В и С объяснило природу ряда внепеченочных проявлений HBV-и HCV-инфекции [Muller Н.М., 1993, Crovatto М., 2000, Esquivel F., 2002]. Вместе с тем многие вопросы патогенеза вирусных гепатитов остаются не до конца проясненными, в частности, механизмы повреждения гепатоцитов. Открытие высокорегулируемой формы клеточной гибели — апоптоза — J.F. Kerr и соавт. в 1972 г. стимулировало изучение роли этого явления в патологии печени, в результате чего было обнаружено, что апоптоз может играть ведущую роль в развитии острых и хронических вирусных гепатитов [Hiramatsu N., 1994, Mita Е., 1994], а также ряда других заболеваний печени, включая алкогольные, аутоиммунные, лекарственные поражения.

Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых вирусы гепатита В и С теоретически могут активировать апоптоз: 1) непосредственное проапоптотическое действие специфических вирусных белков, образующихся в процессе репликации вируса - X белка HBV [Zhang S.J., 2005] и

соге-белка HCV [Saito К., 2006]; 2) повышение экспрессии на клеточной мембране рецепторов, через которые передается сигнал к индукции апоптоза, например, Fas, и увеличение чувствительности клеток к различным проапоптотичес-ким стимулам, в частности, к фактору некроза опухоли а (ФНО-а, TNF-oc) [Zhu N.. 1998, Ding W.X., 2004, Hatano E„ 2007].

Другой, и, по-видимому, наиболее существенный механизм гибели инфицированных гепатоцитов — апоптоз в результате клеточного иммунного ответа, в особенности опосредованного цитотоксическими Т-лимфоцитами. Исследования последних лет подтверждают ведущую роль Т-лимфо-цитов не только в клиренсе вируса, но и в патогенезе повреждения печени при вирусных гепатитах [Абдурахманов Д.Т., 2003, Rehermann В., 1996, Koziel M.J., 1997, Chisari F.V., 1997,2000]. ЦитотоксическиеТ-лимфоциты вызывают апоптоз инфицированных клеток с помощью перфорин-гранзи-мового комплекса и через систему Fas/FasL в результате взаимодействия растворимого или экспрессированного на поверхности активированных лимфоцитов FasL с Fas-рецепто-ром клеток-мишеней.

В понимании патогенеза вирусных гепатитов крайне важным явилось обнаружение репликации вирусов гепатита В и С в лейкоцитах периферической крови (ЛПК) человека [Рей-зис А.Р., 2005, Lascus Т., 1999, Gowans E.J., 2000]. Это позволило рассматривать ЛПК как дополнительную мишень действия вирусов и дополнительный резервуар инфекции. Пер-систенция HBVh HCV в этих клетках может стать причиной их поражения в результате индукции апоптоза, что должно привести к нарушению функций иммунной системы [Сто-рожаков Г.И., 2006, Crovatto М., 2000, Ghavami S., 2005].

Изучение апоптоза при хронических вирусных гепатитах имеет не только фундаментальное, но и прикладное клиническое значение. Во-первых, исследование процессов, ведущих к апоптозу клеток печени, дает возможность понять причины хронизации и прогрессирования воспаления печени и,

что не менее важно, механизмы злокачественной трансформации и противоопухолевой защиты. Во-вторых, изучение апоптоза позволяет разрабатывать новые методы терапии, в частности, уменьшающие избыточную гибель гепатоцитов. В-третьих, применение методов экспресс-оценки апоптоза быстро обновляющихся популяций клеток помогает прогнозировать ответ на противовирусное лечение.

Цель настоящей работы

Изучение роли апоптоза гепатоцитов и лейкоцитов периферической крови в патогенезе хронических гепатитов В и С.

Задачи исследования

1. Исследование уровня апоптоза гепатоцитов и клеток воспалительного инфильтрата в биоптатах печени больных ХГ В и ХГ С.

2. Определение уровня экспрессии белков Fas и FasL в гепатоцитов и клеток воспалительного инфильтрата в биоптатах печени больных ХГ В и ХГ С.

3. Изучение взаимосвязи между уровнем апоптоза и уровнем экспрессии белков Fas и FasL в клетках печени больных ХГ В и ХГ С.

4. Исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК в мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК больных ХГ В и ХГ С.

5. Сравнение интенсивности апоптоза ЛПКу больных ХГ С и хроническим вирусно-алкогольным гепатитом (ХГ С + алкоголь).

6. Сравнение интенсивности апоптоза ЛПКу больных ХГ С и синдромом аутоиммунного перекреста (аутоиммунный гепатит + первичный билиарный цирроз).

7. Оценка корреляционной связи уровня апоптоза ЛПК и ряда провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

8. Сравнительная оценка уровней апоптоза Л ПК до и после проведения комбинированной противовирусной терапии ИФН-й и рибавирином.

Научная новизна

Впервые проведено исследование уровня апоптоза клеток печени и ЛПК больных ХГ В и С как двух независимых мишеней действия вирусов гепатита В и С.

Впервые изучен уровень апоптоза клеток печени (гепа-тоцитов и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата) в сравнении с уровнем экспрессии мембранных белков, участвующих в индукции апоптоза (Fas, FasL). Выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии FasL лимфоцитов внут-рипеченочного инфильтрата и уровнем апоптоза гепатоци-тов. Обнаружена защитная роль экспрессии FasL гепатоци-тами от апоптоз-индуцирующего действия цитотоксических Т-лимфоцитов.

Впервые проведено одновременное исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК мононуклеарных и полиморфноядерныхЛПК у больных ХГ В и С. Обнаружено, что у больных ХГ В и С наблюдается достоверно более высокий по сравнению со здоровыми добровольцами уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерныхЛПК как при изучении апоптоза свежевыделенных клеток, так и спонтанного апоптоза при культивировании клеток in vitro в течение суток. При этом наиболее высокий уровень апоптоза ЛПК наблюдался у больных с повышенным уровнем сывороточного TNF-a.

Выявлена достоверная корреляционная зависимость степени повреждения ДНКсвежевыделенныхЛПКсдолей клеток в состоянии апоптоза после их инкубации в культураль-

ной среде в течение 24 часов, что свидетельствует о наличии в периферической крови не только клеток в состоянии апоп-тоза, но и клеток, коммитированных к нему.

Впервые установлено, что усиление апоптоза мононук-леарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК) в ответ на комбинированную противовирусную терапию служит ранним признаком элиминации НСУ, выступая в роли дополнительного фактора раннего вирусологического ответа.

Практическая значимость

Обнаруженный высокий уровень апоптоза гепатоцитов при ХГ В, и особенно ХГ С, и появление экспрессии РэбЬ на гепатоцитах могут быть использованы в качестве критериев оценки эффективности новых методов этиотропной и патогенетической терапии.

Обнаружено, что регистрация однонитевых разрывов ДНК может выступать в роли теста для выявления клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза или коммитированных к нему. Показано, что регистрация уровня повреждения ДНК и/или уровня апоптоза ЛПК у больных ХГ В и С относится к числу высокоинформативных показателей повреждения иммунокомпетентных клеток при этих заболеваниях и может быть использована в клинической практике для оценки динамики течения хронического вирусного гепатита и эффективности проводимой терапии.

Определение апоптоза МЛПК в динамике на фоне комбинированной противовирусной терапии ХГ С можно рассматривать в качестве дополнительного прогностического фактора вирусологического ответа, что позволяет своевременно вносить коррективы в схемы лечения. Отсутствие корреляции уменьшения концентрации сывороточной НО/РНК с нарастанием уровня апоптоза МЛПК указывает на необходимость тщательного сбора алкогольного анамнеза перед началом противовирусного лечения.

Внедрение

Результаты диссертации внедрены в практику работы стационара и амбулаторно-поликлинического отделения клиники пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии, гепатологии ММАим. И.М. Сеченова; используются при чтении лекций и проведении практических занятий для слушателей курса функциональной диагностики и фармакотерапии в гастроэнтерологии при кафедре семейной медицины ФППОВ.

Положения, выносимые на защиту

1. Апоптоз служит основным механизмом гибели как ге-патоцитов, так и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата у больных ХГ В и С, при этом доля клеток в состоянии апоптоза у больных ХГ С в среднем протекает более интенсивно.

2. Экспрессия Fas-белка в гепатоцитах больных ХГ В и ХГСотличается отэкспрессии уздоровыхлиц, наблюдаясь либо в цитоплазме (диффузно или в виде гранул), либо на клеточной мембране. Количественные различия в уровне экспрессии белка Fas в гепатоцитах при ХГ В и ХГ С не обнаружены.

3. В нормальных гепатоцитах отсутствует экспрессия FasL, однако она становится выраженной наблюдается при ХГ В и ХГ С.

4. Уровень апоптоза гепатоцитов при ХГ В и С прямо пропорционален степени экспрессии FasL клетками лимфогистиоцитарного инфильтрата в печени и обратно пропорционален уровню экспрессии FasL гепатоцита-ми.

5. Уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноя-дерных ЛПК больных ХГ В и ХГ С достоверно превышает уровень апоптоза этих клеток у здоровых лиц.

Значимые различия между интенсивностью апоптоза при ХГ В и ХГ С не выявлены.

6. В периферической крови больных ХГ В и ХГ С присутствуют не только лейкоциты в состоянии апоптоза, но и коммитированные к нему клетки, что проявляется усилением апоптоза мононуклеарных и полиморфно-ядерных лейкоцитов после 24-часовой инкубации в культуральной среде.

7. У больных ХГ С значимо повышены сывороточные концентрации ИФН-г и ТИР-а. Существует высоко достоверная прямая корреляционная связь уровня апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК больных ХГ С и сывороточной концентрации Т^-сс.

