Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клинико-морфологические особенности больных раком молочной железы с врожденной мутацией в гене СНЕК2

Ü03460 157

На правах рукописи

Воскресенский Дмитрий Анатольевич

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ВРОЖДЕННОЙ МУТАЦИЕЙ В ГЕНЕ

СНЕК2

Специальности: - 14.00.14 - онкология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2008

003460157

Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий»

Научные руководители:

Д.М.Н., профессор, член-корр. РАМН.

д.м.н, профессор

Владимир Федорович Семиглазов Евгений Наумович Имянитов

Официальные оппоненты:

д.м.н., профессор Адель Федоровна Урманчеева

д.б.н., профессор, Вадим Петрович Комов

Ведущее научное учреждение:

ФГУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи »

Защита диссертации состоится "_"_200_г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.052.01 ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Росмедтехнологий» (197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, д.68)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте института (vAvw.niioncologii.ru).

Автореферат разослан "_"_200_г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.м.н. Рашида Вахидовна Орлова

Актуальность проблемы

В настоящее время считается, что примерно до 5% случаев рака молочной железы (РМЖ) имеют наследственную природу (Имянитов Е.Н., и др. 2007; Семиглазов В.Ф. и др., 2008). За последнее десятилетие технологии молекулярной генетики позволили идентифицировать некоторые гены, которые ответственны за возникновение, течение и прогноз наследственных форм РМЖ. К генам с высокой пенетрантностью относятся BRCA (Breast Cancer Associated) 1 и 2 (гермкналькые мутации в которых повышают индивидуальный риск развития РМЖ на протяжении жизни пациента более чем в 100 раз), низкопенетрантные гены, такие как PTEN, Р53, ATM (герминальные мутации повышают индивидуальный риск развития РМЖ менее чем в 2 раза). Существуют также т.н. гены средней пенетрантности, например СНЕК2 и NBS1 (повышают индивидуальный риск развития РМЖ от 2 до 10 раз) (Weischer М. et al. 2008).

Ген СНЕК2 расположен в длинном плече 22 хромосомы, кодирует киназу, которая играет важную роль в проводящих путях реакции на повреждения ДНК (Falck J. et. al, 2001.) Эта роль сводится к координации хода клеточного цикла с механизмами репарации ДНК, с выживанием или апоптозом клеток. Дефекты в СНЕК2 приводят к возникновению, как спорадических опухолей, так и наследуемых, что свидетельствует о том, что СНЕК2 является супрессором опухолевого роста. Мутация СНЕК2 HOOdelC приводит к образованию дефектного белка, который не может выполнять функции киназы. Исследования показали, что измененный белок либо не экспрессируется, либо его экспрессия резко снижена (Dong et al., 2003). С 2002 года, когда СНЕК2 1100delC был признан первым низко-пенетрантным аллелем предрасположенности к раку молочной железы (Meijers-Heijboer и др., 2002; Vahteristo и др., 2002), эта мутация стала тщательно изучаться.

Диагноз «наследственного» РМЖ имеет, безусловно, клиническую значимость, т.к. позволяет выделить группы повышенного (иногда почти фатального) риска опухолей. Для подобных групп женщин представляется целесообразным создавать специальные условия, гарантирующие повышенную

доступность и высокую надёжность ранней диагностики онкологических заболеваний (Бит-Сава Е.М., 2005). При планировании скрининга следует иметь в виду, что у этой группы пациентов наибольшую чувствительность и специфичность показывает ежегодная магниторезонансная томография (МРТ) в сравнении со стандартной маммографией и сонографией (Семиглазов В.Ф. и др., 2008). В исключительных случаях (у носителей мутаций BRCA1) диагноз наследственного ракового синдрома обязывает рассматривать не только постоянную систему скрининга и раннего выявления опухоли, но и обоснованность профилактического хирургического вмешательства на молочных железах и яичниках (Семиглазов В.Ф., 2006; Бит-Сава Е.М., 2005).

В недалеком будущем, вероятно, появятся и консервативные методы профилактики и лечения, учитывающие молекулярно-генетические особенности наследственных форм опухолей. В настоящее время за рубежом изучается потенциальная возможность консервативной терапии и профилактики наследственного рака молочной железы с использованием ингибиторов PARP-1 (poly (ADP-ribose) polymerase), ядерного фермента, который в норме участвует в репарации разрывов одной цепи клеточной ДНК. Опухолевые клетки с дефектом гена BRCA1, который играет важную роль в системе репарации разрывов двух цепей ДНК, являются сильно зависимыми от эффективной работы фермента PARP-1 и чувствительными к его ингибиторам. Воздействие данных веществ на опухолевую клетку с дефектом системы репарации ДНК приводит к апоптозу. Опубликованные данные свидетельствуют, что ингибиторы PARP-1 могут повышать чувствительность опухоли к лучевой и химиотерапии. (Tan D.S. et al., 2008; Drew Y. et al., 2008; Lord C.J. et al., 2008; Rubinstein W.S., 2008).

Несмотря на высокую клиническую значимость, в практической деятельности онкологов в Российской Федерации уделяется недостаточное внимание выявлению групп женщин с генетически обусловленным фатальным риском опухолей молочной железы и яичников. Медико-генетическое консультирование и ДНК-тестирование этой группы пациенток налажено только лишь в крупных онкологических центрах Санкт-Петербурга и Москвы. Однако даже здесь не существует системы стандартов ранней диагностики, профилактики

и лечения наследственно детерминированных опухолей. Изучение природы наследственных форм РМЖ имеет важное научное значение, так как понимание механизмов возникновения опухолей связанных с терминальными мутациями, вероятно, откроет занавес в понимании этиологии спорадических форм составляющих почти 90 процентов опухолей молочной железы.

