Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Клинико-морфофункциональное исследование интенсивности апоптоза и экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора при злокачственных новообразованиях кожи

На правах рукописи

РУКША ТАТЬЯНА ГЕННАДЬЕВНА

Клинико-морфофункдиональное исследование интенсивности апоптоза и

экспрессии периферического > бензодиазепинового редептора при -злокачественных новообразованиях кожи

14.00.11 - Кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертациина соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-2007

Работа выполнена в ГОУ ВПОгЖрасноярская государственная медицинская академия ФедеральнощЩгеетбтва пб„здравоохранению и социальному .* ¿^йразвитию» ,

Научные консультанты: ^ V Д м н, профессор | Прохоренков В И

Д м.н, профессор " , СшшинаАБ.

Официальные оппоненты: : -

Д м н, профессор Вавилов А^М ; 7 Д м.н, профессор Дубенский:В В Д.м н, профессор Кошелев ВЛэ -:

Ведущая организация: : "

ГОУ ВПО «Российский угогаерситет дружбы народов Федерального агентства по здравоохранению и со1даадьн<>Му развитию>>, г Москва

Защита состоится « Л в 12 часов на заседании

диссертационного совета ' Д7-208;115 0| при ФГУ «Центральный научно-исследовательский кожно-водёщшршнеский институт Федерального агентства-по здравоохранению и соод^ый^развитию» 107076 г Москва, ул. КоррЛетга(;д З, корп 4

С диссертацией можйо ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГУ «ЦНИКВИ РосздравахГ^ -

Автореферат разослан!« ~___ 200

Ученый секретарь

диссертационного совета N ■ ■ //)/О

кандидат медицинских наук»;-/ ^^^^^НЕЙб-Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Злокачественные заболевания являются одной из важнейших медико-социальных проблем современного общества Многочисленные эпидемиологические исследования свидетельствуют о выраженном увеличении числа больных и показателей смертности в данной группе заболеваний [Чойнзонов Е JI, 2004, Старинский В В, 2002] По состоянию на 2003г в России состоит на учете более 2300000 больных с онкологическими заболеваниями Ежегодно в России злокачественные новообразования выявляются у 450 тысяч человек [Ильницкий АП, 2003] Около 150 тыс человек ежегодно признаются инвалидами по онкологическому заболеванию [Чиссов В И, 2006] Помимо этого, остается малоэффективной ранняя диагностика онкологических заболеваний Удельный вес с опухолевым процессом неустановленной стадии по России составляет 8,8% В некоторых регионах, в том числе в Красноярском крае, данный показатель достигает 30% [Чиссов В И, 2006] В условиях постоянного увеличения числа онкологических больных сохраняется актуальность поиска эффективных новых методов ранней диагностики, а также оптимизации терапии данных заболеваний

В число самых распространенных онкологических заболеваний входят злокачественные новообразования кожи [Молочков В А, 2004, Гармонов А А ,

2003] Повсеместно отмечается рост заболеваемости одной из самых агрессивных опухолей человека - меланомой кожи В России абсолютное число впервые выявленных случаев данного заболевания с 1982г увеличилось в 2 раза, заболеваемость в 2002г составляла у мужчин 3,0, у женщин - 3,5 [Петрова Г В , 2006] В некоторых регионах Российской Федерации, например, в Санкт-Петербурге, с 1980 по 2004г утроилось абсолютное число первичных случаев заболевания, а стандартизованный показатель вырос в 2 раза [Мерабишвили В М , 2006] В целом, злокачественные новообразования кожи занимают третье место в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России [Молочков В А, 2004, Хатырев С А,

2004]

Доказано, что ультрафиолетовое облучение является одним из основных факторов, индуцирующих развитие данных заболеваний [Armstrong В К, 1997] В связи с этим является перспективным изучение функционирования белков клеток кожи, обладающих фоточувствительностью и принимающих участие в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза К группе таких белков относится периферический бензодиазепиновый рецептор (ПБР), точная роль в коже которых остается неясной [Stoebner Р Е, 1998, Bribes Е, 2003] Однако их выраженная экспрессия в коже, способность регулировать пролиферацию клеток требуют дальнейшего изучения механизмов регуляции функционирования рецептора в коже в норме и при патологии, а также позволяет рассматривать ПБР как возможную терапевтическую мишень и маркер интенсивности клеточной пролиферации при злокачественных новообразованиях кожи [Gavish М, 1999, Stoebner Р Е, 2001]

Цель работы

Исследовать взаимосвязь между клиническими проявлениями злокачественных новообразований кожи, распространенного псориаза и уровнем клеточной пролиферации и экспрессией периферического бензодиазепинового рецептора в коже с целью установления этиопатогенетической роли периферического бензодиазепинового рецептора и определения новых диагностических маркеров выраженности патологического процесса при данных заболеваниях

Задачи исследования

1 Провести клинико-статистический анализ заболеваемости онкологическими заболеваниями кожи на территории Красноярского края

2 Определить интенсивность клеточной пролиферации и апоптоза, экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора у больных с различными клиническими формами базально-клеточной карциномы, плоскоклеточного рака кожи, меланомы кожи, при распространенном псориазе, а также исследовать зависимость между интенсивностью экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и клеточной пролиферацией и апоптозом

3 Выявить изменения экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора, клеточной пролиферации и апоптоза в нормальных и опухолевых клетках кожи после ультрафиолетового облучения

4 Выявить эффект лиганда периферического бензодиазепинового рецептора РКП 195 на экспрессию периферического бензодиазепинового рецептора и уровень клеточной пролиферации в нормальных и опухолевых клетках, а также определить уровень эндогенного лиганда периферического бензодиазепинового рецептора БВ1 в нормальных и опухолевых клетках кожи

5 Определить уровень экспрессии цитохрома Р450всс в нормальных и опухолевых клетках кожи и оценить особенности экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и конформационные взаимоотношения между периферическим бензодиазепиновым рецептором и цитохромом Р450зсс в ПБР-трансфектированных клетках кожи

6 Оценить вклад изменений функциональной активности и конформационной стабильности периферического бензодиазепинового рецептора в патогенез злокачественных заболеваний кожи и патогенетически обосновать использование лигандов периферического бензодиазепинового рецептора в терапии злокачественных новообразований кожи

Научная новизна

В данной работе впервые проведен развернутый эпидемиологический и статистический анализ заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи на территории Красноярского края Выявлены регионы края с высоким уровнем заболеваемости данной патологией Определены особенности распределения заболевших по возрасту и полу, оценены уровни смертности от злокачественных новообразований кожи

Впервые исследованы особенности экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора при распространенном псориазе в различные стадии заболевания Впервые определена корреляционная связь между уровнем экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и интенсивностью клеточной пролиферации опухолевых клеток при базально-клеточной карциноме Впервые исследовано изменение экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в клетках кожи при воздействии УФО, а также выявлена связь данных изменений с интенсивностью клеточной пролиферации и апоптоза в нормальных и малигнизированных клетках кожи. Впервые показана экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора в нормальных меланоцитах Впервые обнаружены конформационные изменения периферического бензодиазепинового рецептора в нормальных и опухолевых клетках кожи при воздействии УФО, коррелируемые с уровнем клеточной пролиферации Впервые обнаружен феномен деполимеризации рецептора, индуцируемый воздействием УФО Впервые выявлен модулирующий эффект синтетического лиганда периферического бензодиазепинового рецептора РКП 195 на степень экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и уровень клеточной пролиферации в нормальных и опухолевых клетках кожи

Впервые проведен сравнительный анализ уровня эндогенного лиганда периферического бензодиазепинового рецептора и экспрессии цитохрома Р450зсс в нормальных и опухолевых клетках кожи Впервые показано снижение экспрессии цитохрома Р450зсс при малигнизации опухолевых клеток Впервые произведена трансфекция ПЕР-ОБР (зеленый флуоресцентный белок) в клетки меланомы и плоскоклеточного рака кожи и осуществлена попытка определения пространственных взаимоотношений между периферическим бензодиазепиновым рецептором и цитохромом Р450зсс

Научно-практическая значимость работы

Проведенный клинико-статистический анализ заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи позволил определить тенденции и особенности заболеваемости на территории Красноярского края Были определены регионы края с наиболее высокими показателями уровня заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи

Полученные экспериментальные данные указывают на участие периферического бензодиазепинового рецептора в функционировании нормальной кожи, а также в развитии злокачественных заболеваний кожи Подтверждена патогенетическая роль периферического бензодиазепинового рецептора в развитии заболеваний кожи, связанных с нарушениями клеточной пролиферации Выявленная корреляционная связь между уровнем экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и интенсивностью клеточной пролиферации указывает на возможность использования периферического бензодиазепинового рецептора в качестве маркера выраженности пролиферативных процессов в опухолевых клетках базально-клеточной

карциноме, что может применяться для оценки биологического поведения опухоли и возможности появления рецидивов

Определение модулирующего эффекта лиганда периферического бензодиазепинового рецептора на показатели клеточной пролиферации и апоптоза в клетках кожи позволяет рассматривать применение лигандов периферического бензодиазепинового рецептора как возможный новый подход к терапии заболеваний кожи с нарушением интенсивности клеточной пролиферации

Установленное снижение уровня цитохрома Р450зсс в злокачественных клетках кожи свидетельствует о снижении локального стероидогенеза в коже при развитии злокачественных заболеваний, что может быть применено для формирования новых принципов терапии опухолевых заболеваний кожи Помимо этого, снижение экспрессии Р450бсс может использоваться в качестве маркера развития онкологического процесса в коже Положения, выносимые на защиту

1 В Красноярском крае в период с 1999 по 2005гг отмечается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи, статистически значимое увеличение роста заболеваемости регистрируется в южных, центральных и западных, в лесосибирской группе районов регионах края

2 При злокачественных новообразованиях кожи происходит снижение уровня апоптоза и повышение интенсивности пролиферации в опухолевых клетках кожи при базально-клеточной карциноме, плоскоклеточном раке кожи и меланоме кожи, что сопровождается снижением экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора, при распространенном псориазе происходит снижение уровня периферического бензодиазепинового рецептора в стадию регресса заболевания

3 УФО обладает способностью модулировать экспрессию периферического бензодиазепинового рецептора, изменять соотношение уровня мономеров и полимеров рецептора в клетках, вызывать не только полимеризацию, но и деполимеризацию рецептора в клетках кожи

4 Синтетический лиганд периферического бензодиазепинового рецептора РКП 195 влияет на уровень экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и вызывает однонаправленное изменение интенсивности клеточной пролиферации в нормальных и опухолевых клетках кожи

5 В опухолевых клетках кожи происходит снижение уровня экспрессии цитохрома Р450зсс и эндогенного лиганда периферического бензодиазепинового рецептора - ингибитора связывания диазепама

Внедрение результатов исследования

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в практику КГУЗ «Краевой онкологический диспансер», КГУЗ

«Красноярское краевое патологоанатомическое бюро», ООО "Лаборатория иммунохимических методов исследования", внедрены в учебный процесс Сибирского государственного медицинского университета (кафедра фундаментальных основ клинической медицины), Амурской государственной медицинской академии (кафедра биохимии), Красноярской государственной медицинской академии (кафедра кожных и венерических болезней, кафедра патологической анатомии, кафедра биохимии с курсом медицинской химии) Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на IX, X, XI, XII Международных российско-японских симпозиумах (Канадзава, 2001, Якутск, 2003, Ниигата 2004, Красноярск, 2005), заседании Красноярского краевого общества дерматовенерологов (2000), научно-практической конференции "Современные аспекты биологии и медицины" (Томск, 2002), заседании кафедры биохимии с курсом медицинской химии Красноярской государственной медицинской академии (2002), краевых конференциях дерматовенерологов «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (Красноярск, 2003, 2004, 2005, 2006), совместном заседании проблемных комиссий «Теоретические проблемы медицины» и «Кожные и венерические болезни» Красноярской государственной медицинской академии (2003, 2007), краевой научно-практической конференции «60 лет онкологической службе Красноярского края» (Красноярск, 2005), заседаниях кафедр биохимии, дерматологии университета Джорджтаун (Вашингтон, США, 2005), областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы

