Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Клинико-морфологическая оценка дифференциально-диагностических гистологических критериев хронического гепатита В и С

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВА Татьяна Семеновна

Р г

003058В88

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ КРИТЕРИЕВ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА ВИС

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2007

003058688

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им ИИ Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор

доктор медицинских наук,

профессор

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им академика И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 2007 г в /се часов на засе-

дании диссертационного совета Д 208 089 04 при Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломною образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 191015, Санкт-Петербург, ул Кирочная, д 41

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 195196, г Санкт-Петербург, Заневский проспект, д 1/82

Автореферат разослан «

А? <^-¿-2007 г

Смирнов Олег Алексеевич

Нейштадт Эдуард Львович Чирский Вадим Семенович

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник А.В Соболев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Хронический гепатит В и С (ХГ-В и С) - широко распространенные заболевания, прогрессия которых приводит к формированию цирроза печени и развитию гепатоцелюл-лярной карциномы (ГЦК) Трудности своевременного распознавания ХГ-В и С связывают с увеличением частоты латентных и малосим-птомных форм (Абдурахманов Д Т., 2002, Евдокимова Е Ю, 2004; Карпов СЮ и соавт, 2006), которые, как правило, диагностируются у пациентов терапевтических стационаров при обследовании по поводу патологии разных органов и систем (Сулягина JI Г. и соавт, 2004) При этом почти у 20% впервые выявленных больных поражение печени характеризуется цирротической перестройкой или трансформацией в ГЦК (Gerber МА, 1997, Poynard Т, 1997, 2001) Это подтверждает обоснованность мнения о том, что именно стертые формы заболевания служат основными "поставщиками" ЦП и ГЦК (В В Горбаков, 1998)

Гистологическое исследование биоптатов печени играет важную роль в верификации ХГ Однако диагностическое значение гистологических признаков, характеризующих активность заболевания, его стадию и, особенно, этиологию, до настоящего времени не подвергалось количественной оценке. Такая оценка требует проведения целенаправленного сопоставления комплекса клинико-лабораторных, сывороточных, гистологических и иммуногистохимических маркеров ХГ-В и С Поэтому в настоящее время этиологическая диагностика и определение активности ХГ-В и С основывается, главным образом, на сывороточных тестах (Радченко В Г. и соавт, 2005) При этом нередко приходится сталкиваться с отрицательными результатами стандартных методик (Дуданова О П , 2006) Это не исключает вирусную этиологию заболевания и заставляет использовать дополнительные, более чувствительные и сложные методы диагностики, например, ПЦР Возможность гистологической этиологической диагностики ХГ-В и С многими исследователями подвергается сомнению или отрицается (Комарова Д В , Цинзерлинг В А., 1999, Гепатит С Консенсус, 2002, Радченко В Г и соавт , 2005, Рахманова А Г и соавт , 2005, Malhotra V et al, 2000) Тем не менее, ряд специалистов описывает патоморфологические признаки поражения печени, свойственные разным вирусам (Серов ВВ., 1986, Дуданова ОП, 2003, Арямки-

на О Л , 2006, Крохина Н Б , 2006, Goodman ZD, 1995, Czaia A L , 1997, Lory J , 1997, Luo J С и соавт , 1999, Sakaida 1, 1999)

Таким образом, изучение клинико-морфологических особенностей ХГ-В и С, которые выявляются у больных терапевтических стационаров, представляется актуальной задачей Кроме того, своего решения требует вопрос о значении гистологических маркеров этиологии, активности и стадии в диагностике заболевания и планировании углубленного обследования больных, особенно при серонегативном ХГ. Нуждается в разработке общедоступная модель дифференциальной диагностики ХГ-В и С, основанная на использовании наиболее информативных гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции

Цель исследования: комплексная сравнительная клинико-морфологическая оценка значимости дифференциально-диагностических гистологических критериев хронического гепатита В и С у пациентов терапевтического стационара

Задачи исследования:

1 Изучить особенности клинического течения ХГ у пациентов терапевтического стационара,

2 Провести сравнительный анализ клинико-лабораторных и морфологических проявлений активности и стадии ХГ у пациентов с различными формами заболевания,

3 Выделить гистологические признаки HBV и HCV-инфекции и провести соответствующие сопоставления с сывороточными и имму-ногистохимическими маркерами,

4 Изучить гистологические и иммуногистохимические маркеры HBV и HCV-инфекции у больных серонегативным ХГ,

5 Разработать с помощью методов многомерной статистики способ дифференциальной диагностики между ХГ-В и ХГ-С, основанный на учете наиболее значимых гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции

Научная новизна. Проведен сравнительный анализ и установлены варианты соотношения клинико-лабораторных и гистологических проявлений тяжести и стадии ХГ Изучен спектр и частота гистологических, сывороточных, иммуногистохимических маркеров HBV и HCV-инфекции, впервые подвергнута количественной оценке значимость различных гистологических маркеров Впервые построена дифференциально-диагностическая модель (дискриминантная функция) различения ХГ-В и ХГ-С и сформулировано решающее диагно-

стическое правило, учитывающее весовые коэффициенты наиболее значимых гистологических признаков

Теоретическая и практическая значимость работы. Сравнительное клинико-морфологическое исследование выявило неоднозначную зависимость между клиническими и морфологическими проявлениями тяжести и стадии ХГ Сопоставление различных признаков НВУ и НСУ-инфекции показало, что гистологические (прямые и непрямые) маркеры изучаемых инфекций в большинстве наблюдений соответствуют результатам сывороточных и иммуногистохимических тестов Большинство наблюдений серонегативного ХГ в наших наблюдениях при морфологическом исследовании оказались неверифицированными ранее вирусными гепатитами Частота смешанной НВУ+НСУ-инфекции по данным гистологического исследования биоптатов вдвое, а по результатам иммуногистохимического исследования - втрое выше, чем по данным сывороточных тестов Разработан способ дифференциальной диагностики ХГ-В и С, учитывающий наиболее значимые этиологические гистологические маркеры НВУ и НСУ-инфекции, обладающий высокой точностью предсказания этиологии заболевания Учет комплекса гистологических проявлений заболевания позволяет повысить качество диагностики ХГ-В и С и рационально планировать дальнейшее углубленное обследование больных

