Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клинико-патогенетическая взаимосвязь иммунологических показателей пуповинной крови новорожденных с формированием атопического фенотипа у детей грудного возраста

0034ьа^

На правах рукописи

Васильева Людмила Викторовна

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВЗАИМОСВЯЗЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПУПОВИННОЙ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ С ФОРМИРОВАНИЕМ АТОПИЧЕСКОГО ФЕНОТИПА У ДЕТЕЙ ГРУДНОГО ВОЗРАСТА

14.00.09 - педиатрия 14.00.36 - аллергология и иммунология, медицинские науки

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1пьЗ

Красноярск - 2009

003459415

Работа выполнена в ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН

11 ау ч 111.1 с ру ко н «д ите л и:

доктор медицинских наук,

профессор Терещенко Сергей Юрьевич

доктор медицинских паук Новицкий Иван Александрович

Официальные ошюпептм:

член корреспондент 1'ЛМ11, доктор медицинских наук,

профессор Огородова Людмила Михайловна

доктор медицинских наук,

11 рофессор Куртасова Людмила Михайловна

Ксдущаи организация: Г'ОУ ВПО «Новосибирский государствен!! медицинский университет Федерального агентства по здравоохраненш социальному развитию Российской Федерации»

Защита состоится » 2009 г. в «_» часе

На заседании диссертационной совета Д 208.037.01 при ГОУ В1 «Красноярский государственный медицинский университет им профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения социального развития Российской Федерации» по адресу: 660022, Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ В1 «Красноярский государственный медицинский университет им профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения социального развития Российской Федерации»

Автореферат разослан 3-/ * фМсв^'/и/ 2008 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.037.01 кандидат медицинских наук, доцент

Штарик С.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Атопические болезни являются самыми распространенными хроническими неинфекционными заболеваниями в детском возрасте (Куртасова JT.M., 2002; Огородова JI.M., с соавт., 2003; И.Н. Гаймоленко, И.Р. Ахметгалеева, 2004; Балаболкин И.И., 2003, 2005). Одним из наиболее значимых биологических дефектов для всей группы атонических болезней является атопия, с характерными для нее особенностями фенотипа циркулирующих лимфоцитов в виде снижения количества клеток, проявляющих активность Т-хелперов 1-го типа (Thl) и, наоборот, увеличения клеток с активностью Т-хелперов 2-го типа (Th2). Однако до настоящего времени твердо не установлено, могут ли такие особенности иммунитета формироваться внутриутробно, либо они приобретаются в постнатальный период жизни (Савченко А.А., Смирнова C.B., 2002; Огородова JI.M. с соавт., 2005; Kurzius-Spenser M., 2005).

Поскольку риск формирования атопических заболеваний в большей степени связан с предшествующими указаниями на наличие атопии у матери в сравнении с отцами, была высказана гипотеза о возможном внутриутробном влиянии микро- и макроэкологических факторов на становление иммунной системы плода, что может приводить к недостаточной активности Th-1 лимфоцитов и высокому риску приобретения атопического фенотипа (Ruiz R.G., et al., 1992; Harris J.M., et al., 2001).

Наиболее признанная в настоящее время «гигиеническая гипотеза» роста распространенности атопических болезней за последние десятилетия в качестве причины преобладания ТЪ2-ответа называет снижение стимуляции Thl естественными вирусными и микробными возбудителями в самый ранний период жизни ребенка. Известен целый ряд эпидемиологически верифицированных факторов, ассоциированных с высоким риском формирования атопии у детей: положительный семейный анамнез по атопии, малый размер и высокий социальный статус семьи, мужской пол, низкий вес при рождении, низкая частота респираторных инфекций на первом году жизни ребенка (Прахин Е.И., Терещенко С.Ю., 2000; Манчук В.Т. с соавт., 2003; Kurzius-Spenser М„ 2005).

Последние исследования в целом подтверждают роль указанных внешнесредовых факторов в формировании атопического фенотипа, однако такие исследования в основном проведены у детей старшего возраста и взрослых и имели ретроспективный дизайн. Лишь единичные исследования имели проспективный дизайн с оценкой отдельных иммунных параметров пуповинной крови (Kurzius-Spenser M., 2005; Kerkhof M., 2005). В частности, к настоящему времени нет данных о связи внутриклеточной продукции

ИФН-у+ и маркеров СВ26+ и СОЗО+ в пуповинной крови с последуюп развитием атопического дерматита. Кроме того, не изучено влия вышеперечисленных эпидемиологически верифицированных факторов ри атопии на указанные иммунологические параметры пуповинной крови.

Изложенное определяет актуальность проведенного исследования и соответствие требованиям практической педиатрии, аллергологии иммунологии.

Цель исследования: Изучить клинико-патогенетическую взаимосв иммунологических показателей пуповинной крови новорожденных пренатальными факторами риска формирования атопического фенотип; оценить прогностическую значимость различных маркеров баланса ТЫ лимфоцитов в момент рождения ребенка для оценки риска формирова! атопического дерматита грудного ребенка.

Задачи исследования:

1. Провести проспективное наблюдение за детьми от рождения до месяцев и выявить взаимосвязь особенностей генеалогического анамн течения беременности и родов с формированием атопического дермат! у детей грудного возраста.

2. В возрасте 12 месяцев среди обследованных детей проанализиров; ретроспективные данные и выявить взаимосвязь клинических проявлен атопического дерматита с рецидивирующими инфекция респираторного тракта, эпизодами диареи и особенности вскармливания на первом году жизни.

3. Исследовать влияние известных эпидемиологически верифицирован» факторов риска формирования атопии на субпопуляционный сост мононуклеаров пуповинной крови, с оценкой внутриклеточной продукц интерферона-у+, соотношения СВ26+ и СОЗО+ мононуклеаров концентрации общего 1§Е пуповинной крови.

4. На основании анализа субпопуляционного состава мононуклеар пуповинной крови выявить связь особенностей формирован пренатального иммунитета с клиническими проявлениями поражен центральной нервной системы новорожденного ребенка.

5. Оценить субпопуляционный состав мононуклеаров и содержал различных классов иммуноглобулинов пуповинной крови в качест предикторов формирования атопического дерматита и рецидивирующ! инфекций респираторного тракта у детей грудного возраста.

6. Сформировать научно обоснованные рекомендации по профилакти атопического дерматита в зависимости от иммунного стату

новорожденного, определенного по субпопуляционному составу мононуклеаров пуповинной крови.

Научная новизна

1. Впервые при анализе внутриклеточной продукции интерферона-у+ мононуклеарами пуповинной крови установлена пренатальная поляризация в системе ТЫ/ТЬ2 лимфоцитов, ассоциированная с эпидемиологически верифицированными факторами риска формирования атопического фенотипа у детей.

2. Впервые на основе данных проспективного наблюдения когорты новорожденных установлена высокая прогностическая значимость низкого содержания мононуклеаров пуповинной крови, продуцирующих интерферон-у+, в отношении формирования атопического дерматита у детей грудного возраста.

3. Впервые показана связь концентрации общего ^Е пуповинной крови с количественным содержанием мононуклеаров с экспрессией маркеров С026 и СЭЗО и установлено отсутствие прогностической значимости этих показателей в отношении формирования атопического дерматита у детей грудного возраста.

Практическая значимость работы:

Для практического здравоохранения предложена система формирования групп детей с высоким риском развития атопического дерматита, которая предусматривает проведение ранних превентивных мероприятий с сочетанием анамнестических (положительный атопический семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие), вес при рождении менее 2900 г.) и лабораторно-иммунологических (низкое содержание ИНФ-у+ / СБ69-) маркеров.

Выявление дисбаланса в системе ТЫ/ТЬ2 - лимфоцитов (пониженное содержание С026+ лимфоцитов, высокие концентрации ^Е и снижение содержания ^ клеток, продуцирующих ИНФ-у+), а также увеличение содержания естественных киллерных клеток (СВ16+СБ56+) пуповинной крови новорожденных с нарушениями со стороны нервной системы может служить диагностическим критерием формирования и прогностическим критерием тяжести течения перинатальной патологии центральной нервной системы (ЦНС).