дерматовенерологии» (Иркутск, 2006), XI Сибирской научно-практической конференции с международным участием «Дерматовенерология наука и практика» (Новосибирск, 2007), 16-м международном конгрессе европейской академии дерматовенерологов (Вена, 2007), II региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2007)

Выполненная работа поддержана грантом фонда Boehrmger Ingelheim для фундаментальных биомедицинских исследований (2004г), грантами Красноярского краевого фонда науки (2005,2006,2007гг.) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ, в том числе 8 в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования статей, содержащих результаты диссертационных исследований, 3 учебно-методических пособия

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 247 страницах текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы Работа содержит 82 рисунка, 43 таблицы Библиографический список включает 411 источников, из которых 42 отечественных и 369 иностранных авторов

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе представлены данные наблюдения за больными с диагнозом базально-клеточная карцинома кожи, плоскоклеточный рак кожи и

меланома кожи, проходивших лечение в Красноярском краевом онкологическом диспансере, больными с диагнозом вульгарный псориаз, а также результаты исследований, проведенные с участием здоровых добровольцев, составивших контрольную группу, соответствующих по возрасту и полу

Выделены следующие группы пациентов и контрольная группа

• группа 1 - контрольная группа (п=9),

• группа 2 - больные базально-клеточной карциномой (п=139),

• группа 3 - больные плоскоклеточным раком кожи (п=31),

• группа 4 - больные злокачественной меланомой кожи (п=34),

• группа 5 - больные с распространенным псориазом с длительностью заболевания до 10 лет (п=95) подгруппа 5 1 - больные в стадию прогрессирования заболевания, подгруппа 5 2- больные в стадию регресса,

• группа 6 - больные с распространенным псориазом с длительностью заболевания от 11 до 20 лет (п=95) подгруппа 6 1 - больные в стадию прогрессирования заболевания, подгруппа 6 2 - больные в стадию регресса,

Клинико-статистические, биохимические, морфологические,

молекулярно-биологические, культуральные исследования проводились в Краевом государственном учреждении здравоохранения «Красноярский краевой онкологический диспансер», в Краевом государственном учреждении здравоохранения «Красноярский краевой кожновенерологический диспансер», на кафедре биохимии, морфологической и биохимической межкафедральных лабораториях ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», на кафедре биохимии и молекулярной биологии университета Джорджтаун (г Вашингтон, США)

Клинический метод исследования пациентов заключался в общеклиническом осмотре пациентов с дерматозом Производилось изучение анамнеза, где учитывались длительность существования образования до обращения к врачу, профессиональный маршрут, наследственность, перенесенные ранее и хронические заболевания, район проживания

При выполнении эпидемиологического исследования оценивались заболеваемость онкологическими заболеваниями различных районов на территории Красноярского края, уровень смертности, распределение заболевших и впервые поставленных на учет по возрасту, полу, месту проживания, диагнозу онкологического заболевания кожи [Юрьев В К, 2000] Морфологические методы исследования

Биоптаты кожи фиксировались в 10% нейтральном забуференном формалине с последующей заливкой в парафин В дальнейшем изготавливались гистологические срезы толщиной 5 мкм Производилась окраска гематоксилином и эозином Оценивались общая структура ткани и первичные морфологические изменения

Иммуногистохимическое исследование проводилось по стандартным протоколам [Brown D, 1996] Осуществлялась демаскировка антигена с помощью системы Retrievagen (Novocastra) Гистологические срезы инкубировались с моноклональными антителами к ПБР (любезно предоставлены профессором В Пападопоулосом (университет Джорджтаун, США) в разведении 1 200, PCNA (1 200, Novocastra), каспазе-3 (1 75, Novocastra) Для визуализации комплекса антиген-антитело использовались система детекции Ready-to-Use (Novocastra) и диаминобензидин (Novocastra) в качестве хромогена В дальнейшем срезы докрашивались гематоксилином Подсчет положительно окрашенных клеток производился при увеличении хбОО Оценивалось количество положительно окрашенных клеток на 100 опухолевых клеток, при исследованиях эпидермиса - на 100 клеток эпидермиса Иммуноцитохимическое исследование проводилось с клеточными культурами NHEK, НЕМ, А431, SK-MEL-2 При достижении 70-80% плотности клетки пересевались на стекла Super Cell Culture Slides (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), после чего инкубировались в течение 24 часов В дальнейшем среда удалялась, клетки фиксировались в 10% формалине в течение 10 минут, затем производилась инкубация в течение 3 часов при комнатной температуре с антителами к ПБР в разведении 1 200 [Li Н, 2001] или к цитохрому P450SCc в разведении 1 300 [Black S М, 1993] После промывки в фосфатно-солевом растворе осуществлялась инкубация с вторичными антителами, меченными FITC (для антител к ПБР) и Texas Red (для антител к цитохрому P450scc) (Zymed Laboratories, Inc) При микроскопии оценивалось количество положительных клеток на 100 клеток Культивирование клеток

Нормальные кератиноциты (клеточная линия NHEK, Clonetics) культивировались в среде KGM-2 (Clonetics) с добавлением эпинефрина, эпидермального фактора роста, инсулина, трансферрина, гентамицина, амфотерицина В, гидрокортизона и бычьего питуитарного экстракта

Нормальные меланоциты (НЕМ, Cascade biologies) культивировались в Medium 254 (Cascade biologies), содержащей бычий питуитарный экстракт, фетальную бычью сыворотку, бычий инсулин, бычий трансферрин, основной фактор роста фибробластов, гидрокортизон, гепарин и ацетат форболмиристата

Клетки плоскоклеточного рака кожи (клеточная линия А431, АТСС) и клетки злокачественной меланомы кожи (SK-MEL-2, АТСС) культивировались в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Cellgro, Mediatech Inc), обогащенной 10% раствором фетальной бычьей сыворотки, глютамином, пируватом натрия и глюкозой

Все клеточные культуры инкубировались при 37е в кислородной смеси с 5% содержанием С02

Клетки выращивались до 70-80% плотности, после чего подвергались трипсинизации с последующим пересеванием культур в чашки Петри На следующий день клетки подвергались ультрафиолетовому облучению с помощью источника ультрафиолетового света с пиком длины волны в

диапазоне 302 нм (модель UVM-57 (San Gabriel) с фильтором Kodacel (Eastman Kodak Со) Время облучения 30 секунд соответствовало дозе 120 Дж/м2, 60 секунд - 240 Дж/м2,90 секунд - 360 Дж/м2,120 секунд - 480 Дж/м2 Иммуноблоттинг

Клетки трипсинизировались, переносились в лизирующий буфер В последующем белки после проведения электрофореза переносились на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher&Schuell) Блокирование мембраны производилось в течение 1 часа при комнатной температуре в буфере, содержащем 20мМ Tris-HCl, рН 7,5, 0,5 М NaCl и 0,05% твин-20, а также 5% раствор обезжиренного сухого молока После этого производилась инкубация с антителами к ПБР (1 2000), PCNA (1 200, Santa Cruz Biotechnology, Inc) и каспазе-3 (1 1000, Biomol International) Мембраны промывались в моющем буфере трижды по 10 минут Инкубация со вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена (1 5000, Transduction Laboratories, Lexington, KY) составляла 1 час при комнатной температуре Визуализация комплекса антиген-антитело производилась с помощью ECL (Amersham Biosciences) Для подтверждения содержания равного количества белка в каждом образце, мембраны повторно инкубировались с анти - G3PDH моноклональными антителами (1 10000, Trevigen) Трансфекция и конфокальная микроскопия

ПБР-GFP был создан в лаборатории проф В Пападопоулоса (университет Джорджтаун, г Вашингтон, США) Клетки меланомы и плоскоклеточного рака кожи выращивались до 90% плотности Трансфекция ПБР- GFP выполнялась с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) согласно инструкции производителя Эффективность трансфекции оценивалась с помощью флюоресцентной микроскопии через 2-3 дня Далее клетки инкубировались с моноклональными антителами к цитохрому P450Scc в разведении 1 300 После промывки в фосфатно-солевом растворе осуществлялась инкубация с вторичными антителами, меченными Texas Red (Zymed Laboratoi ies, Inc) С целью установления возможной взаимной пространственной локализации ПБР и цитохром P450SCc применялось исследование с помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа Olympus IX-70

Статистическая обработка результатов

Для оценки достоверности результатов эпидемиологического исследования проводилось определение средней ошибки показателей и средней ошибки разности показателей [Мерков А М, 1962] (проверка по критерию Фишера дала аналогичные результаты [Гланц С , 1998])

Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований проводилась с использованием t-критерия Стьюдента, Т критерия Манна-Уитни, Q критерия Данна для непараметрических множественных сравнений, W критерия Уилкоксона для сравнения наблюдений до и после лечения, коэффициента ранговой корреляции Спирмена, Н критерия Крускала-Уоллиса для сравнения нескольких групп [Гланц С, 1998] Выборочные параметры, приводимые в таблицах, имеют следующие обозначения- М - среднее, s -

стандартное отклонение, Ш - ошибка среднего, а - достигнутый уровень значимости, п - объем анализируемой подгруппы,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи в Красноярском крае

В Красноярском крае злокачественные новообразования кожи находятся на третьем месте среди онкологических заболеваний мужчин и на втором среди онкологических заболеваний женщин (7,6% и 12% соответственно среди всех выявляемых злокачественных новообразований). В 1999г. заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи составляла 16,4 на 100 тыс. населения, в 2005г. - 27,1. За период с 1999 по 2005гг. заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи увеличилась в 1,7 раза (Рис. I, табл.1)

Рис.1. Заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи населения Красноярского края за период 1999-2005 гг.,

* - достоверность различий по отношению к показателю (999г., а=0.01

Заболеваемость онкологическими заболеваниями кожи среди лиц женского пола выше, чем среди мужского. За исследуемый период заболеваемость онкологическими заболеваниями кожи среди мужского населения края выросла в 1,6 раз, среди женского - в 1,7 раза. Анализируя уровень заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи по административно-территориальным районам Красноярского края, отмечается, что статистически значимое увеличение заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи за исследуемый период произошло в центральных, южных и западных регионах и в лесосибирской группе районов Красноярского края (Табл. 2).

Таблица 1

Заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи населения _Красноярского края за период 1999-2005гг _

Общая Заболеваемость Заболеваемость

заболеваемость, мужского женского

М±ш населения, населения,

М±т М±ш

1999г 16,4±1 46 13,7±1,93 19±2,18

2000г 20,8±1 65* 16,5±2,13 24,7±2,49*

2001г 19,2±1,59* 16,5±2,14 21,8±2,35

2002г 21,3±1,68* 15,8±2,10 26,3±2,58*

2003г 21,2±1,68* 16,6±2,16** 25,4±2,54*

2004г 26,1±1,88* 21,6±2,50* 30,2±2,78*

2005г 27,1±1,92* 21,6±2,51* 32±2,69*

* - достоверность различий по отношению к показателю 1999г, а=0 01, ** - достоверность различий по отношению к показателю 1999г, а=0 05

Таблица 2

Заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи в регионах Красноярского края

Репион края Заболеваемость ЗНК 1999г,М±т Заболеваемость ЗНК 2005г, М±т

Красноярск 26,2±3,5 25,9±3,4

Таймырский автономный округ 4,5±6,3 15,2±6,2

Эвенкийский автономный округ 5,1±10,3 28,6±25,5

Центральная группа районов 16,9±2,1 32,5±6,1**

Южная группа районов 28,0±6,3 38,0±7,6 *

Восточная группа районов 21,6±5,4 18,3±5,2

Западная группа районов 14,7±3,7 24,2±4,9**

Норильская группа районов 7,2±3,2 11,1±4,3

Богучанская группа районов 12,7±7,0 23,4±9,0

Лесосибирская группа районов 7,4±4,1 18,9±7,0**

* - статистически значимые различия с показателем 1999г, а=0,05, ** - статистически значимые различия с показателем 1999т, а=0,01

Заболеваемость меланомой кожи с 1999 по 2005гг. выросла в среднем с 2,6 до 4,4 на 100 гыс. населения, при этом среди мужчин - с 2,2 до 4,1 {увеличилась в 1,9 раз), среди женского населения — с 2,9 до 4,7 (увеличилась в 1,6 раз) (Рис.2, табл. 3). Среди мужского населения статистически значимое увеличение заболеваемости меланомой кожи по сравнению с 1999г. произошло только в 2005г. Среди женского населения отмечается неуклонный рост заболеваемости за весь исследуемый период.