Основные положения, выносимые на защиту:

1 У больных терапевтического стационара преобладает латентный и малоактивный варианты течения ХГ, которые характеризуется широким спектром проявлений гистологической активности и степени фиброза

2 Значение, высокая информативность, специфичность и предсказательная ценность гистологических маркеров НВУ и НСУ-инфекции при этиологической диагностике ХГ-В и С определяется большой частотой их совпадения с результатами сывороточных и иммуногистохимических тестов

3. Гистологические и иммуногистохимические маркеры НВУ- и НСУ-инфекции имеются в большинстве случаев серонегативного ХГ по результатам стандартных сывороточных тестов

4 Дифференциально-диагностическая модель различения ХГ-В и С, разработанная с помощью методов многомерной статистики, учитывающая весовые коэффициенты наиболее значимых гистологических признаков, обладает высокой точностью предсказания этиологии заболевания

Личное участие автора в проведении исследования. Автором выполнено гистологическое исследование всех биоптатов печени с оценкой гистологической активности и склероза по методу Я в Кпо<Зе11 и V Оеэте^ у 63 % больных иммуногистохимическое исследование ткани печени на содержание вирусных протеинов, включая изготовление замороженных гистологических срезов, оценка результатов иммуногистохимической реакции, осуществлены статистическая обработка, анализ клинико-лабораторных и данных морфологического исследования

Внедрение и апробация работы. Результаты исследования использованы в работе патологоанатомического отделения больницы им Петра Великого, включены в курс практических занятий студентов 3 курса ГОУВПО СПбГМА им И И Мечникова Росздрава

Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции СПбГМА «Проблемы охраны здоровья населения и окружающей среды» (Санкт-Петербург, 2002), на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Орел. 2005), на 1-ом съезде патологоанатомов Республики Беларусь «Современные технологии в морфологии» (Минск, 2006), на научно-практической конференции СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006) Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов 19 декабря 200б-г Апробация работы прошла на совместном заседании кафедры патологической анатомии и проблемной комиссии СПбГМА им И И Мечникова 23 марта 2007 г

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов практических рекомендаций, списка литературы, содержит 23 таблицы, 26 рисунков, в том числе иллюстрирована 52 микрофотографиями В списке литературы приведены 221 источник, из которых 110 отечественных и 111 иностранных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. Материал исследования представлен 100 наблюдениями ХГ Обязательный лабораторный минимум, соответствующий приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 17.04 1998 г № 125 «Стандарты (протоколы) диагностики и лечения больных с заболеваниями органов пищеварения», включал- клинический анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, определение в сыворотке крови антигенов вирусов (HBsAg, HBeAg) и антител к ним (HBeAb, HBcorAb, HCVAb) методом ИФА с использованием соответствующих коммерческих тест-наборов III поколения ЗАО «Вектор-Бест». Молекулярно-генетические исследования для выявления ДНК HBV и РНК HCV выполнялись в лаборатории молекулярной вирусологии ГУ НИИ гриппа РАМН Инструментальная оценка состояния печени и других органов брюшной полости включала ультразвуковое исследование (УЗИ) Функциональное состояние печени у обследованных больных и 30 здоровых лиц контрольной группы оценивали с помощью общепринятых проб первой необходимости (Хазанов А.И, 1998) активность АлАТ, АсАТ, щелочной фосфатазы, тимоловая проба и концентрация билирубина

Всем больным проводилась пункционная биопсия печени Для гистологического исследования биоптаты печени фиксировали в 10% нейтральном формалине, проводили через спирты возрастающей крепости и заливали в парафин по стандартной методике Серийные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу Ван-Гизона, орсеином по методу Т Shikala Воспроизводили реакцию на железо с ферроцианидом по методу Перльса и реакцию на медь с рубеановой кислотой

Этиологические гистологические маркеры HBV- и HCV-инфекции изучались в соответствии с рекомендациями В В Серова (1989) Степень активности ХГ определяли полуколичественным способом с использованием индекса гистологической активности (ИГА) по RG Knodell и соавт (1981) с учетом рекомендаций V Desmet и соавт (1994) Стадию ХГ определяли полуколичественным способом, основываясь на выраженности фиброза в соответствии с рекомендациями V Desmet и соавт (1994)

В 63 наблюдениях ХГ проведено ИГХ исследование В 39 этих случаях определяли экспрессию антигенов вируса гепатита В

(HBsAg, HBcAg) и неструктурного белка вируса гепатита С (NS3) на парафиновых срезах толщиной 5 мкм стрептавидин-биотиновым им-мунопероксидазным методом с использованием коммерческой ИГХ системы LSAB2 (DAKO, США) В качестве первичных антител использовались моноклональные мышиные антитела к HBsAg (Novocastra Lab , Великобритания) в разведении 1/100, поликлональ-ные кроличьи антитела к HBcAg (DAKO, Великобритания) в разведении 1/700, моноклональные мышиные антитела к NS3HCV (Novocastra Lab, Великобритания) в разведении 1/50 Для демаскировки HBsAg проводилась предварительная обработка срезов ткани протеолитическими ферментами (Proteinasa К, DAKO, США) Для демаскировки NS3HCV в ткани производилась высокотемпературная обработка срезов в цитратном буфере (рН 6,0) В каждой серии ИГХ реакций проводилось негативное контрольное исследование (один из двух серийных срезов, помещенных на предметное стекло вместо первичных антител инкубировался с фосфатным буфером рН 7,4) После проведения ИГХ реакции (согласно рекомендациям фирмы-изготовителя) срезы докрашивались гематоксилином и заключались в полистирол В остальных 24 биоптатах печени ИГХ этиоло1 ические маркеры (HBsAg, HCcorAg, NS4-HCV) определяли на замороженных срезах модифицированным нами (Насыров Р.А., 1995 ) непрямым иммунопероксидазным методом, где в качестве первых антител использовали моноклональные антитела к HBsAg, HCcorAg, NS4-HCV производства лаборатории клеточной инженерии (руководитель -проф А А Кущ) Института вирусологии им Д И Ивановского РАМН (Москва)