Учитывая многообразие известных на сегодняшний день аберраций, приводящих к повышению риска развития опухолей, можно предположить, что синдром генетической предрасположенности к раку, может быть обусловлен наследованием мутаций не только высокопенетрантных генов, таких как BRCA1, BRCA2, но и терминальных мутаций в изученных и неизвестных на сегодняшний день генах со средней и низкой пенетрантностью, в различных комбинациях и вариантах (Byrnes G.B. и др., 2008). Это определяет актуальность избранной темы диссертационной работы.

Цель исследования

Усовершенствовать и внедрить в рутинную клиническую практику методы, позволяющие идентифицировать наследственные формы РМЖ.

Задачи исследования:

1. Изучить клинические и морфологические признаки у больных РМЖ с врожденной мутацией в гене СНЕК2.

2. Оценить значимость диагностики мутаций в гене СНЕК2 для оценки риска развития рака молочной железы и особенностей клинического течения заболевания.

3. Изучить распространенность мутации СНЕК2 у больных с косвенными признаками наследственного РМЖ.

Научная новизна

Определена распространенность мутации СНЕК2 llOOdelC среди больных унилатеральным и билатеральным РМЖ в Северо-Западном регионе Российской Федерации, выявлена распространенность терминальных мутаций СНЕК2 1100 delC и BRCA1 5382insC у больных с косвенными признаками наследственного

РМЖ. Изучены косвенные клинические признаки наследственного РМЖ, а также проведена оценка значения сочетания этих признаков для диагностики наследственных форм РМЖ.

Научно-практическая значимость

Усовершенствованы критерии отбора больных РМЖ по косвенным клиническим признакам для медико-генетического консультирования и ДНК-тестирования.

Усовершенствован алгоритм диагностики наследственных форм РМЖ с использованием ДНК-тестирования на «горячие мутации» в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBS1.

Выработаны практические рекомендации по диспансерному наблюдению и раннему выявлению опухолей у носительниц мутаций в генах BRCA1, СНЕК2.

Апробация диссертации

Результаты диссертации были представлены на IV Международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы» (Санкт-Петербург, июнь 2007 г.), опубликованы в ведущих зарубежных научных изданиях, таких как Breast Cancer Research and Treatment (2006 г.) и Familial Cancer (2007 г.), а также доложены на V Международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы» (Санкт-Петербург, июнь 2008 г).

Результаты работы внедрены и используются в практической и научно исследовательской работе ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петров Росмедтехнологий» и в Санкт-Петербургской государственной педиатрическо медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации каких генов определяют наследственные формы РМЖ?

2. Связь между мутациями генов СНЕК2, BRCA1 и билатеральным РМЖ.

3. Уровень экспрессии рецепторов стероидных гормонов у больных РМЖ с мутацией в гене СНЕК2, BRCAI.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Научная работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц и 24 рисунка. Список литературы состоит из 108 источников российских и зарубежных авторов.

Содержание работы Материалы и методы

Научная работа состоит из двух этапов ретроспективного и проспективного. В ходе ретроспективного этапа работы была изучена медицинская документация 660 больных односторонним и 155 больных билатеральным раком молочной железы, а также 448 здоровых женщин 18-74 лет (средний возраст 44.4 лет), и 373 пожилых женщин (75-96 лет, средний возраст 80,7 лет) без опухоли которым было проведено ДНК-тестирование на врожденную мутацию СНЕК2 1100 del С в лаборатории молекулярной онкологии ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» до 2005 года.

В ходе проспективного этапа научного исследования с целью определения показаний для медико-генетического консультирования была изучена первичная медицинская документация (амбулаторные карты, истории болезни, выписные справки) 1204 пациенток проходивших лечение в отделении опухолей молочной железы ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий», а также пациенток, направленных на консультацию врача-генетика из других учреждений

Санкт-Петербурга с 1 октября 2005 г. по 1 мая 2008 г. Кроме больных раком молочной железы генетическому консультированию подлежали также и здоровые родственники пациенток, у которых были выявлены мутации в генах BRCA1, СНЕК2. Из 1204 женщин были отобраны и обследованы 275 пациенток. В их число вошли 148 больных РМЖ с косвенными признаками наследственной предрасположенности к опухолям, 71 больных раком молочной железы не вошедших в первую группу, но выразивших активное желание выполнить ДНК-тест, 6 больных раком яичников, и 50 здоровых женщин. Все эти женщины прошли медико-генетическую консультацию и им был выполнен ДНК тест на «founder» мутации BRCA1 5382 insC, BRCA1 4153 del А, СНЕК 2 1100 del С. Кроме того, 3 пациенткам выполнено полное секвенирование гена BRCA1.

Обследование данной группы женщин состояло из трех этапов:

- заполнение анкеты с целью сбора подробного семейного анамнеза и изучение первичной медицинской документации для выявления признаков наследственных форм рака молочной железы;

- медико-генетическая консультация с участием комиссии специалистов: врача-генетика и онколога;

- при выявлении показаний проводилось ДНК тестирование образцов крови пациентов, прошедших медико-генетическую консультацию, на наличие «горячих» мутаций в генах BRCA1, СНЕК2.

Показания к проведению медико-генетического консультирования и ДНК-тестированию определялись наличием хотя бы одного косвенного признака наследственного рака молочной железы или их комбинаций. Кроме этого обязательно учитывалось желание пациентки и мнение лечащего врача.

К клиническим признакам наследственных форм рака молочной железы были отнесены:

а) случаи рака молочной железы и рака яичников (РЯ) у ближайших родственников пациентки (в первую очередь у матери и родных сестер), наличие первично-множественных опухолей (РМЖ и РЯ), случаи билатерального рака молочной железы в семье;

б) «молодой» возраст пациенток (до 45 лет на момент установления диагноза РМЖ);

в) наличие первично-множественных опухолей у пациентки (сочетание РМЖ и рака яичников);

г) билатеральный рак молочной железы (метахронный и синхронный).