___________

- , шш

. »

2j6

3.7

äi

3.7

3.2

5.2

3.6

4.4

ЯШ

а 1339 О года П20Й1 пШ7 агиоз П2004 О 2005

Рис. 2. Динамика заболеваемости меланомой кожи населения Красноярского края за период 1999-2005 гг.,

* - достоверность различий по отношению к показателю 1999г., а:=0.01, ** - достоверность различий по отношению к показателю 1999г., а=0,05

Таблица 3

Заболеваемость меланомой кожи населения Красноярского края за период

1999-200 5гг.

Общая заболеваемость, Mim Заболеваемость мужского населения, М=т Заболеваемость женского населения, Mim

1999г. 2,б±0,58 2,2±0,77 2,9±0„85

2000г. 3,7±0,69** 3,4±0,97 4+1.00*

2001г. 3,7=0,69** 2,6^0,85 4,7±1,09*

2002г. 3,2±0,65 2,2=0,78 4,1=1,02*

2Ü03r. 3,2±0,65 £4:0,75 4,3 ±1,05*

2004г. 3,6±0J0** 2,8±0,90 4,2±1,04*

2005г. 4,4гН}.781* 4,1±1,09* 4,7±1,00*

* - достоверность различий по отношению к показателю 1999г., а=0,01, ** - достоверность различий по отношению к показателю 1999г., а=0.05

Заболеваемость другими злокачественными новообразованиями кожи с 1999 по 2005гг увеличилась с 16,5 до 22,7 среди мужчин - с 13,7 до 17,6, среди женского населения - с 19 до 27,3 (Рис 3, табл 4)

меланому кожи) населения Красноярского края за период 1999-2005 гг, * - достоверность различий по отношению к показателю 1999г, а=0 01

Таблица 4

Заболеваемость другими злокачественными новообразованиями кожи (исключая меланому кожи) населения Красноярского края за период 1999'

2005гг

Общая Заболеваемость Заболеваемость

заболеваемость, мужского женского

М±т населения, населения,

М±т М±ш

1999г 16,5±1,46 13,7±1,93 19±2,18

2000г 20,8±1,65* 16,5±2,13 24,7±2,49

2001г 19,3±1,60* 16,5±2,14 21,8±2,35**

2002г 21,3±1,68* 15,8±2,10 26,3±2,58*

2003г 21,2±1,68* 16,6±2,16** 25,4±2,54*

2004г 22,6±1,75* 18,6±2,32* 25,9±2,58*

2005г 22,7±1,76* 17,6±2,27** 27,3±2,65*

* - достоверность различий по отношению к показателю 1999г, а=0 01, ** - достоверность различий по отношению к показателю 1999г., а=0 05

Статистически значимых изменений показателей смертности от злокачественных новообразований кожи за исследуемый период определено не было (Табл 5)

Таблица 5

Смертность населения Красноярского края от злокачественных _новообразований кожи за период 1999-2005гг_

Смертность от меланомы кожи, М±ш Смертность от других злокачественных новообразований кожи, исключая меланому кожи, М±т

1999г 1,80±0,48 1,60±0,46

2000г 1,38±0,43 1,28±0,40

2001г 1,78±0,49 1,09±0,38

2002г 1,86±0,50 1,23±0,40

2003г 1,67±0,47 1,17±0,40

2004г 1,84±0,50 0,85±0,34

2005г 1,80±1,50 1,00±0,37

* - достоверность различий по отношению к показателю 1999г, а=0 01, ** - достоверность различий по отношению к показателю 1999г, а=0 05

В целом, анализ статистических показателей эпидемиологии злокачественными новообразованиями кожи позволяет сделать выводы а) отмечается ежегодный рост уровня заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи в Красноярском крае, что требует особого комплекса мероприятий по профилактике и ранней диагностике данной патологии в регионе,

в) заболеваемость среди лиц женского пола выше, чем среди лиц мужского пола,

г) рост заболеваемости регистрируется в центральных, южных, западных регионах Красноярского края, в лесосибирской группе районов,

г) в течение исследуемого периода определяется ежегодное статистически значимое увеличение заболеваемости меланомой кожи среди лиц женского пола

Клиническая характеристика больных с базально-клеточной карциномой, плоскоклеточным раком кожи, злокачественной меланомой кожи и распространенным псориазом

С целью изучения особенностей клинических проявлений, анализу были подвергнуты 204 пациента с базально-клеточной карциномой, плоскоклеточным раком кожи и меланомой кожи, 180 пациентов с распространенным псориазом Число больных с базально-клеточной карциномой кожи составило 139 человек, из них 52 человека - лица мужского пола, 87 - женского Средний возраст больных составил 62 года, средний возраст мужчин составлял 61 год, женщин - 62 года В 90% случаев опухоль представляла собой единичное образование, которое у 84% больных имело

локализацию на лице, волосистой части головы и шее, у 15,3% - в области туловища, и менее чем в 1% случаев - на конечностях Множественные опухоли отмечались у 10 % больных, при этом из них в 60% больных местом локализации были лицо, волосистая часть головы и шея, у 40% больных -область туловища При анализе распределения локализации образований среди лиц мужского пола базально-клеточный рак в области головы, шеи определялся в 37,3% больных, в области туловища - 13,6% больных, в области конечностей - у 0 8% больных, среди лиц женского пола - 45,8%, 2 5% и 0 соответственно Статистически значимыми между лицами мужского и женского пола были различия в частоте локализации образования в облает туловища (а=0 05)

При анализе локализации образований было определено преимущественное расположение опухоли в области головы При этом в области головы и шеи наиболее часто опухоли обнаруживались в области лба (12,1%), спинки носа (12,1%), волосистой части головы (11,1%) У 3% больных образование возникло на фоне невуса сальных желез Распределение по клиническим формам базально-клеточной карциномы производилось в соответствии с клинической классификацией [Снарская, Е С, 2003] Отмечалось превалирование нодулярной формы (81,8%), при которой наиболее часто определялись микронодулярный (30,1%) и пигментный (22,6) варианты

Группа пациентов с инфильтрирующим плоскоклеточным раком кожи составляла 34 человека, из них 21 человек - мужчины, 13 человек - женщины Средний возраст больных составлял 66 лет, среди мужчин средний возраст был 64 года, среди женщин 71 год Опухоль представляла собой единичное образование, с локализацией у 89,5% пациентов в области лица и шеи, у 5,3% пациентов - в области туловища и у 5,2% пациентов в области конечностей Определялось статистически значимое превалирование лиц мужского пола среди пациентов с локализацией опухоли в области нижней губы - 67% из всех случаев плоскоклеточного рака с данной локализацией (а=0 05)

Число больных со злокачественной меланомой кожи составляло 31 человек, из которых 13 человек были женщины, 18 - мужчины Средний возраст больных был 59 лет, средний возраст мужчин - 55 лет, женщин - 64 года При анализе локализаций образования было обнаружено, что у 67% пациентов опухоль располагалась в области туловища, у 22% - в области лица и волосистой части головы, у 11% - на конечностях Было выявлено

превалирование лиц мужского пола (74%, <х=0 05) среди пациентов с локализацией меланомы кожи в области туловища Среди клинических разновидностей наиболее часто встречалась поверхностно распространяющаяся меланома кожи

Средний возраст пациентов с распространенным псориазом составил 34,2 года 14% больных указывали на наличие псориаза у близких родственников У 11% больных регистрировалось поражение опорно-двигательного аппарата, заболевания желудочно-кишечного тракта встречались у 20% больных У 68% больных обострения возникали в осенне-зимнее время, 34% больных отмечали возникновение высыпаний после эмоционального стресса

Оценка интенсивности клеточной пролиферации и а по птоза у больных со злокачественными новообразованиями кожи; экспрессия PCNA и каспазы-3 в коже

Маркер клеточной пролиферации PCNA в эпидермисе нормальной кожи определялся преимущественно в ядрах клеток базального слоя (Рис.4, 5). Уровень экспрессии PCNA в нормальном эпидермисе составлял 9 положительно окрашенных клеток на 100 клеток эпидермиса. При базалъно-клеточном раке кожи статистически значимое увеличение экспрессии PCNA определялось при склеродермоподобной и поверхностной клинических формах опухоли (Табл. 6), При анализе распределения антигена в опухолевой ткани различных морфологических вариантов опухоли, было обнаружено статистически значимое увеличение уровня PCNA при всех морфологических типах опухоли, кроме пигментного и аденоидного (Табл. 7).

Таблица 6

Уровни экспрессии PCNA и каспазы-3 у больных с различными клиническими формами б аз аль н о-к лето11Н о го рака кожи

PCNAT клетки. % каспаза-3 ' клетки, %

Контроль, п=8 8,97 19

Популярная форма, п=14 11 0,15*

Склеродермоподобная форма, п=8 14** 0,9*

Поверхностная форма, п=10 1.1*

* - достоверно по отношению к контролю, (а=0,01); ** - достоверно по отношению к контролю, (а=0,05).

Рис.4. Экспрессия РСТСА в нормальном эпидермисе: ядро РСКА~ клетки окрашено в темный цвет (указано стрелкой). Ув. хбОО.

Рис.5. Экспрессия PCNA в клетках базально-клеточного рака, солидной формы. Ув. х200.

Экспрессия РСЫА в опухолевых комплексах при плоско клеточном раке кожи была ниже чем в контроле, гомогенной, равномерно выраженной на всем протяжении опухолевого очага (Табл, 8. рис. 6\ 7). В опухолевых о тагах при меланоме кожи РСЫА определялся в ядрах атипичных клеток (Рис. 8), Однако при этом интенсивность экспрессии РСЫА в образцах сильно варьировала, достоверными различия в экспрессии РСМА были обнаружены только между контролем и меланомой IV уровня инвазии по Кларку (Табл. 9).

Таблица7

Уровни экспрессии РС^ГА. каспазы-З в нормальной коже и у больных с различными морфологическими типами б аз алы Ю-клеточной карциномы

РСКА' клетки, % каспаза-3 клетки, %

Контроль, п=8 8.97 19

Солидный тип, п=11 27,8** 0,2*

С кл ер о дер м о п о до бнь!Й тип, п=б 31,32** 1,3*

Поверхностный тип, п=7 49* 0*

Аденоидный тип, 25 0,35*

Шшоидкый тип, п=5 21** 0,05*

Пигментный тип, п=6 0.6 0*

* - достоверно по отношению к контролю, (а=0,01); ** - достоверно по отношению к контролю, (а=0,05).

Рис. 6. Экспрессия РС^ в клетках илоскоклеточного рака кожи. Ув, х200.

Рис. 7. Экспрессия PCNЛ в клетках плоско клеточного рака кожи, гот же препарат, Ув. хбОО,

Каспаза-3, маркер ап о птоз а, в клетках эпидермиса нормальной кожи определялась в базальном слое эпидермиса, в цитоплазме клеток. Уровень каспазы-З в нормальном эпидермисе составил 19 клеток на 100 клеток эпидермиса.

Рис. 8,

В опухолевой ткани каспаза-3 не определялась при поверхностном и пигментном типах опухоли. При остальных морфологических типах опухоли экспрессия каспазы-З определялась незначительно и была достоверно ниже, чем в контрольной группе (Табл. 7). Не было выявлено закономерностей в распределении апоптотических клеток: клетки, зкопре сси ру ю Шие каспазу-3, определились по периферии опухолевых комплексов, в других случаях — в толще опухолевого очага. При плоскоклеточном раке кожи в опухолевой ткани фермент практически не определялся: отмечались единичные слабо окрашенные клетки. Не было выявлено различий между различными клиническими формами плоско клеточного рака кожи (Табл. &). Единичные слабоположительные клетки с экспрессией каспазы-3 определялись в базальном слое эпидермиса при злокачественной мела номе кожи, в опухолевых клетках. Уровень экспрессии каспазы-3 в опухолевой ткани 0.95 {Табл. 9).