С учетом выраженности клинико-лабораторных и морфологических проявлений изученные наблюдения были отнесены к следующим вариантам течения ХГ вирусной этиологии по В В Горбакову (1996, 1998) латентный, малоактивный (вялотекущий) и активный

Оценка диагностической значимости гистологических маркеров HBV- и HCV-инфекции проведена в 63 наблюдениях, которые были разделены на две группы первую (группу сравнения) составили 32 наблюдения с положительными сывороточными маркерами гепато-тропных вирусов Во вторую (основную) группу включили 31 наблюдение ХГ с отрицательными результатами сывороточных тестов В группе сравнения проводилось сопоставление сывороточных, гистологических и ИГХ маркеров HBV- и HCV-инфекции, в основной -соответствующих гистологических и ИГХ признаков

Гистологическое, гистохимическое и результаты ИГХ исследования проведены при помощи светооптического микроскопа Микмед-1 Микрофотографирование гистологических препаратов проводили при помощи цифровой камеры Nikon и Leica

Статистическая обработка материала выполнялась на ПЭВМ с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v 6 0) Для дифференциальной диагностики мезвду ХГ-В и ХГ-С использовали также линейный дискриминантный анализ (Ким Дж -О , Мьюллер Ч У, Клекка У Р , 1989) Для оценки качества полученной модели и решающего диагностического правила рассчитывали чувствительность, специфичность методов, общую точность (Власов В В., 1988, 2001) Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05

Результаты исследования и обсуждение

Изучение 100 наблюдений ХГ у пациентов клиники кафедры внутренних болезней № 2 ГОУВПО Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им И И Мечникова позволило выделить ряд клинико-морфологических особенностей заболевания Подавляющее большинство больных обследовались впервые, анамнестические сведения, указывающие на предшествовавшее поражение печени, у них, как правило, отсутствовали

У обследованных больных терапевтического стационара ХГ практически исключительно представлен латентным и малоактивным вариантами по ВВ. Горбакову (1998), частота которых составила 41,0 % и 50,0 % соответственно Предположение о латентном ХВГ основывалось на наличии сывороточных маркеров HBV и/или HCV-инфекции при отсутствии отчетливых клинико-лабораторных проявлений заболевания

Группа больных с малоактивным (вялотекущим) ХГ была самая многочисленная - 50,0 % изученных наблюдений Ведущими клиническими синдромами у больных были астено-вегетативный (88,0 %) в сочетании с болевым (78,0 %) Активность АлАТ превышала норму в среднем в 1,8 раза, были изменены и другие функциональные пробы печени (средняя концентрация билирубина, активность щелочной фосфатазы, тимол-вероналовая проба) Маркеры HBV и HCV-инфекции выявлены в сыворотке крови 29 (58,0 %) из 50 больных

У 9 (9,0 %) больных была выраженная клиническая картина заболевания с высокой активностью АлАТ, превышавшей нормальные значения в 5-10 раз Показатели других функциональных проб печени также характеризовались значительными сдвигами Маркеры НВУ и НСУ-инфекции обнаружены в сыворотке крови у 8 из 9 (88,8 %) этих больных

Таким образом, скрытое или малосимптомное течение является характерной особенностью ХГ у больных терапевтического стационара, которые нередко госпитализируются и обследуются по поводу других заболеваний Именно это обстоятельство служит основной причиной поздней диагностики заболевания Подобной точки зрения придерживаются и другие исследователи (Радченко В Г и соавт., 2ООО, 2005, Никитин ИГ, Павлов ЧС, 2001, Серов В В, Апроси-на 3 Г , 2004, Рахманова А Г , 2005)

Проведенный клинико-морфологический анализ показал разницу между итоговой оценкой тяжести заболевания, полученной разными способами Установлено, что в 31,0% наблюдений клинически латентного и малоактивного ХГ степень гистологической активности процесса варьировала от умеренной до тяжелой В свою очередь, в 22,0% случаев клинически активного ХГ проявления гистологической активности были слабыми Подобные несоответствия между клинической симптоматикой и тяжестью поражения печени отмечены и другими исследователями (Рогатчиков ЮЕ и соавт, 2003, Трусова Л.А и соавт , 2003, Скляр Л Ф, 2004, Виноградова В.М и соавт, 2004)

Причины подобных несовпадений результатов клинико-лабораторной и морфологической оценки тяжести ХГ изучены недостаточно Во-первых, при их анализе необходимо учитывать общебиологические закономерности соотношений процессов повреждения и защитных реакций на разных стадиях и этапах развития болезни Кроме того, хронические болезни, в том числе и ХГ, как правило, характеризуются волнообразным течением, в основе которого лежит чередование периодов преобладания то процессов повреждения, то защиты, что проявляется обострениями и ремиссиями заболевания (Непомнящих Д Л , 1996, Абдурахманов Д Т, 2002)

Во-вторых, при морфологической оценке тяжести ХГ необходимо учитывать ограничения биопсийного метода, обусловленные малым объемом пунктата печени, а также неравномерностью поражения разных отделов органа Последнее обстоятельство было убедительно

проиллюстрировано ЮН Даркшевичем на гистотопографических срезах ткани печени (Комарова Д В , Цинзерлинг В А , 1999)

