Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Клинико-морфологическая характеристика тяжёлой дисплазии и плоскоклеточного рака шейки матки

На шах рукописи

ЛИТВИНОВА Валерия Владимировна

КЛШШКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЯЖЕЛОЙ ДИСПЛАЗИИ И ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ШЕЙКИ МАТКИ

14.00.01 - акушерство и гинекология 14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 ДЕК 2009

Челябинск - 2009

003486286

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» на кафедрах акушерства и гинекологии №1 и анатомии человека

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Медведев Борис Иванович Куренков Евгений Леонидович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Хамадьянов Ульфат Рахимьянович

доктор медицинских наук,

профессор Гиниатуллин Равиль Усманович

Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ».

Защита состоится «_» декабря 2009 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.208.117.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» (454092 г. Челябинск ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» (454092 г. Челябинск ул. Воровского, 64).

Автореферат разослан «_»_2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор В.Ф. Долгушина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

По данным Всемирной организации здравоохранения количество впервые выявленных карцином шейки матки достигает 500 ООО в год. Из всех ранее выявленных случаев рака шейки матки (РШМ) от двухсот до трехсот тысяч заканчивается летально (Herdman С. et al., 2000). Одной из основных причин роста заболеваемости, по мнению исследователей, является отсутствие должного скрининга РШМ среди населения (Прилепская В.Н., ¡Состава М.Н., 2006; Parkin D.M. et al., 1999; Herdman С. et al., 2000; Rose P.G., 2002). Эта проблема представляется весьма актуальной в связи с тем, что в патогенезе и морфогенезе цервикальной карциномы важную роль играет вирус папилломы человека и продукты его жизнедеятельности (Киселев Ф.Л.; Прилепская В.Н., 2007; Josefsson AJVi. et al., 2000; Mortazavi S. et al., 2002). Однако, феномен усиления пролиферативной активности неоплазированного эпителия не исчерпывается лишь влиянием вирусных частиц на обменные процессы в инициированной клетке. Было отмечено, что клетки неоплазированного экзоцервикса характеризуются высокой экспрессией протеина Ki-67, нарастающей по мере усиления степени анаплазии (Delias A. et al., 1997; Lee J.S. et al., 2002; Carrilho C. et al., 2003; Horikoshi M. et al., 2005; Wei Feng et al., 2007; Looi M.L. et al., 2008). Повышенная активность пролиферативных механизмов в клетках сочеталась с высокой частотой экспрессии bcl-2 (Brychtovâ S. et al., 2000; Ozalp S.S. et al., 2002), особенно в ассоциации с папилломавирусной инфекцией (Saegusa M. et al. 1995). Мещеряковой M.B. с соавт. (2007) было показано, что в крови пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями неизменно нарастает уровень эритропоэтина (ЭП) по мере снижения степени дифференцировки фокуса неопластической трансформации эпителия. При этом авторы выявили наличие четкой связи между концентрацией системного ЭП и повышенной пролиферативной активностью эпителия шейки матки. Проведенные исследования показали, что причиной увеличения уровня ЭП является способность неоплазированных клеток экспрессировать мРНК эритропоэтина (Yasuda Y. et al., 2001; Yasuda Y. et al., 2002). Вместе с тем было высказано мнение о супрессивном действии злокачественных новообразований матки и яичников на секрецию ЭП (Chudek J. et al., 1998).

До настоящего времени, роль эритропоэтина в развитии цервикальной карциномы остается недостаточно изученной. Это создает предпосылки к изучению причастности ЭП к опухолевому росту, апоптозу и ангиогенезу (Farrell F., Lee А., 2004; Lai S., Grandis J., 2006). Комплексное клинико-морфологическое исследование, проведенное нами среди больных цервикальной эпидермоидной карциномой, преследовало цель расширить знания о генезе такого распространенного страдания, как рак шейки матки.

з

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании комплексной клинико-морфологической характеристик тяжёлой дисплазии, карциномы in situ, высокодифференцированногс умереннодифференцированного и низкодифференцированного плоскс клеточного рака шейки матки, изучить влияние эригропоэтина на npouecci возникновения и прогрессии сквамозноклеточной цервикальной карциномы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Дать клинико-морфсшогическую характеристику неопластически трансформаций эпителия экзоцервикса;

2. Исследовать пролиферативную активность клеток фокусо неоплазий эпителия шейки матки и напряженность в них процессов апогтгоза;

3. Определить характер изменения уровня системного эригропоэтина, а таюке экспрессию местного эригропоэтина клетками цервикальной интраэпигелиальной неоплазии тяжелой степени и рака шейки матки в зависимости от степени дифференцировки опухоли;

4. Описать взаимоотношения между эригропоэтином и процессами клеточного обновления в трансформированном экзоцервиксе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые осуществлено клинико-морфологическое исследование фокусов цервикальной неоплазии в свете их взаимосвязи с концентрацией системного эригропоэтина.

В ходе исследования получены данные, свидетельствующие о важной роли системного эригропоэтина в опухолевой прогрессии цервикальной карциномы.

Проведена иммуногистохимическая оценка напряженности пролифе-ративных и апогтготических процессов в клетках цервикальной интраэпигелиальной неоплазии ГЦ степени, внутрюпигелиальной карциномы, а также инвазивного плоскоклеточного рака шейки матки высокой, умеренной, а также низкой степени дифференцировки. Изучена экспрессия эригропоэтина опухолевым и клеткам и.