Показатели содержания основных субпопуляций мононуклеаров пуповинной крови (МПК) у новорожденных предложены для лечебно-профилактических учреждений Красноярского края, как региональные

нормативно-референтные величины оценки формирования пренаталыю иммунитета.

Личный вклад:

Лично автором проведены планирование работы, поиск и анал литературы по проблеме диссертации; забор пуповинной кро новорождённых; сбор клинико-анамнестических данных; статистическ обработка и анализ результатов; написание публикаций, методическ! рекомендаций и диссертации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее значимыми факторами риска формирования атопическо дерматита у детей грудного возраста являются положительный атопичесю семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие), рост мате ниже 160 см, вес матери более 75 кг и вес новорожденного менее 2900 г.

2. Пренатально сформированный дисбаланс в системе ТЫ/ТЬ выражающийся в низком содержании мононуклеаров пуповинной кров способных продуцировать интерферон-у+, ассоциирован с наибол важными эпидемиологическими факторами формировании атопическог фенотипа у детей.

3. Низкое содержание неактивированных мононуклеаров, продуцируюнц интерферон-у+ (субтип 1р1ч'у+/СВ69-), является иммунологически фактором риска формирования атопического дерматита у детей грудног возраста, в то время как, уровень общего 1§Е и отношение СБ26+/СВ30+ пуповинной крови не обладают прогностической значимостью в отношен» данного заболевания.

Внедрение результатов исследования в практику:

Результаты проведенных исследований внедрены в практически работу 2-го детского отделения ГУ НИИ медицинских проблем Севера С РАМН (г. Красноярск), МУ Центра реабилитации для детей и подростков ограниченными возможностями «Радуга» (г. Красноярск), в учебны процесс кафедры фармакологии с курсами клинической фармакологи! фармацевтической технологии и курсом ПО, кафедры поликлиническо педиатрии и пропедевтики детских болезней ГОУ ВПО КрасГМУ Росздрава.

Апробация материалов диссертации:

Материалы работы были представлены на итоговых научны конференциях института медицинских проблем Севера СО РАЛ (Красноярск, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008); на Всероссийской научно практической конференции с международным участием «Метаболически

механизмы иммунореактивности» (Красноярск, 2004); на 12-м Российско-Японском симпозиуме (Красноярск, 2005); на Всероссийской научно-практической конференции (Красноярск, 2005); на Европейском Респираторном Конгрессе (Копенгаген, 2006; Стокгольм, 2007); на 17-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2007); на научно-практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика K.P. Седова (Иркутск, 2008); на научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Кызыл, 2008); на межлабораторном заседании сотрудников ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2008).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 30 печатных работ в местной и центральной печати, из них 5 - в журналах, рекомендуемых ВАК; получен патент РФ на изобретение; получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение

Структура и объем работы:

Диссертация содержит 157 страниц машинописного текста, 24 таблицы, 14 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список использованной литературы включает 250 источников, в том числе 175 отечественных и 75 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

На первом этапе были проведены клинические наблюдения, исследование субпопуляционного состава мононуклеаров пуповинной кров и определение различных классов иммуноглобулинов у 153 новорожденных детей. За данными детьми в дальнейшем проведено проспективное наблюдение в течение 1 года.

Клиническое обследование детей включало в себя: сбор анамнестических данных при беседе с родителями методом интервью с заполнением специально разработанной анкеты, включающей данные по течению беременности, генеалогическому анамнезу, о районе и условиях проживания. Анализ родов и течения периода новорожденное™ проводились по медицинской документации.

На втором этапе исследования было осмотрено 62 ребенка по достижению ими возраста 12 месяцев. На всех повторно обследованных

детей, была заполнена специально разработанная дополнительная анкета ( пунктов), включающая, в частности, данные о наличии и активное атопического дерматита (АД), об общем числе фебрильных эпизод случаев респираторных инфекций, эпизодов диареи, данные о вакцинации размерах БЦЖ-рубчика.

Специальные иммунологические методы исследования субпопуляционноп состава лимфоцитов и различных классов иммуноглобулинов

На базе двух родильных домов г. Красноярска (родильного дома № и родильного дома № 6) проведен забор пуповинной крови 153 доношеннь новорождённых, с последующим типированием лимфоцитов количественным определением концентрации иммуноглобулинов.

У всех детей для иммунологического исследования забиралось 10,0 л пуповинной крови в момент родов. Количественное определеш иммуноглобулинов класса А, М, в и общего 1{>Е проводило иммуноферментным методом с помощью наборов ИФА - БЕСТ - стр| фирмы ЗАО «Вектор - БЕСТ».

Результаты исследования выражались в г/л (1§А, 1§М, 1§С) и в мЕД/м (^Е). У детей, включенных в исследование методом проточной лазерно цитофлюорометрии определены следующие параметры общего иммунно! статуса: абсолютное и относительное содержание лимфоцитов с различным поверхностными маркерами (СБЗ+, СБ4+, СБ8+, С019+, СИ 16+56+).

Для верификации баланса ТЫ/ТЬ2 активности использоваш следующие маркеры: количественное содержание общего плазмы кров! процентное содержание СБ26+ и СБ30+ лимфоцитов и их отношени процентное количество клеток, синтезирующих ИНФ-у+, после стимуляци фетогемагглютинином (раздельно для общей популяции лимфоцитов ТЪ(С04+)-лимфоцитов). Оценка внутриклеточной продукции ИНФ-у проводилась раздельно для лимфоцитов имеющих и не имеющих марке активации - СБ69+. Для исследования популяций лимфоцитов бы использован метод проточной цитометрий. на проточном цитометре РАС. .СаНЬиг с помощью программы Бти^ЕТ на базе Красноярского краевог центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционным! заболеваниями.

Статистические методы анализа.

Статистическую значимость различий количественных признако! анализировали с помощью критерия Манна-Уитни (и). Анали статистической значимости различий качественных признаков проведен помощью критерия %3 с поправкой Йейтса, а для малых выборок

двусторонний точный критерий Фишера. Для оценки силы связи между признаками использован коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде медианы и интерквартильного интервала Ме где Ме - медиана, - 25% процентиль, и(3 - 75% процентиль. Результаты исследования качественных параметров в группах сравнения представлены в виде Р (ДИ) %, где Р - процентная доля, ДИ - 95% доверительный интервал для доли. Для расчета риска были использованы показатели относительного риска (Щ1, проспективное наблюдение), и отношения шансов (011, ретроспективный анализ) с их 95% доверительными интервалами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Общая клиническая характеристика обследованных беременных, новорожденных и детей грудного возраста.

В исследование на первом этапе было включено 153 новорожденных, у которых была забрана пуповинная кровь и проанализировано течение раннего неонатального периода. У матерей новорожденных, включенных в исследование, с помощью специально разработанной анкеты было детально проанализировано течение беременности и родов. Общий вопросник содержал 90 пунктов и включал, в частности, данные семейного анамнеза по атопическим болезням, условиям проживания (социальный статус, количество детей, курение, наличие коллекторов пыли), течению беременности и родов, антропометрических данных на момент рождения.

При оценке образования матерей новорожденных было установлено, что подавляющее большинство (72 %) женщин имели среднее, а 27 % -высшее образование. Анализ родословных в нашем исследовании выявил отягощенный атопический анамнез у 29% обследуемых детей. В 25% случаев матери новорожденных страдали аллергическим заболеванием. У 7 % женщин отмечались аллергические реакции во время беременности.

В числе обследованных нами новорождённых было 54 % мальчиков и 46 ,%; девочек. Вес детей при рождении в 27% случаев., был равен или превышал 3600 г, в 19% случаев вес новорожденных не превышал 2900 г. 51% детей родились без выраженной перинатальной патологии. 54% новорождённых получали медикаментозное лечение в родильном доме, а 16% обследуемых новорожденных нуждались в переводе в стационар.

На первом году жизни 34% детей находились на естественном вскармливании. Впервые получили молочную смесь в возрасте до 4 месяцев 37% детей.