8. Статистически значимые различия между уровнем апоптоза ЛПК у больных ХГ В и С и синдромом аутоиммунного перекреста (аутоиммунный гепатит + первичный билиарный цирроз) отсутствуют, что указывает на роль апоптоза в качестве унифицированного механизма повреждения клеток.

9. Усиление апоптоза мононуклеарных ЛПК у больных ХГ С через 2 нед комбинированной противовирусной терапии интерфероном-а и рибавирином служит ранним признаком элиминации вируса.

Апробация

Диссертация апробирована на заседании научно-методической конференции кафедры пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета Московской Медицинской академии имени И.М. Сеченова 10 июня 2009 года (протокол № 16).

Результаты исследований доложены на 5-й, б-й и 10-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (март 2000 г., март 2001 г., март 2005 г., Москва), на школе-конферен-

ции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, май-июнь 2000), на Ш Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, сентябрь 2000), на Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (октябрь 2000 г., Санкт-Петербург), Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов (февраль 200] г., Санкт-Петербург), на II Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, апрель 2001 г.), Пятой и Шестой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге »(май 2001 и май 2002 г., Санкт-Петербург), на 21-й Европейской Гастроэнтерологической Неделе (UEGW) (октябрь 2001 г., Амстердам), на Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (октябрь 2001 г., Санкт-Петербург), на Балтийском гепатологическом форуме (октябрь 2002 г., Рига), на 2-м Всероссийском съезде инфекционистов (октябрь 2003 г., Санкт-Петербург), на 8-й и 10-й Российской гастроэнтерологической неделе (ноябрь 2003 г., октябрь 2005 г.), на 6-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции (май 2006 г., Красноярск), на Российском медицинском форуме (октябрь 2006 г., октябрь 2007 г., Москва), на Российской конференции «Иммунная система и заболевания печени» (май 2009 г., Нахабино).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и включает введение; обзор литературы; главу, посвященную характеристике изучавшихся больных и клиническим, лабораторным и инструментальным методам исследования; главу собственных результатов, включающую 2 подраздела (апоптоз гепатоцитов и апоптоз лейкоцитов периферической крови); обсуждение полученных результатов,

выводы, практические рекомендации, список литературы (18 отечественных и 171 зарубежный источник). Работа иллюстрирована 31 рисунком и 21 таблицей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Всего обследовано 170 человек, из них 150 с диагнозом «хронический гепатит» (20 человек составили контрольную группу). В основную группу включено 130 больных ХГ В и С (86 мужчин, 44женщины), находившихся на обследовании и лечении в клинике пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии ММА им. И.М. Сеченова (директор — академик РАМН В.Т. Ивашкин) в период с 1999 по 2006 г. Средний возраст больных основной группы составил 35 лет (от 17 до 68 лет). ХГ В диагностирован у 24 человек, ХГ С — у 106. У 25 пациентов установлена смешанная (HCV + алкоголь) этиология гепатита (хронический вирусно-алко-гольный гепатит — ХВАГ). Диагноз устанавливался на основании эпидемиологических, анамнестических, клинических, лабораторных и инструментальных данных. У 12 пациентов (7 с ХГ В, 5 с ХГ С) имелись лабораторные, инструментальные и гистологические признаки компенсированного цирроза печени (класс Ano Чайлд-Пью). Кроме того, в исследованную группу вошли 20 больных САП (синдром аутоиммунного перекреста: аутоиммунный гепатит + первичный били-арный цирроз). Средний возраст больных САП составил 47 лет (27 - 74 г.), среди них были 2 мужчин и 18 женщин. Лабораторные, инструментальные и гистологические признаки компенсированного цирроза присутствовали у 3 пациентов.

У 106 (75,7%) исследованных пациентов была проведена чрескожная слепая биопсия печени по методу Menghini (зав. кабинетом биопсии печени — к.м.н. Ч.С. Павлов). Из них у 24 диагностирован ХГ В, у 82 — ХГ С. Гистологичес-

кое исследование биоптатов печени осуществлялись на кафедре патологической анатомии ММА им. Сеченова д.м.н. В.Б. Золотаревским. Гистологическую картину оценивали в баллах по критериям определения индекса гистологической активности (ИГА), предложенным R.G. Knodell. 26 неокрашенных депарафинизированных срезов использовали для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентно-го исследования.

Группу исследования уровня апоптоза и уровня экспрессии белков Fas и FasL в клетках печени составили 26 больных хроническим вирусным гепатитом (22 мужчин, 4 женщины). Средний возраст больных составил 32 года (от 19 до 55 лет). У 12 больных (46%) был диагностирован ХГ В, у всех обнаружена сывороточная HBV ДНК. В исследование были также включены 14 больных ХГ С, положительные по HCV РНК в сыворотке крови.

Группу сравнения при исследовании уровня апоптоза и уровня экспрессии белков Fas и FasL в клетках печени составили 8 биоптатов печени человека с отрицательными результатами анализов на маркеры НВУи HCV-инфекции. В контрольных препаратах признаки дистрофии, воспаления и/или фиброза отсутствовали.

Группу больных для исследования уровня апоптоза и структуры ДНК ЛПК (вторую группу исследования) составили 104 больных хроническим вирусным гепатитом, из них мужчин 64 (61%), женщин 40 (39%). У 12 человек был диагностирован ХГ В, у 92 — ХГ С. Неравномерное распределение пациентов по этиологии было обусловлено тем, что на первом этапе исследования проводилось сравнение параметров апоптоза и структуры ДНК при ХГ В и С, тогда как в дальнейшем детально изучались характеристики апоптоза в однородной подгруппе больных ХГ С.

Контрольную группу для исследования уровня апоптоза и структуры ДНК ЛПК составили 20 образцов крови здоровых добровольцев без признаков патологии печени и с отрица-

тельными результатами анализов на маркеры HBV и HCV-инфекции.

С целью определения влияния комбинированной противовирусной терапии ИФН-а и рибавирином на уровень апоптоза мононуклеариых ЛПК были выделены следующие группы пациентов: группа больных ХГ С — 29 человек, ХВАГ (ХГ С и алкоголь) — 25 человек и контрольная группа (здоровые доноры) - 20 человек. Средний возраст пациентов составил 37 лет (17-68 лет).

Для больных ХГ С применялись стандартные критерии диагностики. В качестве обязательного критерия рассматривалось повышение активности AJ1T и ACT. У всех пациентов в сыворотке выявлялись анти-HCV иммуноферментным методом и HCV РНК методом полимеразной цепной реакции. Определялись также генотип HCV и количественное содержание HCV РНК в сыворотке — вирусная нагрузка (число копий HCVPHKb 1 мл).

В группу ХВАГ включались пациенты с наличием критериев ХГС и употреблявшими алкоголь в дозе >80 г этанола в день на протяжении не менее 5 лет. Всем больным с ХВАГ проводилось анкетирование с целью оценки алкогольного анамнеза (Мичиганский опросник, опросник ВОЗ). Учитывались также симптомы алкогольного поражения печени: признаки стеатоза печени поданным УЗИ, макроцитозэритроцитов, повышение активности у-глутамилтранспептидазы, доминирование активности ACT над AJ1T.

Все пациенты получали комбинированную противовирусную терапию (интерферон а2а + рибавирин) в стандартных рекомендованных дозах: 3 MU три раза в неделю + 10001200 мг/день в зависимости от массы тела, соответственно. Общая продолжительность лечения составила 24-48 нед в зависимости от генотипа вируса.

Определение апоптоза МЛПК и сывороточной концентрации цитокинов (см. ниже) проводили до начала лечения, через 2 недели и через 24 недели после начала терапии. Ко-

личественное определение сывороточной концентрации HCV РНК методом ПЦР выполнялось исходно, через 2 недели после начала лечения и по окончании курса. У 8 больных выполнено качественное определение HCV РНК в сыворотке через 6 мес после окончания противовирусной терапии (устойчивый вирусологический ответ). Уровеньапоптоза МЛПК определялся методом проточной цитофлуориметрии перед и через 2 недели после начала противовирусной терапии.

Для оценки уровня апоптоза клеток в ткани печени серийные срезы исследовали с помощью метода TUNEL (Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labeling) с использованием набора APO-BRDUTM (Pharmin-Gen). При этом методе происходит введение метки — бром-дезоксиуридинтрифосфата — по свободным З'-ОН-концам в ДНК с помощью фермента концевой дезоксирибонуклеоти-дилтрансферазы. Уровень апоптоза (TUNEL-индекс) в процентах рассчитывали при исследовании не менее 1000 клеток как количество TUNEL-положительных клеток по отношению к общему количеству клеток в исследованном образце, подсчитанных после дополнительного окрашивания красителем Хехст 33258.

Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии Fas и FasL проводили на серийных срезах биоптатов печени больных, фиксированных формалином и залитых в парафин, с помощью непрямого стрептавидин-биотин-пероксидазного метода. Степень экспрессии антигенов оценивали по величине Fas- и FasL-индекса по трехбалльной системе и выражали в условных единицах. Величину индекса определяли в зависимости от количества окрашенных клеток: 0 - отсутствие экспрессии, 1 - низкая экспрессия (не более 30% клеток эксп-рессируют исследуемый антиген), 2 - умеренная (от 30 до 60% клеток экспрессируют исследуемый антиген) и 3 - высокая степень экспрессии (более 60% клеток экспрессируют исследуемый антиген). Средние индексы для ХГ В и С и конт-

рольной группы определялись как средние значения отдельных случаев.

Выделение, мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов из периферической крови проводили одноэтапным методом с использованием двуслойного градиента Ficoll-Paque. Выделенные клетки периферической крови в концентрации 1 млн/мл культивировали в среде RPMI 1640 (Sigma), содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и 50 мкг/мл ген-тамицина, при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С02.

