Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОДГОТОВКИ ЭНДОМЕТРИЯ К ПЕРЕНОСУ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ



На правах рукописи

Л I)

а.о

ЛЕВИАШВИЛИ

Мзия Мерабовна

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОДГОТОВКИ ЭНДОМЕТРИЯ К ПЕРЕНОСУ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

14.01.01 — Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 о АВГ 2012

Москва-2012

005046675

Работа выполнена в 1-ом гинекологическом отделении (отделение сохранения и восстановления репродуктивной функции) ФГБУ «Научный центра акушерства гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель: доктор медицинских наук Мишиева Нона Годовна

Официальные оппоненты:

Серебрянникова Клара Георгиевна - доктор медицинских наук, профессор кафедры семейной медицины с курсом экстрагенитальной патологии в акушерстве и гинекологии ФППОВ ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова»

Калугина Алла Станиславовна - доктор медицинских наук, ассистент

кафедры репродуктивного здоровья женщины ГБОУ ВПО

«Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится «18» сентября 2012 г. в 13.00 ч. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.125.01 при ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «7» августа 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Калинина Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Криоконсервация эмбрионов значительно расширяет клинические преимущества и возможности циклов ЭКО, повышая кумулятивную частоту наступления беременности в расчете на один цикл стимуляции суперовуляции. Несмотря на почти 30 летнюю историю метода и постоянное совершенствование лабораторных этапов, эффективность криопереносов все еще остается низкой и по данным различных авторов составляет 10-30 % (Калинина Е.А., 2004; Вейсман А., 2010; Hodes-Wertz В., 2011).

В последние годы предметом активного обсуждения научного сообщества становится проблема повышения результативности криоциклов, эффективность которой определяется как качеством размороженных эмбрионов, так и структурно-функциональной полноценностью эндометрия (Edgar D., 2000; Margalioth Е., 2006).

Согласно современным представлениям, в процессе имплантации важная роль принадлежит реципрокным взаимодействиям эндометрия с одной стороны, и бластоцисты, с другой стороны. Этот процесс опосредуется различными паракринными регуляторами: цитокинами, простагландинами, факторами роста, семейством молекул адгезии, компонентами межклеточного вещества и др. Изучение характера экспрессии молекул, вовлеченных в процесс имплантации, представляется перспективным в оценке рецептивности эндометрия (Achache H., 2006, Бурлев В .А., 2010; Dimitriadis Е„ 2010).

Наиболее активно в литературе обсуждается вклад в процесс имплантации лейкемия-ингибирующего фактора (ЛИФ). Этот цитокин продуцируется эндометрием на протяжении всего менструального цикла, однако, значительный подъем его экспрессии отмечается во второй половине фазы секреции (19-25-й день цикла) и сопряжен с периодом расцвета пиноподий (Aghajanova L., 2010; Hammoda М.А., 2012). Многие

з

авторы отмечают важную роль гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста (ГС-ЭФР) в процессе имплантации. Максимальная экспрессия ГС-ЭФР в эндометрии также совпадает с расцветом пиноподий (Chobotova К., 2001; Lessey В., 2002; Ejskjaer К., 2005; Byun Н„ 2008).

Экспрессию маркеров в эндометрии можно оценить при иммуногистохимическом исследование соскобов секреторного

эндометрия. Метод является инвазивным и при высокой информативности имеет свои ограничения - применим только в циклах обследования (Dimitriadis Е., 2010). В связи с этим, актуальным является поиск неинвазивных методов, позволяющих оценить рецептивность эндометрия непосредственно в циклах переноса эмбрионов. Проведены исследования, обнаруживающие взаимосвязь экспрессии молекул в ткани эндометрия с его содержанием в смывах из полости матки и цервикальной слизи (Ledee-Bataille N., 2002; Mikolajczyk M., 2003; Gargiulo A.R., 2004). Однако эти работы не имеют пока клинической интерпретации и не применяются на практике.

Болыцое значение имеет выбор метода подготовки эндометрия к криопереносу. Анализ современной научной литературы показал, что наиболее часто в клинической практике применяют гормональную подготовку эндометрия препаратами эстрадиола и прогестерона, перенос размороженных эмбрионов в естественном овуляторном менструальном цикле, а также при стимуляции яичников небольшими дозами гонадотропинов (Gelbaya Т.А., 2006; Chen S.L., 2007; Glujovsky D., 2010).

Значительный вклад в формирование успеха криоциклов ВРТ вносит качество размороженных эмбрионов. Скрупулезный отбор жизнеспособных эмбрионов с хорошим прогнозом выживаемости после размораживания имеет первостепенное значение для достижения успеха. Следует отметить, что дискутабельным остается вопрос выбора наиболее эффективного метода криоконсервации эмбрионов (медленное замораживание или витрификация), а также наиболее подходящей для

криоконсервации стадии развития преимплантационного эмбриона (Кис Р., 2010; Яоэепшакз Ъ„ 2011).

Результаты различных исследований достаточно противоречивы, поэтому представляется актуальным поиск диагностически ценных методов оценки рецептивности эндометрия, применимых на практике (как в циклах обследования, так непосредственно в циклах переносов эмбрионов), определение эффективности различных методов подготовки эндометрия к криопереносу, а также оптимизация эмбриологических этапов криоциклов.

В связи с вышеуказанным, целью исследования явилась: оптимизация программ вспомогательных репродуктивных технологий с использованием криоконсервированных эмбрионов путем усовершенствования схем подготовки и ведения циклов переноса размороженных эмбрионов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить клинико-анамнестические данные пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе для выявления ведущих факторов, предрасполагающих к нарушению рецептивности эндометрия.

2. Изучить анатомо-функциональное состояние эндометрия и его имплантационные свойства у пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе.

3. Определить наиболее диагностически значимые параметры оценки имплантационного потенциала эндометрия и установить их влияние на исходы программ ЭКО с использованием размороженных эмбрионов.

4. Изучить влияние метода криоконсервации (витрификация, медленное замораживание) на выживаемость и качество размороженных эмбрионов, а также результативность их переносов.

5. Провести сравнительный анализ и оценить эффективность различных протоколов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов.

6. Разработать алгоритм подготовки пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе к переносу криоконсервированных эмбрионов.

Научная новизна

Определены клинико-анамнестические факторы,

предрасполагающие к нарушению рецептивности эндометрия. Выявлены особенности рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными попытками ЭКО в анамнезе: при сохраненной морфологической структуре эндометрий характеризуется дисбалансом в экспрессии стероидных рецепторов и снижением формирования и созревания пиноподий.

Установлен наиболее значимый диагностический маркер имплантиции - ЛИФ. Прослежена корреляционная зависимость между его экспрессией в эндометрии и концентрацией в цервикальной слизи. Выявлены особенности экспрессии этого цитокина в эндометрии, присущие пациенткам с неудачами ЭКО в анамнезе.

Определены прогностически благоприятные критерии для наступления беременности: концентрация ЛИФ в цервикальной слизи в пределах 12-25 пг/мл, высокий уровень экспрессии ЛИФ в эпителии и железах эндометрия, а также более 40% клеток поверхностного эпителия с пиноподиями, и соотношение ПР/ЭР <10.