Получено подтверждение ингибирующего действия системного эригропоэтина на апоптоз посредством усиления экспрессии bcl-2. Было выявлено, что одним из факторов повышения пролиферативной активности клеток неопластических изменений экзоцервикса является уровень системного эригропоэтина.

Показано, что местноеингезируемый эригропоэтин не оказывает влияния на напряженность пролиферативных и апопготических процессов. Экспрессия местносинтезируемого эригропоэтина достоверно снижается по мере нарастания степени анаплазии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Результаты исследования помимо теоретических знаний о механизмах опухолевой прогрессии в экзоцервиксе позволяют рассматривать концентрацию ЭП в крови женщин с диагностированной цервикальной неоплазией как прогностический фактор. Стабильно нарастающая концентрация ЭП в крови пациенток может свидетельствовать нарастающей анаплазии и прогрессировании опухолевого процесса. Согласно результатам исследования концентрация системного эритропоэтина определяет интенсивность клеточного обновления в цервикальных карциномах эпидермоидной дифференцировки. Полученные данные предполагают более тщательное изучение показаний к назначению препаратов эритропоэтина в группе больных цервикальной карциномой с целью коррекции анемических состояний.

ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Возникновение и прогрессия плоскоклеточного рака шейки матки сопровождается нарастанием уровня системного эритропоэтина, сопряжённым с активацией пролиферации и синхронным снижением активности апоптоза канкрозных клеток.

2. Уровень системного эритропоэтина является важным фактором, влияющим на интенсивность процессов пролиферации и апоптоза в анаплазированных клетках плоскоклеточной карциномы шейки матки. Экспрессия эритропоэтина клетками экзоцервикса не оказывает существенного влияния на прогрессию плоскоклеточного рака шейки матки.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на V, VI и VII Итоговых научно-практических конференциях молодых ученых ЧелГМА (г. Челябинск, 2007, 2008, 2009 гг.), конференция профессорско-преподавательского состава ЧелГМА, посвященной 65-летию медицинской академии (г. Челябинск, 2009).

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедры акушерства-гинекологии №1 и №2 Челябинской Государственной Медицинской Академии, а также в работу 1-ого гинекологического отделения клиники Челябинской Государственной медицинской академии.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме работы опубликовано 6 научных статей, в том числе 1 - в журнале, входящем в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендуемых ВАК РФ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, использованных в исследовании, 3 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Материал изложен на 118 страницах, иллюстрирован 17 рисунками и 18 таблицами. При написании обзора литературы использовано 148 источников (25 отечественных и 123 зарубежных публикаций).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Было проведено проспективное клинико-морфологическое исследование биопсийного материала, полученного от 88 пациенток Челябинского областного онкологического диспансера (главный врач, член-корреспондент РАМН, проф. Важенин A.B.) и Клиники Челябинской государственной медицинской академии (главный врач, заслуженный врач РФ, докт. мед. наук Кремлев С.Л.). Исследование проводилось среди женщин, в экзоцервиксе которых были верифицированы фокусы CIN III (тяжёлой дисплазии), внутриэпигелиальной и инвазивной эпидермоидной карциномы (табл. 1). В соответствии с положениями Закона о персональных данных материал для исследования принимали в работу после кодирования и получения от пациентки информированного согласия.

Таблица 1

Группы исследования

гистологический диагноз Кол-во наблюдений

абс. %

цервикальная интраэпителиальная неоплазия III стадии 25 28,4

карцинома in situ 17 19,3

плоскоклеточный рак высокой степени дифференцировки 16 18,2

плоскоклеточный рак умеренной степени дифференцировки 22 25,0

плоскоклеточный рак низкой степени дифференцировки 8 9,1

Всем обследуемым проводилось общее гинекологическое обследование, включающее осмотр шейки матки с помощью зеркал Куско и бимануальное исследование. Оценка состояния экзоцервикса проводилась посредством простой и расширенной кольпоскопии. Категоризацию диагностируемых изменений экзоцервикса проводили, используя Международную кольпо-скопическую терминологию (Рим, Италия, 1990), обновленную Международной Ассоциацией по патологии шейки матки и кольпоскопии (Барселона, Испания, 2003). Критериями оценки являлись цвет шейки матки, состояние ее поверхности, характер эпителиальной выстилки, наличие участков эктопии цилиндрического эпителия, характер стыка эпителиев, сосудистый рисунок. Для дифференциальной диагностики многослойного плоского эпителия от цилиндрического, оценки реакции сосудов шейки матки, участков мозаики и пунктации, выявления патологических очагов проводили пробу с 3% раствором уксусной кислоты. С целью выявления признаков хронического воспаления и дистрофических изменений в многослойном плоском эпителии проводилась проба Шиллера. По результатам расширенной кольпоскопии выбирали наиболее измененный участок экзоцервикса для проведения прицельной биопсии и дальнейшего гистологического исследования биоптатов.