Несомненно, суждение о тяжести ХГ, основанное на учете комплекса клинико-лабораторных и морфологических проявлений заболевания, является наиболее информативным и точным Особую ценность такой подход представляет при дифференциальной диагностике носительства HBV и HCV-инфекции и латентных форм ХГ-В и С Понятно, что верификация ХВГ возможна только при наличии гистологических проявлений активности патологического процесса в печени Однако при этом нельзя не учитывать ограничения биопсийной диагностики, которые обсуждались выше. Что же касается пациентов с малоактивным течением ХГ, то изучение пункционного биоптата печени приобретает еще и важное прогностическое значение, так как нередко степень повреждения ткани печени оказывается у них более значительной, чем это можно полагать на основании функциональных проб органа

При оценке гистологической стадии ХГ установлено, что у большинства пациентов выраженность фиброза нарастала параллельно с увеличением тяжести заболевания Однако при латентном и малоактивном течении заболевания спектр фиброзных изменений варьировал в широких пределах - от отсутствия (11,0%) до умеренного (12,0) и тяжелого фиброза (7,0%), и даже цирроза печени (4,0%) Данное обстоятельство заслуживает особого внимания, так как, по мнению В В Горбакова (1998), именно пациенты со скрытым и малоактивным течением ХВГ по всей вероятности являются основными «поставщиками» циррозов и ГЦК

Несмотря на то, что сывороточные и молекулярные маркеры фиброза активно изучаются (Шапиро ИЛ и соавт, 2004, Павлов Ч С , 2005), в повседневной клинической практике они широко не используются Современные неинвазивные методы визуализации (УЗИ, MPT, КТ) не дают четких критериев оценки фиброза печени, особенно на ранних этапах его развития (Павлов Ч С , 2005). Вместе с тем, и здесь необходимо учитывать ограничения биопсийного метода диагностики, связанные с малым объемом исследуемого материала (Пинцани М, 2002) Таким образом, в настоящее время наиболее объективное представление об активности (тяжести) и стадии ХГ можно получить только в ходе комплексных клинико-лабораторных и морфологических сопоставлений

Наличие этиологических маркеров вирусного поражения при гистологическом исследовании биоптатов печени имеет большое диагностическое значение, так как полученные данные согласуются с результатами сывороточных и ИГХ тестов в 90,6 % (28 из 32) случаев

В биоптатах печени достоверно чаще обнаруживали свидетельства наличия НВУ- и смешанной НВУ+НСУ-инфекции, чем признаки моно-НСУ-инфекции Наиболее информативными оказались гистологические маркеры НВУ-инфекции, так как они всегда подтверждались сывороточными тестами. Несовпадение в 2 (6,8 %) и отсутствие в 3 (9,3 %) наблюдениях гистологических маркеров НСУ-инфекции выявило некоторые ограничения морфологического исследования биоптата в диагностике моно-НСУ-инфекции Эти ограничения могут быть связаны с репликацией вируса преимущественно в сыворотке крови, клетках и тканях других органов, а также мононуклеарах периферической крови (Ющук Н Д и соавт , 2000, Бушуева Н В и со-авт, 2005, гЖеП А е1 а1, 2005)

Гистологические признаки двух возбудителей обнаруживались в 2 раза чаще, чем сывороточные маркеры (32,7 % и 15,6 % - соответственно), причем совпадение гистологических и ИГХ маркеров отмечено в 84,6 % наблюдений Отсутствие одного из двух маркеров в сыворотке крови возможно является закономерностью в условиях взаимодействия нескольких вирусов (Радченко В Г и соавт, 2005, Сют-кин В Е и соавт 2000)

Проведенное нами дополнительное ИГХ исследование выявило, что у пациентов группы сравнения частота обнаружения смешанной инфекции в ткани печени в 3 раза выше, чем в сыворотке крови, тем самым, подтвердило значение гистологического исследования, которое оказалось более информативным в диагностике смешанной НВУ+НСУ-инфекции по сравнению с результатами серологического исследования

В основной группе исследования, с отрицательными результатами сывороточных тестов в 19 из 31 (61,2 %) наблюдений обнаружены гистологические признаки поражения печени гепатотропными вирусами Однако гистологических и иммуногистохимических маркеров моно-НСУ-инфекции не обнаружено Данный факт подтверждает мнение 3 Г Апросиной (1996) о возможности серонегативности в части случаев при микст-инфекции, из-за того, что на молекулярном уровне два вируса могут ингибировать друг друга и это сопровождается нарастанием степени поражения гепатоцитов По результатам

нашего исследования тяжесть течения заболевания коррелировала с наличием гистологических признаков смешанной инфекции HBV+HCV у пациентов старших возрастных групп

Проявления HBV-инфекции имелись в биоптатах у 48,3 % больных и HBV+HCV-инфекции - у 12,9 % пациентов Экспрессию маркеров HBV-инфекции в ткани с помощью ИГХ метода в основной группе наблюдали в 38,0 % случаях и HBV+HCV-инфекции - в 9,0 %, что подтверждает данные гистологического исследования в 78,9 % наблюдений Некоторую гипердиагностику ХГ-В и С при исследовании биоптатов печени можно объяснить неспецифичностью большинства гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции Несмотря на это, в случаях отрицательных сывороточных тестов наличие даже непрямых гистологических признаков вирусного поражения является основанием для дальнейшего поиска этиологического агента