Изучены особенности течения циклов переноса размороженных эмбрионов в зависимости от способа подготовки эндометрия. Определены критерии выбора протокола подготовки эндометрия в криоциклах. Проведен анализ эффективности медленного замораживания эмбрионов и их витрификации на 5-й день культивирования по выживаемости эмбрионов и частоте наступления беременности (выявлена равнозначность методов).

Практическая значимость

На основании полученных результатов разработан алгоритм обследования пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе. Разработаны рекомендации для комплексной оценки имплантационных

свойств эндометрия путем морфологического и иммуногистохимического исследования ткани эндометрия в период имплантационного окна, а также исследования цервикальной слизи. Выявлены наиболее диагностически ценные параметры оценки рецептивности эндометрия.

Определены клинические и лабораторные параметры, определяющие выбор протокола подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов в криоциклах ВРТ.

Установлено, что медленное замораживание бластоцист и их витрификация обладают одинаковой эффективностью и могут быть равнозначно использованы в зависимости от оснащенности и предпочтений эмбриологической лаборатории.

Положения, выносимые на защиту

1. При нормальных параметрах овариального резерва, а также адекватном фолликуло-, оо- и раннем эмбриогенезе неудачи в программах ЭКО могут быть связаны с нарушением имплантационных свойств эндометрия, на что указывает наличие негативных факторов (патология эндометрия, ИППП, повторные внутриматочные вмешательства), достоверно чаще встречающихся в анамнезе женщин с неудачными попытками ВРТ.

2. Прогностически неблагоприятными признаками для наступления беременности являются: концентрации ЛИФ в цервикальной слизи до 12 и от 25 пг/мл, снижение экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии и железах эндометрия, а также снижение количества клеток с наличием пиноподий менее 40% поверхностного эпителия, соотношение ПР/ЭР>10. Выявление указанных параметров обуславливает необходимость проведения подготовительной терапии.

3. Протоколы с гормональной подготовкой эндометрия и перенос размороженных эмбрионов в естественном цикле одинаково эффективны (частота наступления беременности - 23% и 26% соответственно). Выбор протокола зависит от исходных клинико-лабораторных характеристик

пациенток. Способ криоконсервации эмбрионов 5-го дня культивирования

не влияет на их выживаемость и частоту наступления беременности.

Личный вклад автора Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на

всех этапах исследования, анализе и обобщении полученных результатов.

Автором лично проводился отбор, обследование и лечение пациенток,

статистическая обработка и научное обоснование результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле

специальности 14.01.01 - акушерство и гинекология. Результаты

проведенного исследования соответствуют области исследования

специальности, конкретно пункту 3 и 5 паспорта акушерства и

гинекологии.

Внедрение результатов в практику Результаты исследования внедрены в практическую работу 1-го

гинекологического отделения (отделение сохранения и восстановления

репродуктивной функции) ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова»

Минздравсоцразвития России.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 в

ведущих рецензируемых научных журналах определенных ВАК.

Апробация работы

Основные положения диссертации и результаты работы доложены на

XXI ежегодной международной конференции Российской ассоциации

репродукции человека (Санкт-Петербург, 2011) и VI международном

конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012).

Работа обсуждена на конференции сотрудников 1-го

гинекологического отделения ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова»

Минздравсоцразвития России (09.04.2012) и заседании апробационной

комиссии ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития РФ

(16.04.2012, протокол №8).

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 139 страницах, содержит 28 рисунков и 20 таблиц. Список литературы содержит 193 работ, в том числе 155 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования Для достижения цели исследования и решения поставленных задач

работа выполнялась проспективно в три этапа (рисунок 1).

II этап

III этап

{/сппвпан группа (п~22^) пациентки с >2 неудачными программами ЭКО в анамнезе

...... ■ V-- ......

Группа исс.и'Очяынин (п-79) пациентки, которым проводилось углубленное исследование рецептивностц эндометрия

Группа сравнения (п=30) пациентки с бесплодием в анамнезе, у которых беременность наступила в 1 или 2 программе

Группа контро;ш {п=Н) фертильные женщины, которым проводилось углубленное исследование рецептивности эндометрия

V

Группа I {п=!9) перенос размороженных эмбрионов производился в естественном цикле

Группа II (п 2<>! перенос размороженных эмбрионов производился в цикле с гормональной подготовкой эндометрия

Группа Ш (n~l6j перенос эмбрионов в цикле с применением «мягких» схем стимуляции овуляции

Рисунок 1. Дизайн исследования.

На первом этапе работы было обследовано 228 бесплодных женщин с 2-мя и более неудачными программами ЭКО в анамнезе, обратившихся в отделение сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России для продолжения лечения бесплодия методом переноса криоконсервированных эмбрионов в 2009-2011г.г.

Критериями включения пациенток в исследование явились: наличие 2 более неудачных попыток ЭКО в анамнезе; возраст пациенток от 20 до 38 лет включительно; отсутствие гинекологических заболеваний, влияющих на репродуктивную функцию и рецептивность эндометрия; отсутствие соматических, эндокринных и психических заболеваний в стадии декомпенсации, а также, злокачественных новообразований органов репродуктивной системы.

Для оценки значимости различных клинико-анамнестических данных в прогнозировании имплантационного потенциала эндометрия и исходов программ ЭКО на данном этапе работы была сформирована группа сравнения, состоящая из 30 пациенток с бесплодием в анамнезе, у которых беременность наступила в 1-ой или 2-ой программе ЭКО.

При сборе анамнеза оценивали менструальный цикл и репродуктивный анамнез пациентки. Особое внимание обращали на наличие в анамнезе оперативных вмешательств на органах малого таза, в том числе и гистероскопии. Большой интерес представляло ранее проведенное лечение бесплодия. Детально изучали клинические и эмбриологические параметры предыдущих программ ЭКО: толщину и структуру эндометрия в программах ВРТ, динамику роста фолликулов, способ оплодотворения, оогенез (количество и зрелость полученных ооцитов) и эмбриогенез, а также количество криоконсервированных эмбрионов, стадия развития эмбрионов, на которой была произведена криоконсервация, методы и протоколы криоконсервации.

На втором этапе работы проводили углубленное исследование имплантационных свойств эндометрия у 79 ранее обследованных женщин основной группы и 8 фертильных женщин репродуктивного возраста с регулярным менструальным циклом, имеющим в анамнезе самостоятельную беременность и роды, составивших группу контроля. Обследование проводили по следующему алгоритму:

• для оценки состояния органов малого таза на 3-5 день цикла производили УЗ исследование (отделение функциональной диагностики ФГБУ НЦ АГиП Минздравсоцразвития России, руководитель - профессор Гус А.И.);

• в дальнейшем для динамической оценки роста и созревания фолликула, констатации овуляции, развития желтого тела, а также оценки толщины и структуры эндометрия производили УЗ-мониторинг цикла;

• на 6-8-й день после овуляции, которую отслеживали совместно 2 методами (УЗ мониторинг цикла и функциональные тесты, для определения пика ЛГ

10

в моче), также осуществляли УЗИ для оценки толщины и структуры эндометрия, после чего производили забор цервикальной слизи и пайпель-биопсию эндометрия.