Выявление возбудителей заболеваний, передающихся половым путем, осуществлялось с помощью полимеразной цепной реакции. У обследуемых стандартными методами оценивались уровни эритроцитов, гемоглобина, цветовой показатель, определялось количество ретикулоцнтов. Методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы ЕРО ELISA (Erythropoietin Enzyme-Lynked Immunosorbent Assay, Biomerica Inc., USA) определяли концентрацию эритропоэтина в 1 мл плазмы крови.

Микропрепараты для оценки степени морфологических изменений готовили из срезов толщиной 5-7 мкм, которые после депарафинирования окрашивали с помощью общепринятых прописей и методик окраски биологических тканей (Меркулов Г.А., 1951; Сапожников А.Г., Доросевич А.Е., 2000).

Апоптотическая активность измененного эпителия экзоцервикса изучалась с помощью коммерческих моноклональных антител (DAKO), выявляли пул клеток, экспрессирующих белок р53 и антиапоптотический фактор - bcl-2. Степень пролиферативной активности эпителия шейки матки определялась с помощью универсального маркера пролиферации Ki-67 (Novocastra). Реакция с белками р53 и Ki-67 считалась положительной при интенсивном коричневом ядерном окрашивании. Факт экспрессии клетками белкового продукта гена bcl-2 и эритропоэтина регистрировался при соответствующем цитоплазматическом мембранном светло-коричневом окрашивании эпителиоцитов. Экспрессию эритропоэтина клетками фокусов неоплазий выявляли с помощью первичных моноклональных антител к

эритропоэтину (Еро (N-19): sc-1310, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA).

Для оценки иммуногистохимической реакции при увеличении 400, в зависимости от внутриклеточной локализации изучаемого маркера, осуществляли подсчет окрашенных ядер или клеток не менее чем в 500 клетках каждого препарата. Объемная плотность позитивных ядер (клеток) определялась с помощью окулярных вставок методом точечного счета в 40 произвольно выбранных полях зрения при увеличении 400 (Автандилов Г.Г., 1990). Микропрепараты анализировались с помощью микроскопа «Olympus-ВХ40». Микрофотограммы изготавливались с использованием видеокамеры «Micromed 5М».

Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с помощью лицензионного пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.») по общепринятым методикам статистического анализа (Хилл Бредфорд А., 1958; Гланц С., 1999; Автандилов Г.Г., 2002). Применялись методы вариационной статистики: определение средней арифметической, среднее квадратическое отклонение, стандартной ошибки средней арифметической. Для изучения различий между группами применялся дисперсионный анализ с расчетом критерия Фишера. Статистическая значимость различий сравниваемых количественных признаков оценивалась по критерию Стьюдента при попарном сравнении и Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений, а также, при необходимости, с использованием теста Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возраст пациенток на момент проведения исследования был неодинаков и колебался в пределах 20-72 лет. Средний возраст женщин, сформировавших группу исследования в целом, составил 39,2 лет (95% ДИ = 36,5-41,9). Большинство пациенток как в группе в целом, так и в подгруппах принадлежали к социальной группе служащих (30,7%), что, возможно обусловлено более высоким уровнем образования, и частым обращением за медицинской помощью женщин данной социальной группы, в сравнении с пациентками других групп. Вероятно, большое значение здесь также имели плановые медицинские осмотры, проводимые среди работников сферы обслуживания и учащихся, а также в большинстве случаев среди работников инженерно-технических специальностей. Среди таких пациенток, т.е. лиц, проходящих регулярные медицинские осмотры, было выявлено достоверное увеличение количества диагностированной интраэпителиальной неоплазии (24,0%).

Возраст пациенток на момент менархе варьировал в диапазоне 11-17 лет, чаще в 13,4 лет. В подавляющем большинстве наблюдений менструации имели регулярный характер, продолжались 2-7, в среднем, 5 дней, умеренные, безболезненные. Наиболее часто сексуальный дебют происходил

в возрасте 18-20 лет, в среднем в 19,2 лет. В подгруппах с цервикальной неоплазией и неинвазивной карциномой доли пациенток, начавших половую жизнь до и после наступления совершеннолетия, почти не различались. Была выявлена тенденция снижения числа карцином, как внутриэпителиальных (41,2%), так и инвазивных (26,1%) у женщин, начавших половую жизнь до 18 лет, в сравнении с пациентками с дебютом в возрасте 18-20 лет (58,8 и 58,7%, соответственно). В подгруппе женщин с сексуальным дебютом после 20 лет, количество пациенток с инвазивными карциномами почти в четыре раза превышало количество женщин с диагностированным фокусом CIN III (р>0,05). Однако, в этой возрастной группе в целом было диагностировано наименьшее количество новообразований экзоцервикса.

Большинство женщин всех подгрупп отметили от 2 до 5 половых партнеров (51,1%). Несмотря на то, что различия не были значимыми, количество незамужних женщин (53,4%) несколько преобладало над количеством замужних пациенток (46,6%). Большинство пациенток (63,6%) не контролировали вероятность наступления нежелательной беременности. Барьерные методы контрацепции (презерватив) применяли не более трети пациенток. Ни одна пациентка не использовала гормональные контрацептивные препараты. В связи с пренебрежением контрацепцией, у отдельных пациенток число беременностей достигало 10. Две пациентки наличие беременностей в анамнезе отрицали. Чаще женщины отмечали 4 беременности (18% наблюдений). Количество срочных родов достигало пяти (две пациентки), наиболее часто в анамнезе отмечалось двое родов. Во всех группах была высока частота медицинских абортов; их максимальное количество (6) было выявлено у пациентки с максимальным числом беременностей. Несмотря на то, что различия не имели статистической значимости, количество выкидышей имело устойчивую тенденцию к увеличению в подгруппах пациенток с инвазивными карциномами.