Регистрация апоптоза клеток осуществлялась с помощью проточной цитофлуориметрии после окрашивания ДНК йодистым пропидием в качестве флуорохрома и измерением процента гиподиплоидных клеток на проточном цитофлуориметре-сортировщике клеток EPICS. Процент клеток в состоянии апоптоза (процент гиподиплоидных клеток со сниженной по сравнению с диплоидными флуоресценцией ДНК) подсчитывали по программе STAT PACK, анализируя флуоресценцию не менее 10 ООО клеток в каждом образце.

Оценка степени повреждения ДНК лейкоцитов проводилась прямым флуориметрическим методом по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток с бромистым эти-дием в качестве флуорофора. Интенсивность флуоресценции всех проб измеряли на флуориметре «Jasco FP 550» при длине волны возбуждения 520 нм, эмиссии 590 нм и ширине щелей 10 нм.

Концентрацию цитокинов ИЛ-10, ИЛ-12, TNF-a, ИФН-гв сыворотке крови больных ХГ С и пациентов контрольной группы определяли методом иммуноферментного анализа. Для исследования концентрации ИЛ-10, ИЛ-12 использовались коммерческие тест-наборы фирмы «Immunotech» (Франция) и «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург), для исследования концентрации TNF-a и ИФН-у - тест-наборы фирмы «R&D Systems Europe» (США) и BioSource (ФРГ). Исследо-

вание осуществлялось в лаборатории патологии эритрона клиники химиотерапии лейкозов ГНЦ РАМН вед. н.с., к.б.н. А.А.Левиной и вед. н. с. ГНЦ РАМН, д.б.н. Д.А. Шмаровым.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной обработки данных в программе Microcal Origin 5,0. Результаты представлены в виде средних значений ± ошибка среднего. Достоверность различия двух средних оценивали с помощью теста One-Way ANOVA. Уровень значимости менее 0,05 рассматривали как статистически значимый.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ основных клинико-лабораторных показателей исследованной группы больных

Результаты биохимического анализа крови показали, что активность сывороточных трансаминаз в этой группе была нормальной или почти нормальной (< 1,5 норм) у 12 больных, незначительно повышенной (1,5 -3 нормы) у 9 и умеренно повышенной (3-5 норм) у 5. Мы обнаружили наличие значимой корреляции уровня сывороточных трансаминаз и тяжести гистологических проявлений гепатита у обследованных пациентов (г=0,6, р=0,002 для связи ИГА с ACT, г=0,4, р=0,03 для связи ИГА с АЛТ).

При гистологическом исследовании биопсийных препаратов печени 106 обследованных больных хроническим вирусным гепатитом (24 пациента с ХГ В и 82 с ХГ С) выявлены

признаки, подтверждающие диагноз ХГ: очаговая лимфо-гис-тиоцитарная инфильтрация склерозированных портальных полей, минимальные или умеренные дистрофические изменения гепатоцитов и некроз гепатоцитов. Активность гепатита была минимальной у 18 (16,9%) больных, низкой у 55 (51,8%) больных, умеренной у 26 (24,5%) и высокой у 7 (6,8%) больных. У 30 из 106 (28,3%) пациентов признаки фиброза отсутствовали, у 44 (41,5%) обнаружен слабый фиброз, у 23 (21,7%) - умеренный фиброз, и у 9 (8,5%) больных - тяжелый фиброз.

У 3 из 12 (25%) больных ХГ В и 6 из 14 (43%) больных ХГ С выявлена жировая дистрофия гепатоцитов, у 18 из 26 (70%) больных обеих групп - слабо или умеренно выраженный деструктивный холангит.

В зависимости от тяжести патоморфологических изменений обследованные больные были разделены на две группы: в первую вошли лица с минимальной и слабовыраженной активностью процесса (ИГА по Я. в. КпоскП - 1-8), а во вторую—с ХГ умеренной и высокой активностью (ИГА 9-15). У больных второй группы наблюдались достоверно более высокие уровни сывороточных трансаминаз, а также более тяжелая степень фиброза (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика больных хроническим вирусным гепатитом по степени тяжести заболевания

Исследуемый показатель Группа больных ХГ В и С С минимальной Со средней и высокой

и низкой активностью ХГ (ИГА 1-8), п=73 активностью (ИГА 9-15), п=33

ИГА (исключая фиброз) 6,4±1,1 11,3±2,4*

Фиброз 0,9+0,3 1,8±0,6*

AJIT, ед/л 80,9± 14,5 172,0±60,0*

ACT, ед/л 57,0±9,7 119,4±29,6*

* р<0,05

При сравнении тяжести гистологических изменений в печени больных ХГ В и ХГ С обнаружено, что исследованные больные ХГ В имели достоверно более высокий уровень ИГА по сравнению с группой больных ХГ С: 7,8±0,6 и 5,3+1,1 (р=0,03), соответственно, главным образом за счет таких параметров, как внутридольковый некроз и воспаление портальных трактов. Степень фиброза у обследованных больных ХГ В также достоверно превышала таковую у больных ХГ С (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительный анализ тяжести гистологических изменений в печени больных при хроническом гепатите В и С по Кпо(1е11

Исследуемый показатель Хронический гепатит В Хронический гепатит С

ИГА 7,8+0,6 5,3±1,1*

Перипортальный некроз 1,2±0,3 1,0+0,1

Внутридольковый некроз 2,5±0,3 1,6±0,4*

Портальное 3,8±0,3 2,5±0,4*

воспаление

Фиброз 1,5±0,3 0,8±0,2*

* различия между гепатитом В и С достоверны, р<0,05

По другим параметрам, таким как возраст, уровень сывороточных трансаминаз, наличие жировой дистрофии и деструктивного холангита, среди больных двух исследованных групп достоверных отличий выявлено не было.

Исследование уровня апоптоза и экспрессии белков Fas и FasLBTKaHH печени больных хроническим гепатитом В и С

Результаты проведения реакции TUN EL на гистологических срезах биоптатов печени больных ХГ В и С неоднознач-

ны. Так, у 9 из 12 (75%) больных ХГ В не было обнаружено признаков апоптоза гепатоцитов, и лишь незначительное число клеток воспалительного инфильтрата демонстрировало положительное окрашивание с помощью метода TUNEL. На рис. 1В представлен препарат биоптата печени больного ХГ В, у которого отсутствуют апоптотические изменения в гепатоцитах. Кроме того, в препарате отсутствует и слабое окрашивание ядер, наблюдаемое в норме, и они выглядят «пустыми» при исследовании с помощью флуоресцентной микроскопии. У трех больных ХГ В наблюдался достаточно высокий TUNEL-индекс как гепатоцитов, так и клеток инфильтрата (в среднем 30% клеток были TUNEL-положитель-ными). На рис. 1А представлен препарат биоптата печени больного ХГ В с высоким уровнем апоптоза гепатоцитов. Ядра TUNEL-положительных клеток имеют интенсивную зеленую флуоресценцию по периферии ядра и частично - в ядерном матриксе. При докрашивании препарата флуорофором Хехст 33258 в ядрах клеток наблюдались признаки прикраевой конденсации хроматина.

При проведении реакции TUNEL на препаратах печени больных ХГ С наблюдалась иная картина. У большинства больных (9 из 14) TUNEL-индекс колебался от 30 до 65%. Интересно, что значительное количество клеток лимфогис-тиоцитарного инфильтрата также находилось в состоянии апоптоза (в среднем 52%). Рис. 1Б демонстрирует препарат биоптата печени больного ХГ С с высоким уровнем апоптоза гепатоцитов и клеток воспалительного инфильтрата. У 4 больных с сопутствующей жировой дистрофией гепатоцитов было отмечено отсутствие TUNEL-положительного сигнала (наблюдаемая картина представлена на рис. 1 Г). Следует обратить внимание на то, что в этих препаратах, также как и в препаратах биоптатов печени больных ХГ В с отсутствием TUNEL-положительного сигнала также отсутствуют ядра с тонким четким окрашиванием ядерной мембраны, которые наблюдаются в норме.

Рисунок 1. Апоптоз гепатоцитов и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата при хронических вирусных гепатитах: апоптоз гепатоцитов при хроническом гепатите В (А); гепатоцитов и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата при хроническом гепатите С (Б); наблюдение отсутствия апоптоза гепатоцитов при хроническом гепатите В (В); жировая дистрофия гепатоцитов при хроническом гепатите С (Г).

При сравнении результатов окрашивания по методу TUNEL образцов печеночной ткани больных ХГ В и С обнаружены значительные различия (табл. 3).

ТаблицаЗ. Уровень апоптоза (количество TUNEL-положитель-пых ¡слеток) гепатоцитов и ¡слеток лимфогистиощипарпого инфильтрата в биоптатах печени при хронических гепатитах ВиС

Исследуемая группа Хронический гепатит В Уровень апоптоза, %

Гепатоциты Клетки инфильтрата

7,6±4,3 11,2+1,8

Хронический гепатит С 32,0+7,1* 22,2±3,5*

* различия между гепатитом ВиС достоверны, р<0.05

Оказалось, что при ХГ С уровень апоптоза и гепатоцитов, и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата достоверно выше, чем при ХГ В. Вместе с тем при сравнении тяжести гистологических изменений при ХГ В и С по таким показателям, как ИГА, уровень перипортального и особенно внут-ридолькового некроза, воспаления портального тракта и фиброза при ХГ В в исследованной группе имели место более тяжелые изменения, чем при ХГ С.

При анализе уровня апоптоза гепатоцитов у больных ХГ В и С в зависимости от степени тяжести хронического гепатита было обнаружено, что у больных с умеренной активностью гепатита (ИГА 9-12) наблюдались более высокие значения апоптоза гепатоцитов по сравнению с группой больных с минимальной и легкой степенью активности вирусного гепатита (ИГА 1-8, табл. 4).