Таким образом, при злокачественных новообразованиях кожи происходит изменение соотношения уровней клеточной пролиферации и а по птоз а, характерное для всех онкологических заболеваний: увеличение пула про лиф е рирующих клеток и снижение интенсивности запрограммированной клеточной гибели.

Исследование динамики роста опухолей применяется для повышения эффективности противоопухолевой терапии [Михнин А.Е., 2004]. Известно, что

Экспрессия РСЫА при меланоме кожи. Ув. х200.

апоптозный и митотический индексы, их соотношение разнятся при различных видах злокачественных новообразований Было обнаружено, что в начальных стадиях роста опухоли уровень апоптотических клеток повышается и количественно достигает уровня клеточной пролиферации, а затем снижается до постоянной величины [Лушников Е Ф., 2001] Таким образом, выраженное преобладание делящихся клеток над апоптотическими, выявленное в трех типах злокачественных новообразований кожи при иммуногистохимическом исследовании, может являться косвенным признаком длительного существования данных опухолей у всех пациентов, принимавших участие в исследовании

Знание кинетики опухолевого роста необходимо для формирования новых терапевтических подходов и динамической оценки эффективности проводимой терапии, а также предотвращения развития рецидивов

Таблица 8

Уровни экспрессии РСЫА, каспазы-3 у больных с инфильтрирующим _плоскоклеточным раком кожи__

РСЫА+ клетки, % каспаза-3+ клетки, %

Контроль, п=8 9 19

Опухолевый тип, п=8 63* 0,4*

Язвенный тип, п=8 74 0*

* - достоверно по отношению к контролю, (а=0,01)

Таблица 9

Уровни экспрессии РСИА и каспазы-3 у больных с различными стадиями

меланомы кожи

РСЫА+ клетки, % каспаза-3+ клетки, %

Контроль, п=8 9 19

I уровень инвазии по Кларку - -

II уровень инвазии по Кларку, п=7 43 0,2*

III уровень инвазии по Кларку, п=8 5,5 0*

IV уровень инвазии по Кларку, п=8 21,8** 0,8*

V уровень инвазии по Кларку, п=8 27 1,1*

* - достоверно по отношению к контролю, (а=0,01),** - достоверно по отношению к контролю, (а=0,05)

Экспрессия периферического беизодиазепинового рецептора в коже больных с базально-клеточной карциномой, плоскоклеточным раком и злокачественной меланомой кожи

В нормальной коже экспрессия ПБР отмечалась в эпидермисе, гомогенно во всех слоях эпидермиса, с нуклеарной, перинуклеарной локализацией (Рис 9) Помимо этого, ПБР экспрессировался в клетках сальных, потовых желез, в

сосочковом слое дермы. Интенсивность экспрессии составляла 92 ПБР" клетки на 100 клеток эпидермиса.

Рис.9. Экспрессия ПБР в эпидермисе нормальной кожи, Ув. хбОО.

В эпидермисе больных базалыто-клеточным раком кожи ПБР определялся в шиповатом и зернистом слоях эпидермиса, регистрировалось снижение уровня ПБР в клетках батального слоя. Сохранялась экспрессия рецептора в клетках волосяных фолликулов, сальных и потовых желез. При солидном типе базально-клеточной карциномы ПБР' клетки определялись повсеместно в опухолевой ткани, помимо этого с такой же интенсивностью в непораженном эпидермисе (Рис,10, 11). Подобный характер экспрессии рецептора отмечался при склеродермоподобном варианте б аз ал ьн о-клеточного рака. При базально-клеточной карциноме с аденоидной дифференцировкой экспрессия ПБР была ниже, чем я контроле, однако рецептор отчетливо визуализировался в опухолевых комплексах (Рис.12). Гомогенно экспрессировался рецептор при поверхностном типе базаль но-клеточного рака (Рис.13). Как и при окрашивании на РСТЧГА, при б аз ал ьн о-клеточном раке с пилоидной дифференцировкой Г1БР+ клетки определялись в незрелых волосяных фолликулах. Минимальный уровень ПБР регистрировался при пигментном типе опухоли, как в клетках эпидермиса, так и непосредственно в опухолевых очагах. При всех морфологических вариантах ПБР+ клетки определялись диффузно в опухолевых комплексах, при этом незначительной была экспрессия рецептора по периферии очагов в так называемых палисадоопразных клетках. В целом экспрессия ПБР была достоверно ниже в биоптатах кожи больных базально-клеточной карциномой (Табл.10, 11).

Обращает на себя внимание однонаправленное изменение степени выраженностн экспрессии ПБР и РСНА при различных морфологических типах БКК: низкий уровень данных белков при пигментной форме опухоли, более

высокий - при склеродермоподобной, поверхностной и пштоидной формах. Была выявлена положительная корреляция между уровнями экспрессии ПБР и PCNA(r=G,9Q, а-0,02).

Рис. 10. Базально-клеточная карцинома, солидная форма: экспрессия ПБР. Ув. х200

Рис. 11. Базально-клеточная карцинома, солидная форма, тот же препарат: экспрессия ПБР. Ув. хбОО.

Рис. 12. Базально-клеточная карцинома, аденоидная форма: экспрессия ПБР. Ув. х200

Рис, 13. Базально-клеточная карцинома, поверхностная форма: экспрессия ПБР, Ув, х200.

Таблица 10

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора у больных с различными клиническими формами базально-клеточного рака кожи

ПБР+ клетки, %

Контроль, п=8 92

Нодулярная форма, п=14 43,7*

Склеродермоподобная форма, п=8 72,1*

Поверхностная форма, п=10 58,6*

* - достоверно по отношению к контролю, (а=0,01), уровень значимости различий между формами базальноклеточного ракау=0,1

Не было обнаружено достоверных различий между уровнем ПБР в нормальной коже и в опухолевых клетках плоскоклеточного рака, однако, при этом интенсивность окраски ПБР+ опухолевых клеток была значительно ниже, чем в контроле (Рис 14, 15, табл 12) При меланоме кожи в опухолевых клетках экспрессия ПБР была достоверно ниже показателей контрольной группы (Рис 16, 17, табл 13) Помимо этого, при плоскоклеточном раке кожи и при меланоме кожи регистрировалось снижение ПБР+ клеток в базальном слое эпидермиса Достоверных различий в уровне экспрессии рецептора при различных стадиях инвазии меланомы выявлено не было

Таблица 11

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора у больных с различными морфологическими вариантами базально-клеточной карциномы

ПБР+ клетки, %

Контроль 92

Солидный тип БКК, п=11 Опухолевая ткань 31,64*

Склеродермоподобный тип БКК, п=6 Опухолевая ткань 72,1*

Поверхностный тип БКК, п=7 Опухолевая ткань 58,8*

Аденоидный тип БКК, п=8 Опухолевая ткань 68,4*

Пилоидный тип БКК, п=5 Опухолевая ткань 36*

Пигментный тип БКК, п-6 Опухолевая ткань 6*

*- достоверные отличия по сравнению с контролем (а=0,01)

Таким образом, при злокачественных новообразованиях кожи отмечается снижение уровня ПБР, которое определяется как снижение количества ПБР+ клеток, так и как уменьшение интенсивности окраски ПБР+ клеток Уровень

экспрессии ПБР достоверно различается при различных морфологических вариантах базально-клеточного рака, в то время как при плоскоклеточном раке кожи и при различных стадиях инвазии злокачественной меланомы кожи этого не происходит При базально-клеточном раке кожи уровень ПБР коррелирует с уровнем РСЫА (г=0,90, а=0,02)

Рис 14 Экспрессия ПБР при Рис 15 Экспрессия ПБР при

плоскоклеточном раке кожи Ув х200 плоскоклеточном раке кожи, тот же

препарат Ув хбОО

Таблица 12

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора у больных _с инфильтрирующим плоскоклеточным раком кожи_

ПБР+ клетки, %

Контроль, п=8 92

Опухолевый тип, п=8 86,3

Язвенный тип, п=8 80

Таблица 13

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора у больных с различными стадиями меланомы кожи

ПБР+ клетки, %

Контроль, п=8 92

I уровень инвазии по Кларку -

II уровень инвазии по Кларку, п=7 28*

III уровень инвазии по Кларку, п=8 54,5*

IV уровень инвазии по Кларку, п=8 61*

V уровень инвазии по Кларку, п=8 55*

* - достоверно по отношению к контролю, (а=0,01)

Рис. 16. Экспрессия ПБР при злокачественной ме ладоме кожи, Ув. х200,

Рис, 17. Экспрессия ПБР при злокачественной меланоме кожи. У в. хбОО.

Полученные данные разнятся с многочисленными исследованиями экспрессйи ПБР в опухолевых тканях других органов Исходя из литературных источников известно, что только при новообразованиях надпочечников и печени наблюдался аналогичный феномен - снижение экспрессии ПБР в опухолевых клетках [Han Z., 2003].

Установлено, что регуляция уровня ПБР осуществляется преимущественно гормонами', прогестероном, АКТ Г [A.nui Н., 1999]. О роли гормонов в развитии опухолей кожи литературные данные немногочисленны и противоречивы. Однако известно, что прогестерон, гидрокортизон, гипофиза кто мия и гонадэктомия обладали способностью замедлять развитие базально-клеточного рака кожи [Снарская Е.С., 2003]. Поэтому возможно, что при опухолях кожи происходит снижение синтеза стероидных гормонов в коже, на что косвенно указывает снижение уровня ПБР. В таком случае объяснимо, почему применение прогестерона может замедлять рост б аз ал ьН о-клеточной карциномы,

С другой стороны, под действием ультрафиолетового излучения могут происходить полимеризация рецептора и изменение его функциональной активности при дальнейшей трансформации клеток кожи в опухолевые. В таком случае конформационные изменения рецептора могут приводить к нарушениям связывания рецептора с антителами, и как следствие, снижение уровня ПБР+ клеток, выявляемое при иммуногистохимическом анализе.

Экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора при распространенном псориазе

При распространенном псориазе снижение экспрессии ПБР происходило в стадию регрессирования заболевания. Не было отмечено достоверных различий между экспрессией ПБР у больных с длительностью заболевания по 10 лет и от 11 до 20 лет. (Табл. 14).

_J

Таблица 14

Экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора в эпидермисе у больных псориазом с различной длительностью заболевания в стадию прогрессирования и в стадию регресса

Стадия прогрессирования, п=8 Стадия регресса, п=8 Контрол ь, п=8

Длительность заболевания 0-10 лет 11-20 лет 0-10 лет 11-20 лет

ПБР+ клетки, % 98 90 13,8*' ** 36,3*'** 92

достоверность по сравнению с контролем * - а=0,05, достоверность по сравнению с показателями до лечения ** - а=0,05

Экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора в культурах клеток, в нормальных кератиноцитах, нормальных меланоцитах, клетках плоскоклеточного рака и меланомы кожи

Выявленные изменения показателей экспрессии ПБР в образцах кожи больных злокачественными новообразованиями кожи указывают на возможную роль ПБР в развитии данных заболеваний С целью изучения функциональной активности ПБР в клетках кожи было проведено исследование в четырех клеточных культурах ИНЕК (нормальные кератиноциты человека), НЕМ (нормальные меланоциты человека), А431 (клетки плоскоклеточного рака кожи), 8К-МЕЬ-2 (клетки меланомы кожи)

Осуществлялось иммуноцитохимическое исследование с целью определения уровня ПБР ПБР экспрессировался во всех тестируемых типах клеток Локализация рецептора была, как и в биоптатах кожи, нуклеарной и перинуклеарной (Рис 18, 19, 20, 21) При подсчете количества ПБР+ клеток на 100 клеток было выявлено достоверное снижение экспрессии рецептора в малигнизированных клетках (Табл 15), что подтверждает результаты, полученные при иммуногистохимическом исследовании биоптатов кожи

Таблица 15

Экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора в клетках кожи

Клеточная линия Количество ПБР+ клеток, М±э

ИНЕК (нормальные кератиноциты), п=350 77±7

НЕМ (нормальные меланоциты), п=400 82±10

А431 (плоскоклеточный рак кожи), п=Ю00 5,4±3*

8К-МЕЬ-2 (меланома кожи), п=1000 6±1**

* - достоверные отличия по сравнению с нормальными кератиноцитами (а=0,05), ** - достоверные отличия по сравнению с в нормальными меланоцитами (а=0,05)

Рис. 18. Экспрессия ПБР в нормальных Рис, 19. Экспрессия ПБР в нормальных

Рис. 20. Экспрессия ПБР в клетках Рис. 21. Экспрессия ПБР в клетках плоскоклеточного рака (ув. хбОО) меланомы кожи (ув. хбОО)

Экспрессии периферического бензодяазепннового рецептора, РСКА н касмазы-З в клетках кожи после ультрафиолетового облучення

С учетом того, что ПБР является фоточувствитсльньш белком, способным изменять свою функциональную активность под действием ультрафиолетового облучения [ре1ауо!е Р., 2003], было проведено исследование уровня экспрессии ПБР, а также РСКА И каспазы-3 в исследуемых типах клеток после воздействия на клетки ультрафиолетовым облучением в различных дозах. Облучение клеток кожи производилось источником УФО с длиной волны 302 иы. Данный вид излучения относится к ультрафиолетовым лучам типа В и был применен, поскольку именно лучи типа В обладают максимальным эффектом на клетки эпидермиса, модулируют функциональную активность кератин оцитов, меланоиитов, клеток Лангерганса [КгШшапп I., 1998].