Клинические проявления трансформаций экзоцервикса не обладали какой-либо специфичностью и характеризовались стереотипной гинекологической симптоматикой. При обращении за медицинской помощью наиболее часто женщины жаловались на тянущие боли внизу живота, отмечаемые 81,8% наблюдений. У 44,3% пациенток болезненные ощущения возникали при половом акте. Широкое распространение (78,1% наблюдений) получили жалобы на кровянистые выделения из половых путей, которые у 22,7% пациенток носили контактный характер, что следует рассматривать как проявление злокачественной трансформации (Кондратьева Е.А., 2003).

В подавляющем числе наблюдений (89,8%) было выявлено инфекционное поражение урогенитального тракта, чаще хламидийной (27%) и уреаплазменной (22%) природы. Более чем в трети наблюдений было диагностировано инфицирование грибами рода кандида. В части случаев имела место микст-инфекция. В анамнезе 72,7% женщин всей группы исследования ранее была диагностирована псевдоэрозия шейки матки. Почти такое же количество женщин (73,9%) страдали хроническим цервицитом.

Инфицирование вирусом папилломы человека в целом было выявлено в 84,1% наблюдений. Преимущественное распространение при этом получили 16-й и 18-й серотипы ВПЧ (77,3%), ВПЧ 31, 33 типов был диагностирован у 53,43,9%% пациенток, ВПЧ б, 11, 35, 45 - у 3,41%. В 5,7% наблюдений был диагностирован вирус простого герпеса 1 и 2 типов. Доля пациенток с CIN 111 и верифицированным ВПЧ-носительством было достоверно максимальным в сравнении с пациентками остальных групп (р < 0,05). Несмотря на выявленную тенденцию к снижению доли ВГТЧ-инфицированных женщин по мере дедифференцировки карциномы в группах, статистической значимости различия в количестве пациенток не имели (рис.1). У женщин с интраэпителиальной неоплазией ВПЧ был диагностирован у 80,0% пациенток (здесь и далее в подгруппе). Карциноме in situ сопутствовало инфицирование вирусом папилломы в 76,5% случаев. В группе больных инвазивным раком количество случаев инфицирования ВПЧ достигло 89,1% наблюдений.

CIN CIS ВПКР УПКР НПКР

Рисунок 1. Доля ВПЧ-инфицированных пациенток в группе исследования, %.

Вирусы высокого онкогенного риска (ВПЧВ) были диагностированы у подавляющего большинства (95,9%) пациенток всей группы исследования. Вирусы такого типа выявлялись часто у молодых женщин, в возрасте до 29 лет, что, возможно, связано с более высокой сексуальной активностью пациенток этой возрастной подгруппы. В то же время, нельзя исключить, что это было обусловлено большим представительством женщин указанного возраста в группе исследования. Большинство пациенток, инфицированных ВПЧ высокой онкогенности, принадлежали к профессиональной группе инженерно-технических работников (32,4%), а также социальной группе неработающих (33,8%). Начало половой жизни большинство женщин, инфицированных ВПЧ высокого онкогенного риска, отмечали в возрасте 1820 лет. Количество половых партнеров у большинства женщин с верифицированным ВПЧ высокой онкогенности - было от 2 до 5. Не было неожиданным также выявление большого количества случаев инфицирования высокоонкогенными штаммами среди незамужних женщин.

10

Почти две трети женщин, не состоящих в браке, были инфицированы вирусом папилломы человека высокого онкогенного типа.

Большое влияние на соотношение вирусов различной степени онкогенности оказало пренебрежение контрацептивными средствами. Среди женщин, инфицированных ВПЧ высокого онкогенного риска, большинство (76,1%) не использовали никаких контрацептивов. Как и в группе в целом, большинство беременностей у пациенток с ВПЧ заканчивалось либо срочными родами, либо медицинским прерыванием в равных долях и не было связано с вирусологическим статусом женщин.

Как показал дисперсионный анализ, достоверности различий в количестве случаев выявления ВПЧ высокой онкогенности у женщин с неоплазиями различной степени инвазии и анаплазии не было, несмотря на некоторую тенденцию к увеличению количества ВПЧ-положительных пациенток по мере нарастания злокачественности. Все пациентки с инвазивными цервикальными карциномами были инфицированы высокоонкогенными вирусами папилломы.

Частота регистрации тех или иных кольпоскопических симптомов согласовалась с распространенностью папилломавирусной инфекции. Наиболее разнообразная кольпоскопическая картина была зарегистрирована у пациенток с интраэпителиальной неоплазией и карциномой in situ экзоцервикса. Чаще в группе регистрировались мозаика (90,5%) и ацетобелый эпителий (85,7%). Несколько реже выявлялась пуйктация (71,4%). Нарушение созревание эпителия проявлялось в виде йод-негативных зон, которые выявлялись почти у всех пациенток (95,2%). Немногим реже диагностировалась атипическая зона трансформации (85,7%). Различия в частоте того или иного кольпоскопического признака у пациенток групп CIN III и CIS не имели достаточной статистической значимости. Исключение составили лишь случаи регистрации остроконечных кондилом. Число женщин с данным образованием на экзоцервиксе было достоверно больше (р<0,05) в группе пациенток с карциномой in situ (58,8%). У женщин, вошедших в группу больных с инвазивной карциномой, кольпоскопические симптомы были более однообразны и представляли собой видимые разрастания опухолевой ткани различней локализации, формы и размеров.