2. Данные проспективного наблюдения когорты новорожденных оценкой факторов риска формирования атопического фенотипа

Из обследованных на первом этапе 153 доношенных новорожденны проспективно по достижению возраста 12 месяцев было осмотрено 6 ребенка. На всех повторно обследованных детей, была заполнена специальи разработанная дополнительная анкета (50 пунктов), включающая, частности, данные о наличии и активности атопического дерматита (АД), о общем числе фебрильных эпизодов, случаев респираторных инфекцш эпизодов диареи, данные о вакцинации и размерах БЦЖ-рубчик Клинические проявления АД у обследованных детей соответствовал основным диагностическим критериям, предложенным согласительны документом ассоциации детских аллергологов и иммунологов Росси «Современная стратегия терапии атопического дерматита» (2004 г.) У 3 повторно обследованных нами детей были выявлены клинические признак АД. На основании расчета показателя относительного риска (ЯЛ) и его 95 доверительного интервала (ДИ) нами установлена взаимосвя: анамнестических данных, касающихся генеалогического анамнеза, течеш беременности, родов и раннего неонатального периода с формирование АД в обследованной когорте новорожденных. Данные анализа представлен в таб. 1.

Таблица

Значимые факторы риска формирования АД по данны проспективного анализа-

Фактор Относительный риск формирования АД (Щ1) ДИ

Отягощенный атопический анамнез 1,6 (1,1-2,4)

Высшее образование матери 1,4 (1,0-2,0)

Социальное положение матери (служащая) 1,7 (1,1-2,5)

Социальное положение отца (служащий) 1,6 (1Д-2,3)

Вес ребенка при рождении < 2900 г 1,6 (1,1-2,3)

Рост матери ниже 160 см 1,5 (1,0-2,2)

Вес матери более 75 кг 1,8 (1,1-2,7)

Анализ генеалогического анамнеза позволил нам оценить степе] риска формирования аллергического заболевания. Так, у детей с А положительный атопический анамнез выявлен в 36,1 (22,5-52,5) %, а у дет без АД - в 12,0 (4,4-30,2) %, р=0,039. Отягощенный атопический анамнез

нашем исследовании статистически значимо повышает риск формирования АД грудного ребенка в 1,6 (1,1-2,4) раза.

Кроме того, нами выявлено, что социальный статус родителей (служащие) и высшее образование родителей повышают риск формирования АД у детей (таб. 1). Так, например, у детей с АД социальный статус матери «служащая» был в 58,3 (42,1-72,9) %, а у детей без АД - в 28,0 (14,3-47,8) % р=0,02Э. Относительный риск формирования АД у детей от матерей с социальным статусом «служащая» составил 1,7 (1,1-2,5). Очевидно, что в семьях с высокими уровнем образования и социальным статусом «служащие» в большей мере соблюдаются гигиенические нормы, что приводит к уменьшению контакта с инфекционными антигенами, что приводит к дисбалансу в системе ТЫ/ТЬ2 лимфоцитов за счет недостаточного стимулирования ТЫ звена иммунитета.

Известно, что у недоношенных новорожденных с низкой массой тела могут быть нарушены и способность В-лимфоцитов к изотопическому переключению классов иммуноглобулинов и способность Т-клеток к дифференцировке в ТЫ (Таболин В.А. с соавт., 1997). Эти данные подтверждены и нашим исследованием. Нами установлено, что вес при рождении не превышающий 2900 г значительно повышает риск формирования АД у детей. Так, у детей с АД вес при рождении не превышающий 2900 г был зарегистрирован в 27,7 (15,9-44,1) % случаев, а у детей без АД - в 8,0 (2,4-25,1) %, р=0,061. Относительный риск формирования АД у детей с массой тела при рождении менее 2900 г. составил 1,6 (1,1-2,3).

В возрасте 12 месяцев среди обследованной нами детей были проанализированы и некоторые ретроспективные данные (частота встречаемости эпизодов гипертермии, ОРВИ и диареи), касающиеся особенностей развития детей на первом году жизни и их связи с формированием АД с расчетом показателя отношения шансов (011) и его доверительного интервала. Только фактор полного отсутствия эпизодов гипертермии был частично ассоциирован с формированием АД у детей грудного возраста. Так, у детей с АД полное отсутствия эпизодов повышения температуры было зарегистрировано в 41,6 (27,0-57,9)% случаев, а у детей без АД - в 20,0 (9,0-39,4)%, р=0,08.

Дополнительный анализ показал, что у детей с АД статистически значимо ниже общее количество эпизодов гипертермии, чем у детей без АД, кроме того, ниже было и общее количество дней с повышенной температурой (рис. 1).

Количество Количество Количество эпизодов Дней с ОРВИ

гипертермии повышенной температурой

Рис.1. Влияние эпизодов гипертермии и ОРВИ на первом году жизни на формирование АД у детей грудного возраста по данным ретроспективного анализа.

Примечание: данные представлены в виде медианы для каждого анализируемого фактора; р - достоверность различий по методу Манна» Уитни (и).

Для изучения влияния особенностей пренатального иммунитета на последующую заболеваемость в течение первого года жизни нами была проанализирована связь иммунологических параметров пуповинной крови с общим чгйслом эпизодов гипертермии, ОРВИ. Результаты анализа представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2

Связь иммунологических параметров пуповинной крови с обгцш числом эпизодов гипертермии

Параметр Количество Количество Р

эпизодов эпизодов

гипертермии < 4 гипертермии > 4

(п=39) (п=22)

СВ4+ЯРЫу+ 0,70 1,60 0,009

(%) (0,45-1,47) (0,85-3,45)

СБ4+ДРЫу+/СБ69+ 10,79 17,49 0,040

(кл/мкл) (6,22-21,21) (13,95-38,14)

Примечание: р - достоверность различий по методу Манна-Уитни (11).

Таблица 3

Связь иммунологических параметров пуповинной крови с общим числом эпизодов ОРВИ

Параметр Количество эпизодов ОРВИ < 4 (п=40) Количество эпизодов ОРВИ >4 (п=21) Р

СВ4+/1РЫу+ (%) 0,72 (0,47-1,54) 1,53 (0,83-2,87) 0,02

СБ4+ЛРЫу+/С069+ (кл/мкл) 10,80 (6,28-15,34) 20,22 (15,57-38,14) 0,02

Примечание: р - достоверность различий по методу Манна-Уитни (11).

Как следует из представленных в таблицах 2 и 3 данных, у детей с большим количеством эпизодов гипертермии на первом году жизни в пуповинной крови было зарегистрировано увеличение общего количества ТЫ лимфоцитов (субтип СВ4+/1ПЧу+, р=0,009) и активированных ТЫ лимфоцитов (субтип СВ4+/1РЫу+/С069+, р=0,040). Одновременно, у детей с большим количеством эпизодов ОРВИ на первом году жизни в пуповинной крови было зарегистрировано увеличение общего количества ТЫ лимфоцитов (субтип СБ4+/1ЕМу+, р=0,020) и активированных ТЫ лимфоцитов (субтип СП4+/1КМу+/С069+, р=0,020).

Кроме того, при анализе факторов микроокружения беременной и их связи с внутриутробной продукцией интерферона нами было установлено, что размер семьи беременной положительно коррелировал с активированными ТЫ лимфоцитами пуповинной крови ребенка (субтип С04+/ 1РИу+/С069+ - г=0,22, р=0,038). Мы предполагаем, что большее количество активированных ТЫ лимфоцитов в пуповинной крови может прямо отражать степень инфекционной (прежде всего, вирусной) нагрузки в семье, так как оно связано и с размером семьи во время беременности и с количеством эпизодов гипертермии у ребенка на первом году жизни. В свою очередь, высокая вирусная нагрузка может обладать протективным эффектом в отношении формирования атопии, что и было продемонстрировано нашими данными. Важным итогом анализа полученных данных является выявленный нами факт реализации пренатального влияния вирусной нагрузки на формирование АД у детей грудного возраста через активацию ТЫ звена иммунитета, что полностью согласуется с «гигиенической гипотезой» формирования атопии, дополняя ее новыми данными.

3. Влияние известных эпидемиологически верифицированных факторов риска формирования атопии на субпоггупяционный состав мононуклеаров пуповинной крови.

До настоящего времени неизвестно может ли генетически детерминируемый ТЫ/ТЬ2 дисбаланс, реализуемый, в частности, в виде преобладании количества мононуклеаров, продуцирующих ИФН-у+ (ТЫ субтип), формироваться внутриутробно, уже к моменту рождения ребенка.