Таблица 4. Уровень апоптоза гепатоцитов в зависимости от гистологической активности воспаления при хронических гепатитах ВиС

Тяжесть гистологических изменений в печени (ИГАпо КпосЗеИ) ypoBeHbTUNEL-положительных гепатоцитов в биоптатах печени, %

Больные ХГ В (п=12) Больные ХГ С (п=14)

Низкая степень гистоло гической активности (ИГА 1-8) 4,3+4,3 27,4 ± 9,6*

Умеренная степень гистологической активности (ИГА 9-12) 10,8 ± 7,6 43,5 ±4,6*

* различия между гепатитом В и С достоверны, р < 0,05

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что у пациентов с ХГ В и С значительное количество клеток печени являются TUNEL-положительнымй, что свидетельствует о наличии в ДНК свободных З'-ОН-концов и, следовательно, повреждении ДНК, что обычно интерпретируется как состояние апоптоза. При сравнении уровня апоптоза клеток печени у исследованной группы больных обнаружено, что уровень TUNEL положительных гепатоцитов и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата у больных ХГ С достоверно превышает значения такового в печени больных ХГ В. Кроме того, обнаружено, что у больных с умеренной степенью гистологических изменений уровень апоптоза клеток печени значительно превышает уровень TUNEL-поло-жительных гепатоцитов у пациентов с минимальной и низкой активностью гепатита.

Полученные данные о значительном количестве гепатоцитов в состоянии апоптоза (от 12 до 65%) у больных ХГ В и С изменяют сложившееся ранее представление о некрозе как об основной форме гибели клеток печени при этих заболеваниях и подчеркивают важную роль апоптоза в патогенезе хро-

нических вирусных гепатитов. Обнаруженное нами значительное количество клеток печени в состоянии апоптоза, как уже отмечалось, скорее всего представляет собой следствие не цитопатического действия вирусов, а результат повреждения гепатоцитов при взаимодействии Fas-антигена клетки-мишени и Fas-лиганда активированного Т-лимфоцита. Чтобы оценить возможную роль этой системы в поражении клеток печени при хронических вирусных гепатитах, мы исследовали уровень экспрессии белков Fas и FasL на гепатоцитах и клетках лимфогистиоцитарного инфильтрата.

При оценке результатов иммуногистохимического окрашивания мы выделяли, как и ранее, два типа клеток в ткани: гепатоциты и клетки лимфогистиоцитарного инфильтрата. При этом отдельно оценивали уровень экспрессии белков Fas и FasL гепатоцитами вблизи портального тракта и вблизи центральной вены. Необходимо отметить, что достоверных отличий в степени экспрессии Fas и FasL перицентральными и пе-рипортальными гепатоцитами выявлено не было, в связи с чем мы приводим усредненный показатель экспрессии исследуемых белков гепатоцитами. Для количественной оценки уровня экспрессии белков Fas и FasL были введены такие показатели как Fas-индекс и FasL-индекс, отражающие долю окрашенных и, следовательно, экспрессирующих антиген клеток.

В результате проведенных исследований во всех контрольных биоптатах печени (п=8) была обнаружена экспрессия Fas-антигена. На рис. 2А, слева представлен участок паренхимы печени пациента, оперированного по поводу стеноза портальной вены. Как видно, более 60% гепатоцитов экспрессиру-ет Fas (Fas-индекс = 3) в цитоплазме. Кроме того, наблюдается ярко выраженная экспрессия Fas в виде зерен (гранул) в цитоплазме гепатоцитов, окружающих центральную вену. Аналогичную картину наблюдали в других исследованных контрольных образцах. Средний Fas-индекс составил 2,3±0,1.

При исследовании образцовткани печени из группы сравнения экспрессии FasL практически не обнаружено (рис. 2А справа).

Рисунок 2. Экспрессия Fas и FasL гепатоцитами и клеткамилимфоци-тарного инфильтрата при хронических гепатитах В и С: нормальная печень (А); лимфогистиоцитарный инфильтрат при хроническом гепатите В (Б); лимфогистиоцитарный инфильтрат при хроническом гепатите С (В). Слева — окрашивание антителами к Fas, справа - к FasL, увеличениех 400.

Так же как и при исследовании контрольных образцов, на всех препаратах биоптатов печени больных ХГ В и С была обнаружена выраженная экспрессия Fas (рис. 2 Б, В слева).

Гепатоциты больных экспрессируют Fas главным образом в цитоплазме, иногда в виде зерен, и частично на мембране, причем примерно в равной степени как в перипортальной области, так и внутри дольки, вблизи центральной вены. Выраженная экспрессия Fas обнаружена среди клеток воспалительного инфильтрата (рис. 2 Б, В слева).

При подсчете Fas-положительных клеток показано, что уровень экспрессии Fas на гепатоцитах больных ХГ В и С достоверно не различался, в отличие от такового для клеток воспалительного инфильтрата: при ХГ С клетки воспалительного инфильтрата экспрессируют Fas в достоверно большей степени (табл. 5.).

Таблица 5. Уровень экспрессии белков Fas и FasL па гепатоцитах и клетках лимфогистиоцитарного инфильтрата в био-птатах печени при хронических гепатитах В и С

N Исследуемая Уровень экспрессии, усл. ед.

группа Fas FasL

(А) Гепатоциты инфильтрата (В) Клетки (А) Гепатоцить инфильтрат; (В) Клетки

1 Хронический гепатит В 2,3±0,2 0,9±0,2 * 0,8+0,1 *** 1,1 ±0,3

2 Хронический гепатит С 2,1+0,2 2,3+0,2 ** 1,0±0,2 ***

3 Контрольная группа (группа сравнения) 2,3+0,1 )шф|иырлт отсутствует 0,2+0,1 инфильтрат исутстпует

* - отличие в экспрессии антигена на гепатоцитах и клетках воспалительного инфильтрата внутри одной исследуемой группы, рА.„< 0.05 ** - отличие в экспрессии антигена на клетках одного типа между группами больных с ХГ В и С, р | 2 < 0.05

*** - отличие в экспрессии антигена при ХВГот нормы, р 13 2} < 0.05

Экспрессия FasL обнаружена на гепатоцитах (примерно в равной степени на гепатоцитах больных ХГ В и С) и на клетках воспалительного инфильтрата. Уровень экспрессии FasL на клетках инфильтрата при ХГ В был очень низким, а при ХГ С - высоким (рис. 2 Б, В справа, табл. 5.). При сравнении степени экспрессии Fas и FasL на клетках печени больных хроническим вирусным гепатитом и контрольных образцах показано, что гепатоциты больных и здоровых людей в равной степени экспрессируют Fas, однако в здоровой печени экспрессия Fas часто обнаруживается в виде цитоплазматических гранул. В то же время гепатоциты больных в незначительной степени экспрессируют FasL, в отличие от нормальной печени, где исследованный маркер, как правило, не обнаруживался (рис. 2 А справа, табл. 5). Экспрессия FasL наблюдалась также на клетках воспалительного внутрипеченочного инфильтрата.

При сопоставлении уровня апоптоза гепатоцитов с результатами иммуногистохимического исследования уровня экспрессии FasL клетками печени обнаружены следующие взаимосвязи:

1) прямая, статистически значимая корреляция уровня апоптоза гепатоцитов больных ХГ В и С с уровнем экспрессии FasL клетками лимфогистиоцитарного инфильтрата (г= 0.5, р=0.04);

2) обратная корреляция уровня апоптоза гепатоцитов с уровнем экспрессии FasL гепатоцитами (г= - 0.5, р=0.01).

Эти данные подтверждают роль белка FasL лимфоцитов инфильтрата в индукции апоптоза гепатоцитов, а также указывают на защитную роль экспрессии FasL гепатоцитов от индукции апоптоза, индуцированного лимфоцитами инфильтрата.

Необходимо отметить, что значимой корреляции уровня апоптоза гепатоцитов и уровня экспрессии Fas и FasL ни с ИГА, ни со степенью фиброза у исследованной группы больных выявлено не было. В то же время при сопоставлении результатов исследования уровня апоптоза клеток печени и

уровня экспрессии в них Fas и FasL с наличием жировой дистрофии гепатоцитов обнаружены:

1) обратная корреляция уровня апоптоза гепатоцитов i больных ХГ В и С с наличием жировой дистрофии гепатоцитов (р=0,03, рис. ЗА), особенно в группе больных с ХГ С (р=0.002);

2) прямая корреляция уровня экспрессии FasL на гепато-цитах и наличием жировой дистрофии гепатоцитов (р=0,045; рис. ЗБ)

i

Рисунок 3. Связь уровня апоптоза гепатоцитов (ТиМЕЛ-индекс.Уо, А) и уровня экспрессии Ли! на гепатоцитах (ГазЬ-индекс, усл. ед., Б) больных хроническими гепатитами В и С с наличием жировой дистрофии гепатоцитов.

* - различия достоверны, р<0,05

Исследование уровня апоптоза в сравнении со степенью повреждения ДН К в мононуклеарных и полиморфноядерных

лейкоцитах периферической крови больных хроническими гепатитами В и С

Результаты исследования уровня апоптоза мононуклеар-ных и полиморфноядерных ЛПК 58 больных ХГ В и С и 15 здоровых добровольцев в качестве группы сравнения представлены на рисунках 4-5. Обнаружено, что количество клеток обоих типов в состоянии апоптоза у больных ХГ достоверно превышает значения такового в контрольной группе как непосредственно после выделения, так и после инкубации в течение суток. При этом доля свежевыделенных лимфоцитов в состоянии апоптоза составила 1,2 ± 0,2% у здоровых доноров и 7,7 ± 1,3% у больных хроническим вирусным гепатитом (р < 0,05), а гранулоцитов - 9,2 ± 1,6% и 15,3 ± 1,8% (р < 0,05), соответственно. Доля клеток в состоянии апоптоза после инкубации в течение 24 часов in vitro в питательной среде составила 3,6 ± 0,7% и 15,4 ± 2,4% (р < 0,05) для лимфоцитов здоровых и больных, соответственно и 22,0±3,0% и 36,2±3,2% (р < 0,05) для гранулоцитов здоровых и больных, соответственно.