Общий анализ крови свидетельствовал о наличии у пациенток анемических состояний, тяжесть которых усиливалась по мере снижения степени дифференцировки фокуса неоплазии. Количество эритроцитов в периферической крови было минимальным у пациенток с низкодиф-ференцированной карциномой (3,2 х 1012/мл). Снижение количества гемоглобина было значимым только у женщин с карциномами умеренной и низкой степени дифференцировки. Вследствие развития анемии в группах наблюдалось реципрокное раздражение кроветворного ростка. Количество ретикулоцитов увеличивалось по мере снижения степени дифференцировки, от 1,8 у пациенток с CIN III, до 7,9 - с низкодифференцированным раком. У пациенток всех погдрупп было увеличено содержание палочкоядерных

нейтрофилов в крови, до 8-11%, что, однако, не оказало существенного влияния на общее количество лейкоцитарных клеточных элементов. Скорость оседания эритроцитов была максимальной у женщин с карциномами экзоцервикса низкой степени дифференцировки, что является патогномоничным для злокачественных новообразований любой локализации. Другие гематологические показатели находились в пределах физиологической нормы.

Концентрация системного ЭП в группе в целом широко варьировала и колебалась в пределах 0,92-94,04 мЕд/мл. При этом средняя концентрация ЭП у пациенток разных групп достоверно различалась (рисунок 2). Минимальное среднее содержание ЭП было выявлено у женщин, в экзоцервиксе которых диагностировалась интраэпителиальная неоплазия (р<0,01). Статистической значимости различия не имели только между пациентками с карциномой in situ по отношению к CIN III и ВПКР. Уровень ЭП нарастал по мере снижения дифференцировки карциномы. В целом, среднее содержание ЭП в крови пациенток с плоскоклеточным раком низкой дифференцировки превышало таковой показатель у пациенток с высокодифференцированной карциномой более чем в четыре раза и в десять - у пациенток с интраэпителиальной неоплазией.

Полученные нами данные противоречат сообщениям о снижении концентрации сывороточного ЭП у онкологических больных (Leng Н.М. et al., 1999), обусловленного, по мнению исследователей, супрессивным действием злокачественных новообразований матки (Chudek J. et al., 1998). В то же время результаты проведенного исследования совпадают с данными, согласно которым в крови пациенток с РШМ уровень эритропоэтина, напротив, повышается (Мещерякова М.В. и др., 2007, Мещерякова М.В., 2009). Это позволяет расценивать уровень сывороточного ЭП как диагностический критерий, свидетельствующий о нарастании степени анаплазии.

100

CINÜI CIS ВПКР УПКР НГ1КР

Рисунок 2. Концентрация эритропоэтина в крови пациенток в группах исследования, мЕд/мл; приведены средние значения и стандартные

отклонения в выборке: рп- р<0,05: 1 - к CIN III;2 - к CIS;3 - к ВПКР;4 - к УПКР;5 - к НПКР

Уровень системного ЭП и количество эритроцитов, а также концентрация гемоглобина находились в обратной зависимости (г = 0,6, р<0,01 в обоих случаях). При этом зависимость факторов между собой хорошо описывалась функцией линейной регрессии. Согласно результатам регрессионного анализа, уровень эритропоэтина зависел от содержания эритроцитов и гемоглобина, определяя при этом содержание ретикулоцитов (г = 0,8, р<0,01).

Согласно задачам исследования в каждой группе были исследована экспрессия про- и антиапоптотических протеинов, пролиферативная активность клеток фокусов неоплазии, а также изучена экспрессия эритропоэтина. Клетки, экспрессирующие Ki-67, располагались в эпителиальном пласте неравномерно, при этом их преобладающая локализация была обусловлена типом и стадией неопластического процесса. В эпителии, характеризующемся наличием изменений, типичных для CIN III, клетки, продемонстрировавшие положительную реакцию с антителами к Ki-67, были представлены в базальных и парабазальных слоях эпителия. В инвазивных карциномах клетки, экспрессирующие Ki-67 встречались диффузно, что свидетельствовало о расширении зоны пролиферации. Морфометрическое исследование выявило тенденцию к увеличению доли пролиферирующих клеток по мере снижения степени дифференцировки карциномы. Максимальная доля Ki-67-положительных клеток (4,6%) была зарегистрирована в очагах НПКР (р<0,05). Минимальная доля клеток в фазе пролиферации была зарегистрирована в фокусах CIN III (1,5%). В фокусах иных изменений доля пролиферирующих клеток имела промежуточное значение, возрастая от CIS к УПКР. Полученные данные согласуются с результатами многочисленных исследований, согласно которым экспрессия Ki-67 стабильно увеличивается от CIN I до инвазивного рака (Spinillo А. et al., 2004; Horikoshi М. et al., 2005; Kimura M. et al„ 2006; Wei Feng et af., 2007; Looi M.L. et al., 2008).