В нормальных кератиноцитах УФВ индуцировало образование полимеров ПБР, максимально - в дозе 120 Дж/м2, а также снижение уровня

мономера рецептора (Табл 16) Подобный эффект УФО наблюдался в других типах клеток ранее [БЫаУош Б, 2003] В клетках плоскоклеточного рака кожи следует отметить незначительное изначальное присутствие мономера ПБР, что также соответствует данным о том, что в опухолевых клетках преобладают полимерные формы ПБР [Бе1аУ01е Б, 2003] Помимо этого, клетки плоскоклеточного рака кожи были значительно более резистентны к воздействию УФО только излучение в дозе 480 Дж/м2 обладало модулирующим эффектом на экспрессию ПБР и вызывало увеличение уровня димера и тримера (Табл 18)

Таким образом, нормальные и малигнизированные кератиноциты обладают различной чувствительностью к УФО, что определяется как различный характер экспрессии ПБР после воздействия

Уровень РСМА изменялся в нормальных кератиноцитах, как и в клетках плоскоклеточного рака кожи только при воздействии УФО в дозе 480 Дж/м2 (Табл 17, 19) Однако эффект УФО на нормальные и малигнизированные кератиноциты был разнонаправленным интенсивность клеточной пролиферации в нормальных клетках снижалась, в злокачественных — увеличивалась Помимо этого, в нормальных кератиноцитах не изменялся уровень активной формы каспазы-3, что говорит о том, что УФО в выбранных дозах не обладало апоптоз-индуцирующим действием на кератиноциты В клетках плоскоклеточного рака кожи происходило увеличение экспрессии РСЫА, каспазы-3, ее активной формы и профермента Таким образом, если нормальные кератиноциты в ответ на УФО снижают интенсивность пролиферации, но не гибнут, то в малигнизированных кератиноцитах увеличивается уровень и клеточной пролиферации, и апоптоза

Таблица 16

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в нормальных кератиноцитах после облучения ультрафиолетовым излучением в

дозах 120-480Дж/м2

Контроль, п=5 120Дж/м2, п=5 240Дж/м2, п=5 ЗбОДж/м2, п=5 480Дж/м2, п=5

18ГОа 0 27 0 2* 0 02** 0 14** 0 05**

36 кДа 1 7 2 87* 2 15* 2 15* 0 86*

54 кДа 0 14 0 24 0 39 0 39 0 86*

72 кДа 281 1 12 0 89* 2 3* 0 34*

90 кДа 0 64 001 0 33* 0 3* 0 2*

*- достоверные отличия по сравнению с контролем, (а=0,01),

** - достоверные отличия по сравнению с контролем, (а=0,05)

Таблица 17

Уровни РСМА и каспазы-3 в нормальных кератиноцитах после облучения ультрафиолетовым излучением в дозах 120-480Дж/м2

Контроль, п=5 120 Дж/м2, п=5 240Дж/м2, п=5 360Дж/м2, п=5 480Дж/м2, п=5

РСИА 1,41 1,13 2,21 1,86 1,02*

Профермент каспазы-3 4,82 2,15 3,6 1,45* 1,07*

Активная форма каспазы-3 0,06 0,09 0,22 0,08 0,05

* - достоверные отличия по сравнению с контролем, (а=0,01)

Таблица 18

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в клетках плоскоклеточного рака кожи после облучения ультрафиолетовым излучением в дозах 120-480Дж/м2

Контроль, п=5 120Дж/мг, п=5 240Дж/м2, п=5 360Дж/м2, п=5 480Дж/м2, п=5

18кБа 0,08 0,06 0,05 0,1 од

36 к Да 0,73 0,66 0,4 0,57 1,07*

54 кДа 0,17 0,51 0,55 0,42 1,1*

72 кДа - - - - -

90 кДа 0,08 0,13 0,13 0,07 0,09

* - достоверные отличия по сравнению с контролем (а=0,01)

Таблица 19

Уровни РСИА. каспазы-3 в клетках плоскоклеточного рака кожи после облучения ультрафиолетовым излучением в дозах 120-480Дж/м2

Контроль, п=5 120 Дж/м2, п=5 240Дж/м2, п=5 360Дж/м2, п=5 480Дж/м2, п=5

РОМА 0,67 0,68 0,21 0,35 1,23*

Профермент каспазы-3 1,13 0,82 1,09 0,84 2,13*

Активная форма каспазы-3 0,04 0,04 0,04 0,02 0,06*

* - достоверные отличия по сравнению с контролем, (а=0,01)

ПБР в нормальных меланоцитах определялся преимущественно в

виде димера Ультрафиолетовое облучение во всех дозах приводило к достоверному снижению уровня димера рецептора по сравнению с контролем, регистрировалось снижение экспрессии РСКА после ультрафиолетового

облучения Каспаза-3 в нормальных меланоцитах определялась только в виде профермента При облучении в дозах 120Дж/м2, 360Дж/м2, 480 Дж/м2 уровень профермента каспазы-3 оставался ниже контроля, при облучении в дозе 240Дж/м2 превышал контрольный уровень (Табл 20) Можно отметить, что в нормальных кератиноцитах и меланоцитах происходят похожие процессы при воздействии УФО, хотя некоторые авторы отмечают, что меланоциты обладают большей резистентностью к апоптозу по сравнению с кератиноцитами [ОПсЬгез! В А, 1999]

Таблица 20

Уровни периферического бензодиазепинового рецептора, РСИА, каспазы-3 в нормальных меланоцитах после облучения ультрафиолетовым излучением в

дозах 120-480Дж/м2

Контроль, п=5 120 Дж/м2, п=5 240Дж/м2, п=5 360Дж/м2, п=5 480Дж/м2, п=5

ПБР 0,34 0,26* 0,06* 0,12* 0,17*

Р(ЖА 1,94 0,73* 0,28* 0,18* 0,11*

Каспаза-3 0,09 0,04* 0,1* 0,05* 0,04*

* - достоверные отличия по сравнению с контролем (а=0,01)

Наиболее выраженные изменения после воздействия УФО происходили в клетках меланомы. В первую очередь, стоит отметить, что УФО, начиная с минимальной дозы - 120 Дж/м2, изменяло уровень ПБР, индуцировало образование полимеров Этот эффект определялся до увеличения дозы УФО до 480 Дж/м2, при воздействии которой происходила деполимеризация рецептора и образование мономеров вновь Снижение уровня полимеров сопровождалось снижением экспрессии РСЫА (Табл 21, 22, рис 22)

Таблица 21

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в клетках злокачественной меланомы кожи после облучения ультрафиолетовым излучением в дозах 120-480Дж/м2

Контроль, 120 Дж/м2, 240Дж/м2, 360Дж/м2, 480Дж/м2,

п=5 п=5 п=5 п=5 п=5

18Ша 0,035 0* 0* 0* 0,07

36 кДа 0,76 1,31* 1,73* 1,04* 0,24

54 кДа 0,8 1,6** 2,5* 1,2 0,24**

72 кДа - - - - -

90 кДа 0 0 0,03** 0,04** 0

*- достоверные отличия по сравнению с контролем (р<0,01), ** - достоверные отличия по сравнению с контролем (р<0,05)

Й Ш

V

¡тт ш

мр ШЩ ■■

к » л' - ■■ Я С

щ

¡11- ' ^ ^ ^ ■ ЭДЙ^г^НЩ^ ¿г

ИВ , * '« 1 шнЫм! ЧшИИ* ' :

ч ^ ж £ -I, '* ■ ,

-90 кДа

-54 кДа -36 кДа

<-18 кДа

v--.fr

РСЫА

профермент каспазы-3

активная форма каспазы-3

»».,,,*«».. ¿ъ-т

ОЗРБН

12 3 4 5 Рис. 22. Экспрессия ПБР, РСМА, каспазы-3 в клетках меланомы кожи после ультрафиолетового облучения; 1 - контроль, 2 - 120Дж/м2, 3 - 240Дж/м3, 4 -360Дж/мг, 5 -480 Дж/м2

Таблица 22

Уровни РСКА, каспазы-3 в клетках меланомы кожи после облучения ультрафиолетовым излучением в дозах 120-480 Дж/м1

Контроль, п=5 120 Дж/м1, 0=5 240Дж/мг. п=5 360Дж/м2, п=5 4 80Дж/м*, п=5

РСИА 0,85 1,12** 1,52* 0,67 0,25*

Профермент каспазы-3 0,27 0,75* 1,15* 0,51 0,1

Активная форма каспазы-3 0,05 0,07 0,15* 0,04 0,02

* - достоверно по отношению к контролю, (р<0,01), ** - достоверно по отношению к контролю, (р<0,05).

В данном исследовании впервые были получены данные о том, что УФО обладает двояким эффектом на структуру рецептора - может индуцировать образование полимеров, и наоборот, вызывать его деполимеризацию Ранее проводились многочисленные, но безуспешные попытки индуцировать деполимеризацию рецептора додецилсульфатом натрия, этанолом, различными хаотропными агентами [Delavoie F, 2003]

Известно, что конформационные изменения белковых молекул могут являться физиологическим событием в клетке, необходимым для нормального функционирования данного белка, и могут наблюдаться при патологических изменениях в клетках, В любом случае, конформационные перестройки белков отражаются на их свойствах [Клячко HJI, 2000, Dafforn T.R, 1999, Carrell R W, 2002]

Наличие полимеров ПБР описано различными группами исследователей и наблюдалось как в нормальных, так и в дефектных клетках [Doble А, 1985, Parola AL, 1989, Hardwick М, 1999, Delavoie F, 2003] Таким образом, вероятнее всего, полимеризация рецептора является физиологическим событием и должна быть сопряжена с определенными функциональными изменениями рецептора

Изменение уровня полимеров и мономеров ПБР происходило в нормальных кератиноцитах при воздействии УФО и имело однонаправленный характер с изменением экспрессии PCNA И если увеличение уровня полимеров сопровождалось повышением экспрессии PCNA, то при деполимеризации ПБР происходило резкое снижение пролиферации клеток, при этом интенсивность апоптоза не изменялась.