Источником для анализа ДНК являлись лейкоциты периферической крови.

Лабораторные процедуры предусматривали анализ «горячих» мутаций в генах BRCA1.CHEK2. Для этого использовались методики: выделения ДНК, аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени.

Выделение ДНК производилось из лейкоцитов периферической крови с помощью модифицированного соль-хлороформного метода (Mullenbach R. et al., 1989, Бит-Сава Е.М., 2005). Анализ мутаций BRCA1 5382insC, BRCA1 4153delA, BRCA1 185delAG, BRCA2 6174delT, CHEK2 llOOdelC и CHEK2 IVS2+1G>A проводился методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR) с использованием флуоресцентного красителя SYBR Green I и термоциклера iCycler iQ Real Time Detection System (Bio-Rad). (Рис. 1,2).

Cycle

Рис. 1. Мутация CHEK2 1100 del С не выявлена (Термоциклер ¡Cycler iQ Real Time Detection System (Bio-Rad))

44 46 49 50 52 54

Рис 2. Мутация СНЕК2 1100 del С обнаружена (Термоциклер ¡Cycler iQ Real Time Detection System (Bio-Rad))

Информация о пациентках собиралась в компьютерную базу данных Microsoft Access 2002. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Statsoft Inc. Statistica 6.0.

Результаты работы

В ходе ретроспективного этапа работы получены следующие результаты: было выявлено 14 (2,1%) носителей мутации из 660 больных односторонним раком молочной железы (р=0,0089). 8 (5,2%) из 155 пациенток страдавших билатеральным раком молочной железы (р<0,0001), а также 1 (0,2%) из 448 здоровых женщин средних лет (контроль) (табл. 1).

В ходе проспективного этапа исследования с целью оценки значимости косвенных клинических признаков в диагностике наследственных форм рака молочной железы было обследовано 148 больных РМЖ отобранных по перечисленным выше признакам. Следует отметить, что у некоторых пациенток имелось сочетание этих признаков в различных комбинациях.

В результате было выявлено 12 носителей мутаций BRCA1 5382 ins С, 1 носительница мутации BRCA1 R1699w (пациентке выполнялось полное секвенирование гена BRCA1), 1 носительница мутации BRCA1 4153delA, 1

носительница СНЕК2 1100 del С, 1 носительница NBS1 657 del5. В итоге было выявлено 16 (10,8%) случаев наследственного РМЖ (р<0,05). (Рис. 3).

Таблица 1.

Частота врожденной мутации СНЕК2 1100 del С у женщин СевероЗападного региона Российской Федерации.

Изучаемые группы Возрастные группы (лет) Количество носителей мутации СНЕК2 HOOdelC

Унилатеральный РМЖ п=660 25-86 14/660 (2,1%) (р=0,0089)

Билатеральный РМЖ п=155 26-87 8/155 (5,2%) (р<0,0001)

Здоровые женщины средних лет (контроль) п=448 18-74 1/448(0,2%)

10,8%

89,2% „ Наследственные формы РМЖ • Без мутаций

Рис. 3. Частота наследственных форм РМЖ в группе с косвенными клиническими признаками (п=148, р<0,05)

Значение возраста установления диагноза как критерия для диагностики наследственных форм РМЖ

Самым частым показанием для медико-генетического консультирования и ДНК-тестирования пациенток с РМЖ был возраст установления диагноза до 46 лет (91 случай из 148). В эту группу вошли женщины от 25 до 45 лет включительно, средний возраст составил 37,79 лег, среднеквадратичное отклонение о = 5,98. В результате было выявлено 10 носителей мутаций BRCA1 (п=91). А также 1 носительница мутации NBS1 657 del5. По данному критерию в исследуемой группе не было выявлено ни одной носительницы СНЕК2 1100.

Таким образом, было диагностировано 11 (12,1%) случаев наследственного РМЖ (п=91, р<0,01).

Значение семейного анамнеза как критерия для диагностики наследственных форм РМЖ Случаи РМЖ у родственников 1-2 степени родства Важным показанием для медико-генетического консультирования и ДНК-тестирования пациенток с РМЖ было наличие случаев РМЖ у ближайших родственников (1-2 степени родства). В этой группе было обследовано 63 пациентки, в результате было выявлено 4 носительницы BRCA1 5382 insC, 1 BRCA1 4153deIA, 1 BRCA1 R1699w, 1 CHEK2 1100 del С. Итого выявлено 7 (11,1%) случаев наследственного РМЖ (р<0,01). Следует отметить, что в этой группе допускалось сочетание признаков: молодого возраста пациентки (до 46 лет) и отягощенного семейного анамнеза и не учитывались иммуногистохимические характеристики опухоли.

Случаи рака яичников у родственников 1-2 степени родства Исследованная группа больных РМЖ, в семейном анамнезе которых встречались только случаи РЯ (у родственников 1-2 степени родства), была значительно меньше, чем предыдущая группа. 11 пациенток было отобрано по этому критерию из 148 больных РМЖ. Всем им также был проведен ДНК-тест, в результате которого выявлены 2 носительницы (18,2%; р=0,1066) мутации BRCA1 5382 ins С. Других исследуемых мутаций выявлено не было.

По-видимому, наличие в семейном анамнезе случаев РЯ (рис. 4) является более редким, но более весомым критерием для диагностики ВЯСА1-ассоциированного РМЖ, чем наличие у родственников только случаев РМЖ.