Забор цервикальной слизи (ЦС) производили урогенитальным «велюр-зондом» фирмы «Сорап» (Италия). Анализ образцов проводили методом ИФА в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ "НЦ АГиП им. В.И.Кулакова" Минздравсоцразвития России (руководитель - д.м.н. Кречетова JI.B.). Концентрацию ЛИФ в цервикальной слизи определяли наборами тест-систем фирмы «Bender Medsystems» (cotol. № 242, США); концентрацию ГС-ЭФР - наборами фирмы «Ray Biotech» (cotol. № ELH HB-EGF-001, США).

Биопсию эндометрия проводили под ультразвуковым контролем из области дна матки с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier ("Laboratoire C.C.D.", Франция). Исследование препаратов проводили в световом микроскопе при увеличении от х50 до х400. Гистологические заключения формулировали в 1-ом патологоанатомическом отделении ФГБУ "НЦ АГиП им. академика В.И.Кулакова" Минздравсоцразвития России (руководитель - д.м.н., профессор Е.А.Коган) в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах (Кондриков Н.И., 2008; Mazur М.Т., 2005). Также проводили оценку процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в световом микроскопе при увеличении х400 в 5 полях зрения.

При иммуногистохимическом анализе (ИГХ) для визуализации реакций применяли универсальный пероксидазный набор LSAB+kit («DAKO», США). Определение стероидных рецепторов проводили с использованием мышиных моноклональных антител к эстрогеновым рецепторам а (клон 1D5 «DAKO», США; разведение 1:35) и прогестероновым рецепторам (клон 636 «DAKO», США; разведение 1:50). Для оценки экспрессии ЛИФ использовали первичные антитела к LIF

и

(R@D Systems, USA, clone: 9824, mouse anti-human antibody 1:100), экспрессии ГС-ЭФР - первичные антитела к ГС-ЭФР (R@D Systems, USA, anti-goat antibody 1:100).

Результаты для ЭР и ПР оценивали с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета HISTO Score по формуле: HS=la+2b+3c, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток; 1,2,3 -интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 % - отсутствие экспрессии, 11-100 % - слабая экспрессия, 101-200 % - умеренная экспрессия, 201-300 % -выраженная.

Результаты ИГХ для ЛИФ и ГС-ЭФР оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) - 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов.

На третьем этапе работы проводили оценку эффективности разных протоколов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов. С этой целью, ранее обследованные пациентки группы исследования были произвольным образом разделены на 3 группы:

• Группа 1-19 пациенток, которым перенос эмбрионов осуществлен в естественном овуляторном цикле;

• Группа II - 26 пациенток, у которых подготовку эндометрия проводили гормональными препаратами;

• Группа III - 16 пациенток, у которых перенос криоэмбрионов проводили в цикле на фоне «мягких» схем стимуляции овуляции.

В натуральном менструальном цикле перенос размороженных

эмбрионов проводили на 6-7 день после овуляции, которую отслеживали

12

при УЗ-мониторинге цикла и определении пика ЛГ в мочи.При подготовке эндометрия гормональными препаратами с 3-го дня менструального цикла вводили препараты эстрадиола валерата, доза подбиралась индивидуально (4-12 мг/сут), далее с 14-15-го для цикла присоединяли микронизированный прогестерон в дозе 400-600 мг/сут. Перенос эмбрионов осуществляли на 5-6 день введения препаратов прогестерона. При переносе размороженных эмбрионов в цикле со стимуляцией функции яичников индукцию овуляции проводили с 5-го дня менструального цикла прямыми индукторами в дозе 50-150 ME в сутки (чМГ или р-ФСГ). При достижении фолликулов преовуляторных размеров (17-20 мм) назначали триггер овуляции (чХГ в дозе 5-8 тыс. Ед.), а после констатации овуляции - поддержку лютеиновой фазы препаратами прогестерона. Перенос размороженных эмбрионов в полость матки осуществляли на 5-6-й день введения препаратов прогестерона.

В циклах криопереносов проводили анализ клинических и эмбриологических этапов.

Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц "Microsoft Excel" и пакета программ "Statistica for Windows" версии 7.0, StatSoft Inc. (США).

Все полученные количественные (анамнестические, клинические, лабораторные, инструментальные) данные обработаны методом вариационной статистики. Для количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратическое отклонение (5), ошибка среднего (m), медиана (Me), 95% доверительный интервал, для качественных данных - частота (%). Для сравнения числовых данных (после проверки на нормальное распределение) использовали метод дисперсионного анализа и t-критерий Стьюдента для 2-х независимых выборок. Для сравнения непараметрических данных применяли методы Круаскала-Уоллиса (для нескольких групп), попарное сравнение

осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни для несвязанных совокупностей.

Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод х2 с поправкой Йетса на непрерывность, для вычисления которого прибегали к построению сетки "2x2" и "3x2", а также точный критерий Фишера для небольших выборок. Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95%-уровень значимости).

Связь между изучаемыми показателями оценивалась по результатам корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Пирсона (г) и последующим установлением его значимости по критерию I. Показатель корреляции менее 0,25 считали незначимым; 0,25-0,70 -корреляционная связь считалась умеренной; от 0,7 и выше - сильной (Реброва О.Ю., 2002).

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе работы было обследовано 228 пациенток с бесплодием, имеющих неудачные программы ЭКО в анамнезе, которые обратились для переноса криоконсервированных эмбрионов. Средний возраст пациенток составил 32,5 ± 3,5 года, длительность бесплодия в среднем - 4,4±2,0 года. Первичное бесплодие отмечалось у 104 (46 %), вторичное - у 124 (54 %) пациентов. На перенесенные гинекологические операции в анамнезе указывали большинство пациенток, из них 184 (81%) перенесли от 1 до 3 лапароскопических вмешательств. Внутриматочные хирургические манипуляции (гистероскопии и ДВ) произведены 206 пациенткам (90 %), причем 144 (63 %) из них 2 и более раз.

Всем пациенткам основной группы ранее было проведено более 2-х попыток ЭКО (2,3±0,5): с использованием протоколов с аГнРГ в 63,6% и с антГнРГ в 36,4% случаев. При этом параметры фолликуло-, оо- и раннего эмбриогенеза, а также толщина и структура эндометрия в индуцированном цикле соответствовали нормальным значениям (таблице 1).

Таблица 1

Параметры фолликуло-, оо- и эмбриогенеза циклов ЭКО пациенток группы

обследования

Параметры На 1 цикл

Количество растущих фолликулов 15,6±9,2

Количество аспирированных фолликулов 15,0±8,2

Количество полученных ооцитов /из них зрелых 14,7±8,0/74%

Метод оплодотворения ЭКО/ИКСИ 62%/38%

2-е сутки после ТВП - количество эмбрионов 2РИ 12,2±5,1

3-е сутки после ТВП - эмбрионы с 6-8 бластомерами /из них класса А и В фрагментации цитоплазмы 9,9±3,7 29% и 43%

5-ые сутки культивирования - количество бластоцист 8,2±3,1

Количество перенесенных эмбрионов 2,1 ±0,7

Количество криоконсервированных эмбрионов 4,4±2,8

Толщина эндометрия в день переноса эмбрионов, мм 10,0±1,4

Для выявления факторов, предрасполагающих к нарушению рецептивности эндометрия, проводили оценку различных клинико-анамнестических данных. На этом этапе работы была сформирована группа сравнения, состоящая из 30 пациенток с бесплодием в анамнезе, у которых беременность наступила в 1-й или 2-й программе ЭКО.