45

40

f 35

9 30

| 25

л 20

в 15

а

10

5

0

Dl-kcpufcue лвКЦ wcmmm м»м □ Ьалкчмг ХЙГ

=П1

0 24

Rprtta кv ,. 1 и»и-.жt.

Рисунок 4. Динамика апоптоза лимфоцитов периферической крови здоровых добровольцев и больных хроническим вирусным гепатитом непосредственно после выделения и через 24 ч инкубации в кулыпуральной среде * - отличия от контроля, р<0,05

1 * .....-л А 1 г и

с 1 « 2 ' / г ш

Рисунок 5. Анализ апоптоза методом проточной цитофлуоримет-рии в гранулоцитах периферической крови здорового добровольца (А) и больного хроническим гепатитом С (Б) через 24 ч инкубации клеток в кулыпуральной среде. Гистограмма, отражающая клеточный цикл гра-нулоцитов. По оси абсцисс — интенсивность флуоресценции, по оси ординат — количество клеток. 1 — пик диплоидной ДНК, соответствует фазе СО/Б! клеточного цикла, 2 — пик гиподиплоидной ДНК, соответствует клеткам в состоянии апоптоза.

Для исследования структуры ДНК лейкоцитов периферической крови использовался метод определения скорости щелочной денатурации ДНКлизатов клеток. Измеряемый показатель О обратно пропорционален количеству однонитевых разрывов и/или щелочелабильных сайтов в ДНК клеток, и таким образом позволяет судить о целостности нативной ДНК. Величина О тем выше, чем меньше повреждений содержит ДНК клеток. Как видно из таблицы б, скорость щелочной денатурации ДНКлимфоцитов и гранулоцитов периферической крови общей группы исследованных больных увеличена в сравнении с нормой, что свидетельствует о наличии значительного уровня повреждений ДНК этих клеток.

Таблица 6. Скорость щелочной денатурации ДНК, Д лейкоцитов периферической крови здоровых доноров и больных хроническими гепатитами В и С

Исследуемая группа Скорость щелочной денатурации ДНК, Б, усл. ед.

Лимфоциты Гранулоциты

Здоровые доноры, п=15 85,5 ±2,3 85,8+ 1,8

Больные ХГ, п=34 80,9 ± 3,2 72,7 ±4,6*

А: ХГ В, п=12 ХГ С, п=22 80,2±2,2 81,3+4,9 72,8±6,6* 72,7+5,9

Б: цирроз, п=12 ХГ, п=22 79,7+6,4 78,1 ±8,7

81,5+3,7 70,3+5,5*

* - отличия от контроля достоверны, р < 0,05

Обнаружено, что доля свежевыделенных ЛПК в состоянии апоптоза пропорциональна увеличению степени повреждения ДНК этих клеток, но эта зависимость была статистически малозначимой (г= - 0,2, р=0,33 для лимфоцитов и г= -0,02, р=0,88 для гранулоцитов). В то же время доля ЛПК в состоянии апоптоза после инкубации в питательной среде в течение 24 часов с высокой значимостью коррелировала со степенью повреждения ДНК свежевыделенных лимфоцитов и гранулоцитов (г= - 0,3, р=0,03 для лимфоцитов и г= - 0,4, р=0,004 для гранулоцитов). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что регистрация однонитевых разрывов ДНК является тестом для выявления клеток на ранних стадиях апоптоза. Регистрируемое по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК накопление повреждений ДНК в значительной мере определяется не столько появлением в периферическом русле клеток в состоянии апоптоза, сколь-

ко клеток, коммитированных к апоптозу, находящихся на самых ранних стадиях этого процесса.

При проведении экспериментов по определению уровня апоптоза ЛПК больных хроническим вирусным гепатитом у части больных из исследованной нами группы (88 из 130) совместно с докторантом кафедры пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М. Сеченова С.Н. Маммаевым и аспирантами кафедры Ю.О. Шульпековой и А.Е. Грязиным были исследованы уровни сывороточных цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-12, TNF-a, ИФН-у) с помощью иммуноферментного метода. Из исследованной группы пациентов ХГ В диагностирован только у 4, поэтому они не были включены в обработку полученных результатов. Таким образом, приведенные ниже результаты относятся только к больным ХГ С.

Анализ уровня апоптоза ЛПК в сравнении с уровнем сывороточных цитокинов у больных ХГ С. При определении концентрации цитокинов в сыворотке крови достоверное отличие от группы контроля (р<0,05) было получено для Т^-а и ИФН-у (рис. 6). Различие между группами ХГ С и ХВАГ было недостоверным. Не было получено достоверных отличий по сравнению с группой контроля сывороточных концентраций ИЛ-10 и ИЛ-12.

ИФН-У тот-а ИЛ-10 ИЛ-12

Рисунок 6. Концентрация сывороточных цитокинов у больных хроническим гепатитом С, хроническим вирусно-алкогольным гепатитом и группы контроля до лечения

Сопоставление уровня апоптоза ЛПК с сывороточной концентрацией TNF-a представляет особый интерес в связи с провоспалительной и проапоптотической функцией последнего. При проведении корреляционного анализа взаимосвязи уровня сывороточного TNF-б и уровня апоптоза ЛПК у исследованных больных было обнаружено, что уровень апоптоза свежевыделенных клеток пропорционален концентрации TNF-a, но эта зависимость была статистически малозначимой (г=0,04, р=0,89 для лимфоцитов и г=0,3, р=0,27 для гранулоцитов, рис. 7А и 8А). В то же время уровень апоптоза ЛПК больных ХВГ после 24 часов инкубации в полной питательной среде in vitro с высокой значимостью коррелируете уровнем сывороточногоTNF-аутаких больных (г=0,9, р=0,0001 для лимфоцитов и г=0,7, р=0,004для гранулоцитов, рис. 7Б и 8Б).

го-,

о -J—i—•—i—<—I—■—I—■—I—<—I—<—1

ю го зо до so во 70

V(>пщ-НТМ-'-О, ПГЧ.1

Рисунок 7. Корреляция уровня апоптоза свежевыделенных лимфоцитов (А) и лимфоцитов через 24 ч инкубации в культуральной среде (Б) с уровнем ШГ-а в сыворотке крови.

о * " Т ■ '--1-1-1-'-!-•-Г—1-1-'-Ч

ю го зо до и 60 го

>'/»«|м-Н(. 1 -М'-а, 1м .к.]

Рисунок. 8. Корреляция уровня апоптоза свежевыделешшх грапуло-цитов (А) и граиулоцитов через 24 ч инкубации в кулыпуральной среде (Б) с уровнем ТЫР-а. в сыворотке крови.

Достоверной связи уровня апоптоза с концентрацией других исследованных цитокинов не выявлено.

Сравнительная характеристика апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных хроническим вирусным гепатитом и синдромом аутоиммунного перекреста

С целью установления различий в интенсивности апоптоза у больных хроническими вирусными и аутоиммунными заболеваниями печени нами выполнено сравнительный анализ апоптоза периферических лейкоцитов у больных ХГ В и С и САП (аутоиммунный гепатит + первичный билиарный цирроз). Число лейкоцитов периферической крови в состоя-

нии спонтанного апоптоза в группе больных САП также было достоверно выше в сравнении с показателями контрольной группы (таблица 7).

Таблица 7. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов периферической крови здоровых допоров и больных синдромом аутоиммунного перекреста

Больные САП, п=20 Контроль, п=20

Уровень спонтанного апоптоза,% 9,9 + 0,83* 4,2 ± 0,1

* - отличия от контроля достоверны, р < 0,05

Сравнение средних уровней спонтанного апоптоза общей фракции лейкоцитов в группах хронического вирусного гепатита и САП продемонстрировало отсутствие достоверных различий между группами ХГ В и САП и ХГ С и САП, что указывает на общность механизмов апоптоза при вирусных и аутоиммунных поражениях печени.

Сравнительная характеристика больных хроническим гепатитом С и хроническим вирусно-алкогольным гепатитом (HCV + алкоголь)

Достоверных различий по показателям физикального исследования пациентов, клинического анализа крови, по уровням активности AJ1T и ACT между группами больных ХГ С и ХВАГ не выявлено. В группе больных ХВАГ отмечались несколько более высокие показатели г-глутамилтранспептида-зы по сравнению с группой ХГС (69,8±26,3 ед/л и 50,1 + 19,9 ед/л), не достигавшие, однако, статистически значимых различий. Также между группами отсутствовали достоверные различия по ИГА (8,2+3,1 и 8,6±4,3 балла соответственно) и

индексу фиброза (1,9±0,8 и 2,1±1,1 балла соответственно, Р > 0,05).

До начала лечения уровень апоптоза МЛПК был достоверно выше у больных ХГ С по сравнению с таковым в контрольной группе: 4,7± 1,5 Ув. 0,81+0,5%, р<0,05. Аналогичный результат получен в группе ХВАГ: уровень апоптоза моно-нуклеарных ЛПК составил 2,9±1,9% (рис. 9) Достоверных различий между группами ХГ С и ХВАГ не выявлено, однако имела место тенденция к несколько меньшему уровню апоптоза в группе вирусно-алкогольного гепатита. При определении концентрации цитокинов в сыворотке крови достоверное отличие от группы контроля (р<0,05) было получено для ИФН-у и Т^-а в обеих группах пациентов (рис. 6).