1

Условные обозначения (ф Здоровая женщина носитель мутации BRCA1 5382 insC ф Женщина страдающая РМЖ или РЯ | | Больные онкологической патологией кроме РМЖ и РЯ ^ Пробанд

j Пациент обследован, мутации BRCA1 5382 ins С не выявлено. [ | (3 Здоровые мужчина и женщина ? Статус BRCA1 неизвестен. БРМЖ Билатеральный РМЖ

Рис. 4 Генеалогическое дерево больной Д., 54 лет.

Значение сочетания случаев РМЖ и РЯ в семейном анамнезе (1-2 степень родства) для диагностики наследственных форм РМЖ

Наличие в семейном анамнезе сочетания случаев РМЖ и РЯ у родственников 1-2 степени родства сравнительно редкая ситуация, в эту группу отобрано го 148 больных РМЖ 7 пациенток.

В результате ДНК-тестирования на «горячие» мутации в генах BRCA1, СНЕК2 были выявлены 3 носительницы (42,9%; р>0,05) мутации BRCA1 5382 ins С (рис. 4).

Значение диагноза билатерального РМЖ как критерия для диагностики наследственных форм опухолей молочной железы

Билатеральным синхронным РМЖ считаются опухоли, диагностированные с интервалом менее одного года. По данному критерию из исследуемой группы больных РМЖ (п=148) отобрано 14 пациенток. Всем им также выполнен ДНК-тест на «горячие» мутации BRCA1, СНЕК2. В результате выявлено 2 носительницы (14,3%; р=0,0483) мутации BRCA1 5382 ins С. Носительниц мутаций СНЕК2 1100 del С в этой группе выявлено не было, видимо в связи с малой выборкой и сравнительно невысокой распространенностью этой мутации.

Билатеральным метахронным РМЖ считаются опухоли, диагностированные с интервалом более одного года. Из исследуемой группы больных РМЖ (п=148) отобрано 12 пациенток с билатеральным метахронным РМЖ. Все они были обследованы на «горячие» мутации BRCA1, СНЕК2. В результате выявлена одна носительница (8,3%; р=0,0212) мутации BRCA1 5382 ins С.

Значение иммуногистохимическнх характеристик опухоли как признака BRCA-ассоциированного РМЖ

Опухоли молочной железы не экспрессирующие рецепторы эстрогенов и / или прогестерона и HER2-neu, составляют достаточно разнородную группу, в которую входят и BRCA1, BRCA2 - ассоциированные раки.

Поскольку опухоли носителей врожденных мутаций BRCA1 редко экспрессируют рецепторы эстрогенов и / или прогестерона и HER2-neu (Бит-Сава Е.М., 2005), а опухоли, ассоциированные с врожденной мутацией в гене СНЕК2 наоборот часто экспрессируют эти рецепторы (Kilpivaara О. et al., 2005), тройная

негативность опухоли по уровню экспрессии рецепторов эстрогенов и / или прогестерона и HER2-neu может рассматриваться как косвенный признак наследственных исключительно BRCA- ассоциированных форм РМЖ.

Нами было обследовано 11 больных трижды-негативными РМЖ, следует заметить, что у некоторых из них имелось и сочетание этого признака с другими косвенными признаками наследственного РМЖ. При выполнении ДНК теста было выявлено 5 носителей (45,5%; р>0,05) мутаций BRCA1: 3 носительницы BRCA1 5382insC, 1 носительница BRCA1 4153delA и 1 носительница BRCA1 R1699w (пациентке было выполнено полное секвенирование гена BRCA1).

Значение сочетания косвенных клинических признаков для выявления наследственных форм РМЖ

Из приведенных в диссертации клинических случаев, очевидно, что часто косвенные клинические признаки наследственных форм РМЖ могут нередко сочетаться между собой. Для того чтобы изучить взаимосвязь сочетания нескольких признаков наследственного РМЖ с частотой выявления мутаций в генах BRCA1, СНЕК2 была исследована группа больных РМЖ (п=148) имеющих эти признаки, а также группа из 34 больных унилатеральным РМЖ, не имеющих ни одного косвенного клинического признака наследственной предрасположенности к РМЖ. Причем в исследуемой группе каждый случай РМЖ или РЯ в семейном анамнезе учитывался как отдельный признак.

В группу, у которых наблюдался 1 признак, вошли 87 больных РМЖ (табл.2). В результате ДНК-тестирования выявлено 4 пациентки с наследственными формами РМЖ. Из них 2 носительницы BRCA1 5382 ins С, 1 NBS1 657 del 5, 1 СНЕК2 1100 del С.

В группу, в которой наблюдалось 2 признака, вошли 40 больных РМЖ. В данной группе обнаружены 2 носительницы мутации BRCA1 5382 ins С.

Аналогично были обследованы 21 пациентки с РМЖ имевших одновременно 3 и более признаков наследственного РМЖ. Количество больных, у которых отмечалось сочетание более Зх признаков незначительное, поэтому выделять их в отдельную группу нецелесообразно. В результате ДНК-тестирования было

выявлено 9 носительниц мутации BRCAJ 5382 ins С и 1 BRCA1 4153 del А. Итого выявлено 10 носительниц врожденной мутации в гене BRCA1 из 21 обследованной.

В группе сравнения было обследовано 34 больные унилатеральным РМЖ, в возрасте старше 45 лет, не имевших случаев РЯ или РМЖ у родственников 1-2 степени родства. В этой группу не включались больные, опухоли которых были отрицательными по уровню рецепторов эстрогенов, прогестерона и HER2-neu.

В результате ДНК-тестирования больных без признаков наследственного РМЖ не было выявлено ни одной носительницы врожденных мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, NBS1 (табл. 2).

В результате можно сделать вывод о высокой значимости косвенных клинических признаков, а также их сочетания для диагностики врожденных мутаций в генах, определяющих высокую предрасположенность к онкологической патологии. Из полученных данных следует, что с увеличением количества сочетающихся косвенных клинических признаков наследственного РМЖ увеличивается и вероятность выявления мутаций, обуславливающих наследственную предрасположенность к РМЖ.