Пациентки группы сравнения были сходны по возрасту (средний возраст 31,8±3,7 лет) и имели нормальный овариальный резерв. В циклах ЭКО у них также регистрировались адекватные параметры фолликуло-, оо-и эмбриогенеза. Толщина и структура эндометрия при УЗ-мониторинге в программах ЭКО у них также не отличались от нормативных показателей. Тем не менее, удалось выявить различия в клинико-анамнестических характеристиках пациенток (таблица 2).

Установлено, что среди группы женщин, у которых беременность наступила, в анамнезе достоверно реже производились повторные внутриматочные манипуляции (искусственные аборты, гистероскопии и ДВ) и реже использовали с целью контрацепции ВМС, а также достоверно реже встречались патологии эндометрия и инфекции, передающиеся половым путем.

Таблица 2

Сравнительный анализ клинико-анамнестических данных пациенток _основной группы и группы сравнения _

Параметры репродуктивного здоровья Основная группа (п=228) Группа сравнения (п=30)

Хронический сальпингоофорит 47% 49%

Патология эндометрия (гиперплазия, синехии, полипы) 41% * 13%

Заболевания шейки матки 30% 27%

ИППП 44% * 25%

Миома матки 8% 10%

НГЭ НИ ст. 9% 9%

Спаечный процесс в малом тазу 19% 17%

Хронический эндометрит 25% 20%

Лапароскопические операции 81% 63%

Гистероскопия и ДВ 27%* 53%

2 и более гистероскопии и ДВ 63%* 20%

Своевременные роды 14% 13%

Самопроизвольные аборты 15% 15%

Искусственный аборт 19% 20%

2 и больше искусственных аборта 37%* 18%

Внематочные беременности 43% 45%

Использование ВМС с целью контрацепции 20% * 7%

* - р<0,05 — имеются достоверные различил с группой сравнения

Таким образом, при анализе клинических и эмбриологических параметров ранее проведенных программ ЭКО не было найдено отклонений, но в анамнезе пациенток основной группы выявлены факторы, предрасполагающие к нарушению рецептивности эндометрия. Все это явилось предпосылкой для углубленного изучения имплантационных свойств эндометрия у данной группы больных.

На втором этапе работы 79 ранее обследованным пациенткам (группа исследования), а также 8 фертильным женщинам репродуктивного возраста (31,3±3,8), составившим группу контроля произвели морфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия.

При морфологическом исследовании биоптатов фертильных женщин (п=8) наблюдали эндометрий ранней и средней стадии фазы секреции, зрелые пиноподии имели в среднем 50±7,7% клеток поверхностного эпителия (от 40 до 60 %). Признаки хронического эндометрита в этой группе женщин отсутствовали.

Морфологическое датирование эндометрия в группе исследования выявило, что у 78 женщин был обнаружен эндометрий ранней и средней стадии фазы секреции (рисунок 2) и лишь у одной женщины наблюдали эндометрий поздней стадии фазы пролиферации. Пиноподии покрывали в среднем 27,3±15,1% клеток поверхностного эпителия (от единичных до 50 % клеток). Снижение количества зрелых пиноподий было отмечено и исследователем Мкаэ в. (2002) у пациенток с нарушением имплантации в анамнезе и у женщин с бесплодием неясного генеза. При морфологическом исследовании у 18 женщин были выявлены остаточные явления хронического эндометрита - эти пациентки были исключены из группы исследования, которую теперь составили 61 пациентка.

Рисунок 2. Морфологическое исследование эндометрия пациентки Н. группы исследования: оценка количества клеток покровного эпителия со зрелыми пиноподиями. Окраска гематоксилином и эозином: А - х200, Б - х400.

При оценке экспрессии стероидных рег^епторов у женщин составивших группу исследования наблюдали умеренную и выраженную экспрессию ПР и умеренную и низкую экспрессию ЭРа в эпителиальных, железистых структурах и строме эндометрия (рисунок 3).

Рисунок 3. Иммунопероксидазная реакция с рецепторами к стероидньм гормонам. Эндометрий стадии секреции пациентки М. группы исследования: А - ЭРа (х200), Б - ПР (х200).

В группе фертильных женщин выявлена умеренная экспрессия ПР и ЭРа во всех оцениваемых клеточных структурах эндометрия (таблица 3).

Таблица 3

Экспрессия стероидных рецепторов в ткани эндометрия, оцениваемая по

системе Н-Бсоге

Локализация рецепторов Группа исследования (п=61) Группа контроля (п=8)

ПР-эпителий (%) 151,9±89,5% 147,1±82,9%

ПР-железы (%) 147,2±81,3 % 141,2±79,1 %

ПР-строма (%) 144,3±73,5 % 144,3±75,6 %

ЭРа-эпителий (%) 90,5±54,3 % 71,4±32,9 %

ЭРа-железы (%) 86,8±73,6 % 66,3±42,7 %

ЭРа-строма (%) 49,6±49,3 % 59,0±43,0 %

Соотношение ПР/ЭРа 8,1±3,4* 3,0±0,8

* - р<0,05 - достоверное отличие с группой контроля.

Что касается соотношения рецепторов стероидных гормонов в эндометрии, то этот показатель рассчитывали по соотношению ПР/ЭР в строме. У пациенток группы исследования соотношение ПР/ЭР колебалось от 1 до 180 и в среднем составило 8,1±7,7 (что отражает снижение количества эстрогеновых рецепторов). В группе контроля показатель оказался в диапазоне от 2 до 5 и в среднем составил 3,0±0,8. За норму мы приняли значения, полученные при обследовании фертильных женщин (ПР/ЭР = 2-5), что также соответствует данным, которые получили другие авторы (Дюжева Е.А. 2010, Talbi S. 2006). Было установлено, что в группе исследования достоверно меньшее количество женщин (25% пациенток против 100% среди фертильных женщин, р<0,05) имели этот показатель в пределах нормы.

При оценке экспрессии лейкемия-ингибирующего фактора в эндометрии фертильных женщин отмечена высокая степень экспрессии маркера (5-6 баллов). Тогда как, в образцах, полученных у пациенток с безуспешными программами ЭКО в анамнезе, экспрессия этого цитокина варьировала от полного отсутствия до высокой, в среднем оставаясь достоверно ниже уровня группы контроля (таблица 4), что отражает

нарушение его имплантационных свойств.

18

Таблица 4

Экспрессия ЛИФ в ткани эндометрия_

Локализация Группа исследования (п=61) Группа контроля (п=8)

Эпителий (баллы) 3,0±0,8 ♦ 5,0±0,8

Пиноподии (баллы) 2,5±1,0 * 5,1 ±0,6

Строма (баллы) 2,9±1,7 3,1±1,0

* - р<0,05 - достоверное отличие с группой контроля.

При оценке взаимосвязи количества клеток поверхностного эпителия с пиноподиями и уровня экспрессии ЛИФ была отмечена умеренная корреляция признаков (г=0,35), что согласуются с данным А§а]апоуа Ь. и соавт. (2004). Эти факты подтвердили высокую диагностическую ценность оценки экспрессии ЛИФ в определении имплантационного потенциала эндометрия.