Мы установили различия в содержании отдельных субпопуляций МПК крови новорожденных в зависимости от наличия или отсутствия атопических проявлений у ближайших родственников (таб. 4).

Таблица 4

Количество клеток пуповинной крови, продуцирующих ИФН-у+ > детей, имеющих родственников с атопическими заболеваниями (АЗ)

Группы детей

Параметр Не имеющих родственников с АЗ (п= 109) Имеющих родственников с АЗ (п = 43) Р

Шу +СБ6 9-(кл/мкл) 7,21 (3,09-15,41) 3,50 (0,00-7,04) 0,015

№N7 + (%) . 0,76(0,43-1,18) 0,53 (0,31-0,68) 0,038

1ЕМу +СБ69-(%) 0,20 (0,07-0,36) 0,09 (0,00-0,17) 0,006

Шу +СЭ6 9+ 0,46 (0,27-0,77) 0,42 (0,20-0,54) >0,05

Примечание: р - достоверность различий по методу Манна-Уитни (и).

Из таблицы 4 следует, что содержание МПК, синтезирующих ИФН-у в пуповинной крови детей с отягощенным аллергологическим анамнезо*. достоверно ниже, чем у детей, чьи родственники не страдают атопией Необходимо отметить, что уменьшение содержания мононуклеаров синтезирующих ИФН-у+ происходит в основном за счет снижен! популяции неактивированных интерферон-продуцирующих клето (1Шу+/С069-), вероятно, отражая потенциальную, нереализованную моменту обследования способность детей к формированию атопии.

Многочисленные эпидемиологические данные свидетельствуют более низкой распространенности атопии у жителей, проживающих сельской местности, по сравнению с городским населением. В соответствии

«гигиенической гипотезой» механизм такого влияния связывают с недостаточной активацией ТЫ звена иммунитета у городских жителей. Однако неизвестно влияние таких экологически обусловленных различий на формирование продукции интерферона иммунными клетками плода. Нами установлено четкое снижение содержания неактивированных МПК, продуцирующих ИФН-у+ (1РНу+/С069-), ассоциированное с проживанием беременной в городе в сравнении с сельской местностью. Количество МПК, продуцирующих ИФН-у+ (субтип 1РЫу+/СБ69-) у новорожденных от матерей из сельской местности составило 11,09 (6,8-18,01) кл/мкл, а от городских матерей - 4,73 (0-10,49) кл/мкл, р=0,02.

Нами было проанализировано влияние порядка рождения (первые/повторные роды) и пола новорожденного на продукцию ИФН-у+ МГЖ, что продемонстрировано на рис. 2.

8f 1

l\ 1

6"Г Ü МАЛЬЧИКИ

S1 1 р=0.008 ¿ЩЙ ДЕВОЧКИ

4т я

з\ 2i i-t ■■■■ уа-

ПЕРВЫЙ ВТОРОЙ ПЕРВЫЙ ВТОРОЙ

Рис. 2. Влияние порядка родов и пола новорожденного на количество МПК субтипа IFNy+/CD69- (в кл/мкл).

Примечание: р - достоверность различий по методу Манна-Уитни (U).

Из рисунка 2 следует, что новорожденные от вторых родов имеют сниженное количество неактивированных МПК, продуцирующих ИФН-у+ (первые роды - 7,2 (3,4-15,3) кл/мкл, вторые - 2,9 (0-7,2) кл/мкл, р=0,013). Дополнительный анализ показал, что снижение количества IFNy+/CD69-МПК у новорожденных от повторных родов регистрируется только у мальчиков (р=0,008), но не у девочек (р=0,427),

Общеизвестно, что оптимальным питанием младенцев на протяжении, по крайней мере, первых 4-6 месяцев жизни является грудное молоко (Schafer Т., 2005). Нами выявлена тенденция к увеличению частоты

заболеваемости АД у обследованных детей, которым впервые дал1 искусственную смесь в возрасте до 4 месяцев. Так, у детей с аллергически», поражением кожи было зарегистрировано введение искусственной смеси возрасте до 4 месяцев в 47,2 (31,9-63,1) %, а у детей без АД - в 24,0 (11,6 43,6) %, р=0,07. Риск формирования заболевания был в 2,7 (0,7-9,3) ра выше.

4. Ранние иммунологические предикторы формирования атопическог дерматита: результаты 1-летнего проспективного наблюдения когорт! новорожденных.

Известно, что атопический дерматит (АД) грудного ребенка - мощны и ранний клинический маркер атопического фенотипа, а ИФН-у+ являете важнейшим цитокином, характеризующим функцию ТЫ клеток, чь недостаточная активность в первые месяцы жизни может приводить дисбалансу в системе ТЫ/ТЬ2 клеток и формированию атопш Предполагается, что возможна и внутриутробная ТЬ1/ТЬ2 поляризаци иммунного ответа, однако маркеры такой поляризации, надежи ассоциированные с формированием атопии неизвестны. Задаче исследования было с помощью проспективного наблюдения обследованными новорожденными выявить связь между количеством МП продуцирующих ИФН-7+, и последующим риском формирования АД. Крон того, мы попытались определить связь поверхностных маркеров СБ26+ СБ30+ на МПК с уровнем общего ^Е плазмы пуповинной крови и оцени возможность их использования в качестве предикторов формирования АД детей грудного возраста

У 62 вовлеченных в проспективное наблюдение новорожденных бы оценено наличие АД в возрасте 1 года, АД установлен у 36 из них. Даннь анализа показали, что только для неактивированных МПК, продуцируют! ИФН-у+ (субтип 1РНу+/СБ69-), нами найдена выраженная ассоциация формированием АД на первом году жизни среди обследованнь новорожденных (количество 1ЕЫу+Л1Т)69- МПК у детей с АД было 3,3 ( 6,4) кл/мкл, в отличие от детей без АД - 9,4 (5,3-16,5) кл/мкл, р=0,00 Относительный риск формирования АД у новорожденных со сниженнь количеством 1РИу+/СВ69- (< 5.0 кл/мкл - медиана для нашей совокупност составил 3,4 (1,19-9,69).

Таким образом, снижение количества неактивированных МП продуцирующих ИФН-у+ (субтип 1ЕМу+/СБб9-), свидетельствующее внутриутробном сдвиге в балансе ТЫ/ТЬ2, является сильным и независимь предиктором формирования АД у детей грудного возраста.

Нами было выявлено наличие следующих корреляционных связей концентрации общего 1§Е пуповинной крови: положительной с уровнем СОЗО+ лимфоцитов (г=0,28, р=0,006) и отрицательной с уровнем С026+ лимфоцитов (1=-0,24, р=0,01); особенно показательна отрицательная корреляционная связь с отношением СБ2б/СОЗО лимфоцитов (т=-0,37, р=0,0005). Не было найдено ассоциации экспрессии СВ26+, СБ30+, отношения СБ26+/СВ30+, а также уровня общего ^Е с формированием АД фудного возраста (в качестве точек разделения выбраны медианы показателей среди обследованных новорожденных). Относительные риски составили 1,5 (0,67-3,33), 0,67 (0,37-1,19), 0,78 (0,42-1,45) и 1,24 (0,59-2,61), соответственно. Таким образом, экспрессия поверхностных маркеров С026+-и СОЗО+ на МПК связана с продукцией ^Е, вероятно, отражая соотношение активированных ТЫ/ТЬ2 лимфоцитов. Однако снижение отношения СП26+/СОЗО+, как и уровень общего ^Е пуповинной крови, не являются предикторами формирования атопического фенотипа у детей грудного возраста.

5. Связь иммунологических параметров пуповинной крови с течением перинатального периода новорожденных.