Возможно, что полимеризация-деполимеризация ПБР - это циклический процесс, который, судя по литературным данным, находится под контролем стероидных гормонов И если преобладание ПБР в виде полимеров сопровождается высокой пролиферативной активностью клеток, и, возможно, неопластической трансформацией клеток, то деполимеризация, вероятно, наоборот, связана со снижением интенсивности клеточной пролиферации В таком случае деполимеризация рецептора - вероятный патогенетический механизм и возможная терапевтическая цель при заболеваниях кожи, ассоциированных с увеличением пролиферации клеток В связи с этим стоит провести аналогию с актином, поскольку известно, что воздействие на клетки веществ, нарушающих полимеризацию или деполимеризацию актиновых филаментов, приводит к гибели этих клеток, что применяется в экспериментальных работах с целью индукции апоптоза в трансформированных клетках [Фаллер, Д М, 2003]

Немного известно о различиях в функционировании ПБР, к которым приводит образование его полимеров Существуют сообщения, что полимеры ПБР в меньшей степени связываются с холестерином, чем мономеры [Delavoie F, 2003] Исходя из этого, наблюдаемое повышение уровня полимеров в клетках плоскоклеточного рака и меланомы по сравнению с нормальными кератиноцитами и меланоцитами, должно сопровождаться снижением синтеза стероидных гормонов в коже при развитии данного вида опухоли. Изменение

уровня синтеза стероидных гормонов в коже, реализующих свои эффекты, вероятно, при помощи аутокринных и паракринных механизмов, может оказывать влияние на продукцию многих цитокинов в клетках кожи, взаимодействие с иммунокомпетентными клетками, вызывать изменение чувствительности к про- и антиапоптогенным стимулам или модулировать апоптоз непосредственно

Подводя итог данному этапу исследования, стоит резюмировать, что УФО вызывает изменения экспрессии ПБР как в нормальных клетках кожи, так и злокачественных Помимо этого, УФО оказывает выраженный эффект на структуру белка, индуцируя как полимеризацию, так и деполимеризацию рецептора В связи с этим, возможно, что в коже ПБР является белком-мишенью для ультрафиолетовых лучей и принимает участие в регуляции реакций, индуцированных УФО модуляция апоптоза, клеточной пролиферации, синтеза цитокинов Данный белок, его функциональная активность могут являться патогенетически обоснованной мишенью при лечении дерматологических заболеваний, в том числе злокачественных новообразований кожи

Экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора и PCNA в клетках кожи после инкубации с PK 11195 и ультрафиолетового облучения

В данном исследовании эффект синтетического лиганда ПБР РКП 195 оценивался на клетки кожи, подверженные воздействию УФО В нормальных кератиноцитах при инкубации с РКП 195 сохранялось статистически значимое снижение уровня ПБР В нормальных меланоцитах РК11195 в концентрациях 10 и 100 нм вызывал повышение экспрессии ПБР и обладал двояким действием на уровень PCNA в концентрации 10 нм увеличивал уровень экспрессии антигена, в концентрации 100 нм - резко снижал до нуля Бифазный эффект РКП 195 прослеживается также в клетках плоскоклеточного рака и меланомы В клетках плоскоклеточного рака РКП 195 в концентрации 10 нм ингибирует уровни экспрессии ПБР и PCNA В клетках меланомы лиганд во всех тестируемых дозах модулировал уровни ПБР и PCNA Известно, что лиганд периферических бензодиазепиновых рецепторов РКП 195 обладает бифазным эффектом на пролиферацию клеток в низких концентрациях снижает интенсивность клеточной пролиферации, в высоких дозах — повышает [Hardwick M, 1999] В клетках кожи при ультрафиолетовом излучении эффект РКП 195 также носит бифазный характер и характеризуется достоверными изменениями уровней клеточной пролиферации и экспрессии периферических бензодиазепиновых рецепторов Несмотря на различия концентраций РК11195, которые приводят к изменению уровней клеточной пролиферации в тестируемых типах клеток кожи, сохраняется однонаправленный эффект лиганда на экспрессию периферических бензодиазепиновых рецепторов и интенсивность клеточной пролиферации в нормальных меланоцитах, клетках плоскоклеточного рака и меланомы кожи (Рис 23, 24, 25, 26, табл 23, 24, 25, 26)

В нормальных меланоцитах отмечалась слабая корреляционная связь между экспрессией ПБР и PCNA при воздействии РКП 195 и ультрафиолетового излучения (г=0 43, а=0 5) (Рис 24) Была обнаружена положительная корреляционная связь между уровнями экспрессии ПБР и PCNA в клетках плоскоклеточного рака при воздействии РКП 195 в присутствии ультрафиолетового излучения (г=0 83, а=0 1) (Рис 25), а также в клетках меланомы (г~0 94, а=0 02) (Рис 26)

1 4

Рис 23 Уровни экспрессии ПБР и PCNA в нормальных кератиноцитах после

инкубации с PKI 1195 и ультрафиолетового облучения

Здесь и далее точками с белым фоном отмечены значения, достоверно

различные по сравнению со значением в контроле по данному показателю

(а=0,05)

Таблица 23

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и PCNA в нормальных кератиноцитах после инкубации с РКП 195 и ультрафиолетового облучения

Контроль, п=5 УФ, п=5 0,1 нМ РКП 1195 +УФ, п=5 1нМ РКП 1195 +УФ, п=5 ЮнМ РКП 1195 +УФ, п=5 ЮОнМ РК111195 +УФ, п=5

ПБР 1,16 0,35* 0,53* 0,6* 0,47* 0,9*

PCNA 0,02 0,01* 0,007* 0,004* 0,02 0,06*

Здесь и далее * - достоверные отличия по сравнению с контролем, а=0,05

-•♦•-пбр

-Я-PCNA

^ ^

пбр -pcna

Рис 24 Уровни экспрессии ПБР и PCNA в нормальных меланоцитах после инкубации с PKI 1195 и ультрафиолетового облучения

Таблица 24

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и PCNA в нормальных меланоцитах после инкубации с PKI 1195 и ультрафиолетового облучения

Контроль, п=5 УФ, п=5 ОДнМ РК111195 +УФ, п=5 1нМ РКП 1195 +УФ, п=5 ЮнМ РКП 1195 +УФ, п=5 ЮОнМ РКП 1195 +УФ, п=5

ПБР 0,74 0,41* 0,68 0,9 1,2* 1,1*

PCNA 0,08 0,02* 0,06 0,09 1,06* 0*

Рис 25 Уровни экспрессии ПБР и PCNA в клетках плоскоклеточного рака после инкубации с PKI 1195 и ультрафиолетового облучения

Таблица 25

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и PCNA в клетках плоскоклеточного рака кожи после инкубации с PKI 1195 и ультрафиолетового облучения

Контроль, п=5 УФ, п=5 ОДнМ РКП 1195 +УФ, п=5 1нМ РК111195 +УФ, п=5 ЮнМ РК1И195 +УФ, п=5 ЮОнМ РК111195 +УФ, п=5

ПБР 0,93 1,34* 3,3 0,88 0,34* 3,01*

PCNA 1,74 2,54* 2,2 1,56 1,14* 9,84*

Рис 26 Уровни экспрессии ПБР и PCNA в клетках меланомы кожи после инкубации с PKI 1195 и ультрафиолетового облучения

Таблица 26

Уровни экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и PCNA в клетках меланомы после инкубации с PKI 1195 и ультрафиолетового

облучения

Контроль, п=5 УФ, п=5 ОДнМ РК111195 +УФ, п=5 1нМ РКП 1195 +УФ, п=5 ЮнМ РКП 1195 +УФ, п=5 ЮОнМ РКП 1195 +УФ, п=5

ПБР 0,3 0,04* 0,8* 0,7* 1,71* 0,17*

PCNA 0,57 0,37* 1,21* 0,84* 1,9* 0,4*

Определение уровня БВ1 в клетках кожи

БВ1 (ингибитор связывания диазепама) является эндогенным лигандом ПБР, который принимает участие в регуляции стероидогенеза, обладает способностью активировать апоптоз [Рараёоро1оиз V, 1998, Кп^ег КЕ,

1992] Однако роль данного пептида в коже остается неизвестной Уровень БВ1 может служить косвенным признаком функциональной активности ПБР, поэтому было определено содержание данного пептида в клетках кожи

При иммуноблотгинге БВ1 определялся во всех исследуемых типах клеток кожи Было обнаружено, что уровень ингибитора связывания диазепама был достоверно ниже в клетках плоскоклеточного рака по сравнению с нормальными кератиноцитами и в клетках меланомы кожи по сравнению с нормальными меланоцитами (Табл 27)

Таблица 27

Уровни ВВ1 в клетках кожи

Нормальные кератиноциты, п=4 Нормальные меланоциты, п=4 Клетки плоскоклеточного рака, п=4 Клетки меланомы, п=4

БВ1 1,71 0,55 0,15* 0,47**

*- достоверно по отношению к нормальным кератиноцитам, (р<0,01), ** -достоверно по отношению к нормальным меланоцитам, (р<0,05)

Присутствие БВ1 является подтверждением наличия функционально активного ПБР в коже, как в норме, так и при развитии злокачественных новообразований Снижение уровня ингибитора связывания диазепама в опухолевых клетках согласуется с изменениями уровня экспрессии рецептора в этих клетках и указывает на снижение функциональной активности ПБР

Трансфекция ПБР в клетки плоскоклеточного рака и меланомы кожи и идентификация комплекса «ПБР-цитохром Р4505СС» методом конфокальной микроскопии

Фермент цитохром Р450всс катализирует реакцию отщепления боковой цепи холестерина и его дальнейшего превращения в прегненолон -предшественника всех стероидных гормонов Известно, что клетки кожи обладают способностью к синтезу стероидных гормонов рЗкишадк! А, 2000] Поскольку в других стероидпродуцирующих тканях доказано участие ПБР в регуляции стероидогенеза, возможно, что в коже рецептор может выполнять подобную функцию

С целью установления возможной взаимной пространственной локализации ПБР и цитохрома Р450ЗСс проводилась трансфекция ПЕР-ОБР (зеленый флуоресцентный белок) в клетки плоскоклеточного рака и меланомы кожи

I

Рис. 27. Трансфекция ПБР-СБР (зеленое окрашивание) в клетки меланомы. Ув. хбОО.

При проведении конфокальной микроскопии не было обнаружено колокализации между ПБР и цитохром Р450$сс (Рис. 27).

Определение цитохрома Р450ксс в клетках кожи

Не смотря на отсутствие колокализации трансфектированного ПБР и цитохрома Р4505СС в клетках плоско клеточного рака кожи и злокачественной меланомы, не исключается участив ПБР в стероидогенезе кожи. С целью определения возможности стероидогенеза в нормальных и опухолевых клетках кожи было проведено иммуноцитохимическое исследование для выявления уровня экспрессии цитохрома Р450зсс.

Цитохром Р450;СС определялся также во всех четырех исследуемых клеточных культурах также перинуклеарно (Рис. 28, 29). Количество нормальных кератиноцитов, в которых определялся исследуемый фермент составляло 68 на 100 клеток, в нормальных меланоцитах - 89. Уровень цитохрома Р450нсс был снижен в клетках плоскоклеточного рака и меланомы: 8 и 6,5 соответственно (Табл.28).

Анализируя полученные данные и соотнося их с уровнями ПБР в данных типах клеток кожи, можно отметить одинаковую динамику изменения ПБР и цитохрома Р450ксс: оба белка экспрессируются значительно менее интенсивно в опухолевых клетках, чем в нормальных.

Таблица 28

Экспрессия цитохрома Р450$сс в клетках кожи

Клеточная линия Цитохром Р450зсс + клетки на 100 клеток,

КЫЕК (нормальные кератин о циты), п-400 68,5±25,7

НЕМ (нормальные меланоциты), п=500 89±3,5

А431 (плоскоклеточный рак кожи), п=1000 8±2,8*

6К-МЕЕ-2 (меланома кожи), п=850 6,5±1,7**

достоверно по сравнению с нормальными кератиноцитами (ц=0,05), ** -

достоверна по сравнению с в нормальными меланоцитами (а=0,05).

Рис. 28 Цитохром Р450^сс в Рис. 29. Цитохром Р450ЕИ- в

нормальных кератиноцитах, Ув. хбОО нормальных мелайоцитах. У в. чбОО

Наличие цитохрома Р450$сс в нормальных кератшюцитах и меланоцитах, ¡слетках плоскоклеточного рака и мелзномы, определяемое при данном исследовании, указывает не только на синтез стероидных гормонов а коже, не также подразумевает функционирование ПНР в коже как непосредственного регулятора данного процесса. На это указывает и однонаправленное изменение экспрессии рецептора и фермента в опухолевых клетках.

Снижение экспрессии цитохрома Р450зсс ъ клетках плоскокйеточного рака кожи и меланомы является признаком снижения интенсивности стероидогенеза в коже при данных заболеваниях.