При изучении экспрессии гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста (ГС-ЭФР) в ткани эндометрия не удалось выявить достоверной разницы в экспрессии фактора в образцах группы исследования и контроля, хотя, в работах других исследователей (Ьеээеу В.А., 2006, Амбарцумян Э.М., 2004) было отмечено снижение экспрессии фактора в эндометрии женщин с бесплодием. В группе исследования экспрессия ГС-ЭФР была незначительно ниже, чем в группе контроля (4,0±0,8 и 4,5±1,0 против 5,1±0,2, 5,3±0,6; р>0,05).

Одной из важных задач, которую мы ставили перед собой, был поиск неинвазивных методов оценки имплантационных свойств эндометрия, применимых не только в циклах обследования, но и в циклах переноса эмбрионов. Для решения этой задачи определяли концентрацию ЛИФ и ГС-ЭФР в цервикальной слизи (ЦС) и экспрессию этих маркеров в ткани эндометрия в период имплантационного окна.

При иммуноферментном анализе цервикальной слизи у фертильных женщин концентрация ЛИФ составила 12-25 пг/мл (20±3,6 пг/мл в среднем), у пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе этот показатель значительно варьировал (от 0 до 38 пг/мл) и в среднем составил 19±8,6 пг/мл (таблица 5).

Таблица 5

ЛИФ в цервикальной слизи и ткани эндометрия_

Группа исследования(п=61) Группа контроля (п=8)

ЛИФ в цервикальной слизи (пг/мл) 0-38 (19 ±8,6) 12-25 (20 ±3,6)

Экспрессия ЛИФ в ткани эндометрия (баллы) 0-6 (3,0±0,8)* 5-6 (5,3±0,8)

* - р<0,05 - достоверное отличие с группой контроля.

Отмечена строгая взаимосвязь между уровнем экспрессии ЛИФ в ткани эндометрии и его концентрацией в цервикальной слизи (г=0.68), что не противоречит публикациям Амбарцумян Э.М. (2003; 2004).

При изучении в ЦС содержания ГС-ЭФР было установлено, что этот показатель варьировал в значительной степени в обеих группах. В среднем он составил 13,3±9,6 среди женщин группы исследования и 12,2±9,4 у фертильных женщин (р>0,05). При оценке взаимосвязи между экспрессией ГС-ЭФР в ткани эндометрия и его концентрацией в цервикальной слизи была отмечена крайне слабая корреляционная связь признаков (г=0,16).

Мы провели анализ прогностической ценности оценки имплантационного потенциала и исходов криопереносов для всех исследуемых параметров. Значимые показатели относительности шансов были выявлены лишь для некоторых из них (таблица 6).

Таблица 6

Диагностической ценности параметров оценки рецептивности _эндометрия_____

Параметры Беременность наступила (п=13) Беременность не наступила (п=48) Р Отношение шансов ОЯ (95% ДИ)

Пиноподии занимают >40% клеток поверх, эпителия 10(77%) 13(27%) 0,0009 8.97 (2,1-37,8)

Высокая экспрессия ЛИФ в эндометрии (5-6 баллов) 8(61%) 7(14.6%) 0,0019 9.37 (2,4-37,1)

ПР/ЭР<10 12(92%) 28 (58%) 0,0016 8,57 (1,03-71,3)

Концентрация ЛИФ в ЦС 12-25 пг/мл 10 (77%) 17(35%) 0.0033 6.08 (1,5-25,1)

При морфологическом исследовании и ИГХ достоверно оценить перспективы имплантации позволяют: процент клеток поверхностного эпителия со зрелыми пиноподиями и уровень экспрессии ЛИФ, а также

баланс стероидных рецепторов в эндометрии; при исследовании цервикальной слизи - концентрация цитокина ЛИФ. Неинформативным оказалось исследовании ГС-ЭФР как в ткани эндометрия, так и в ЦС.

Таким образом, низкая экспрессия ЛИФ в поверхностном эпителии и железах эндометрия и изменение его концентрации в цервикальной слизи (за норму мы принимали значения, полученные при обследовании фертильных женщин), а также снижение количества пиноподий в среднесекреторную фазу, являются негативными прогностическими признаками и отражают нарущение имплантационных свойств эндометрия. Неблагополучным признаком является также выраженный дисбаланс в экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии (ПР/ЭР>10).

На третьем этапе исследования ранее обследованным пациенткам группы исследования произвели переносы эмбрионов в криоцикле ВРТ. Пациентки были произвольным образом разделены на 3 группы в зависимости от применяемого протокола подготовки эндометрия. В группе I перенос производили в естественном цикле (п=19); в группе II -подготовку эндометрия препаратами эстрадиола и прогестерона (п=26); а группе III (п=16) - перенос эмбрионов осуществляли на фоне «мягких» схем стимуляции овуляции. Все размороженные и перенесенные эмбрионы были криоконсервированы на стадии бластоцисты, причем в 28 случаях (46%) методом медленного замораживания и в 33 случаях (54%) эмбрионы были витрифицированы.

Проведен сравнительный анализ клинико-анамнестических данных ранее проведенных циклов между пациентками различных групп -достоверных отличий в репродуктивном анамнезе, овариальном резерве и клинико-эмбриологических параметрах найдено не было.

Изучение особенностей протоколов мы проводили по клиническим и эмбриологическим параметрам. Следует отметить, что не было ни одной отмены запланированного переноса в связи с неудовлетворительным

качеством полученных после размораживания эмбрионов или по состоянию эндометрия на день переноса.

При подготовке эндометрия препаратами эстрадиола средняя доза эстрадиола валерата, применяемого в группе II из расчета на цикл составила 102,7±10,8 мг (с 3-го по 28-й день). Доза использованного прямого индуктора из расчета на цикл стимуляции составила в среднем 540±10 МЕ (группа III).

При анализе клинико-эмбриологических аспектов криоциклов установлено, что толщина эндометрия в день переноса была достоверно меньше в естественных циклах и в среднем составила 9,2±1,2 (против 11,2±1,4 и 10,4±1,5 в группах II и III соответственно) (таблица 7). Наиболее эффективными оказались протоколы с гормональной подготовкой эндометрия и перенос эмбрионов в естественном менструальном цикле -26% и 23% соответственно против 13% в протоколах со стимуляцией овуляции.

Таблица 7

Сравнительная характеристика циклов переносов, при различных протоколах подготовки эндометрия

Параметры Группа I (п=19) Группа II (п=26) Группа III (п=16)

Доминантный фолликул, шт. 1 » - 2,4±1,4

Овуляция (УЗИ, пик ЛГ в моче), день м/ц 15,7±1,6* - 14,0±0,7

Толщина эндометрия на 13-15 день м/ц 8,0±1,0 *•*" 9,3 ±0,8 9,0±1,1

Толщина эндометрия в день ПЭ, мм 6-11*-»»* (9,2±1,2) 8-14 (11,2±1,4) 7-13 (10,4±1,5)

ПЭ, день м/ц 21,8±2,0 * *** 19,6±0,9** 20,0±0,6

Разморожено эмбрионов, шт./выживаемость 2,7±0,4/75% 2,9±0,3/71% 3,0±0,7/71%

Число перенесенных эмбрионов, шт. 2,2±0,2 2,4±0,5 2,2±0,3

Клиническая беременность 5 (26%)* 6 (23%) 2(13%)

* - р<0,05 - имеются достоверное отличие между группами I и III, ** - р<0,05 - имеются достоверные отличия между группами II и III, *** - р<0,05 - имеются достоверные отличия между группами I и И.