Существуют литературные данные о связи патологии беременности и родов, приводящих к гипоксии плода, с изменениями иммунного статуса детей и с формированием некоторых атопических заболеваний у детей грудного возраста (Таболин В.А. с соавт., 1997; Куртасова Л.М., 2002; Феденко Е.С., 2000; Карачинцева Н.В., 2004; Беликова М.Э. с соавт., 2006). В связи с этим, представляется интересным выявление дополнительных факторов, нарушающих формирование иммунной системы ребенка в перинатальном периоде. С этой целью мы проанализировали связь состояния нервной системы и иммунного статуса новорожденных

При исследовании было установлено, что абсолютное содержание лимфоцитов в пуповинной крови новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией составило 1608 (1107-2124) кл/мкл, а без патологии ЦНС - 2497(2010,5-3264,5) кл/мкл, р=0,008. Относительное содержание лимфоцитов в пуповинной крови новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией составило 42 (41-54) %, а без патологии ЦНС

- 58 (51-68) %, р=0,026. Относительное содержание естественных киллерных клеток (С016+СБ56+) в пуповинной крови новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией составило 34 (34-39) %, а без патологии ЦНС

- 26 (14-32) %, р=0,019. Абсолютное содержание С026+ лимфоцитов в пуповинной крови новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией составило 963(841,3-1436,2) кл/мкл, а без патологии ЦНС -

1985(1467,4-2499,3) кл/мкл, р=0,007. Относительное содержание СБ26+ лимфоцитов в . пуповинной крови новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией составило 36 (31-39) %, а без патологии ЦНС - 46 (39-53) %, р=0,027. В тоже время количество активированных МПК, продуцирующих ИФН-у+ (субтип 1РКу+/С069+) у новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией составило 5,4 (4,7-8,6) кл/мкл, а без патологии ЦНС - 18,4 (10,3-31,8) кл/мкл, р=0,037. Тогда как концентрация общего 1§Е у новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией составила 6,2 (3,6-15,1) МЕ/л, а без патологии ЦНС - 3,25 (1,7-4,4) МЕ/л, р<0,02.

Таким образом, иммунологические показатели пуповинной крови новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией характеризуется абсолютной и относительной лимфопенией, выраженным увеличением относительного содержания естественных киллерных клеток (С016+С056+), снижением количества активированных ТЫ-лимфоцитов (субтип 1РЫу+/С069+ и СБ26+) и высокой концентрацией общего ^Е.

ВЫВОДЫ

1. В результате проспективного наблюдения когорты новорожденных установлено, что наиболее значимыми факторами риска формирования атопического дерматита у детей грудного возраста являются положительный атопичёский семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие), рост матери ниже 160 см, вес матери более 75,кг и вес новорожденного менее 2900 г. Дополнительный ретроспективный анализ показал защитную роль нетяжелых респираторных инфекций в формировании атопического фенотипа и его ассоциацию с ранним искусственным вскармливанием и частыми эпизодами диареи на 1-м году жизни.

2. Высокое содержание в пуповинной крови новорожденных общих (СБ4+/1Шу+) и активированных (СВ4+/1Шу+/СВ69+) ТЫ-лимфоцитов, продуцирующих интерферон-у+, ассоциировано с большим количественным составом семьи беременной и большим количеством эпизодов ОРВИ на первом году жизни ребенка, что, вероятно, отражает влияние суммарной инфекционной нагрузки в семье на формирование ТЫ звена иммунитета плода и грудного ребенка.

3. Установлено, что низкое содержание неактивированных мононуклеаров пуповинной крови (МПК), продуцирующих интерферон-у (1РКу+/СВ69-), ассоциировано с положительным атопическим семейным анамнезом (р=0,006), проживанием беременной в городе (в сравнении с сельской

местностью, р=0,02), и мужским полом новорожденного от повторных родов (р=0,008), что согласуется с эпидемиологически верифицированными факторами риска формирования атопии у детей. Контакт беременной с домашними животными приводит к увеличению количества активированных МПК, продуцирующих интерферон-у+ (субтип ШНу+/С069+), р=0,03.

4. Снижение количества неактивированных МПК, продуцирующих интерферон-у+ (1ЕМу+/СБ69-), свидетельствующее о внутриутробном сдвиге в балансе ТЫ/ТЬ2 лимфоцитов, является сильным и независимым предиктором формирования атопического дерматита у детей грудного возраста. Относительный риск формирования атопического дерматита у новорожденных со сниженным абсолютным количеством МПК субтипа 1РЫу+/СБ69-составил 3,4 (1,19-9,69).

5. Экспрессия поверхностных маркеров С026+ и СОЗО+ на МПК связана с продукцией общего ^Е пуповинной крови, отражая пренатальное соотношение активированных ТЫ/ТЬ2 лимфоцитов. Однако снижение отношения С026+/С030+, как и уровень общего ^Е пуповинной крови, не являются предикторами формирования атопического дерматита у детей грудного возраста.

6. Показано, что иммунологические показатели пуповинной крови новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией характеризуется абсолютной и относительной лимфопенией, выраженным увеличением относительного содержания естественных киллеров (СВ16+СБ56+), снижением количества активированных ТЫ-лимфоцитов (субтип П"ЪГу+/С069+ и СБ26+) и высокой концентрацией общего ^Е.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выделения группы детей, обладающих высоким риском формирования атопического дерматита, с проведением ранних превентивных мероприятий целесообразно использование сочетания высокозначимых анамнестических (положительный атопический семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие) и вес при рождении менее 2900 г.) и лабораторно-иммунологических (низкое содержание 1РМу+/СБ69- МПК) маркеров.

2. Впервые полученные данные о содержании основных субпопуляций мононуклеаров пуповинной крови у новорожденных Красноярского края могут быть использованы в качестве региональных нормативно-референтных величин для оценки формирования пренатального иммунитета.

3. Исследование иммунологических показателей пуповинной крови у новорожденных с сочетанным поражением ЦНС рекомендуется использовать для оценки риска формирования инфекционных осложнений и научного обоснования иммунокорригирующих мероприятий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Атопия и поствакцинальный иммунитет: есть ли связь?/ С.Ю.Терещенко И.А. Новицкий, И.А.Ольховский, H.A. Шакина, JI.B. Васильева / Метаболические механизмы иммунореактивности: матер. Всерос. науч. практ. конф. с междунар. участием. - Красноярск, 2004. - С. 191-192.

2. Иммунный статус пуповинной крови новорожденного, как предикто формирования атопических заболеваний у детей / С. Ю.Терещенко, И. А Новицкий, И.А.Ольховский, H.A. Шакина, JI. В. Васильева / Метаболические механизмы иммунореактивности: матер. Всерос. науч. практ. конф. с междунар. участием. - Красноярск, 2004. - С. 188-190.

3. Внутриклеточная-продукция интерферона-гамма (ИФН-у) лимфоцитам! пуповинной крови (ЛПК): роль материнских факторов в формировани Thl/Th2 баланса новорожденного / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренко И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, Е. Нейман, Л. В. Васильева, М.В. Стольникова И Сборник резюме 15-г Национального конгресса по болезням органов дыхания. - М., 2005. -37.

4. Микроэкологические факторы, действующие на беременную женщину состояние иммунитета новорожденного / С. Ю. Терещенко, В. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И. Исаков, Е.Г. Нейман, Л. В. Васильева, М.В. Стольникова // Сборни резюме 15-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. М., 2005.-С. 8.

5. Некоторые параметры иммунного статуса пуповинной крови здоровы доношенных новорожденных и перспективы его использования в качест предиктора формирования атопических заболеваний у детей / С. ] Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, Н. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, Л. В. Васильева, М.В. Стольникова Материалы Всероссийской научно-практической конференци посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционным заболеваниями. - Красноярск, 2005. - С. 178-179.

6. Связь уровня IgE пуповинной крови новорожденных с поверхностными и внутриклеточными маркерами баланса Thl/Th2 лимфоцитов / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, Н.А. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, JI. В. Васильева, М.В. Стольникова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. - Красноярск, 2005,- С. 180-181.

7. Связь уровня общего IgE с поверхностными и внутриклеточными маркерами лимфоцитов пуповинной крови новорожденных / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, Н.А. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, JI. В. Васильева, М.В. Стольникова // Сборник резюме 15-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. - М„ 2005. - С. 36.

8. Терещенко С.Ю. Взаимосвязь иммунного статуса новорожденного и атопии / С. Ю. Терещенко, И. А. Новицкий, Л. В. Васильева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. -Красноярск, 2005. - С. 175-178.

9. Intracellular interferon-y production by cord blood mononuclear cells: the role of maternal factors in neonatal Thl/Th2 balance forming / S. Tereshchenko, V. Prochorenkov, I. Novitzkiy, I. Olkhovsky, N. Shakina, I. Isakov, L. Vasilieva, E. Neyman // Eur. Resp. J. - 2005. - V. 26, Suppl. 49. - P. 589.