Известно, что регуляция синтеза стероидных гормонов в коже осуществляется с помощью А.КТГ и прогестерона [&1отгпШ А., 2000]. Именно эти гормоны демонстрировали способность модулировать функциональную активность ПЕР [Рарас1орои1оз V., 1993, Ое1ауо1е Р., 2003]. Функционирование компонентов эндокринной системы кожи, в свою очередь, является регулируемым и должно изменяться при воздействии различных стимулов, в том числе поступающих из окружающей среды. В первую очередь, это касается УФО. Является вероятным участие ГОР в регуляции локального

стероидогенеза в коже, ПБР-опосредованное воздействие на него УФО Остается неизвестным и требует дальнейшего исследования регуляция данного процесса, участие в нем различных цигокинов, механизм передачи сигнала, непосредственное влияние стероидных гормонов на процессы клеточной пролиферации и апоптоза При этом восстановление или интенсификация локального стероидогенеза в коже может являться необходимым терапевтическим подходом в терапии злокачественных новообразований кожи Вполне закономерными следует считать, в таком случае, обратные взаимоотношения между интенсивностью клеточной

пролиферации/интенсивностью апоптоза и функциональной активностью холестерин-транспортирующих и холестерин-утилизирующих систем в клетках кожи

Таким образом, ПБР является фоточувствительным белком, уровень экспрессии которого снижается при злокачественных новообразованиях кожи Уровень ПБР коррелирует с интенсивностью клеточной пролиферации при базально-клеточном раке кожи, что позволяет использовать ПБР в качестве маркера выраженности данного процесса Помимо этого, лиганд ПБР модулирует интенсивность клеточной пролиферации, что позволяет рассматривать ПБР как новую терапевтическую мишень при злокачественных новообразованиях кожи

ВЫВОДЫ

1 На территории Красноярского края в период с 1999 по 2005гг регистрируется повышение уровня заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи, наиболее высокие показатели отмечаются в южных, центральных, западных регионах края, в лесосибирской группе районов Выше заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи среди лиц женского пола В структуре базально-клеточного рака превалирует нодулярная форма (81,8%), меланомы кожи - поверхностно распространяющаяся форма (97%) У лиц мужского пола чаще, чем у лиц женского пола регистрируется базально-клеточный рак и меланома кожи в области туловища, плоскоклеточный рак - в области нижней губы

2 У больных с базально-клеточной карциномой, плоскоклеточным раком кожи и меланомой кожи происходит снижение апоптоза и повышение клеточной пролиферации, снижение уровня экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора, при распространенном псориазе определяется снижение уровня экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в стадию регрессирования заболевания. При базально-клеточном раке в опухолевых комплексах ПБР+ клетки определяются диффузно, менее интенсивно рецептор экспрессируется по периферии очагов в палисадообразно расположенных клетках При плоскоклеточном раке кожи снижение экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора определяется как снижение интенсивности окраски ПБР+ клеток При плоскоклеточном раке и при меланоме кожи определяется уменьшение экспрессии рецептора в базальном слое эпидермиса Наблюдается положительная корреляция между уровнем

клеточной пролиферации и экспрессией периферического бензодиазепинового рецептора при различных морфологических типах базально-клеточной карциномы (г=0,90, а=0,02)

3 При воздействии УФО в опухолевых и нормальных клетках кожи происходит изменение экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора, изменение соотношения уровня мономеров и полимеров периферического бензодиазепинового рецептора, уровень клеточной пролиферации во всех исследуемых типах клеток изменяется однонаправлено с изменениями уровней полимеров периферического бензодиазепинового рецептора, помимо способности вызывать полимеризацию рецептора, УФО также обладает способностью индуцировать деполимеризацию периферического бензодиазепинового рецептора При этом повышение уровня полимеров рецептора сопровождается с повышением уровня клеточной пролиферации, в то время как деполимеризация - снижением уровня клеточной пролиферации

4 Синтетический лиганд периферического бензодиазепинового рецептора РКП 195 обладает модулирующим эффектом на уровень экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в нормальных и опухолевых клетках кожи, интенсивность клеточной пролиферации меняется однонаправлено с изменениями экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора при воздействии УФО в присутствии РКП 195, что позволяет рассматривать модуляцию лигандами периферического бензодиазепинового рецептора клеточной пролиферации как новый метод в терапии заболеваний кожи, ассоциированных с нарушениями интенсивности клеточной пролиферации В опухолевых клетках кожи регистрируется снижение уровня эндогенного лиганда периферического бензодиазепинового рецептора - DBI

5 В клетках плоскоклеточного рака кожи и меланомы кожи происходит снижение экспрессии цитохрома P450scc по сравнению с нормальными кератиноцитами и меланоцитами, в трансфектированных клетках плоскоклеточного рака и меланомы кожи не было выявлено колокализации периферического бензодиазепинового рецептора и цитохрома P450scc

6 Периферический бензодиазепиновый рецептор является фоточувствительным белком клеток кожи, принимающим участие в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза в коже

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Требуется оптимизация методов ранней диагностики злокачественных новообразований кожи, повышение информированности населения о данной патологии на территории Красноярского края, совершенствование системы профилактических осмотров с целью повышения уровня ранней диагностики злокачественных новообразований кожи

2 Необходимо совершенствование профессиональной подготовки и повышение квалификации врачей дерматологов и онкологов в области

дерматоонкологии, обеспечение преемственности между онкологическим и кожно-венерологическим диспансерами при динамическом наблюдении за больными с доброкачественными и злокачественными новообразованиями кожи

3 Особенное внимание в плане развития меланомы кожи необходимо уделить лицам женского пола в связи с увеличением уровня заболеваемости меланомой кожи в данной группе населения

4 Регистрация экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора при базально-клеточном раке кожи может быть использована в качестве маркера интенсивности клеточной пролиферации в опухолевых клетках и может применяться при изучении биологического поведения опухоли

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Рукша Т Г Экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора, PCNA, каспазы-3 в клетках меланомы и плоскоклеточного рака кожи / ТГ Рукша, А Б Салмина, В Д Соколов, Т В Максимова, Ю.А Анисимов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007 -№7 - С 87-89

2 Рукша Т Г Лиганд периферических бензодиазепиновых рецепторов PKI 1195 модулирует пролиферацию клеток кожи / Т Г Рукша // Бюллетень СО РАМН -2007 -№1 -С 35-39

3 Рукша ТГ Экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора коррелирует с уровнем PCNA при базально-клеточной карциноме / Т Г Рукша, А Б Салмина, Т В Максимова, Ю А Анисимов // Российский журнал кожных и венерических болезней - 2007 -№2 - с 4-7

4 Рукша Т Г Роль периферического бензодиазепинового рецептора в развитии злокачественных новообразований кожи / Т Г Рукша // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии сборник материалов региональной конференции молодых ученых- под ред H В Чердынцевой, В Е Гольдберга - Томск, 2007 - 1 электрон опт диск (CD-ROM)

5 Рукша ТГ Современные представления об этиопатогенезе базально-клеточной карциномы / ТГ Рукша // Сибирский журнал дерматологии и венерологии -2007 -№8 -С34-39

6 Рукша Т Г Экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора и PCNA в клетках кожи модулируются ультрафиолетовым излучением / ТГ Рукша//Сибирский медицинский журнал -2007 - №1 -С 61-63

7 Рукша ТГ Иммуно- и гистохимические исследования в дерматологии методические рекомендации / Т Г Рукша, В И Прохоренков, А Б Салмина, ЛД Зыкова//Красноярск -2007 -34с

8 Рукша Т Г Иммуноблоттинг методические рекомендации / Т Г. Рукша, А Б Салмина, С В Михуткина//Красноярск -2007 -18с

9 Ruksha Т G Structural alterations of peripheral benzodiazepine receptor (PBR) induced by UVB light m melanoma cells / T G Ruksha, V Papadopoulos // Abstracts 16th Congress European Academy of Dermatology and Venerology — Vienna, Austria 2007 (CD-ROM)

10 Рукша Т Г Определение экспрессии каспазы-3 с целью детекции апоптоза в коже / Т Г Рукша, А Б Салмина, В Д Соколов, Ю А Анисимов, Т В Максимова // Сибирский журнал дерматологии и венерологии - 2007 - №8 -С 73

11 Рукша ТГ Анализ заболеваемости меланомой кожи на территории Красноярского края за 1999-2005гг / ТГ Рукша // Сибирский журнал дерматологии и венерологии -2007 -№8 - С 62-63

12 Рукша ТГ Молекулярная диагностика апоптоза и клеточной пролиферации при патологических состояниях кожи методические рекомендации / Т Г Рукша, А Б Салмина, В И Прохоренков, В Д Соколов, ЛД Зыкова//Красноярск -2007 -17с

13 Рукша ТГ Изменение уровня клеточной пролиферации в коже после воздействия ультрафиолетовым излучением / Л А Василовская, И А Савченко, О М Шемонаева, В В Салмин, Т Г Рукша // Сборник научных трудов "Актуальные проблемы морфологии" - Красноярск, 2007 - С 30-31

14 Рукша ТГ Интенсивность клеточной пролиферации и апоптоза при различных клинических вариантах базально-клеточного рака кожи / Т Г Рукша // Сборник научных трудов "Актуальные проблемы морфологии" - Красноярск, 2007 -С 120-121

15 Рукша ТГ Функционирование периферического бензодиазепинового рецептора в коже / ТГ Рукша // Сборник тезисов научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» - Красноярск 2006 -С 141-144

16 Рукша Т Г Экспрессия каспазы-3 и PCNA при плоскоклеточном раке кожи / ТГ Рукша, А Б Салмина, ТВ. Максимова, ЮА Анисимов // Сборник научных трудов "Актуальные проблемы морфологии" - Красноярск, 2006 -С 141

17 Рукша Т Г Роль локального стероидогенеза в функционировании кожи / ТГ Рукша, А Б Салмина, Л К Кухарская // Сборник тезисов научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» -Иркутск2006 -С 51-52

18 Рукша ТГ Запрограммированная клеточная гибель кератиноцитов и ее роль в патогенезе некоторых заболеваний кожи / В И Прохоренков, Т Г Рукша, Л Л Петрова, А Б Салмина // Вестник дерматологии и венерологии - 2005 -№4 - С 4-7

19 Рукша ТГ Изменение экспрессии периферических бензодиазепиновых рецепторов в клетках кожи под воздействием ультрафиолетового излучения / Т Г Рукша // Сборник научных трудов «Актуальные вопросы дерматовенерологии» - Красноярск 2005 -С 131-133

20 Ruksha Т G Skin cancer mortality rates m Krasnoyarsk territory / T.G Ruksha, К A Detsel, S К Antonova, VI Prokhorenkov // Abstracts of Xllth International Symposium of Russian - Japanese Medical Exchange - Krasnoyarsk 2005 - P 604605

21 Рукша T Г Экспрессия периферических бензодиазепиновых рецепторов при базальноклеточной карциноме и меланоме кожи / Т Г. Рукша, К А Детцель,

Т В Максимова // Сборник статей научно-практической конференции «60 лет онкологической службе красноярского края» - Красноярск, 2005 - С 269-272

22 Рукша Т Г Апоптоз кератиноцитов и экспрессия периферических бензодиазепиновых рецепторов при псориазе / Т Г Рукша, В И Прохоренков, А Б Салмина, JIB. Труфанова, ЕИ Таксанова, Л Л Петрова // Вестник дерматологии и венерологии - 2004 -№5 - С 4-6.