По многочисленным данным литературы, трудности выявления маркеров гепатотропных инфекций в сыворотке крови обусловлены многими причинами, например, мутациями в геноме вируса, ведущими к изменению структуры антигенов, что препятствует их выявлению в крови стандартными тест-системами (Werner А , 1992, Carman W F , 1997, Koziel M , 1997, Ferrari С , 1999) Большое значение имеют низкий уровень и транзиторный характер виремии (Ющук H Д и соавт, 2ООО, Серов В.В , Апросина 3 Г, 2004, Ferau С , Schmidt M V , 1997, Calvin Q P , Zhang J , 2005, Chih-Lin I, Li- Ying I, Chaur-Shme W et al, 2005), особенности иммунного ответа хозяина, а также чувствительность тест-системы и качество ее исполнения (Апросина 3 Г, Игнатова Т M , 2001) Перечисленные особенности течения ХВГ объясняют значительную частоту так называемого ХГ неясной (неустановленной) этиологии в клинической практике

Гистологические признаки HBV-инфекции достоверно чаще определялись у пациентов с положительными сывороточными маркерами инфекции и характеризовались довольно высокой специфичностью - 91,9% и предсказательной ценностью положительного результата - 87,5 %

У больных с активной репликацией вируса (HBV ДНК в сыворотке крови) и у пациентов с отсутствием нуклеиновых кислот, различия по морфологической картине в биоптатах печени не выразительны При этом у пациентов с отрицательными сывороточными маркерами достоверно чаще определялись гистологические признаки HBV-инфекции в ткани печени Наличие гистологических и ИГХ

признаков НВУ-инфекции в сочетании с минимальной тяжестью течения заболевания и отрицательными результатами сывороточных тестов позволяет считать, что латентное течение является весьма характерной особенностью ХГ-В Гистологические неспецифические признаки НСУ-инфекции достоверно чаще сочетались с наличием НСУ РНК в сыворотке, а точность предсказания НСУ-инфекции по результатам гистологического исследования достигала 76,5 % Отсутствие морфологических проявлений заболевания у пациентов с маркерами НСУ в сыворотке крови соответствуют данным литературы о возможной репликации НСУ преимущественно вне печени (Апроси-на 3 Г и соавт, 2005, Ющук Н Д. и соавт , 2000)

Иммуногистохимический метод исследования позволил объективизировать данные гистологического исследования, а также существенно расширить представление об истинной частоте и особенности смешанной НВУ+НСУ-инфекции Частота встречаемости смешанной инфекции НВУ+НСУ, полученная в ткани печени с помощью ИГХ методик, в 3 раза выше частоты, определяемой при использовании сывороточных маркеров, ив 1,5 раза выше частоты, определяемой с помощью гистологического исследования Кроме того, у 20,4 % пациентов группы сравнения маркеры НСУ-инфекции определялись либо в ткани печени - 16,3 %, либо в сыворотке крови - 4,8 % По мнению Т FuJlsawa и соавт (1997), при ХГ-С отрицательные результаты ПЦР связаны с репликацией вируса преимущественно в гепатоцитах

Проведенное сравнительное клинико-морфологическое исследование послужило основой для разработки способа дифференциальной диагностики между ХГ-В и С С помощью линейного дискриминант-ного и множественного регрессионного анализа выделена совокупность диагностически значимых гистологических признаков ступенчатые некрозы, крупнокапельная жировая дистрофия, песочноядер-ные гепатоциты, лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов При этом получена формула (1), отражающая зависимость этиологии ХГ от совокупности вышеперечисленных гистологических признаков

ХГВ/С = 0,92+0,27хКЖД+0,11 хСН-0,145хПЯГ+0,1 ЗхЛГПТ (1) Я2=0,38, Р=9,64, р<0,0001 где ХГВ/С - код хронического гепатита (В или С),

КЖД - крупнокапельная жировая дистрофия (0 - нет, 1 - есть), СН - ступенчатые некрозы (0 - нет, 1 - единичные, 2 - немногочисленные, 3 - распространенные),

ПЯГ - песочноядерные гепатоциты (0 - нет, 1 - единичные,

2 - немногочисленные), ЛГПТ - лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов

(О - нет, 1 - скудная, 2 - умеренная, 3 - выраженная) Чтобы завершить построение диагностической модели различения ХГ-В и ХГ-С, был использован линейный дискриминантный анализ для группы признаков, приведенных в формуле (1) и представленных (в порядке уменьшения их диагностической значимости) втабл 1

Таблица 1

Совокупность гистологических признаков, имеющих наиболее высокую значимость (по результатам линейного дискриминантного анализа)

Признак Г Р

Ступенчатые некрозы 14,04 <0,001

Крупнокапельная жировая дистрофия 7,26 <0,009

Песочноядерные гепатоциты 7,18 <0,009

Лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов 6,63 <0,01

В результате было получено уравнение дискриминантной функции фр), или диагностическая модель различения между ХГ-В и ХГ-С (формула 2)

БР = 0,510хС11+1,267хКЖД-0,688хПЯГ+0,618хЛГПТ (2)

где ОР— дискриминантная функция для различения ХГ-В и ХГ-С Остальные обозначения такие же, как в формуле (1)

После расчета значений ОИ по формуле (2) для каждого из пациентов было сформулировано следующее решающее диагностическое правило (РДП) если ЭР не превышает 1,90, то это указывает на высокую вероятность наличия у пациента ХГ-В, а если значение ЭР более 1,90, тогда принимается решение о высокой вероятности наличия

у пациента ХГ-С С помощью полученного уравнения (2) и РДП было сделано заключение о наличии того или иного диагноза у каждого из пациентов с гепатитом В или С, а затем проведено сравнение фактического и "расчетного" диагнозов В результате у 50 из 57 (87,7 %) пациентов было отмечено совпадение гистологического и расчетного диагнозов У 7 (12,3 %) пациентов при использовании РДП были установлены неправильные диагнозы Отметим, что значения ЭР, при которых встречались неправильно принятые решения, находились в общей подынтегральной области двух кривых - области трансгрессии Для выявления причины ошибочной постановки диагноза у 7 пациентов было произведено сопоставление результатов гистологического исследования Обнаружено, что достоверным отличием группы больных с признаками НВУ-инфекции от пациентов с признаками НСУ-инфекции оказались гистологические признаки, представленные известными компонентами ИГА, которые не являлись характерными для данной группы