При сравнении эффективности методов криоконсервации (медленное замораживание и витрификация) достоверной разницы в выживаемости эмбрионов (71,5% и 72,1% соответственно) или в исходах циклов (частота клинической беременности 21% в обоих случаях) выявлено не было.

Было проведено сравнение протоколов внутри групп исследования, между пациентками с положительным и отрицательным исходом криопереноса. Анализ данных показал, что при переносе эмбрионов в естественном цикле беременность наступила у пациенток более молодого возраста с 28-дневным менструальным циклом и с овуляцией на 13-15-й день цикла. В группе II и III у пациенток с положительным исходом в день переноса эмбрионов толщина эндометрия была достоверно больше.

Таким образом, скрупулезный анализ клинико-анамнестических данных, выявление в анамнезе факторов, предрасполагающих к нарушению рецептивности эндометрия, определяет необходимость проведения углубленного исследования имплантационных свойств эндометрия и при необходимости назначение подготовительной терапии (рисунок 4).

Ihl lil'ltic а тшмпас >2 {неуспешных попыток ЖО и (чшмчас

У

Углубленное обследование структурно-функционального состояния эндометрия

» Отсутствие органической патологии эндометрия

» В среднесекреторной фазе зрелые пиноподии покрывают >40% клеток поверхностного эпителия

• Соотношение ПР/ЭР <10

» Высокая и/или умеренная экспрессия ЛИФ в эпителии и железах

• ЛИФ в ЦС от 12 до 25 пг/мл

Выявление органической патологии эндометрия

подготовительная терапия и контрольное исследование состояния эндометрия

crvoET

Рисунок 4. Алгоритм подготовки пациенток к криопереносу.

ВЫВОДЫ

Ведущими факторами, негативно влияющими на рецептивность эндометрия при неудачных попытках ЭКО, являются повторные внутриматочные вмешательства, выявленные у 67%, патология

23

эндометрия - у 41% и инфекции, передающиеся половым путем - у 44% пациенток.

2. Имплантационные свойства эндометрия, при его нормальной морфологической структуре у пациенток с безуспешными попытками ЭКО в анамнезе характеризуются дисбалансом в экспрессии стероидных рецепторов (за счет уменьшения экспрессии рецепторов к эстрогенам) у 75% из них и нарушением формирования и созревания пиноподий у 70%.

3. Экспрессия ЛИФ в эндометрии отражает его имплантационный потенциал. Концентрация ЛИФ в цервикальной слизи коррелирует с его экспрессией в ткани эндометрия (г=0,68) и может служить неинвазивным методом оценки имплантационных свойств эндометрия. Содержание ГС-ЭФР в ткани эндометрия и в цервикальной слизи у пациенток с неудачами ЭКО в анамнезе не имеет значимых различий по сравнению с группой фертильных женщин.

4. Прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются: концентрация ЛИФ в цервикальной слизи в пределах 12-25 пг/мл, высокий уровень экспрессии ЛИФ в эпителии и железах эндометрия, а также наличие в период «имплантационного окна» более 40% клеток поверхностного эпителия с пиноподиями и соотношение ПР/ЭР < 10.

5. Медленное замораживание эмбрионов и их витрификация на 5-й день культивирования являются равнозначными по эффективности: выживаемость эмбрионов после размораживания составила 71,5% и 72,1% соответственно, частота наступления беременности при обоих видах криоконсервации- 21%.

6. Протоколы с гормональной подготовкой эндометрия и перенос размороженных эмбрионов в естественном цикле одинаково эффективны по частоте наступления беременности - 23% и 26% соответственно. Выбор протокола зависит от исходных клинико-лабораторных характеристик пациенток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациенткам с неудачными программами ЭКО в анамнезе, имеющим криоконсервированные эмбрионы, перед их переносом необходимо провести исследования, направленные на оценку рецептивных свойств эндометрия в период «имплантационного окна»: морфологические датирование эндометрия, выявление признаков хронического эндометрита, определение уровня экспрессии ЛИФ в эндометрии, а также изучение формирования и созревания пиноподий и оценка баланса стероидных рецепторов.

2. Нарушение экспрессии ЛИФ в эндометрии, снижение формирования пиноподий, дисбаланс в экспрессии стероидных рецепторов свидетельствуют о снижении имплантационных свойств эндометрия и требуют подготовительной терапии.

3. В циклах криопереносов целесообразно исследовать цервикальную слизь в период имплантационного окна: концентрация ЛИФ менее 12 пг/мл и более 25пг/мл свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия, что, в свою очередь, может быть аргументом для отмены переноса.

4. Такие данные как преобладание экспрессии ЛИФ в строме эндометрия и повышение его концентрации в цервикальной слизи выще 45 пг/мл отражают наличие хронического эндометрита и могут быть рекомендованы как дополнительные критерии его диагностики.

5. Медленное замораживание бластоцист и их витрификацию можно рассматривать как методы криоконсервации, обладающие одинаковой эффективностью, и использовать тот или иной способ в зависимости от оснащенности и предпочтений эмбриологической лаборатории.

6. Женщинам, имеющим регулярный 28-дневный менструальный цикл с овуляцией на 13-15-й день цикла, толщиной эндометрия в день переноса эмбрионов не менее 9 мм, предпочтительней переносить размороженные эмбрионы в естественном менструальном цикле.

7. При отсутствии условий, перечисленных в предыдущем пункте, целесообразно переносить размороженные эмбрионы на фоне заместительной гормональной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оценка морфологии преимплантационных эмбрионов на различных стадиях развития in vitro (обзор литературы) /М.М. Левиашвили, Н.Г. Мишиева, Н.Ю. Костромина, Т.А. Назаренко //Проблемы репродукции. 2011. №3. С. 74-79.

2. Оценка рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными программами ЭКО в анамнезе /М.М. Левиашвили. Т.А. Демура, Н.Г. Мишиева, Н.М. Файзуллина, Т.А. Назаренко, Е.А. Коган //Акушерство и гинекология. 2012. №4. С. 65-69

3. Лейкемия-ингибирующий фактор и рецептивность эндометрия /М.М. Левиашвили, Н.Г. Мишиева, Т.А. Назаренко, Е.А Коган //Проблемы репродукции. 2012. №3. С. 17-21.

4. Подготовка эндометрия к переносу эмбрионов в криоциклах ВРТ /М.М. Левиашвили, Н.Г. Мишиева,Т.А. Назаренко //Врач. 2012.№5.С. 73-75.

5. Методы улучшения имплантационных свойств эндометрия в программах ВРТ /М.М. Левиашвили, Н.Г. Мишиева, Е.А. Коган, Т.А. Демура //Материалы XXI Ежегодной международной конференции Российской ассоциации репродукции человека. Санкт-Петербург, 2011. С.63-64.