Таблица 2

Значение количества сочетающихся косвенных клинических признаков для выявления наследственных форм РМЖ.

Группа Количество признаков Количество обследованных Выявлено носителей мутаций BRCA1, СНЕК2, NBS1 Наследственные формы РМЖ р*

1 1 87 4 4,6% 0,1869

2 2 40 2 5% 0,1907

3 3 и более 21 10 47,6% <0,01

4 (контроль) 0 34 0 0%

* при сравнении относительных значений с контролем (Statistics 6.0)

Причем особенно высокая частота наследственного РМЖ наблюдается в группе 3, когда имеется сочетание трех и более признаков. В этом случае различия с контрольной группой статистически достоверны (р<0,01). По-видимому, частота выявления врожденных мутаций, обуславливающих предрасположенность к РМЖ в этой группе, может оказаться значительно выше при применении методики полного секвенирования генов. Очевидно, что в этой группе больных РМЖ можегг быть оправдано применение данной дорогостоящей методики. В случае отрицательного результата ДНК-тестирования больных, имеющих сочетание трех и более косвенных признаков, необходимо учитывать возможность реализации этой предрасположенности в результате наследования других, неизвестных на сегодняшний день генов, определяющих генетическую предрасположенность к онкологической патологии.

Клинические особенности больных наследственными формами рака молочной железы

С целью изучения клинических и морфологических особенностей наследственных форм РМЖ была исследована медицинская документация 41 больной РМЖ носителей врожденной мутации в генах BRCA1 и 15 больных РМЖ носителей мутации в гене СНЕК2, которые были выявлены в ФГУ НИИ онкологии им. H.H. Петрова с 2003 по 2008 год. В качестве группы контроля была отобрана случайным образом медицинская документация 300 больных РМЖ получавших лечение в отделении опухолей молочной железы в течение этого же периода времени.

Средний возраст возникновения первой опухоли в группе носителей мутации в гене СНЕК2 равен 51,13 лет (п=15), среднеквадратичное отклонение сг=14,3, минимальный возраст 25 лет, максимальный 72 года. Учитывая эти данные можно расширить рамки возрастного критерия отбора пациенток для медико-генетического консультирования с 45 до 50 лет. Средний возраст возникновения первой опухоли в группе носителей мутации в гене BRCA1 равен 44,05 лет. (п=41), среднеквадратичное отклонение о=7,89 , минимальный возраст 26 лет,

максимальный 67 лет. В группе контроля средний возраст возникновения опухоли составляет 53,05 лет (п=300), среднеквадратичное отклонение о=11,64, минимальный возраст 25 лет, максимальный 84 года.

Оценка достоверности различий средних возрастов в этих группах была проведена по (-критерию Стьюдента. В результате установлены статистически достоверные отличия (р=0,05) от контрольной группы у больных с врожденной мутацией в гене В11СА1, у которых диагноз РМЖ был установлен в среднем на 9 лет раньше.

При изучении статуса репродуктивной системы обследованных пациенток установлено, что наследственные формы РМЖ ассоциированные с врожденными мутациями в генах ВЯСА1 и СНЕК2 чаще встречаются у женщин в репродуктивном периоде, чем в состоянии постменопаузы (71%, р=0,0004 и 53%, р=0,1973 соответственно против 30% в группе контроля).

Достоверных различий в гистологическом строении опухолей ассоциированных с мутациями в генах ВЯСА1 и СНЕК2 в сравнении с контрольной группой выявлено не было. По гистологическому типу опухоли преимущественно представлены инвазивным протоковым раком, однако в сравнении с контролем в группе опухолей ассоциированных с СНЕК2 мутацией чаще встречается дольковая карцинома, а в группе опухолей ассоциированных с ВИСА 1 -мутацией несколько чаще встречаются редкие формы РМЖ, такие как медуллярная карцинома, слизистый рак и др.

По степени гистологической злокачественности опухоли, ассоциированные с мутациями в генах ВЯСА1 и СНЕК2, достоверно не отличаются от группы контроля.

При морфологической оценке размеров первичной опухоли (рТ), в исследуемых группах обращает на себя внимание особенность, что опухоли носителей мутаций в гене СНЕК2 чаще представлены в подгруппе рТ1-Т2 по сравнению с контрольной группой: 89% (СНЕК2) против 70% (контроль), р=0,0967 и соответственно реже в подгруппе рТЗ-Т4.

В группе опухолей носителей мутации в гене ВИСА1 различия не столь заметны: в подгруппе рТ1-Т2 находится 76% образцов по сравнению с контрольной группой 70%, р=0,4936.

При изучении морфологического статуса регионарных лимфоузлов (рИ), который является важным критерием для оценки прогноза заболевания, в исследуемых группах не было отмечено статистически значимых различий с контрольной группой.

В ходе данной научной работы выявлено, что по уровню экспрессии рецепторов эстрогенов (ЭР) и НЕК2-пеи наследственные опухоли, ассоциированные с мутацией СНЕК2, достоверно не отличаются от спорадического РМЖ. Все же имеется небольшая тенденция к повышенной экспрессии рецепторов прогестерона. Напротив наследственные раки, ассоциированные с мутацией ВЯСА1 часто по уровню экспрессии ЭР, ПР и НЕЯ2-пеи представлены «трижды негативными» опухолями (р<0,05).

При изучении семейного анамнеза больных наследственными формами РМЖ, ассоциированными с ВЯСА1 и СНЕК2 мутациями установлено, что их родственники в 2 раза чаще страдают различными онкологаческими заболеваниями, чем родственники больных спорадическими формами РМЖ.