Экспрессия антиапоптотического протеина bcl-2 увеличивалась по мере снижения дифференцировки. В фокусах CIN-III клетки, положительные к антителам против bcl-2, располагались преимущественно в базальных слоях измененного эпителия. В фокусах инвазивных карцином Ьс1-2-положительные клетки регистрировались по всей толще очага неоплазии. Количество меченых клеток в очагах интраэпителиальной неоплазии и карциноме in situ было достоверно минимальным (р<0,05) и составило 0,5% и 0,8% соответственно. В группе инвазивных карцином наименьшая доля bcl-2-положительных клеток наблюдалась в очагах ВПКР (1,01%). Наибольшее количество клеток, экспрессирующих bcl-2, было зарегистрировано в фокусах эпидермоидного рака низкой степени дифференцировки (2,5%). Усиление экспрессии было неоднократно отмечено в многочисленных

исследованиях (Van de Putte G. et al., 2005; Cheah P.L., Looi L.M., 2006; Wei Feng et al., 2007; Looi M.L. et al., 2008). Но ряд авторов указывал на то, что уровень экспрессии bcl-2 у пациенток с неоплазией экзоцервикса оставался одинаковым независимо от степени анапластических явлений (Cooper К. et al., 1999; Dimitrakakis С. et al., 2000; Turkfiioglu I. et al., 2007). Противоречивость опубликованных данных, обусловленная, по всей видимости, изучением разных когорт пациенток, не позволяет однозначно интерпретировать роль bcl-2 в развитии и прогрессии рака шейки матки (Dimitrakakis С. et al., 2000; Tiirkfiioglu I. et a)., 2007). В изучаемой нами группе пациенток изменение уровня экспрессии bcl-2 укладывается в общую концепцию канцерогенеза.

Распределение р53-положительных клеток в фокусах неоплазий и карцином было диффузным, как и в исследовании Cheah P.L., Looi L.M. (2002). Доля клеток, претерпевающих апоптозные изменения, в очагах неопластического роста по мере дедифференцировки фокуса неоплазии значимо уменьшалась. Минимальная доля клеток в апоптозе была зарегистрирована в карциномах низкой степени дифференцировки (1,03%). В фокусах высокодифференцированного рака доля клеток, демонстрирующих экспрессию р53, была достоверно выше (2,5%). Наибольшее количество клеток в апоптозе было выявлено в фокусах CIN-III (7,5%). Полученные нами результаты совпадают с данными, опубликованными Z.H. Tang et al. (2003), показавшими корреляцию экспрессии р53 со стадией карциномы. Характерное нарастание доли клеток, экспрессирующих апоптотический протеин, было неоднократно показано в различных исследованиях (Фролова И.И. и др. 2004; Spinillo A. et al., 2004). В то же время, встречаются мнения об отсутствии связи интенсивности апоптоза со стадией карциномы (Dimitrakakis С. et al., 2000; Looi M.L. et al., 2008).

Рисунок 3. График линейной регрессии зависимости доли клеток, экспрессирующих Ю-67, от доли клеток экспрессирующих Ьс1-2; сплошная линия - линия регрессии, пунктирные линии - границы 95% доверительного интервала

Доля опухолевых клеток, экспреееирующих ЭП, снижалась по мере снижения степени дифференцировки карциномы, при этом их максимальное количество наблюдалось в очагах интраэпителиальной неоплазии (5,4%), тогда как их минимум (0,01%) был зарегистрирован в фокусах плоскоклеточного рака низкой дифференцировки (р<0,05). Однако, полученные нами результаты противоречат опубликованным данным, согласно которым по мере нарастания анаплазии эпителия синтез ЭП клетками усиливается. И, если в нормальном плоском эпителии экспрессия ЭП отсутствует (Ьее й а!., 2008), то при дисплазиях клетки,

экспрессирующие ЭП, демонстрируют значимую корреляцию с тяжестью дисплазии (Асэ в. е1 а1., 2003).

Было выявлено наличие статистически значимой связи между активностью пролиферативных механизмов и экспрессией антиапоптозных протеинов (г = 0,99; р<0,01). Регрессионный анализ показал увеличение доли пролиферирующих клеток соответственно увеличению доли клеток, экспресссирующих антиапоптозный фактор по мере снижения дифференцировки фокуса неоплазии (рис. 3). По всей видимости, такое взаимоотношение является стереотипным в опухолях. Так, было показано, что экспрессия Ьс1-2 в плоскоклеточном раке легкого коррелирует с пролиферативной активностью клеток опухоли, детектором которой выступает Кл-67 (Коган Е. и др., 1996). Такие же результаты были получены и при исследовании цервикальных карцином (Ьоо1 М. Ь. и а1., 2008). .

Такую же силу продемонстрировала связь уровня системного ЭП и экспрессии К¡-67, а также ЭП и Ьс1-2 (г = 0,99; р<0,01). Уравнения регрессии имели вид:

К1-67 = 1,3765 + 0,0516 х ЭП (1)

и

Ьс1-2 = 0,4667 + 0,0333 х ЭП (2)

Согласно представленным уравнениям, доля активно пролиферирующих клеток увеличивалась на 0,05% на одну единицу прироста ЭП в крови (мЕд/мл), что демонстрирует вклад ЭП в интенсивность прироста клеточной популяции (рис. 4). При теоретическом нулевом уровне ЭП доля клеток, экспрессирующих Кь67 в очаге неоплазии, составляет не более 1,38%.