10. Revealing prognostically meaningful immune markers in the umbilical blood for the analysis of the development of clinical and par clinical signs of the atopic phenotype formation in newborns / S. Tereshchenko, I. Novitzkiy, L. Vasilieva et al. // Abstracts of the XII Symposium of the Russia-Japan Medical Exchange, 20-21 September, Krasnoyarsk, 2005. - Krasnoyarsk, 2005. - P. 338-339.

'. 11. Влияние иммунного статуса новорожденного на формирование атопического фенотипа грудного ребенка / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, Н.А. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, Л. В. Васильева // Медицинская иммунология. -2006.-№2-3.-С. 212. 12. Внутриклеточная продукция интерферона-гамма (ИФН-у) лимфоцитами пуповинной крови: роль генетических факторов в формировании Thl/Th2 баланса новорожденных / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, Н.А. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, Л. В. Васильева, М.В. Стольникова // Дни иммунологии в Сибири: матер.

Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 30-летнему юбилею ГУ НИИ мс проблем Сёвера СО РАМН и 25-летнему юбилею ГУ НИИ клини иммунологии СО РАМН. - Красноярск, 2006. - С. 37-39.

13. Маркеры активности Т-хелперов 1 типа (Thl) в пуповинной кро новорожденных с наследственной отягощенностью по атопии / С. К Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, Н. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, Л. В. Васильева, М.В. Стольникова Сборник трудов 16-го Национального конгресса по болезням орган дыхания и II Конгресса Евроазиатского Респираторного Общества. СПб., 2006.-С. 87.

14. Маркеры CD26 и CD30 лимфоцитов пуповинной крови новорожденных их связь с формированием атопии / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренко И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, Е.1 Нейман, JI. В. Васильева, М.В. Стольникова // Дни иммунологии Сибири: материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 30-летне юбилею ГУ НИИ мед. проблем Севера СО РАМН и 25-летнему юбиле ГУ НИИ клинич. иммунологии СО РАМН. - Красноярск, 2006. - С. 17 174.

15. CD26+ и CD30+ лимфоциты пуповинной крови новорожденных и их свя с формированием атопии / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, J В. Васильева, М.В. Стольникова // Сборник трудов 16-го Национально конгресса по болезням органов дыхания и II Конгресса Евроазиатског Респираторного Общества. - СПб., 2006. - С. 88.

16. Влияние порядка рождения и пола новорожденного на внутриклеточну] продукцию интерферона-у мононуклеарами пуповинной крови / С. I Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, Н. Шакина, И.В. Исаков, JI.B. Васильева // Рос. аллергол. журн. - 2007. - № Прил. 1.-С. 66-67.

17. Внутриклеточная продукция интерферона-у мононуклеарами пуповинно крови, как предиктор формирования атопического дерматита у дете грудного возраста: 1-летнее проспективное исследование когорт новорожденных / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкш И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, JI.B. Васильева // Ро аллергол. журн. - 2007. - №3, Прил. 1. - С. 148.

18. Наличие повторных родов у матери и мужской пол новорожденног сопряжены с более низкой продукцией интерферона-у мононуклеарам пуповинной крови / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, JI.B. Васильева

Сборник резюме 17-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. - Казань, 2007. - С. 9.

19. Низкая продукция интерферона-у у новорожденных детей увеличивает риск формирования атопического фенотипа в грудном возрасте: 1-летнее проспективное когортное исследование / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, JI.B. Васильева // Сборник резюме 17-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. - Казань, 2007. - С. 10.

20. Состояние иммунного статуса у новорожденных с перинатальным поражением центральной нервной системы / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, JI. В. Васильева, М.В. Стольникова // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: матер, итог, науч.-практ. конф. НИИ мед. проблем Севера СО РАМН. - Красноярск, 2007.- С. 132-134.

21. Субпопуляционный состав мононуклеаров пу повинной крови новорожденных, как перидиктор формирования атопии: 1-летнее проспективное исследование когорты новорожденных / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, Е.Г. Нейман, Л. В. Васильева, М.В. Стольникова // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: матер, итог, науч.-практ. конф. НИИ мед. проблем Севера СО РАМН. - Красноярск, 2007.-С. 134-137.

22. Субпопуляционный состав лимфоцитов пуповинной крови новорожденных и перспективы его использования в качестве предиктора формирования атопических заболеваний у детей / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, JI. В. Васильева, Е.Г. Нейман // Тихоокеанский мед. журн. - 2007. -№3.- С. 41-43.

23. Уровень общего IgE и поверхностные маркеры мононуклеаров (CD26 и CD30) пуповинной крови не ;являются предикторами формирования атопии у детей грудного возраста / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий, И.А. Ольховский, H.A. Шакина, И.В. Исаков, Л.В. Васильева // Сборник резюме 17-го Национального конгресса по болезням органов дыхания. - Казань, 2007. - С. 10.

24. Экспрессия CD26 и CD30 на мононуклеарах пуповинной крови и уровень общего IgE как предикторы формирования атопического дерматита у детей грудного возраста: 1-летнее проспективное исследование когорты новорожденных / С. Ю. Терещенко, В.И. Прохоренков, И. А. Новицкий,

И.А. Ольховский, Н.А. Шакина, И.В. Исаков, JI.B. Васильева // Ро аллергол. журн.-2007.-№3,Прил. 1.-С. 147.

25. CD26 and CD30 expression on cord blood mononuclear cells (CBMC) and tot, IgE level as predictors of atopic dermatitis (AD) forming in infants: a one-ye, prospective birth cohort study / S. Tereshchenko, V. Prochorenkov, Novitzkiy, I. Olkhovsky, N. Shakina, I. Isakov , L. Vasilieva, E. Neyman Eur. Resp. J. - 2007. -V. 30, Suppl. 51. - P. 643.

26. IgE level, CD26, CD30 expression and intracellular interferon production b cord blood mononuclear cells as predictors of atopic dermatitis forming i infants: a one-year prospective birth cohort study / S. Tereshchenko, Prochorenkov, I. Novitzkiy, I. Olkhovsky, N. Shakina, I. Isakov, I Vasilieva // World Allergy Organization J. - 2007, Nov. - P. 124.

27. Intracellular interferon (IFN)-y production by cord blood mononuclear eel (CBMC) as predictor of atopic dermatitis (AD) forming in infants: a one-ye, prospective birth cohort study / S. Tereshchenko, V. Prochorenkov, Novitzkiy, I. Olkhovsky, N. Shakina, I. Isakov, L. Vasilieva, E. Neyman Eur. Resp. J. - 2007. - V. 30, Suppl. 51. - P. 642.

28. The influence of birth order and newborn gender on intracellular interfero (IFN)-y production by cord blood mononuclear cells (CBMC) / . Tereshchenko, V. Prochorenkov, I. Novitzkiy, I. Olkhovsky , N. Shakina, Isakov, L. Vasilieva, E. Neyman // Eur. Resp. J. - 2007. - V. 30, Suppl. 51. P. 642.

29. Maternal history of atopy influence on intracellular interferon-gam production by cord blood mononuclear cells / S. Tereshchenko, Prochorenkov, I. Novitzkiy, I. Olkhovsky, N. Shakina, I. Isakov, I Vasilieva, E. Neyman // J. Eur. Acad. Dermatol. & Venerol. - №1. - 2007. P. 144.

30. Васильева JI.B. Факторы риска формирования атопического дерматита/ В. Васильева // Вопросы сохранения и развития здоровья населен! республики Тыва: мат. конф., проходящей в рамках ежегодной ито науч.-практ. конф. «Вопросы сохранения и развития здоровья населен Севера и Сибири». - Кызыл, 2008. - С.225-227.

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Получен патент на изобретение 2331881 Российская Федерация, МП

G 01N 33/38. Способ определения риска развития атопических заболеваний

новорожденных детей / С.Ю. Терещенко, И. А. Новицкий, Л. В. Васильев

Краснояр. гос. мед. акад. -№ 2007108866/15; опубл. 20.08.2008, бюл. № 23.

Зс.