Причем родственники больных РМЖ, ассоциированным с СНЕК2 мутацией в 3 раза чаще, чем в контроле страдают РМЖ. В группе носителей мутации в гене ВЯСА1 родственники больных РМЖ почти в 4 раза чаще страдали РМЖ, чем родственники больных РМЖ из группы контроля (43% против 11,3%, р=0,0115), и в 8 раз чаще страдали раком яичников по сравнению с контролем (18,6% против 2,3%, р=0,3695). По другим опухолям существенных различий не выявлено.

Выводы:

1. Наследственные формы РМЖ в Северо-Западном регионе Российской Федерации определяются не только мутациями в высокопенетрантных генах, таких как ВЯСА1, но также и мутациями в генах со средней пенетрантностью, такими как СНЕК2.

2. В Северо-Западном регионе Российской Федерации врожденная мутация СНЕК2 1100с1е1С выявлена у 2,1 % больных унилатеральным РМЖ и у 5,2% больных билатеральным РМЖ. (р<0,01).

3. Усовершенствованы критерии отбора больных РМЖ для медико-генетического консультирования и ДНК-тестирования с целью выявления наследственных форм РМЖ:

а) наличие случаев рака яичников и / или РМЖ у кровных родственников больной (1-2 степень родства);

б) билатеральный рак молочной железы (синхронный или метахронный);

в) первично-множественные опухоли у заболевшей (сочетание РМЖ и рака яичников);

г) возраст установления диагноза РМЖ до 50 лет;

д) наличие опухоли с отсутствием экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и Н1Ж2-пеи (трижды-негативные опухоли).

4. Наследственные формы РМЖ диагностированы с помощью ДНК-тестирования у 10,8% больных РМЖ имеющих косвенные клинические признаки наследственной предрасположенности к опухолям.

5. Средний возраст установления диагноза РМЖ у носителей врожденной мутации в гене ВЯСА! составляет 44 года, что на 9 лет раньше, чем у женщин без мутации (р=0,05).

6. 71% больных РМЖ с врожденной мутацией в гене ВНСА1, находились в репродуктивном возрасте, против 30% пациенток из контрольной группы (р<0,01). В группе носителей герминальной мутации в гене СНЕК2 имеется тенденция к более частому возникновению РМЖ в репродуктивном возрасте 53%, против 30% в контрольной группе (р>0,05).

7. У 80% больных с врожденной мутацией в гене ВИСА1 выявляются опухоли с отсутствием экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и НЕЯ2-пеи. Наследственные опухоли молочной железы, ассоциированные с мутацией в гене СНЕК2, по уровню экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и ШЖ2-пеи достоверно не отличаются от спорадических опухолей молочной железы.

Практические рекомендации

1. Больным РМЖ с косвенными клиническими признаками наследственного заболевания показано медико-генетическое консультирование и ДНК-тестирование на горячие мутации BRCA1 5382insC, BRCA1 4153delA, СНЕК2 1100 delC. При отрицательном результате и наличии трех и более клинических признаков наследственного РМЖ показано тестирование на дополнительный набор мутаций: BRCA1 185 delAG, BRCA1 C61G, BRCA2 6174delT, NBS1 657del5, CHEK2 IVS2+1G>A. При отрицательном результате и наличии трех и более клинических признаков наследственного РМЖ целесообразно выполнение полного секвенирования гена BRCA1.

2. ДНК-тестирование целесообразно проводить и кровным родственникам больных наследственным РМЖ.

3. Здоровым женщинам - носителям мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, BRCA2, NBS1 целесообразно рекомендовать комплекс скрининговых мероприятий направленных на раннее выявление опухолей молочных желез, а также опухолей яичников (для носителей мутаций в гене BRCA1), включающих помимо стандартных методов (маммографии и УЗИ), также и магнитно-резонансную томографию (МРТ).

4. При диспансерном наблюдении за больными наследственными формами РМЖ целесообразно учитывать повышенную вероятность развития опухоли в противоположной молочной железе, а у носителей мутаций в гене BRCA1 и высокую частоту первично-множественных заболеваний (сочетание РМЖ и рака яичников).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Воскресенский Д.А. Медико-генетическое консультирование больных наследственными формами рака молочной железы. / Воскресенский Д.А., Бит-Сава Е.М., Иевлева А.Г. и др. // Материалы пятой международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы», - СПб. - 2008. - С. 22-23.

2. Воскресенский Д.А. Психологические аспекты медико-генетического консультирования больных наследственными формами рака молочной железы. / Воскресенский Д.А., Вандинская А.И., Тимофеева Е.С. и др. // Вестник российской Военно-медицинской академии.- 2007. - Т.З (19).- С. 258.

3. Воскресенский Д.А. Клинические и генетические аспекты наследственного рака молочной железы. / Воскресенский Д.А., Соколенко А.П., Иевлева А.Г. и др. // Материалы четвертой международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы». -СПб. - 2007.- С. 58.

4. Воскресенский Д.А. Возраст манифестирования рака молочной железы у пациенток с врожденной мутацией в генах СНЕК2 и BRCA1. / Воскресенский Д.А., Соколенко А.П., Иевлева А.Г. // Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины».- СПбМАПО,- 2008.- С. 220221.

5. Семиглазов В.Ф. Патоморфология предрака, неинвазивных и инвазивных форм рака молочной железы. / Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Воскресенский Д.А. и др. // Материалы четвертой международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы». -СПб. - 2007,-С. 102-110.

6. Семиглазов В.Ф. Эффективность неоадьювантной эндокринотерапии в сравнении с химиотерапией у постменопаузальных больных с гормонзависимым (ЭР+) раком молочной железы. / Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Воскресенский Д.А. II Материалы четвертой

международной ежегодной конференции «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы». - СПб. - 2007.- С. 124-131.