Уравнение, описывающее характер взаимосвязи уровня ЭП и антиапоптозного протеина Ьс1-2, свидетельствует о приросте доли клеток, экспрессирующих антиапоптозный фактор на 0,03% в ответ на увеличение уровня ЭП на 1 мЕд/мл (рис. 5). При этом при нулевом значении ЭП в крови, доля Ьс1-2-положительных клеток составляет в очаге неоплазии не более 0,47%.

Связь уровня ЭП и апопотозной активности клеток на основании регистрации экспрессии протеина р53 клетками неоплазии экзоцервикса была обратной, умеренной силы (г = -0,54) и недостоверной. Также в исследуемой группе пациенток не было выявлено связи между интенсивностью апоптоза, оцененной на основании изучения экспрессии р53, и пролиферативной активностью клеток.

Рисунок 4. График линейной регрессии изменения доли пролиферирутощих клеток, на основе регистрации экспрессии Ю-67 от концентрации системного эритропоэтина; сплошная линия - линия регрессии, пунктирные линии - границы 95% доверительного интервала

Рисунок 5. Графики линейной регрессии изменения доли клеток, экспрессирующих антиапоптозный протеин Ьс1-2 клетками фокусов неоплазии от концентрации системного эритропоэтина; сплошная линия -линия регрессии, пунктирные линии - границы 95% доверительного интервала.

Полученные результаты согласуются с рядом исследований, продемонстрировавших связь индекса Кл-67 с экспрессией Ьс!-2, в то время как по отношению к р53 такой связи не прослеживалось (Вгус^оуа 8. е1 а1., 2000; 1.001' МХ. е1 а!., 2008). В отдельных публикациях было отмечено, что случаи резко позитивные в отношении р53, характеризуются слабой

экспрессией K¡-67 и, в то же время, р53-негативиые наблюдения отличались выраженной экспрессией Ki-67 (Horikoshi М. et al., 2005).

Концентрация эритропоэтина в крови достоверно увеличивалось по мере снижения степени дифференцировки фокуса неоплазии. В свою очередь, экспрессия эритропоэтина клетками фокусов неоплазии по мере снижения их дифференцировки, напротив, снижалась. Несмотря на то, что корреляционный анализ выявил умеренную отрицательную связь между экспрессией ЭП неоплазированными клетками и концентрацией ЭП в периферической крови (г = - 0,69), статистической значимости она не имела (р>0,05).

Выявленная обратная связь между уровнем пролиферативной активности клеток и числом клеток, экспрессирующих ЭП, позволяют подвергнуть сомнению роль местносинтезируемого эритропротеина в активации пролиферативных механизмов, то есть его функцию паракринного стимулятора роста. В то же время активность пролиферативных механизмов продемонстрировала отчетливую зависимость от уровня системного эритропоэтина в крови пациенток.

Эритропоэтин-индуцированные ингибиция апоптоза и усиление пролиферации позволили ряду исследователей предположить способность эритропоэтина способствовать росту опухоли и рассматривать его как фактор роста (Sereno М. et al., 2006; Laugsch М. et а!., 2008). В эксперименте было показано, что ЭП увеличивает передачу сигнала и активаторов bcl-2 (Wei L. et al., 2006). Корреляция между уровнем системного ЭП и экспрессии bcl-2 была выявлена в шванноме и диспластичном плоском эпителии (Acs G.et al., 2003; Diensthuber M. et al., 2007). Другие авторы более сдержанны в трактовках собственных результатов и рассматривают ЭП лишь в качестве фактора выживания посредством репрессии апоптоза (Silva М. et al., 1999). В любом случае ингибиция апоптоза посредством усиления экспрессии эритропоэтином антиапоптотического bcl-2 является доказанным фактом (Dolznig Н. et al., 2002; Acs G. et al., 2003; Acs G. et al., 2004; Emir M. et al„ 2007).

На основании полученных результатов и данных литературы можно заключить следующее. Прогрессирующее нарастание тканевой гипоксии, вызывает компенсаторное усиление синтеза системного эритропоэтина. В свою очередь эритропоэтин крови оказывает ингибирующее апоптоз действие, благодаря чему, при одновременном нарастании пролиферативной активности, происходит снижение интенсивности элиминации трансформированных клеток и, как следствие, увеличение численности клеточной популяции и рост опухоли. Благодаря последовательно развивающейся цепи событий, происходит формирование порочного круга. Местносинтезируемый эритропоэтин не играет прямой роли в усилении опухолевой прогрессии и нарастании клеточной массы опухоли.

выводы

1. В исследуемой группе тяжелая дисплазия и плоскоклеточный рак шейки матки чаще регистрировались у незамужних (53,4%) пациенток в возрасте до 29 лет (30,7%), начавших половую жизнь в 18-20 лет (55,7%), с умеренным количеством половых партнеров (2-5), не использовавших контрацептивные средства.