Оценка точности диагноза, установленного с помощью БР, характеризовалась следующими операционными характеристиками чувствительность - 68,8 %, специфичность - 95,1 %, предсказательная ценность положительного результата - 84,6 %, предсказательная ценность отрицательного результата - 88,6 %, точность предсказания - 87,7 %

Результаты исследования свидетельствуют о расширении возможности дифференциальной диагностики ХГ-В и ХГ-С на основании данных гистологического исследования биоптатов печени Для этого необходимо использовать совокупность диагностически значимых признаков, а не отдельно взятые этиологические (прямые и непрямые) маркеры

ВЫВОДЫ

1 Хронический гепатит у больных терапевтического стационара характеризуется преобладанием латентного и малоактивного вариантов течения заболевания, частота которых составляет 41,0 % и 50,0 % соответственно, а также отсутствием сывороточных маркеров НВУ и НСУ-инфекции в 31 % наблюдений В 29,0 % случаев хронический гепатит выявляется при углубленном клинико-лабораторном и морфологическом обследовании пациентов, госпитализированных в стационар по поводу заболеваний других органов и систем

2 Между результатами оценки тяжести и стадии хронического гепатита по данным клинико-лабораторных тестов и гистологического исследования биоптатов печени имеется неполное соответствие 31,0 % наблюдений клинически латентного и малоактивного хронического гепатита характеризуется умеренной или тяжелой степенью гистологической активности процесса, а 22,0 % случаев клинически активного хронического гепатита - слабой При латентном и малоактивном течении хронического гепатита частота умеренного и тяжелого фиброза печени достигает 19 %, а цирроза печени - 4,0 %

3 Значение и высокая информативность гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции при этиологической дифференциальной диагностике хронического гепатита В и С определяются большой частотой их совпадения с результатами сывороточных и иммуноги-стохимических тестов, составляющей 90,6 %

4 Гистологические признаки HBV-инфекции сочетаются с положительными сывороточными маркерами HBV в 87,5 % случаев и характеризуются высокой специфичностью (91,9 %) и предсказательной ценностью (87,5 %) Наиболее информативными гистологическими признаками HBV-инфекции являются гидропическая дистрофия ге-патоцитов, полиморфизм ядер и так называемые «песочные» ядра, расширение, фиброз и лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов

5 Гистологические признаки HCV-инфекции в 81,8 % случаев сочетаются с наличием HCV РНК в сыворотке больных, а точность предсказания HCV-инфекции по результатам гистологического исследования биоптатов печени составляет 76,5 % Наиболее информативными гистологическими признаками HCV-инфекции являются мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов, ступенчатый некроз, лимфоидная инфильтрация портальных трактов, короткие, единичные порто-портальные и портоцентральные септы («звездчатый» фиброз портальных трактов)

6 Гистологические проявления HBV- и HCV-инфекции имеются в 61,2 % наблюдений серонегативного хронического гепатита по результатам стандартных сывороточных тестов Вирусная этиология заболевания в 78,9 % этих случаев подтверждается экспрессией им-муногистохимических маркеров гепатотропных вирусов Эффективность диагностики смешанной HBV + HCV-инфекции по данным гистологического и иммуногистохимического исследования вдвое выше,

чем по стандартным сывороточным тестам 34,6 % и 15,6 % соответственно

7. Дифференциально-диагностическая модель различения хронического гепатита В и С, разработанная путем линейного дискрими-нантного и множественного регрессионного анализа, позволяет сформулировать решающее диагностическое правило, учитывающее весовые коэффициенты наиболее значимых гистологических признаков и обладающее точностью предсказания этиологии заболевания, равной 87,7 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Гистологические маркеры этиологии, активности и стадии заболевания имеют высокую информативность и значимость в комплексной диагностике хронического гепатита у больных терапевтического стационара

2 Наиболее информативными гистологическими маркерами НВУ-инфекции являются гидропическая дистрофия гепатоцитов, полиморфизм ядер и так называемые «песочные» ядра, расширение, фиброз и лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов

3 Наиболее информативными гистологическими маркерами НСУ-инфекции являются жировая дистрофия и ступенчатый некроз гепатоцитов, лимфоидная инфильтрация и «звездчатый» фиброз портальных трактов

4 Дифференциально-диагностическая модель различения между ХГ-В и ХГ-С, основанная на учете совокупности наиболее значимых гистологических признаков, может быть рекомендована для использования в клинической морфологии печени

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Смирнов О А Иммуногистохимическая диагностика хронического вирусного гепатита Материалы Шестой Российской Гастроэнтерологической недели / О А Смирнов, Р А Насыров, В Г Радченко, Т С Соловьева, В А Дамбаева // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2000 - Т 10, № 5, Приложение №11, Реф 330 -С 88

2 Соловьева Т С Возможности иммуногистохимической диагностики хронического вирусного гепатита /ТС Соловьева, О А Смирнов, Р А Насыров, В Г Радченко, В А Дамбаева // Сборник трудов

научно-практической конференции СНО СПбГМА им И И Мечникова, 2002 -С 271-272

3 Смирнов ОАО возможностях комплексной этиологической диагностики хронического гепатита В и С / О А Смирнов, Р А На-сыров, В Г Радченко, Т С Соловьева, И О Смирнова // Архив патологии -2002 -№ 3 С 3-6

4 Соловьева Т С Гистологические маркеры вирусной инфекции в диагностике хронического гепатита В и С / Т С Соловьева, О А Смирнов, В Г Радченко // Вестник СПбГМА им И И Мечникова - 2003. - № 1.-С. 180