6. Диагностическая ценность определения ЛИФ в цервикальной слизи /М.М. Левиашвили, Н.Г. Мишиева, Т.А. Назаренко, Е.А. Коган, А.Н. Абубакиров, Л .А. Подрез //Материалы VI Международного Конгресса по репродуктивной медицине. Москва, 2012. С. 38-39.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

аГнРГ - агонист гонадотропин рилизинг-гормона

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ДВ — диагностическое выскабливание

ИГХ — иммуногистохимическое исследование

ИППП - инфекции, передающиеся половым путем

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛИФ - лейкемия-ингибирующий фактор

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ПР - рецептор к прогестерону

ПЭ - перенос эмбрионов

ТВП - трансвагинальная пункция

УЗИ - ультразвуковое исследование

р-ФСГ — фолликулостимулирующий гормон

ХГ - хорионический гонадотропин

ЦС — цервикальная слизь

чМГ - человеческий менопаузальный гонадотропин ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение ЭР - рецептор к эстрадиолу

Подписано в печать: 19.06.2012 Объем: 1,0усл.п.л. Тираж: 120 экз. Заказ № 502 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул.Рождественка, 5/7,стр.1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru

Значительные достижения в криобиологии, разработка эффективных методов криоконсервации и хранения клеток и тканей человека позволили расширить возможности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Наиболее востребованным в клинической практике является криоконсервация эмбрионов. Метод позволяет повысить кумулятивную частоту наступления беременности в расчете на один цикл стимуляции суперовуляции, при этом не требуется дорогостоящих и не всегда безопасных для здоровья женщины схем стимуляции суперовуляции [16,36,43,47,130,143].

В настоящее время успешное использование криоконсервации в рамках программ ВРТ позволяет достигать 60-70%-ой выживаемости эмбрионов после размораживания. Но, несмотря на значительный прогресс в лабораторных этапах программ, результативность криопереносов остается низкой и по данным различных авторов составляет 10-30% [16,17,22,193].

Стремление повысить результативность криоциклов ВРТ явилось поводом расширения научного поиска в этом направлении. Известно, что эффективность метода определяется как структурно-функциональной полноценностью эндометрия, так и качеством размороженных эмбрионов [8,10,23,33,121,159,170]. В связи с этим, поиск метода оценки имплантационных свойств эндометрия и идентификации «имплантационного окна» представляет значительный научный интерес.

Согласно современным представлениям, в процессе имплантации важная роль принадлежит реципрокным взаимодействиям эндометрия с одной стороны и бластоцисты с другой стороны. Этот процесс опосредуется различными паракринными регуляторами: цитокинами, простагландинами, факторами роста, семейством молекул адгезии, компонентами межклеточного вещества и др.[39,45,66,94]. Изучение характера экспрессии молекул, вовлеченных в процесс имплантации, представляется перспективным в оценке рецептивности эндометрия.

Наиболее активно в литературе обсуждается вклад в процесс имплантации лейкемия-ингибирующего фактора (ЛИФ). Этот цитокин продуцируется эндометрием на протяжении всего менструального цикла, однако значительный подъем его экспрессии отмечается во второй половине фазы секреции - на 19-25-й день цикла, что сопряжено с периодом расцвета пиноподий (особых протрузий мембраны на апикальных полюсах клеток поверхностного эпителия) -ультраструктурных маркеров рецептивности эндометрия [5,40,119,133].

Многие авторы отмечают важную роль гепаринсвязывающего эпидермального фактора роста (ГС-ЭФР) в процессе имплантации. Максимальная экспрессия ГС-ЭФР также совпадает с расцветом пиноподий в период имплантационного окна, когда данный фактор определяется как внутри клеток поверхностного эпителия, так и на поверхности пиноподий [1,51,55,78,95,107,118,171].

Экспрессию маркеров в эндометрии можно оценить при иммуногистохимическом исследовании соскобов секреторного эндометрия. Метод является инвазивным и при высокой информативности имеет свои ограничения - применим только в циклах обследования. В связи с этим, актуальным является поиск неинвазивных методов, позволяющих оценить рецептивность эндометрия непосредственно в циклах переноса эмбрионов.

Проведены исследования, обнаруживающие взаимосвязь экспрессии молекул в ткани эндометрия с его содержанием в смывах из полости матки и цервикальной слизи [57,64,135,180]. Однако эти работы не имеют пока клинической интерпретации и не применяются на практике.

Немаловажным является также полноценная подготовка эндометрия к криопереносу. Анализ современной научной литературы показал, что наиболее часто в клинической практике применяются несколько протоколов подготовки эндометрия, к которым относятся перенос размороженных эмбрионов в естественном овуляторном менструальном цикле, гормональная подготовка эндометрия препаратами эстрадиола и прогестерона, а также перенос размороженных эмбрионов на фоне индукции овуляции «мягкими» схемами стимуляции [12,54, 90,109,189].

Значительный вклад в формирование успеха криоциклов ВРТ вносит качество размороженных эмбрионов. Скрупулезный отбор жизнеспособных эмбрионов с хорошим прогнозом выживаемости после размораживания имеет первостепенное значение для достижения успеха. Следует отметить, что дискутабельным остается вопрос выбора наиболее эффективного метода криоконсервации эмбрионов (медленное замораживание или витрификация), а также наиболее подходящей для криоконсервации стадии развития преимплантационного эмбриона [61,69,100,108].

Результаты различных исследований достаточно противоречивы, поэтому представляется актуальным поиск диагностически ценных методов оценки рецептивности эндометрия, применимых на практике (как в циклах обследования, так непосредственно в циклах переносов эмбрионов), определение эффективности различных методов подготовки эндометрия, а также оптимизация эмбриологических этапов криоциклов.

Цель исследования: оптимизация программ вспомогательных репродуктивных технологий с использованием криоконсервированных эмбрионов путем усовершенствования схем подготовки и ведения циклов переноса размороженных эмбрионов.

Задачи исследования

1. Оценить клинико-анамнестические данные пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе для выявления факторов, предрасполагающих к нарушению рецептивности эндометрия.

2. Изучить анатомо-функциональное состояние эндометрия и его имплантационные свойства у пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе.

3. Определить наиболее диагностически значимые параметры оценки имплантационного потенциала эндометрия и установить их влияние на исходы программ ВРТ с использованием размороженных эмбрионов.

4. Изучить влияния метода криоконсервации (витрификация, медленное замораживание) на выживаемость и качество размороженных эмбрионов, а также результативность их переносов.

5. Провести сравнительный анализ и оценить эффективность различных протоколов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов.

6. Разработать алгоритм подготовки пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе к переносу криоконсервированных эмбрионов.

Положения, выносимые на защиту

1. При нормальных параметрах овариального резерва, а также адекватном фолликуло-, оо- и раннем эмбриогенезе, неудачи в программах ЭКО могут быть связаны с нарушением имплантационных свойств эндометрия, на что указывает наличие негативных факторов (патология эндометрия, ШИШ, повторные внутриматочные вмешательства), достоверно чаще встречающихся в анамнезе женщин с неудачными попытками ЭКО.