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение. Способ прогнозирования развития атопического дерматита у новорожденных. / Терещенко С.Ю., Васильева Л.В., Исаков И.В. и др. Заявка № 2007107288/15(007930); заявлено 26.02.2007 г.; приоритет 26.02.2007 г. Заявитель и патентообладатель ГУ НИИ МПС СО РАМН; решение о выдаче патента 17.12.2007 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД атопический дерматит

^А иммуноглобулин А

1ёЕ иммуноглобулин Е

^О иммуноглобулин Б

1§М иммуноглобулин М

ИНФ-у+ интерферон гамма

ЖКТ желудочно-кишечный тракт

СБ кластер дифференцировки

МПК мононуклеары пуповинной крови

№С естественные киллерные клетки

ОРВИ острая респираторная вирусная инфекция

СЦСП сочетанная цереброспинальная патология

ТЬ Т-хелперы

ЦНС центральная нервная система

1ЕЫу+ общее количество мононуклеаров,

продуцирующих ИНФ-у+ 1Шу +СБ69+ общее количество активированных

мононуклеаров, продуцирующих ИНФ-у+ СБ4+1РЫу + количество клеток, продуцирующих ИНФ-у+ и

несущих на своей мембране маркер СБ4 СБ4+1РЫу +СБ69+ количество активированных клеток,

продуцирующих ИНФ-у+ и несущих на своей мембране маркер СЭ4

Подписано в печать 10.11.08. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,5. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ №370 Цена свободная

Отпечатано ООО Издательство «Красноярский писатель» 660060, г. Красноярск, ул. А. Лебедевой, 89, тел.: (391)223-48-60, 223-57-46. Е-таи1:ата^ата2007@таП.ги

За последние десятилетия произошел значительный рост распространенности атопических заболеваний (атопического дерматита, бронхиальной астмы, поллиноза, аллергического ринита) практически во всех странах мира. Эта тенденция позволила исследователям обозначить последовательное развитие аллергических реакций у предрасположенных к атопии лиц как «аллергический марш» (Локшина Э.Э., Зайцева О.В., 2006). Заболеваемость указанными болезнями, особенно в детской популяции, настолько высока, а возможности профилактики и терапии настолько ограничены, что фундаментальные исследования в этой области еще долгое время не потеряют своей актуальности (Scezch W., 1992; Begishvili Т.В., 1996; Смирнова С.В., 1997; Andreassi М., Forleo P., 1997; Островский И.М., 2000; Короткий Н.Г., 2000; Прахин Е.И., 2000; Зайцева С.В., 2001; Княжеская Н.Н., 2001; Золотова И.А., 2001; Альбанова В.И., 2002; Смирнова Г.И., 2002; Иванов, О.Л., 2004).

Эпидемиологические исследования, проведённые во многих странах мира (Англия, Болгария, Венгрия, Германия, Польша, Россия, США и многие другие), свидетельствуют, что от 10 до 30% городского и сельского населения, проживающего в областях с высокоразвитым экономическим потенциалом страдает аллергическими заболеваниями (А. Д. Адо, 1990; А. Г. Чучалин, 1999, 2001; Anderson, 1993).

Изучение естественных иммунных механизмов формирования атопии, как основного патогенетического звена атопических болезней, играет первостепенную роль в таких исследованиях. Большинством исследователей признается ведущая роль дисбаланса в системе Т-хелперов (Thl/Th2-лимфоцитов) в сторону преобладания ТЬ2-ответа избыточной продукции IgE при контакте с широко распространенными экзоаллергенами - атопии (Медуницын Н.В., 1999; Соловей Т.Н., 1999; Смолкин Ю.С., 2000; Намазова Л.С., 2000; Федосеева В.Н., 2006; Локшина Э.Э., Зайцева О.В., 2006; Ромапцов

М.Г., 2006). Исследование цитокиновой регуляции атопии используется в последнее время достаточно широко. Однако в большей части таких работ в качестве маркерного предиктора использован уровень IgE, реже используются уровень цитокинов и фенотипирование лимфоцитов (Резник И.Б., 1989; Воронова А.В., 1989; Hansen L.G., 1993; Banks W.A. 1995; Mazor М., 1995; Талаев В.Ю., 1999, 2001; Дигилова Н.Д., 2000; Каап А. 2000; Гавриш Т.В., 2000; Ревякина В.А., 2000; Трофимова И.Б., 2001; Ветров В.П. 2001; Бережная Н.М., 2002, 2006; Батенева Е.И., Трофимов Д.Ю., Хаитов P.M., 2001, 2006). Описаны возрастные особенности иммунной системы у детей старшего возраста с атопическим дерматитом (Шамов Б.А., 1999).

Наиболее признанная в настоящее время «гигиеническая гипотеза» роста атопических болезней, в качестве причины преобладания ТЬ2-ответа называет снижение стимуляции Thl естественными микробными и вирусными возбудителями (Strachan, DP., 2000; Вискова Н.Ю., 2003; Гордеева Л.А., 2005). Однако совершенно неясным остается «критический возраст», в котором происходит критический сдвиг в сторону преобладания ТЬ2-активности, в частности, не установлено, может ли такое изменение происходить антенатально.

Выявление «критического возраста» формирования дисбаланса в системе Thl/Th2-лимфоцитов важно по причинам острой необходимости донозологической диагностики с целью превентивной профилактики атопии и реальной возможностью вмешаться в процесс созревания иммунной системы. С целью однозначного фенотипического маркирования для выделения Thl и ТЬ2-лимфоцитов рекомендуется исследование комплекса поверхностных антигенов (кластеров дифференцировки)

CD30,CD62L,CCR3,CCR4 - ТЬ2-профиль и CD26,CCR5,CXCR3 - Thl-профиль) (Katoh N., 2000; Bock О., 2001; Schade R. P. , Van Ieperen-Van Dijk A. G., Versluis C. et al. 2002; Holmlund U., Bengtsson A., Nilsson C. et al. 2003; Lorenzo, 2003).

Таким образом, предлагаемое изучение субпопуляционного состава лимфоцитов в пуповинной крови, как возможного предиктора формировании атопии является актуальным и обладает достаточной научной новизной для фундаментальной аллергологии. Исследование направлено на решение задач по позициям «технологии живых систем» перечня "Приоритетные направления развития науки, технологий и техники РФ" и «технологии иммунокоррекции» перечня "Критических технологий Российской Федерации".

Цель научного исследования:

Изучить клинико-патогенетическую взаимосвязь иммунологических показателей пуповинной крови новорожденных с пренатальными факторами риска формирования атопического фенотипа и оценить прогностическую значимость различных маркеров баланса Thl/Th2 лимфоцитов в момент рождения ребенка для оценки риска формирования атопического дерматита грудного возраста. Задачи научного исследования:

1. Провести проспективное наблюдение за детьми от рождения до 12 месяцев и выявить взаимосвязь особенностей генеалогического анамнеза, течения беременности и родов с формированием атопического дерматита у детей грудного возраста.

2. В возрасте 12 месяцев среди обследованных детей проанализировать ретроспективные данные и выявить взаимосвязь клинических проявлений атопического дерматита с рецидивирующими инфекциями респираторного тракта, эпизодами диареи и особенностями вскармливания на первом году жизни.

3. Исследовать влияние известных эпидемиологически верифицированных факторов риска формирования атопии на субпопуляционный состав мононуклеаров пуповинной крови, с оценкой внутриклеточной продукции интерферона-у+, соотношения

CD26+ и CD30+ мононуклеаров и концентрации общего IgE пуповинной крови.

4. На основании анализа субпопуляционного состава мононуклеаров пуповинной крови выявить связь особенностей формирования пренатального иммунитета с клиническими проявлениями поражения центральной нервной системы новорожденного ребенка.

5. Оценить субпопуляционный состав мононуклеаров и содержание различных классов иммуноглобулинов пуповинной крови в качестве предикторов формирования атопического дерматита и рецидивирующих инфекций респираторного тракта у детей грудного возраста.

6. Сформировать научно обоснованные рекомендации по профилактике атопического дерматита в зависимости от иммунного статуса новорожденного, определенного по субпопуляционному составу мононуклеаров пуповинной крови.

Новизна исследования:

1. Впервые при анализе внутриклеточной продукции интерферона-у+ мононуклеарами пуповинной крови установлена пренатальная поляризация в системе Thl/Th2 лимфоцитов, ассоциированная с эпидемиологически верифицированными факторами риска формирования атопического фенотипа у детей.