7. Семиглазов В.Ф. Прямое сравнение эффективности неоадъювантной эндокринотерапии и химиотерапии у постменопаузальных больных с гормонозависимым (ЭР+) раком молочной железы.. / Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В., Воскресенский Д.А. и др. И Опухоли женской репродуктивной системы. Маммология / онкогинекология - 2007. - Т. 3.- С. 28-37.

8. Chekmariova E.V. СНЕК2 IlOOdelC mutation is frequent among Russian breast cancer patients. / Chekmariova E.V., Sokolenko A.P., Voskresenskiy D.A., et al. // Breast Cancer Research and Treatment. - 2006. - Vol. 100. - P. 99-102.

9. Semiglazov V.F. Phase II clinical trial of neoadjuvant hormone therapy in comparison with chemotherapy of patients with breast cancer. / Semiglazov V.F., Semiglazov V.V., Voskresenskii D.A. et al. // Vopr. Onkol. - 2007. - Vol. 53(4). -P. 400-408.

10. Sokolenko A.P. Founder mutations in early-onset, familial and bilateral breast cancer patients from Russia. / Sokolenko A.P., Rozanov M.E., Voskresenskiy D.A. et al. // Fam. Cancer. -2007. - Vol. 6. - P. 281-286.

Благодарности

Выражаю сердечную признательность научному руководителю диссертационной работы заслуженному деятелю науки РФ, чл.-корр. РАМН, проф. Владимиру Федоровичу Семиглазову за постоянное внимание и ценные рекомендации.

От всей души благодарю научного руководителя диссертационной работы проф. Евгения Наумовича Имянитова за мудрое руководство и неустанную поддержку.

Приношу сердечную благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии: Иевлевой А.Г., к.б.н. Кулигиной Е.Ш., к.м.н. Суспицину E.H., к.м.н. Буслову К.Г., Соколенко А.П., Розанову М.Е., Чекмаревой Е.В., Митюшкиной Н.В., Яцук О.С., Зайцевой O.A., Рикуновой JI.B., Пономаревой Д.Н. за помощь в выполнении работы.

Выражаю глубокую благодарность всем сотрудникам 1 хирургического отделения за помощь в работе, особенно к.м.н. Раисе Тихоновне Поповой, д.м.н. Алле Александровне Божок, к.м.н. Вадиму Геннадьевичу Иванову, к.м.н. Петру Владимировичу Криворотько.

Искренне признателен сотрудникам патологоанатомической лаборатории, в особенности руководителю лаборатории проф. Дмитрию Евгеньевичу Мацко.

Подписано в печап. «25» декабря 2008 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ№_

Типография «Восстания-1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Изучение наследственных форм злокачественных опухолей проводится в течение нескольких последних десятилетий. Однако большой прорыв в этих исследованиях произошел в 1990 году, когда впервые технологии молекулярной генетики позволили выявить ген с высокой пенетрантностью BRCA1, мутации в котором повышают индивидуальный риск рака молочной железы (РМЖ) более чем в 100 раз (Hall J.M., 1990; Miki Y., 1994; Pejovic Т., 1995). В последующие годы были идентифицированы и другие гены г ответственные за наследственную предрасположенность к опухолям молочной железы: BRCA2 еще один ген с высокой пенетрантностью, а также гены со средней (СНЕК2, NBS1) и низкой пенетрантностью (PTEN, Р53, ATM) (Копнин Б.П., 2000; Weischer М. et al. 2008; Turnbull С. et al., 2008; Garcia M.J. et al., 2008).

Накопленные знания об особенностях наследственных форм рака молочной железы, вызванных мутациями в генах BRCA1, BRCA2 свидетельствуют он необходимости создания особых условий скрининга и раннего выявления опухоли, а также обосновывают проведения профилактических хирургических вмешательств на молочных железах и яичниках у женщин с врожденными дефектами в этих генах (Семиглазов В.Ф., 2006; Бит-Сава Е.М., 2005; Perez Segura P. et al., 2008; Scheufler O. et al., 2008; Tan D.S., 2008).

В недалеком будущем, вероятно, появятся и консервативные методы профилактики и лечения, учитывающие молекулярно-генетические особенности наследственных форм опухолей. В настоящее время за рубежом изучается потенциальная возможность консервативной терапии и профилактики наследственного рака молочной железы с использованием ингибиторов «PARP-1» (poly (ADP-ribose) polymerase), ядерного фермента, который в норме участвует в репарации разрывов одной цепи клеточной ДНК.

Опухолевые клетки с дефектом гена BRCA1, который играет важную роль в системе репарации разрывов двух цепей ДНК, являются сильно зависимыми от эффективной работы фермента PARP-1 и чувствительными к его ингибиторам. Воздействие данных веществ на опухолевую клетку с дефектом системы репарации ДНК приводит к апоптозу. Опубликованные данные свидетельствуют, что ингибиторы PARP-1 могут повышать чувствительность опухоли к лучевой и химиотерапии. (Tan D.S. et al., 2008; Drew Y. et al., 2008; Lord С J. et al., 2008; Rubinstein W.S., 2008).

Несмотря на высокую клиническую значимость, в практической деятельности онкологов в Российской Федерации уделяется недостаточное внимание выявлению групп женщин с генетически обусловленным фатальным риском опухолей молочной железы и яичников. Медико-генетическое консультирование и ДНК-тестирование этой группы пациенток налажено только лишь в крупных онкологических центрах Санкт-Петербурга и Москвы.

Однако даже здесь не существует системы стандартов ранней диагностики, профилактики и лечения наследственно детерминированных опухолей.