2. В большинстве случаев фокусам неоплазии сопутствовало инфицирование вирусом папилломы человека (84,1%). Чаще диагностировались высокоонкогенные серотипы ВПЧ (77,3%). В 73,9% наблюдений в экзоцервиксе были выявлены морфологические признаки хронического неспецифического воспалительного процесса.

3. Уровень системного эритропоэтина в крови женщин с неопластическими трансформациями эпителия в шейке матки зависит от степени дифференцировки очага неоплазии и достоверно нарастает соответственно усилению анаплазии клеток, при этом его содержание колеблется в пределах 0,92-94,04 мЕд/мл;

4. Концентрация системного эритропоэтина зависит от содержания эритроцитов и гемоглобина и определяет содержание ретикулоцитов в периферической крови. Характер взаимоотношений описывается уравнением линейной регрессии, согласно которому снижение содержания эритроцитов на 1 х 10 2/мл вызывает увеличение концентрации эритропоэтина на 19 мЕд/мл. Снижение гемоглобина на 1 мг/л у пациенток исследуемой группы обусловливает увеличение концентрации эритропоэтина на 0,4421 мЕд/мл. Увеличение уровня системного эритропоэтина на 1 мЕд/мл способствует увеличению содержания ретикулоцитов на 0,0977%;

5. Интенсивность пролиферативных процессов в клетках неопластических очагов определяется активностью антиапоптозных механизмов. Увеличение пула клеток, экспрессирующих Ьс1-2, на один процент достоверно увеличивает долю пролиферирующих клеток (Кь67+) на 1,5 процента. Уровень экспрессии проапоптозного протеина р53 не зависит от реализации антиапоптозных программ и не связана с пулом пролиферирующих клеток;

6. Экспрессия клетками неопластически измененного экзоцервикса местного эритропоэтина прогрессивно снижалась по мере нарастания степени дедифференцировки клеток от тяжёлой дисплазии к плоскоклеточному раку шейки матки низкой степени и была минимальной в низкодифференцированных опухолях (0,01%). Связь между уровнем экспрессии местного ЭП и показателями, характеризующими интенсивность клеточного обновления, отрицательная и недостоверная (р>0,05).

7. Системный эритропоэтин активирует клеточные механизмы пролиферации и процессы, препятствующие апоптозу, что подтверждается достоверным увеличением экспрессии протеинов К1-67 и Ьс1-2, соответственно, по мере нарастания уровня системного эритропоэтина;

8. Концентрация системного эритропоэтина не связана с уровнем экспрессии клетками неопластически трансформированного экзоцервикса местного эритропоэтина. Местносинтезируемый эритропоэтин не играет прямой роли в усилении опухолевой прогрессии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Увеличение уровня системного эритропоэтина следует рассматривать как диагностический критерий нарастания анаплазии цервикальной интраэпителиальной неоплазии, а также признак формирования очага злокачественного роста в экзоцервиксе;

2. Определение концентрации эритропоэтина в крови молодых пациенток с цервикальной карциномой должно быть включено в программу предоперационного обследования с целью изучения прогноза течения заболевания и минимизации объема оперативного вмешательства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Литвинова, В. В. Эритропоэтин и прогрессия плоскоклеточного рака шейки матки / В.В. Литвинова, Е.Л. Куренков // Ур. медицин, журн.. -№2 (42).-2008.-С. 13-16;

2. Литвинова, В.В. Экспрессия протеинов р53 и Ьс1-2 в фокусах неоплазии экзоцервикса / В.В. Литвинова, Е.Л. Куренков, Б.И. Медведев // Изв. высших учеб. заведений Уральского региона. -№3-4. -2008. - С. 111-113;

3. Литвинова, В.В. Сравнительная характеристика экспрессии маркеров пролиферации и апоптоза у пациенток с неопластическими превращениями экзоцервикса / В.В. Литвинова, Е.Л. Куренков, Б.И. Медведев // Изв. высших учеб. заведений Уральского региона. - №1. -2009.-С. 32-36;

4. Литвинова, В.В. Влияние эритропоэтина на интенсивность клеточного обновления в клетках неопластически измененного экзоцервикса / В.В. Литвинова, Е.Л. Куренков, Б.И. Медведев // Изв. высших учеб. заведений Уральского региона. - №2. - 2009. - С. 74-75;

5. Литвинова, В.В. Характеристика состава периферической крови у больных злокачественными эпидермоидными новообразованиями шейки матки / В.В. Литвинова, Б.И. Медведев, Е.Л. Куренков // Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения. Труды научной сессии, посвященной 65-летию Медицинской академии. -Челябинск, 2009.-С.80;

6. Литвинова, В.В. Эритропоэтиновая ингибиция апоптоза клетками в очагах неоплазированного экзоцервикса / В.В. Литвинова, Е.Л. Куренков, Б.И. Медведев // Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения. Труды научной сессии, посвященной 65-летию Медицинской академии. - Челябинск, 2009. - С.70-71.

На правах рукописи

ЛИТВИНОВА Валерия Владимировна

РОЛЬ ЭРИТРОПОЭТИНА В ПРОГРЕССИИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО РАКА

ШЕЙКИ МАТКИ

14.00.01 - акушерство и гинекология 14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2009 Отпечатано в типографии «Искра» 454080, г. Челябинск, ул. Сони Кривой, д. 42 тел. (351)230-57-70