Результаты комбинированной противовирусной терапии и апоптоз мононуклеаров периферической крови

54 пациентам с хронической НСУ-инфекцией — ХГ С и ХВАГ — проведена комбинированная терапия ИФН-а и риба-вирином (см. «Материалы и методы»). Для удобства обработки и интерпретации результатов в качестве точки оценки эффективности лечения принят срок 24 нед. Вместе с тем в соответствии с общепринятыми принципами ведения пациентов с хронической НСУ-инфекцией у больных, инфицированных 1-м генотипом НО/, при снижении вирусной нагрузки на 12 нед лечения более чем в 100 раз ПВТ продлевалась до 48 нед.

У 29 пациентов (53,7%) 24-недельная комбинированная ПВТ привела к элиминации НСУРНК. Из них доля больных ХГ С составила 19 человек (65,5%), ХВАГ - 10 человек (34,5%). В группе ответивших на ПВТ наблюдалось раннее — через 2 недели после начала ПВТ —усиление апоптоза МЛПК, достоверно более выраженное в группе ХГ С по сравнению с больными ХВАГ (8,9% уз. 3,6%, р<0,05) (рис. 10). В группе

пациентов с ХГ С, ответивших на ПВТ, отмечена корреляция снижения уровня вирусной нагрузки с усилением апоп-тоза через 2 недели комбинированной терапии (рис. 11). В группе ХВАГ подобной корреляции выявлено не было. В группе пациентов, не ответивших на комбинированную терапию, достоверного усиления апоптоза в ответ на лечение зафиксировать не удалось. Следует отметить, что первичный биохимический ответ на ПВТ отмечен у всех пациентов вне зависимости от достижения вирусологического ответа.

На фоне 24-недельной комбинированной ПВТ зафиксировано достоверное снижение сывороточной концентрации TNF-a (рис. 12). Значимой динамики уровней других определявшихся цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-12, ИФН-у) не отмечено.

Из общего числа больных, которым проводилась ПВТ, у 13 пациентов (24%) удалось проследить развитие устойчивого вирусологического ответа, который фиксируется через 6 мес после окончания курса ПВТ. Из них 3 больных (23%) были исходно инфицированы 2а генотипом вируса, 8 (62%) -За и 2 (15%) - 1Ь. Из числа пациентов с устойчивым вирусологическим ответом больные ХВАГ составили 4 человека (31%). У 10 пациентов (77%), ответивших на ПВТ стойкой элиминацией НСУ, наблюдалось усиление апоптоза МЛ ПК через 2 недели лечения.

Рисунок 9. Апоптоз мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных хроническим гепатитом С, хроническим вирусно-алко-гольным гепатитом и группы контроля до лечения

Апоптоз МПК до и после лечения

*

г

Рисунок 10. Апоптоз мопонуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных хроническим гепатитом С и хроническим вирусно-алко-гольным гепатитом до лечения и через 2 нед противовирусной терапии

Корреляция между уровнем апоптоза МПК и вирусной нагрузкой

Вирусной ню -

нагрузки.

¡0 тыс. хи -

копии МП

60 -

4« -

20 •

й '

«2-46 V

-I апотпазя «ононукпелрое,

Рисунок //. Корреляция уровня апоптоза моаонуклеарных лейкоцитов периферической крови больных хроническим гепатитом С с уменьшением вирусной нагрузки через 2 нед противовирусной терапии.

50 40 30 20 10 0

Т^-а

ИФН-у ИП-10 ИП-12

□ До печения

в Через 6 мес лечения

Рисунок 12. Динамика сывороточной концентрации цитокинов на фоне. 24-недельной комбинированной противовирусной терапии; различия достоверны для ТЫР-а, р <0,05

выводы

1. Апоптоз служит основным механизмом гибели как ге-патоцитов, так и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата у больных хроническим гепатитом (ХГ) В и С, при этом доля клеток в состоянии апоптоза у больных ХГ С достоверно больше, чем у больных ХГ В.

2. Гепатоциты больных ХГ В и ХГ С, также как и гепато-циты лиц контрольной труппы экспрессируют белок Fas либо в цитоплазме (диффузно или в виде гранул), либо на клеточной мембране. Количественных различий в уровне экспрессии белка Fas в гепатоцитах при ХГ В, ХГ С и в группе контроля не обнаружено.

3. В норме гепатоциты практически не экспрессируют FasL, однако его экспрессия наблюдается при ХГ В (0,8±0,1) и ХГ С (0,9±0,2). Индуцируемая вирусами экспрессия FasL приводит к появлению гепатоцитов с цитотоксическим фенотипом и служит одним из механизмов элиминации цитотоксических лимфоцитов инфицированными вирусом гепатоцитами.

4. Обнаружено, что уровень апоптоза гепатоцитов при ХГ В и С прямо пропорционален степени экспрессии FasL клетками лимфогистиоцитарного инфильтрата в печени (г=0,5, р=0,04) и обратно пропорционален уровню экспрессии FasL гепатоцитами (г=-0,5, р=0,01), что указывает на взаимодействие Fas - FasL как на ведущий механизм патогенеза хронических вирусных гепатитов.

5. Уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноя-дерныхлейкоцитов периферической крови больных ХГ В и ХГ С достоверно превышает уровень апоптоза этих клеток у здоровых лиц: 7,7+1,3 и 1,2±0,2; 15,3+1,8 и

9,2±1,6, соответственно (р < 0,05). Достоверных различий между интенсивностью апоптоза при ХГ В и ХГ С не выявлено.

6. В периферической крови больных ХГ В и ХГ С присутствуют не только лейкоциты в состоянии апоптоза, но и коммитированные к нему клетки, что проявляется усилением апоптоза мононуклеарных и полиморфно-ядерных лейкоцитов после 24-часовой инкубации в культуральной среде.

7. У больных ХГСдостоверно повышены сывороточные концентрации ИФН-у и ТЫР-а. Выявлена прямая корреляционная связь уровня апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови больных ХГ С и сывороточной концентрации Т^-а (г=0,9, р=0,0001; г=0,7, р=0,004, соответственно).

8. Статистически значимые различия между уровнем апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных ХГ В и С и синдромом аутоиммунного перекреста (аутоиммунный гепатит + первичный билиарный цирроз) отсутствуют, что свидетельствует о роли апоптоза в качестве унифицированного механизма повреждения клеток.

9. Усиление апоптоза мононуклеарныхлейкоцитов периферической крови у больных ХГ С через 2 нед комбинированной противовирусной терапии интерфероном-б и рибавирином служит ранним признаком элиминации вируса (корреляция с уменьшением виремии г=0,58; р=0,045).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Исследование апоптоза МЛ ПК при ХВГ представляет собой недорогую методику, позволяющую быстро и эффективно оценивать динамику течения заболевания, в том числе на фоне применения различных лекарственных препаратов.

Определение апоптоза МЛПК в процессе комбинированной противовирусной терапии ХГС интерфероном-би рибавирином дает возможность прогнозировать достижение быстрого и, соответственно, устойчивого вирусологического ответа.

Применение методики определения апоптоза МЛПК в процессе противовирусной терапии ХГ С нецелесообразно у пациентов с сочетанным алкогольным поражением печени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Буеверов А.О.Дихонина Е.В., Москалева ЕЛО, Белуш-кина H.H., Попова О.Н., Ивашкин В.Т., Северин Е.С. Апоп-тоз и повреждение ДНК лейкоцитов периферической крови у больных хроническим гепатитом // Росс. журн. гастроэн-терол. гепатол. колопроктол. — 2000. - №1 (прил. 9). - С. 25.

2. БуеверовА.О.,Тихонина Е.В., Москалева Е.Ю., Белуш-кина H.H., Попова О.Н., Ивашкин В.Т., Северин С.Е., Северин Е.С. Апоптоз периферических лейкоцитов при хронических HBV- и HCV-инфекциях // Росс. журн. гастроэнте-рол. гепатол. колопроктол. - 2000. - № 6. - С. 33-36.

3. Москалева Е.Ю., Тихонина Е.В., Буеверов А.О., Караулов A.B. Повреждение ДНК и вторичные иммунодефицит-ные состояния при различных заболеваниях // В сб.: «Успехи клинической иммунологии и аллергологии». Под ред. A.B. Караулова. - Т.1 - М. - 2000. - С. 38-71.

4. Буеверов А. О., Дмитриева Е. В., Москалева Е.Ю., Коган Е.А., Северин Е.С., Ивашкин В.Т. Система Fas/FasLnpn хронических вирусных гепатитах // Росс. журн. гастроэнте-рол. гепатол. колопроктол. — 2001. - № 5 (прил. 15). - С. 71.

5. Буеверов А.О., Дмитриева Е.В., Москалева Е.Ю., Коган Е.А., Ивашкин В.Т., Северин Е.С. Иммунопатогенезхронических вирусных гепатитов // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. — 2001. - №5 (прил.15). - С. 76.

6. Буеверов А.О., Маммаев С.Н. Апоптоз лимфоцитов крови у больных хроническим гепатитом С // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. -2001. - №5 (прил.15). -С. 82.

7. Маммаев С.Н., Шульпекова Ю.О., Лукина Е.А., Буеверов А.О., Левина A.A., Маевская М.В., Ивашкин В.Т. Иммунные механизмы повреждения печени при хроническом вирусном гепатите С (ХВГ С) // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. — 2002. - №1 (прил. 16). - С. 29.

8. Буеверов А.О., Маммаев С.Н., Шульпекова Ю.О., Лукина Е.А., Левина A.A., Маевская М.В., Ивашкин В.Т. Функциональная активность системы мононуклеарных фагоцитов у больнных хроническими диффузными заболеваниями печени // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопрок-тол. - 2002. - №1 (прил.16). - С. 29.

9. Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., Бондаренко О.Ю., Буеверов А.О., Осадчук A.M., Коган Е.А., Склянская O.A., Москалева Е.Ю., Дмитриева Е.В., Северин С.Е., Креветный И.М. Процессы апоптоза и пролиферации при патологии желудочно-кишечного тракта и печени // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. — 2002. - №6. - С.38-43.

Ю.Дмитриева Е.В., Москалева Е.Ю., Коган Е.А., Буеверов А.О.,

Белушкина H.H., Северин Е.С., Ивашкин В.Т., Пальцев М.А. Роль системы Fas/Fas-лиганд в индукции апоптоза ге-патоцитов при хронических вирусных гепатитах // Арх. па-тол. - 2003. - Т. 65. - №6. - С. 13-16.

11. ГрязинА.Е., Буеверов А.О., Шмаров Д.А., Маевская М.В., Шептулин A.A., Ивашкин В.Т. Апоптоз лимфоцитов периферической крови при хронических вирусных и вирус-но-алкогольных гепатитах // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. - 2005. - №1 (прил.24). - С. 10.

12. Буеверов А.О., Грязин А.Е., Шмаров Д.А., Маевская М.В., Шептулин A.A., Ивашкин В.Т. Апоптоз лимфоцитов периферической крови при хроническом вирусном гепатите и противовирусная терапия // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. - 2005. - №1 (прил.24). - С. 10.

13. ГрязинА.Е., БуеверовА.О., ШмаровД.А., Маевская М.В., Шептулин A.A., Ивашкин В.Т. Апоптоз лейкоцитов периферической крови и цитокиновый профиль у больных хроническим гепатитом // Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения. Материалы 5-й Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием. — Красноярск. - 2005. - С. 183.

14. Буеверов А.О. Апоптоз при хронических вирусных гепатитах: от лабораторных исследований к клинической практике // Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения. Материалы 6-й Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием. - Красноярск. - 2006. -С.314-325.

15. Грязин А.Е., Буеверов А.О., Ивашкин В.Т., Шепту-лин A.A., ШмаровД.А.

Апоптоз мононуклеаров периферической крови при хроническом гепатите С и хроническом вирусно-алкогольном гепатите // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. — 2005. - №4.-С. 35-41.

16. Грязин А.Е., Буеверов А.О., Шмаров Д.А., Маевс-кая М.В., Шептулин A.A., Ивашкин В.Т. Апоптоз моноцитов периферической крови при хроническом вирусном гепатите до и после противовирусного лечения // Росс, журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. — 2005. - №5 (прил. 25). - С. 71.

17. Буеверов А.О., Грязин А.Е. Клинические аспекты изучения апоптоза при хронических вирусных гепатитах// Росс, журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. - 2006. - №2. -С. 4-10.

18. Буеверов А.О., Грязин А.Е., Ивашкин В.Т., Шептулин A.A. Апоптоз мононуклеаров периферической крови и оценка эффективности противовирусной терапии хронического гепатита С // Клин, медицина. — 2006. - № 9. - С. 39-44.

19. Буеверов А.О. Некоторые аспекты изучения апоптоза при хронических вирусных гепатитах// Клин, перспект. гастроэнтерол. гепатол. — 2009. - № 2. - С. 11-17.

20. Буеверов А.О., Киселева О.Ю., Ивашкин В.Т., Белуш-кина H.H., Москалева Е.Ю., Широкова E.H., Маевская М.В. Сравнительная характеристика апоптоза периферических лейкоцитов при вирусных и аутоиммунных заболеваниях печени // Росс. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. — 2009. - №4. -С. 41-47.

Актуальность проблемы. Хронические вирусные гепатиты В и С (ХГ В и С) в последние два десятилетия относятся к числу наиболее интенсивно изучаемых проблем гепатологии. Эти болезни характеризуются высокой медицинской и социальной значимостью ввиду широкого распространения, тенденции к росту заболеваемости, особенно среди лиц молодого возраста, нередкого развития тяжелых осложнений — цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы и недостаточной эффективностью существующих методов лечения. Применение современных методов молекулярной и клеточной биологии позволило значительно расширить имеющиеся представления о биологии вирусов гепатита В и С (HBV, HCV). Так, установление факта репликации HBV и HCV помимо печени в мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитах периферической крови больных ХГ В и С объяснило природу ряда внепече-ночных проявлений HBV- и HCV-инфекции [40, 47, 121, 160, 167, 189]. Вместе с тем многие вопросы патогенеза вирусных гепатитов остаются не до конца проясненными, в частности, механизмы повреждения гепатоцитов. Открытие апоптоза [88] стимулировало изучение роли этого явления в патологии печени, в результате чего было обнаружено, что апоптоз может играть ведущую роль в развитии острых и хронических вирусных гепатитов [74, 116], а также ряда других заболеваний печени, включая алкогольные, аутоиммунные, лекарственные поражения.

На клеточном уровне постоянно протекающие деление и рост должны сопровождаться альтернативным процессом удаления рудиментарных клеток в эмбриональном периоде, а на протяжении всей жизни — старых, поврежденных, мутировавших клеток, а также клеток с измененными антигенными свойствами. Высокорегулируемую форму программированного прекращения жизнедеятельности клетки с характерными морфологическими и биохимическими признаками определяют как апоптоз (греческое слово, соответствующее листопаду: аро — отделение, ptosis — падение).

Апоптозу принадлежит важнейшая роль в регуляции как физиологических, так и патологических процессов [4, 7, 51, 111, 124]. И подавление, и неадекватное усиление апоптоза ведет к патологическим изменениям органов и тканей. В то время как избыточная активация апоптоза, наблюдаемая, в частности, при инфицировании клеток печени гепатотропными вирусами, обусловливает разрушение печеночной ткани, ослабление апоптотической гибели клеток (вызванное, к примеру, мутацией гена, кодирующего проапоптогенный белок р53) служит одним из важнейших факторов канцерогенеза.

При гепатите наиболее важным диагностическим и прогностическим признаком считается некроз паренхимы печени, который, однако, значительно отличается от типичных признаков омертвения, наблюдаемых морфологом в других органах. Прежде всего в ткани печени отсутствуют некротизированные гепатоциты, а видны лишь участки печеночной дольки, замещенные мононук-леарными инфильтратами. Вторая особенность — отсутствие полиморфно-ядерных лейкоцитов (за исключением острого алкогольного гепатита) — стереотипной реакции на некроз во всех тканях. Следовательно, в большинстве случаев хронического поражения печени, в том числе при инфекции гепатот-ропными вирусами, основным механизмом гибели клеток служит апоптоз. За много лет до открытия апоптоза был описан характерный гистологический признак вирусного гепатита — округлые гомогенные эозинофильные образования, часто содержащие пикнотичное ядро. Эти образования, названные тельцами Каунсильмена, представляют собой ни что иное, как гепатоциты в состоянии апоптоза [4, 51].

Основные отличия апоптоза от некроза

Апоптоз Некроз

Физиологический или патологический Патологический

Регулируемый процесс Нерегулируемый или слабо регулируемый процесс

Плазматическая мембрана интактна до поздней стадии Плазматическая мембрана разрушается в начальной стадии

Инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами отсутствует или минимальна Лейкоцитарная инфильтрация присутствует в большинстве случаев

Кариопикноз, кариорексис, фрагментация ДНК Набухание (онкоз) цитоплазмы и митохондрий

Образование апоптозных телец с последующим их фагоцитозом или вторичным некрозом Разрушение и дезинтеграция клетки

При вирусном гепатите апоптоз может быть результатом как прямого повреждающего действия вирусной инфекции (цитопатическое действие), так и опосредованного, развивающегося в результате иммунных реакций. Традиционно считалось, что вирусы вызывают гибель клеток в результате узурпации механизмов транскрипции и трансляции и разрушения клеточной мембраны, однако в настоящее время не вызывает сомнений, что большая часть вирусов индуцирует апоптоз инфицированной клетки [86, 179]. Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых вирусы гепатита В и С теоретически могут активировать апоптоз: 1) непосредственное проапоптотическое действие специфических вирусных белков, образующихся в процессе репликации вируса: X белка HBV [87,138,185] и соге-белка HCV[75, 83,151]; 2) повышение экспрессии на клеточной мембране тех рецепторов, через которые передается сигнал к индукции апоптоза, например, Fas [74], и увеличение чувствительности клеток к различным проапоптотическим стимулам, в частности, к фактору некроза опухоли а (ФНО-а, TNF-a) [43, 162, 166, 187].

Другой, и, по-видимому, наиболее существенный механизм гибели инфицированных гепатоцитов — апоптоз в результате клеточного иммунного ответа, в особенности опосредованного цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Исследования последних лет подтверждают ведущую роль ЦТЛ не только в клиренсе вируса, но и в патогенезе повреждения печени при вирусных гепатитах [34-36, 94, 142]. ЦТЛ вызывают апоптоз инфицированных клеток с помощью перфорин-гранзимового комплекса и через систему Fas/FasL в результате взаимодействия растворимого или экспрессированного на поверхности активированных лимфоцитов FasL с Fas-рецептором клеток-мишеней. Они также нарушают репликацию вируса и экспрессию вирусных белков в инфицированной клетке посредством секреции таких цитокинов, как интерферон-у (ИФН-у) и TNF-а [29]. Анализ литературы показал, что система Fas/FasL может играть ведущую роль в повреждении клеток печени при вирусных гепатитах [57, 90, 130], о чем, в частности, свидетельствует обнаружение конститутивной экспрессии белка Fas гепатоцитами и выявление в печени пациентов с ХГ В или С в зонах активного воспаления активированных лимфоцитов, экспрессирующих FasL [68].