2. Прогностически неблагоприятными признаками для наступления беременности являются: концентрация ЛИФ в цервикальной слизи до 12 и от 25 пг/мл, снижение экспрессии ЛИФ в поверхностном эпителии и железах эндометрия, а также снижение количества клеток с наличием пиноподий менее 40% поверхностного эпителия и соотношение ПР/ЭР>10. Выявление указанных параметров обуславливает необходимость проведения подготовительной терапии.

3. Протоколы с гормональной подготовкой эндометрия и перенос размороженных эмбрионов в естественном цикле одинаково эффективны (частота наступления беременности - 23% и 26% соответственно). Выбор протокола зависит от исходных клинико-лабораторных характеристик пациенток. Способ криоконсервации эмбрионов 5-го дня культивирования не влияет на их выживаемость и частоту наступления беременности.

Научная новизна

Определены клинико-анамнестические факторы, предрасполагающие к нарушению рецептивности эндометрия. Выявлены особенности рецептивности эндометрия у пациенток с безуспешными попытками ЭКО в анамнезе: при сохраненной морфологической структуре, эндометрий характеризуется дисбалансом в экспрессии стероидных рецепторов и снижением формирования и созревания пиноподий.

Установлен наиболее значимый диагностический маркер имплантиции - ЛИФ. Прослежена корреляционная зависимость между его экспрессией в эндометрии и концентрацией в цервикальной слизи.

Выявлены особенности экспрессии этого цитокина в эндометрии, присущие пациенткам с неудачами ЭКО в анамнезе.

Определены прогностически благоприятные критерии для наступления беременности: концентрация ЛИФ в цервикальной слизи в пределах 12-25 пг/мл, высокий уровень экспрессии ЛИФ в эпителии и железах эндометрия, а также более 40% клеток поверхностного эпителия с пиноподиями и соотношение ПР/ЭР <10.

Изучены особенности течения циклов переноса размороженных эмбрионов в зависимости от способа подготовки эндометрия. Определены критерии выбора протокола подготовки эндометрия в криоциклах. Проведен анализ эффективности медленного замораживания эмбрионов и их витрификации на 5-ый день культивирования по выживаемости эмбрионов и частоте наступления беременности - выявлена равнозначность методов.

Практическая значимость

На основании полученных результатов разработан алгоритм обследования пациенток с неудачными программами ЭКО в анамнезе. Разработаны рекомендации для комплексной оценки имплантационных свойств эндометрия путем морфологического и иммуногистохимического исследования ткани эндометрия в период имплантационного окна, а также исследования цервикальной слизи. Выявлены наиболее диагностически ценные параметры оценки рецептивности эндометрия.

Определены клинические и лабораторные параметры, определяющие выбор протокола подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов к криоциклах ВРТ.

Установлено, что медленное замораживание бластоцист и их витрификация обладают одинаковой эффективностью и могут быть равнозначно использованы в зависимости от оснащенности и предпочтений эмбриологической лаборатории.

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации и результаты работы доложены на XXI ежегодной международной конференции Российской ассоциации репродукции человека (Санкт-Петербург, 2011) и VI международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012).

Работа обсуждена на конференции сотрудников 1-го гинекологического отделения ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 09.04.2012 и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 16.04.2012.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах компьютерного текста, состоит из введения и 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение), а также выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 20 таблиц и 28 рисунков. Использованная литература включает 38 источников на русском и 155 источников на английском языках.

выводы

1. Ведущими факторами, негативно влияющими на рецептивность эндометрия при неудачных попытках ЭКО, является повторные внутриматочные вмешательства (у 67% пациенток), патология эндометрия (у 41%) и инфекции передающиеся половым путем (у 44%).

2. Экспрессия ЛИФ в эндометрии наиболее значимо отражает его рецептивность. Концентрация ЛИФ в цервикальной слизи коррелирует с его экспрессией в ткани эндометрия (г=0.68) и может служить неинвазивным методом оценки имплантационных свойств эндометрия. Содержание ГС-ЭФР в ткани эндометрия и в цервикальной слизи у пациенток с неудачами ЭКО в анамнезе не имеет значимых различий по сравнению с группой фертильных женщин.

3. Имплантационные свойства эндометрия при его нормальной морфологической структуре у пациенток с безуспешными попытками ЭКО характеризуются дисбалансом в экспрессии стероидных рецепторов (за счет уменьшения экспрессии рецепторов к эстрогенам) у 75% из них и снижением формирования и созревания пиноподий у 70%.

4. Прогностически благоприятными критериями наступления беременности являются: концентрация ЛИФ в цервикальной слизи в пределах 12-25 пг/мл, высокий уровень экспрессии ЛИФ в эпителии и железах эндометрия в период «имплантационного окна», а также наличие более 40% клеток поверхностного эпителия со зрелыми пиноподиями и соотношение ПР/ЭР <10.

5. Медленное замораживание эмбрионов и их витрификация на 5-ый день культивирования являются равнозначными по эффективности: выживаемость эмбрионов после размораживания составила 71,5% и

72,1% соответственно, частота наступления беременности при обоих видах криоконсервации- 21%.

6. Протоколы с гормональной подготовкой эндометрия и перенос размороженных эмбрионов в естественном цикле одинаково эффективны по частоте наступления беременности - 23% и 26% соответственно. Выбор протокола зависит от исходных клинико-лабораторных характеристик пациенток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациенткам с неудачными программами ЭКО в анамнезе, имеющим криоконсервированные эмбрионы, перед их переносом необходимо провести исследования, направленные на оценку рецептивных свойств эндометрия. Обследование включает гистологическое и иммуногистохимическое исследования ткани эндометрия в период имплантационного окна: морфологические датирование эндометрия, выявление признаков хронического эндометрита, оценка баланса стероидных рецепторов и определение уровня экспрессии ЛИФ в эндометрии, изучение формирования и созревания пиноподий.

2. Снижение экспрессии ЛИФ в эндометрии, а также нарушение формирования и созревания пиноподий и дисбаланс в экспрессии стероидных рецепторов свидетельствуют о снижении имплантационных свойств эндометрия и требуют подготовительной терапии.

3. В циклах криопереносов целесообразно исследовать цервикальную слизь в период имплантационного окна: концентрация ЛИФ менее 12 пг/мл и более 25пг/мл свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия, что, в свою очередь, может быть аргументом для отмены переноса.

4. Такие признаки, как преобладание экспрессии ЛИФ в строме эндометрия и повышение его концентрации в цервикальной слизи выше 45 пг/мл, отражают наличие хронического эндометрита и могут быть рекомендованы как дополнительные методы его диагностики.

5. Медленное замораживание бластоцист и их витрификацию можно рассматривать как методы криоконсервации, обладающие одинаковой эффективностью, и использовать тот или иной способ в зависимости от оснащенности и предпочтений эмбриологической лаборатории.

6. Женщинам, имеющим регулярный 28-дневный менструальный цикл с овуляцией на 13-15 день цикла, толщиной эндометрия в предположительный день переноса эмбрионов не менее 9 мм, предпочтительней переносить размороженные эмбрионы в естественном менструальном цикле.

7. При отсутствии условий, перечисленных в предыдущем пункте, целесообразно переносить размороженные эмбрионы на фоне заместительной гормональной терапии.