2. Впервые на основе данных проспективного наблюдения когорты новорожденных установлена высокая прогностическая значимость низкого содержания мононуклеаров пуповинной крови, продуцирующих интерфероп-у+, в отношении формирования атопического дерматита у детей грудного возраста.

3. Впервые показана связь концентрации общего IgE пуповинной крови с количественным содержанием мононуклеаров с экспрессией маркеров CD26+ и CD30+ и установлено отсутствие прогностической значимости этих показателей в отношении формирования атопического дерматита у детей грудного возраста. Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее значимыми факторами риска формирования атопического дерматита у детей грудного возраста являются положительный атопический семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие) и вес при рождении менее 2900 г.

2. Пренатально сформированный дисбаланс в системе Thl/Th2, выражающийся в низком содержании мононуклеаров пуповинной крови, способных продуцировать интерферон-у+, ассоциирован с наиболее важными эпидемиологическими факторами формировании атопического фенотипа у детей.

3. Низкое содержание неактивированных мононуклеаров, продуцирующих интерферон-у+ (субтип IFNy+/CD69-), является иммунологическим фактором риска формирования атопического дерматита у детей грудного возраста, в то время как, уровень общего IgE и отношение CD26+/CD30+ в пуповинной крови не обладают прогностической значимостью в отношении данного заболевания.

Практическая значимость работы:

Для практического здравоохранения предложена система формирования групп детей с высоким риском развития атопического дерматита, которая предусматривает проведение ранних превентивных мероприятий с сочетанием анамнестических (положительный атопический семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие), вес при рождении менее 2900 г.) и лабораторно-иммунологических (низкое содержание ИНФ-у+ / CD69-) маркеров.

Выявление дисбаланса в системе Thl/Th2 - лимфоцитов (пониженное содержание CD26+ лимфоцитов, высокие концентрации IgE и снижение содержания клеток, продуцирующих ИНФ-у+), а также увеличение содержания естественных киллерных клеток (CD16+CD56+) пуповинной крови новорожденных с нарушениями со стороны нервной системы может служить диагностическим критерием формирования и прогностическим критерием тяжести течения перинатальной патологии центральной нервной системы (ЦНС).

Показатели содержания основных субпопуляций мононуклеаров пуповинной крови (МПК) у новорожденных предложены для лечебно-профилактических учреждений Красноярского края как региональные нормативно-референтные величины оценки формирования пренатального иммунитета.

Внедрение результатов исследования:

Результаты проведенных исследований внедрены в практическую работу 2-го детского отделения ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (г. Красноярск), МУ Центра реабилитации для детей и подростков с ограниченными возможностями «Радуга» (г. Красноярск), в учебный процесс кафедры фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармацевтической технологии и курсом ПО, кафедры поликлинической педиатрии и пропедевтики детских болезней ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Росздрава. Апробация материалов диссертации:

Материалы работы были представлены на итоговых научных конференциях института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Метаболические механизмы иммунореактивности» (Красноярск, 2004); на 12-м Российско-Японском симпозиуме (Красноярск, 2005); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (Красноярск, 2005); на Европейском Респираторном Конгрессе (Копенгаген, 2006); на Европейском

Респираторном Конгрессе (Стокгольм, 2007); на 17-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2007); на научно-практической конференции, посвященной 90-летиюсо дня рождения академика К.Р. Седова (Иркутск, 2008); на научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Кызыл, 2008); на межлабораторном заседании сотрудников ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2008). Публикации:

По теме диссертации опубликовано 30 печатных работы в местной и центральной печати, из них 5 - в журналах, рекомендуемых ВАК. Получен патент на изобретение Пат. 2331881 Российская Федерация, МПК G 01N 33/38. Способ определения риска развития атопических заболеваний у новорожденных детей/ С.Ю. Терещенко, И. А. Новицкий, JL В. Васильева; Краснояр. гос. мед. акад. - № 2007108866/15; опубл. 20.08.2008, бюл. № 23. -3 с. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение. Способ прогнозирования развития атопического дерматита у новорожденных. / Терещенко С.Ю., Васильева Л.В., Исаков И.В. и др. Заявка № 2007107288/15(007930); заявлено 26.02.2007 г.; приоритет 26.02.2007 г. Заявитель и патентообладатель ГУ НИИ МПС СО РАМН; решение о выдаче патента 17.12.2007 г. Структура и объем работы:

Диссертация содержит 157 страниц машинописного текста, 24 таблиц, 14 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список использованной литературы включает 250 источников, в том числе 175 отечественных и 75 зарубежных авторов.

выводы

1. В результате проспективного наблюдения когорты новорожденных установлено, что наиболее значимыми факторами риска формирования атопического дерматита у детей грудного возраста являются положительный атопический семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие), рост матери ниже 160 см, вес матери более 75 кг и вес новорожденного менее 2900 г. Дополнительный ретроспективный анализ показал защитную роль нетяжелых респираторных инфекций в формировании атопического фенотипа и его ассоциацию с ранним искусственным вскармливанием и частыми эпизодами диареи на 1 -м году жизни.

2. Высокое содержание в пуповинной крови новорожденных общих (CD4+/IFNy+) и активированных (CD4+/IFNy+/CD69+) Thl-лимфоцитов, продуцирующих интерферон-у+, ассоциировано с большим количественным составом семьи беременной и большим количеством эпизодов ОРВИ на первом году жизни ребенка, что, вероятно, отражает влияние суммарной инфекционной нагрузки в семье на формирование Thl звена иммунитета плода и грудного ребенка.

3. Установлено, что низкое содержание неактивированных мононуклеаров пуповинной крови (МПК), продуцирующих интерферон-у+ (IFNy+/CD69-), ассоциировано с положительным атопическим семейным анамнезом (р=0,006), проживанием беременной в городе (в сравнении с сельской местностью, р=0,02), и мужским полом новорожденного от повторных родов (р=0,008), что согласуется с эпидемиологически верифицированными факторами риска формирования атопии у детей. Контакт беременной с домашними животными приводит к увеличению количества активированных МПК, продуцирующих интерферон-у+ (субтип IFNy+/CD69+), р=0,03.

4. Снижение количества неактивированных МПК, продуцирующих интерферон-у+ (IFNy+/CD69-), свидетельствующее о внутриутробном сдвиге в балансе Thl/Th2 лимфоцитов, является сильным и независимым предиктором формирования атопического дерматита у детей грудного возраста. Относительный риск формирования атопического дерматита у новорожденных со сниженным абсолютным количеством МПК субтипа IFNy+/CD69- составил 3,4 (1,19-9,69).

5. Экспрессия поверхностных маркеров CD26+ и CD30+ на МПК связана с продукцией общего IgE пуповинной крови, отражая пренатальное соотношение активированных Thl/Th2 лимфоцитов. Однако снижение отношения CD26+/CD30+, как и уровень общего IgE пуповинной крови, не являются предикторами формирования атопического дерматита у детей грудного возраста.

6. Показано, что иммунологические показатели пуповинной крови новорожденных с сочетанной цереброспинальной патологией характеризуется абсолютной и относительной лимфопенией, выраженным увеличением относительного содержания естественных киллеров (CD16+CD56+), снижением количества активированных Thl-лимфоцитов (субтип IFNy+/CD69+ и CD26+) и высокой концентрацией общего IgE.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выделения группы детей, обладающих высоким риском формирования атопического дерматита, с проведением ранних превентивных мероприятий целесообразно использование сочетания высокозначимых анамнестических (положительный атопический семейный анамнез, социальный статус родителей (служащие) и вес при рождении менее 2900 г.) и лабораторно-иммунологических (низкое содержание IFNy+/CD69- МПК) маркеров.

2. Впервые полученные данные о содержании основных субпопуляций мононуклеаров пуповинной крови у новорожденных Красноярского края могут быть использованы в качестве региональных нормативно-референтных величин для оценки формирования пренатального иммунитета.

3. Исследование иммунологических показателей пуповинной крови у новорожденных с сочетанным поражением ЦНС рекомендуется использовать для оценки риска формирования инфекционных осложнений и научного обоснования иммунокорригирующих мероприятий.