5 Соловьева Т С Сравнительная эффективность иммуногисто-химической, гистологической и серологической диагностики хронического вирусного гепатита В и С / Т С Соловьева, О А Смирнов, Р А Насыров, В Г Радченко // Сборник научных трудов 1-ой Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов -Орел, 2005 - С 76-78

6 Соловьева Т С К оценке значимости гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции в дифференциальной диагностике хронического гепатита /ТС Соловьева // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых -СПб , - Изд дом МАПО, 2006 -С 275-276

7 Соловьева Т С Иммуногистохимия в дифференциальной диагностике хронического вирусного гепатита В и С / Т С Соловьева, О А Смирнов, Р А Насыров, В Г Радченко // Высокие технологии в морфологии, их значение в клинике и перспективы внедрения в практическое здравоохранение Материалы I съезда патологоанатомов Республики Беларусь - Минск. РУМЦ ФВН, 2006 - С 62-64

8 Соловьева Т С Гистологические и иммуногистохимические маркеры вирусной инфекции в этиологической диагностике хронического гепатита / ТС Соловьева, OA Смирнов // К 100-летию СПбГМА им И И Мечникова Современные проблемы патологии Сборник научных трудов под ред чл -корр РАМН Н М Аничкова СПб, 2007 -С 142-146

ЛР № 020496

Подписано в печать 10 04 2007 г Заказ № 410 Формат бумаги 60 х 84/16 Тираж 100 экз. Уел п л 1,0

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им И И. Мечникова Типография ООО «ЛАДОГА» Санкт-Петербург, Выборгская наб., д 29

Актуальность исследования. Хронический гепатит В и С (ХГ-В и С) -широко распространенные заболевания, прогрессия которых приводит к формированию цирроза печени и развитию гепатоцелюллярной карциномы (ГЦК). Трудности своевременного распознавания ХГ-В и С связывают с увеличением частоты латентных и малосимптомных форм (Абдурахманов Д.Т., 2002; Евдокимова Е.Ю., 2004; Карпов С.Ю. и соавт., 2006), которые, как правило, диагностируются у пациентов терапевтических стационаров при обследовании по поводу патологии разных органов и систем (Сулягина Л.Г. и соавт., 2004). При этом почти у 20% впервые выявленных больных поражение печени характеризуется цирротической перестройкой или трансформацией в ГЦК (Gerber М.А., 1997; Poynard Т., 1997; 2001). Это подтверждает обоснованность мнения о том, что именно стертые формы заболевания служат основными "поставщиками" ЦП и ГЦК (В.В. Горбаков, 1998).

Гистологическое исследование биоптатов печени играет важную роль в верификации ХГ. Однако диагностическое значение гистологических признаков, характеризующих активность заболевания, его стадию и, особенно, этиологию, до настоящего времени не подвергалось количественной оценке. Такая оценка требует проведения целенаправленного сопоставления комплекса клинико-лабораторных, сывороточных, гистологических и иммуногистохимических маркеров ХГ-В и С. Поэтому в настоящее время этиологическая диагностика и определение активности ХГ-В и С основывается, главным образом, на сывороточных тестах (Радченко В.Г. и соавт., 2005). При этом нередко приходится сталкиваться с отрицательными результатами стандартных методик (Дуданова О.П., 2006). Это не исключает вирусную этиологию заболевания и заставляет использовать дополнительные, более чувствительные и сложные методы диагностики, например, ПЦР. Возможность гистологической этиологической диагностики ХГ-В и С многими исследователями подвергается сомнению или отрицается (Комарова Д.В., Цинзерлинг В.А., 1999; Гепатит С: Консенсус, 2002; Радченко В.Г. и соавт., 2005; Рахманова А.Г. и соавт., 2005; Malhotra V. et al., 2000). Тем не менее, ряд специалистов описывает патоморфологические признаки поражения печени, свойственные разным вирусам (Серов В.В., 1986; Дуданова О.П., 2003; Арямкина O.J1., 2006; Крохина Н.Б., 2006; Goodman Z.D., 1995; Czaia A.L., 1997; Lory J., 1997; Luo J.C. и соавт., 1999; Sakaida I., 1999).

Таким образом, изучение клинико-морфологических особенностей ХГ-В и С, которые выявляются у больных терапевтических стационаров, представляется актуальной задачей. Кроме того, своего решения требует вопрос о значении гистологических маркеров этиологии, активности и стадии в диагностике заболевания и планировании углубленного обследования больных, особенно при серонегативном ХГ. Нуждается в разработке общедоступная модель дифференциальной диагностики ХГ-В и С, основанная на использовании наиболее информативных гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции.

Цель исследования: комплексная сравнительная клинико-морфологическая оценка значимости дифференциально-диагностических гистологических критериев хронического гепатита В и С у пациентов терапевтического стационара.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности клинического течения ХГ у пациентов терапевтического стационара;

2. Провести сравнительный анализ клинико-лабораторных и морфологических проявлений активности и стадии ХГ у пациентов с различными формами заболевания;

3. Выделить гистологические признаки HBV и HCV-инфекции и провести соответствующие сопоставления с сывороточными и иммуногистохимическими маркерами;

4. Изучить гистологические и иммуногистохимические маркеры HBV и HCV-инфекции у больных серонегативным ХГ;

5. Разработать с помощью методов многомерной статистики способ дифференциальной диагностики между ХГ-В и ХГ-С, основанный на учете наиболее значимых гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции.

Научная новизна.