В понимании патогенеза вирусных гепатитов крайне важным явилось обнаружение репликации вирусов гепатита В и С в лейкоцитах периферической крови (ЛПК) человека. Это позволило рассматривать ЛПК как дополнительную мишень действия вирусов и дополнительный резервуар инфекции. Персистен-ция HBV и HCV в этих клетках может стать причиной их поражения в результате индукции апоптоза, что должно привести к нарушению функций иммунной системы.

Изучение апоптоза при хронических вирусных гепатитах имеет не только фундаментальное, но и прикладное клиническое значение. Во-первых, исследование процессов, ведущих к апоптозу клеток печени, дает возможность понять причины хронизации и прогрессирования воспаления печени и, что не менее важно, механизмы злокачественной трансформации и противоопухолевой защиты. Во-вторых, изучение апоптоза позволяет разрабатывать новые методы терапии, в частности, уменьшающие избыточную гибель гепатоцитов. В-третьих, применение методов экспресс-оценки апоптоза быстро обновляющихся популяций клеток помогает прогнозировать ответ на противовирусное лечение.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении роли апоптоза гепатоцитов и лейкоцитов периферической крови в патогенезе хронических гепатитов В и С.

В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи исследования.

1. Исследование уровня апоптоза гепатоцитов и клеток воспалительного инфильтрата в биоптатах печени больных ХГ В и ХГ С.

2. Определение уровня экспрессии белков Fas и FasL в гепатоцитов и клеток воспалительного инфильтрата в биоптатах печени больных ХГ В и ХГ С.

3. Изучение взаимосвязи между уровнем апоптоза и уровнем экспрессии белков Fas и FasL в клетках печени больных ХГ В и ХГ С.

4. Исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК в мононук-леарных и полиморфноядерных ЛПК больных ХГ В и ХГ С.

5. Сравнение интенсивности апоптоза ЛПК у больных ХГ С и хроническим вирусно-алкогольным гепатитом (ХГ С + алкоголь).

6. Сравнение интенсивности апоптоза ЛПК у больных ХГ С и синдромом аутоиммунного перекреста (аутоиммунный гепатит + первичный билиарный цирроз).

7. Оценка корреляционной связи уровня апоптоза ЛПК и ряда провоспали-тельных и противовоспалительных цитокинов.

8. Сравнительная оценка уровней апоптоза ЛПК до и после проведения комбинированной противовирусной терапии ИФН-а и рибавирином.

Научная новизна. Впервые проведено исследование уровня апоптоза клеток печени и ЛПК больных ХГ В и С как двух независимых мишеней действия вирусов гепатита В и С.

Впервые изучен уровень апоптоза клеток печени (гепатоцитов и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата) в сравнении с уровнем экспрессии мембранных белков, участвующих в индукции апоптоза (Fas, FasL). Выявлена взаимосвязь между уровнем экспрессии FasL лимфоцитов внутрипеченочно-го инфильтрата и уровнем апоптоза гепатоцитов. Обнаружена защитная роль экспрессии FasL гепатоцитами от апоптоз-индуцирующего действия ЦТЛ.

Впервые проведено одновременное исследование уровня апоптоза и степени повреждения ДНК мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК у больных ХГ В и С. Обнаружено, что у больных ХГ В и С наблюдается достоверно более высокий по сравнению со здоровыми добровольцами уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных ЛПК как при изучении апоптоза све-жевыделенных клеток, так и спонтанного апоптоза при культивировании клеток in vitro в течение суток. При этом наиболее высокий уровень апоптоза ЛПК наблюдался у больных с повышенным уровнем сывороточного TNF-a.

Выявлена достоверная корреляционная зависимость степени повреждения ДНК свежевыделенных ЛПК с долей клеток в состоянии апоптоза после их инкубации в культуральной среде в течение 24 часов, что свидетельствует о наличии в периферической крови не только клеток в состоянии апоптоза, но и клеток, коммитированных к нему.

Впервые установлено, что усиление апоптоза мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК) в ответ на комбинированную противовирусную терапию служит ранним признаком элиминации HCV, выступая в роли дополнительного фактора раннего вирусологического ответа.

Практическая значимость. Обнаруженный высокий уровень апоптоза гепатоцитов при ХГ В, и особенно ХГ С, и появление экспрессии FasL на гепа-тоцитах могут быть использованы в качестве критериев оценки эффективности новых методов этиотропной и патогенетической терапии.

Обнаружено, что регистрация однонитевых разрывов ДНК может выступать в роли теста для выявления клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза или коммитированных к нему. Показано, что регистрация уровня повреждения ДНК и/или уровня апоптоза ЛПК у больных ХГ В и С относится к числу высокоинформативных показателей повреждения иммунокомпетентных клеток при этих заболеваниях и может быть использована в клинической практике для оценки динамики течения ХВГ и эффективности проводимой терапии.

Определение апоптоза МЛПК в динамике на фоне комбинированной противовирусной терапии ХГ С можно рассматривать в качестве дополнительного прогностического фактора вирусологического ответа, что позволяет своевременно вносить коррективы в схемы лечения. Отсутствие корреляции уменьшения концентрации сывороточной HCV РНК с нарастанием уровня апоптоза МЛПК указывает на необходимость тщательного сбора алкогольного анамнеза перед началом противовирусного лечения.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на 5-й, 6-й и 10-й Российской конференции «Гепатология сегодня» (март 2000 г., март 2001 г., март 2005 г., Москва), на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, май-июнь 2000), на III Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, сентябрь 2000), на Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (октябрь 2000 г., Санкт-Петербург), Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов (февраль 2001 г., Санкт-Петербург), на II Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, апрель 2001 г.), Пятой и Шестой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (май 2001 и май 2002 г., Санкт-Петербург), на 21-й Европейской Гастроэнтерологической Неделе (UEGW) (октябрь 2001 г., Амстердам), на Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (октябрь 2001 г., Санкт-Петербург), на Балтийском гепатологическом форуме (октябрь 2002 г., Рига), на 2-м Всероссийском съезде инфекционистов (октябрь 2003 г., Санкт-Петербург), на 8-й и 10-й Российской гастроэнтерологической неделе (ноябрь 2003 г., октябрь 2005 г.), на 6-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции (май 2006 г., Красноярск), на Российском медицинском форуме (октябрь 2006 г., октябрь 2007 г., Москва), на Российской конференции «Иммунная система и заболевания печени» (май 2009 г., Нахабино).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 16 статей в центральных журналах, рекомендуемых ВАК для публикаций материалов докторских диссертаций.

выводы

1. Апоптоз служит основным механизмом гибели как гепатоцитов, так и клеток лимфогистиоцитарного инфильтрата у больных хроническим гепатитом (ХГ) В и С, при этом доля клеток в состоянии апоптоза у больных ХГ С достоверно больше, чем у больных ХГ В.

2. Гепатоциты больных ХГ В и ХГ С, также как и гепатоциты лиц контрольной группы экспрессируют белок Fas либо в цитоплазме (диффузно или в виде гранул), либо на клеточной мембране. Количественных различий в уровне экспрессии белка Fas в гепатоцитах при ХГ В, ХГ С и в группе контроля не обнаружено.

3. В норме гепатоциты практически не экспрессируют FasL, однако его экспрессия наблюдается при ХГ В (0,8±0,1) и ХГ С (0,9±0,2). Индуцируемая вирусами экспрессия FasL приводит к появлению гепатоцитов с цитотоксичес-ким фенотипом и служит одним из механизмов элиминации цитотоксических лимфоцитов инфицированными вирусом гепатоцитами.

4. Обнаружено, что уровень апоптоза гепатоцитов при ХГ В и С прямо пропорционален степени экспрессии FasL клетками лимфогистиоцитарного инфильтрата в печени (г=0,5, р=0,04) и обратно пропорционален уровню экспрессии FasL гепатоцитами (г=-0,5, р=0,01), что указывает на взаимодействие Fas — FasL как на ведущий механизм патогенеза хронических вирусных гепатитов.

5. Уровень апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови больных ХГ В и ХГ С достоверно превышает уровень апоптоза этих клеток у здоровых лиц: 7,7±1,3 и 1,2±0,2; 15,3±1,8 и 9,2±1,6, соответственно (р < 0,05). Достоверных различий между интенсивностью апоптоза при ХГ В и ХГ С не выявлено.

6. В периферической крови больных ХГ В и ХГ С присутствуют не только лейкоциты в состоянии апоптоза, но и коммитированные к нему клетки, что проявляется усилением апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов после 24-часовой инкубации в культуральной среде.

7. У больных ХГ С достоверно повышены сывороточные концентрации ИФН-у и TNF-a. Выявлена прямая корреляционная связь уровня апоптоза мононуклеарных и полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови больных ХГ С и сывороточной концентрации TNF-a (г=0,9, р=0,0001; г=0,7; р=0,004, соответственно).

8. Статистически значимые различия между уровнем апоптоза лейкоцитов периферической крови у больных ХГ В и С и синдромом аутоиммунного перекреста (аутоиммунный гепатит + первичный билиарный цирроз) отсутствуют, что свидетельствует о роли апоптоза в качестве унифицированного механизма повреждения клеток.

9. Усиление апоптоза мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных ХГ С через 2 нед комбинированной противовирусной терапии ин-терфероном-а и рибавирином служит ранним признаком элиминации вируса (корреляция с уменьшением виремии г=0,58; р=0,045).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование апоптоза МЛПК при ХВГ представляет собой недорогую методику, позволяющую быстро и эффективно оценивать динамику течения заболевания, в том числе на фоне применения различных лекарственных препаратов.

2. Определение апоптоза МЛПК в процессе комбинированной противовирусной терапии ХГ С интерфероном-а и рибавирином дает возможность прогнозировать достижение быстрого и, соответственно, устойчивого вирусологического ответа.

3. Применение методики определения апоптоза МЛПК в процессе противовирусной терапии ХГ С нецелесообразно у пациентов с сочетанным алкогольным поражением печени.