Прогресс в изучении механизмов возникновения наследственных форм рака молочной железы обусловленных дефектами в генах с высокой пенетрантностью (BRCA1, BRCA2), так и в генах со средней (СНЕК2, NBS1) и низкой пенетрантностью (PTEN, Р53, ATM), в недалеком будущем может привести к созданию эффективных средств профилактики и лечения данных форм онкологической патологии, а также оказать содействие в понимании механизмов возникновения спорадических опухолей молочной железы.

Цель исследования

Усовершенствовать и внедрить в рутинную клиническую практику методы, позволяющие идентифицировать наследственные формы РМЖ.

Задачи исследования:

1. Изучить клинические и морфологические признаки у больных РМЖ с врожденной мутацией в гене СНЕК2.

2. Оценить значимость диагностики мутаций в гене СНЕК2 для оценки риска развития рака молочной железы и особенностей клинического течения заболевания.

3. Изучить распространенность мутации СНЕК2 у больных с косвенными признаками наследственного РМЖ.

Научная новизна

Определена распространенность мутации СНЕК2 llOOdelC среди больных унилатеральным и билатеральным РМЖ в Северо-Западном регионе Российской Федерации, выявлена распространенность терминальных мутаций СНЕК2 llOOdelC и BRCA1 5382insC у больных с косвенными признаками наследственного РМЖ.

Изучены косвенные клинические признаки наследственного РМЖ, а также проведена оценка значения сочетания этих признаков для диагностики наследственных форм РМЖ.

Практическая значимость

Усовершенствованы критерии отбора больных РМЖ по косвенным клиническим признакам для медико-генетического консультирования и ДНК-тестирования.

Усовершенствован алгоритм диагностики наследственных форм РМЖ с использованием ДНК-тестирования на «горячие мутации» в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBS1.

Выработаны практические рекомендации по диспансерному наблюдению и раннему выявлению опухолей у носительниц мутаций в генах BRCA1, СНЕК2.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации каких генов определяют наследственные формы РМЖ?

2. Связь между мутациями генов СНЕК2, BRCA1 и билатеральным РМЖ.

3. Уровень экспрессии рецепторов стероидных гормонов у больных РМЖ с мутацией в гене СНЕК2, BRCA1.

Реализация результатов работы

Результаты работы внедрены и используются в практической и научно-исследовательской работе ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий» и в Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Научная работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц и 24 рисунка. Список литературы состоит из 108 источников российских и зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ:

1. Наследственные формы РМЖ в Северо-Западном регионе Российской Федерации определяются не только мутациями в высокопенетрантных генах, таких как BRCA1, но также и мутациями в генах со средней пенетрантностью, такими как СНЕК2.

2. В Северо-Западном регионе Российской Федерации врожденная мутация СНЕК2 1 lOOdelC выявлена у 2,1% больных унилатеральным РМЖ и у 5,2% больных билатеральным РМЖ. (р<0,01).

3. Усовершенствованы критерии отбора больных РМЖ для медико-генетического консультирования и ДНК-тестирования с целью выявления наследственных форм РМЖ: а) наличие случаев рака яичников и / или РМЖ у кровных родственников больной (1 -2 степень родства); б) билатеральный рак молочной железы (синхронный или метахронный); в) первично-множественные опухоли у заболевшей (сочетание РМЖ и рака яичников); г) возраст установления диагноза РМЖ до 50 лет; д) наличие опухоли с отсутствием экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и HER2-neu (трижды-негативные опухоли).

4. Наследственные формы РМЖ диагностированы с помощью ДНК-тестирования у 10,8% больных РМЖ имеющих косвенные клинические признаки наследственной предрасположенности к опухолям.

5. Средний возраст установления диагноза РМЖ у носителей врожденной мутации в гене BRCA1 составляет 44 года, что на 9 лет раньше, чем у женщин без мутации (р=0,05).

6. 71% больных РМЖ с врожденной мутацией в гене BRCA1, находились в репродуктивном возрасте, против 30% пациенток из контрольной группы (р<0,01). В группе носителей терминальной мутации в гене СНЕК2 имеется тенденция к более частому возникновению РМЖ в репродуктивном возрасте 53%, против 30% в контрольной группе (р>0,05).

7. У 80% больных с врожденной мутацией в гене BRCA1 выявляются опухоли с отсутствием экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и HER2-neu. Наследственные опухоли молочной железы, ассоциированные с мутацией в гене СНЕК2, по уровню экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и HER2-neu достоверно не отличаются от спорадических опухолей молочной железы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Больным РМЖ с косвенными клиническими признаками наследственного заболевания показано медико-генетическое консультирование и ДНК-тестирование на горячие мутации BRCA1 5382insC, BRCA1 4153delA, СНЕК2 1100 delC. При отрицательном результате и наличии трех и более клинических признаков наследственного РМЖ показано тестирование на дополнительный набор мутаций: BRCA1 185 del AG, BRCA1 C61G, BRCA2 6174delT, NBS1 657del5, CHEK2 IVS2+1G>A. При отрицательном результате и наличии трех и более клинических признаков наследственного РМЖ целесообразно выполнение полного секвенирования гена BRCA1.

2. ДНК-тестирование целесообразно проводить и кровным родственникам больных наследственным РМЖ.

3. Здоровым женщинам - носителям мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, BRCA2, NBS1 целесообразно рекомендовать комплекс скрипинговых мероприятий направленных на раннее выявление опухолей молочных желез, а также опухолей яичников (для носителей мутаций в гене BRCA1), включающих помимо стандартных методов: маммографии и УЗИ, также и магнитно-резонансную томографию (МРТ).

4. При диспансерном наблюдении за больными наследственными формами РМЖ целесообразно учитывать повышенную вероятность развития опухоли в противоположной молочной железе, а у носителей мутаций в гене BRCA1 и высокую частоту первично-множественных заболеваний (сочетание РМЖ и рака яичников).