Проведен сравнительный анализ и установлены варианты соотношения клинико-лабораторных и гистологических проявлений тяжести и стадии ХГ. Изучен спектр и частота гистологических, сывороточных, иммуногистохимических маркеров HBV и HCV-инфекции, впервые подвергнута количественной оценке значимость различных гистологических маркеров. Впервые построена дифференциально-диагностическая модель (дискриминантная функция) различения ХГ-В и ХГ-С и сформулировано решающее диагностическое правило, учитывающее весовые коэффициенты наиболее значимых гистологических признаков.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Сравнительное клинико-морфологическое исследование выявило неоднозначную зависимость между клиническими и морфологическими проявлениями тяжести и стадии ХГ. Сопоставление различных признаков HBV и HCV-инфекции показало, что гистологические (прямые и непрямые) маркеры изучаемых инфекций в большинстве наблюдений соответствуют результатам сывороточных и иммуногистохимических тестов. Большинство наблюдений серонегативного ХГ в наших наблюдениях при морфологическом исследовании оказались неверифицированными ранее вирусными гепатитами. Частота смешанной HBV+HCV-инфекции по данным гистологического исследования биоптатов вдвое, а по результатам иммуногистохимического исследования - втрое выше, чем по данным сывороточных тестов. Разработан способ дифференциальной диагностики ХГ-В и С, учитывающий наиболее значимые этиологические гистологические маркеры HBV и HCV-инфекции, обладающий высокой точностью предсказания этиологии заболевания. Учет комплекса гистологических проявлений заболевания позволяет повысить качество диагностики ХГ-В и С и рационально планировать дальнейшее углубленное обследование больных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У больных терапевтического стационара преобладает латентный и малоактивный варианты течения ХГ, которые характеризуется широким спектром проявлений гистологической активности и степени фиброза.

2. Значение, высокая информативность, специфичность и предсказательная ценность гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции при этиологической диагностике ХГ-В и С определяется большой частотой их совпадения с результатами сывороточных и иммуногистохимических тестов.

3. Гистологические и иммуногистохимические маркеры HBV- и HCV-инфекции имеются в большинстве случаев серонегативного ХГ по результатам стандартных сывороточных тестов.

4. Дифференциально-диагностическая модель различения ХГ-В и С, разработанная с помощью методов многомерной статистики, учитывающая весовые коэффициенты наиболее значимых гистологических признаков, обладает высокой точностью предсказания этиологии заболевания.

выводы

1. Хронический гепатит у больных терапевтического стационара характеризуется преобладанием латентного и малоактивного вариантов течения заболевания, частота которых составляет 41,0% и 50,0% соответственно, а также отсутствием сывороточных маркеров HBV и HCV-инфекции в 31% наблюдений. В 29,0% случаев хронический гепатит выявляется при углубленном клинико-лабораторном и морфологическом обследовании пациентов, госпитализированных в стационар по поводу заболеваний других органов и систем.

2. Между результатами оценки тяжести и стадии хронического гепатита по данным клинико-лабораторных тестов и гистологического исследования биоптатов печени имеются несоответствия: 31,0% наблюдений клинически латентного и малоактивного хронического гепатита характеризуется умеренной или тяжелой степенью гистологической активности процесса, а 22,0% случаев клинически активного хронического гепатита - слабой. При латентном и малоактивном течении хронического гепатита частота умеренного и тяжелого фиброза печени достигает 19%, а цирроза печени - 4,0%.

3. Значение и высокая информативность гистологических маркеров HBV и HCV-инфекции при этиологической дифференциальной диагностике хронического гепатита В и С определяются большой частотой их совпадения с результатами сывороточных и иммуногистохимических тестов, составляющей 90,6%.

4. Гистологические признаки HBV-инфекции сочетаются с положительными сывороточными маркерами HBV в 87,5% случаев и характеризуются высокой специфичностью (91,9%) и предсказательной ценностью (87,5%). Наиболее информативными гистологическими маркерами HBV-инфекции являются: гидропическая дистрофия гепатоцитов, полиморфизм ядер и так называемые «песочные» ядра, расширение, фиброз и лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов.

5. Гистологические признаки HCV-инфекции в 81,8% случаев сочетаются с наличием HCV РНК в сыворотке больных, а точность предсказания HCV-инфекции по результатам гистологического исследования биоптатов печени составляет 76,5%. Наиболее информативными гистологическими маркерами HCV-инфекции являются: мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов, ступенчатый некроз, лимфоидная инфильтрация портальных трактов, короткие, единичные порто-портальные и портоцентральные септы («звездчатый» фиброз портальных трактов).

6. Гистологические проявления HBV- и HCV-инфекции имеются в 61,2% наблюдений серонегативного хронического гепатита по результатам стандартных сывороточных тестов. Вирусная этиология заболевания в 78,9% этих случаев подтверждается экспрессией иммуногистохимических маркеров гепатотропных вирусов. Эффективность диагностики смешанной HBV + HCV-инфекции по данным гистологического и иммуногистохимического исследования вдвое выше, чем по стандартным сывороточным тестам: 34,6% и 15,6% соответственно.

7. Дифференциально-диагностическая модель различения хронического гепатита В и С, разработанная путем линейного дискриминантного и множественного регрессионного анализа, позволяет сформулировать решающее диагностическое правило, учитывающее весовые коэффициенты наиболее значимых гистологических признаков и обладающее точностью предсказания этиологии заболевания, равной 87,7%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Гистологические маркеры этиологии, активности и стадии заболевания имеют высокую информативность и значимость в комплексной диагностике хронического гепатита у больных терапевтического стационара.

2. Наиболее информативными гистологическими маркерами HBV-инфекции являются: гидропическая дистрофия гепатоцитов, полиморфизм ядер и так называемые «песочные» ядра, расширение, фиброз и лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов.

3. Наиболее информативными гистологическими маркерами HCV-инфекции являются: жировая дистрофия и ступенчатый некроз гепатоцитов, лимфоидная инфильтрация и «звездчатый» фиброз портальных трактов.

4. Дифференциально-диагностическая модель различения между ХГ-В и ХГ-С, основанная на учете совокупности наиболее значимых гистологических признаков, может быть рекомендована для использования в клинической морфологии печени.