23 Рукша Т Г Коннексины в коже / В И Прохоренков, А Б Салмина, Т Г Рукша, Ю А Успенская // Клиническая дерматология и венерология - 2003 -№3 - С 16-20

24 Рукша ТГ Применение метода TUNEL для оценки выраженности апоптоза кератиноцитов в коже больных псориазом / В И Прохоренков, Т Г Рукша, А Б Салмина, НС. Горбунов, J1B Труфанова, ЕИ Таксанова // Сборник научных трудов "Актуальные проблемы морфологии" - Красноярск, 2003 -С 174-176

25 Рукша Т Г Экспрессия периферических бензодиазепиновых рецепторов и апоптоз кератиноцитов эпидермиса у больных псориазом / В И Прохоренков, Т Г Рукша, С К Антонова, А Д Климова, А Б Салмина // Сборник тезисов X Международного Симпозиума Российско-Японского Медицинского Обмена -Якутск, 2003 - С 690-691

26 Рукша Т Г Апоптоз и пролиферация кератиноцитов у больных псориазом с различной давностью заболевания / Т Г Рукша, А Б Салмина, В И Прохоренков, А А Гайдаш, АД Климова, С К Антонова, НС Горбунов // Клиническая дерматология и венерология - 2003 - №2 - С 60-62

27 Рукша Т Г Морфологические особенности состояния эпидермиса у больных псориазом / В И Прохоренков, Т Г Рукша, А Б Егорова, А А Гайдаш // Сборник тезисов городской научно-практической конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории - Томск, 2002 -С 58-59

28 Ruksha Т G Alterations m keratinocytes apoptosis in patients with psoriasis / VI Prokhorenkov, T G Ruksha, А В Egorova, A A Gaidash // Abstracts of IX International Symposium of Russian - Japanese Medical Exchange - Kanadzava, 2001 -P 210

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон

ЗНК - злокачественные новообразования кожи

ПБР - периферический бензодиазепиновый рецептор

УФА - ультрафиолетовое излучение А

УФВ - ультрафиолетовое излучение В

УФО - ультрафиолетовое облучение

DBI - ингибитор связывания диазепама

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток

Заказ Тираж 100 экз

Отпечатано ООО "Новые компьютерные технологии", г Красноярск, ул К Маркса, .62-120, тел 26-31-31

Актуальность проблемы.

Злокачественные заболевания являются одной из важнейших медико-социальных проблем современного общества. Многочисленные эпидемиологические исследования свидетельствуют о выраженном увеличении числа больных и показателей смертности в данной группе заболеваний [Чойнзонов E.JL, 2004, Старинский В.В., 2002]. В 2000г. в мире было зарегистрировано более 10 млн. случаев заболевания злокачественными новообразованиями, к 2020г. прогнозируется 16 млн. заболевших [Заридзе Д.Г., 2002]. По состоянию на сегодняшнее время в России состоит на учете более 2300000 больных с онкологическими заболеваниями. Ежегодно в России злокачественные новообразования выявляются у 450 тысяч человек [Ильницкий А.П., 2003]. Около 150 тыс. человек ежегодно признаются инвалидами по онкологическому заболеванию [Чиссов В.И., 2006]. Помимо этого, остается малоэффективной ранняя диагностика онкологических заболеваний. Удельный вес с опухолевым процессом неустановленной стадии по России составляет 8,8%. В некоторых регионах, в том числе в Красноярском крае, данный показатель достигает 30% [Чиссов В.И., 2006]. В условиях постоянного увеличения числа онкологических больных сохраняется актуальность поиска эффективных новых методов ранней диагностики, а также оптимизации терапии данных заболеваний.

В число самых распространенных онкологических заболеваний входят злокачественные новообразования кожи [Молочков В.А., 2004, Гармонов А.А., 2003]. Повсеместно отмечается рост заболеваемости одной из самых агрессивных опухолей человека - меланомой кожи. Наиболее высокий уровень заболеваемости данной патологией зарегистрирован в Австралии — 30,9 у мужчин и 28,5 у женщин на 100000 населения. В России абсолютное число впервые выявленных случаев данного заболевания с 1982г. увеличилось в 2 раза, заболеваемость в 2002г. составляла у мужчин 3,0, у женщин - 3,5 [Петрова Г.В., 2006]. В некоторых регионах Российской

Федерации, например, в Санкт-Петербурге, с 1980 по 2004г. утроилось абсолютное число первичных случаев заболевания, а стандартизованный показатель вырос в 2 раза [Мерабишвили В.М., 2006].

В целом, злокачественные новообразования кожи занимают третье место в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России [Молочков В.А., 2004, Хатырев С.А., 2004]. По некоторым данным, 92,6% из числа злокачественных опухолей кожи эпителиального происхождения составляет базально-клеточный рак кожи - сравнительно доброкачественно протекающая опухоль, но при этом характеризующаяся высокой частотой рецидивов - до 46% [Ключарева С.В., 2005, Новиков А.Г., 2004].

Доказано, что ультрафиолетовое облучение является одним из основных факторов, индуцирующих развитие данных заболеваний [Armstrong В.К., 1997]. В связи с этим является перспективным изучение функционирования белков клеток кожи, обладающих фоточувствительностью и принимающих участие в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза. К группе таких белков относятся периферические бензодиазепиновые рецепторы (ПБР), точная роль в коже которых остается неясной [Stoebner Р.Е., 1999, Bribes Е., 2003]. Однако их выраженная экспрессия в коже, способность регулировать пролиферацию клеток требуют дальнейшего изучения механизмов регуляции функционирования рецептора в коже в норме и при патологии, а также позволяет рассматривать ПБР как возможную терапевтическую мишень и маркер интенсивности клеточной пролиферации при злокачественных новообразованиях кожи [Gavish М., 1999, Stoebner Р.Е., 2001].

Цель работы

Исследовать взаимосвязь между клиническими проявлениями злокачественных новообразований кожи, распространенного псориаза и уровнем клеточной пролиферации и экспрессией периферического бензодиазепинового рецептора в коже с целью установления этиопатогенетической роли периферического бензодиазепинового рецептора и определения новых диагностических маркеров выраженности патологического процесса при данных заболеваниях.

Задачи исследования

1. Провести клинико-статистический анализ заболеваемости онкологическими заболеваниями кожи на территории Красноярского края.

2. Определить интенсивность клеточной пролиферации и апоптоза, экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора у больных с различными клиническими формами базально-клеточной карциномы, плоскоклеточного рака кожи, меланомы кожи, при распространенном псориазе, а также исследовать зависимость между интенсивностью экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и клеточной пролиферацией и апоптозом.

3. Выявить изменения экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора, клеточной пролиферации и апоптоза в нормальных и опухолевых клетках кожи после ультрафиолетового облучения.

4. Выявить эффект лиганда периферического бензодиазепинового рецептора РКП 195 на экспрессию периферического бензодиазепинового рецептора и уровень клеточной пролиферации в нормальных и опухолевых клетках, а также определить уровень лиганда периферического бензодиазепинового рецептора DBI в нормальных и опухолевых клетках кожи.

5. Определить уровень экспрессии цитохрома P450scc в нормальных и опухолевых клетках кожи и оценить особенности экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и конформационные взаимоотношения между ПБР и цитохромом P450scc в ПБР-трансфектированных клетках кожи.

6. Оценить вклад изменения функциональной активности и конформационной стабильности периферического бензодиазепинового рецептора в патогенез злокачественных заболеваний кожи и патогенетически обосновать использование лигандов периферического бензодиазепинового рецептора в терапии злокачественных новообразований кожи.

Научная новизна

В данной работе впервые проведен развернутый эпидемиологический и статистический анализ заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи на территории Красноярского края. Выявлены регионы края с высоким уровнем заболеваемости данной патологией. Определены особенности распределения заболевших по возрасту и полу, оценены уровни смертности от злокачественных новообразований кожи.

Впервые исследованы особенности экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора при распространенном псориазе. Впервые определена корреляционная связь между уровнем экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и интенсивностью клеточной пролиферации опухолевых клеток при базально-клеточной карциноме. Впервые исследовано изменение экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в клетках кожи при воздействии УФО, а также выявлена связь данных изменений с интенсивностью клеточной пролиферации и апоптоза в нормальных и малигнизированных клетках кожи. Впервые показана экспрессия периферического бензодиазепинового рецептора в нормальных меланоцитах. Впервые обнаружены конформационные изменения периферического бензодиазепинового рецептора в нормальных и опухолевых клетках кожи при воздействии УФО, коррелируемые с уровнем клеточной пролиферации. Впервые обнаружен феномен деполимеризации рецептора, индуцируемый воздействием УФО. Впервые выявлен модулирующий эффект синтетического лиганда периферического бензодиазепинового рецептора РКП 195 на степень экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и уровень клеточной пролиферации в нормальных и опухолевых клетках кожи.

Впервые проведен сравнительный анализ уровня эндогенного лиганда периферического бензодиазепинового рецептора DBI и экспрессии цитохрома P450scc в нормальных и опухолевых клетках кожи. Впервые показано снижение экспрессии цитохрома P450scc при малигнизации опухолевых клеток. Впервые произведена трансфекция периферического бензодиазепинового рецептора в клетки меланомы и плоскоклеточного рака кожи и осуществлена попытка определения пространственных взаимоотношений между периферическим бензодиазепиновым рецептором и цитохромом P450scc.

Научно-практическая значимость работы

Проведенный клинико-статистический анализ заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи позволил определить тенденции и особенности изменений уровня заболеваемости на территории Красноярского края. Были определены регионы края с наиболее высокими показателями уровня заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи.

Полученные экспериментальные данные указывают на участие периферического бензодиазепинового рецептора в функционировании нормальной кожи, а также в развитии злокачественных заболеваний кожи. Выявленная корреляционная связь между уровнем экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и интенсивностью клеточной пролиферации указывает на возможность использования периферического бензодиазепинового рецептора в качестве маркера выраженности пролиферативных процессов в опухолевых клетках базально-клеточной карциноме, что может применяться для оценки биологического поведения опухоли и возможности появления рецидивов.

Определение модулирующего эффекта лиганда периферического бензодиазепинового рецептора на показатели клеточной пролиферации и апоптоза в клетках кожи позволяет рассматривать применение лигандов периферического бензодиазепинового рецептора как возможный новый подход к терапии злокачественных новообразований кожи.

Установленное снижение уровня цитохрома P450scc в злокачественных клетках кожи свидетельствует о снижении локального стероидогенеза в коже при развитии злокачественных заболеваний, что может быть применено для формирования новых принципов терапии опухолевых заболеваний кожи. Помимо этого, снижение экспрессии P450scc может использоваться в качестве маркера развития онкологического процесса в коже.

Положения, выносимые на защиту

1. В Красноярском крае в период с 1999 по 2005гг. отмечается рост заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи, статистически значимое увеличение роста заболеваемости регистрируется в южных, центральных и западных, в лесосибирской группе районов регионах края.

2. При злокачественных новообразованиях кожи происходит снижение уровня апоптоза и повышение интенсивности пролиферации в опухолевых клетках кожи при базально-клеточной карциноме, плоскоклеточном раке кожи и меланоме кожи, что сопровождается снижением экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора; при распространенном псориазе происходит снижение уровня периферического бензодиазепинового рецептора в стадию регресса заболевания.

3. УФО обладает способностью модулировать экспрессию периферического бензодиазепинового рецептора, изменять соотношение уровня мономеров и полимеров рецептора в клетках, вызывать не только полимеризацию, но и деполимеризацию рецептора в клетках кожи.

4. Синтетический лиганд периферического бензодиазепинового рецептора РК11195 влияет на уровень экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора и вызывает однонаправленное изменение интенсивности клеточной пролиферации в нормальных и опухолевых клетках кожи.

5. В опухолевых клетках кожи происходит снижение уровня экспрессии цитохрома P450scc и эндогенного лиганда периферического бензодиазепинового рецептора - ингибитора связывания диазепама.

Внедрение результатов исследования

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в практику КГУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер», КГУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро», ООО "Лаборатория иммунохимических методов исследования", внедрены в учебный процесс Сибирского государственного медицинского университета (кафедра фундаментальных основ клинической медицины), Амурской государственной медицинской академии (кафедра биохимии), Красноярской государственной медицинской академии (кафедра кожных и венерических болезней, кафедра патологической анатомии, кафедра биохимии с курсом медицинской химии).

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на IX, X, XI, XII Международных российско-японских симпозиумах (Канадзава, 2001, Якутск, 2003, Ниигата 2004, Красноярск, 2005), заседании Красноярского краевого общества дерматовенерологов (2000), научно-практической конференции "Современные аспекты биологии и медицины" (Томск, 2002), заседании кафедры биохимии с курсом медицинской химии Красноярской государственной медицинской академии (2002), краевых конференциях дерматовенерологов «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (Красноярск, 2003, 2004, 2005, 2006), совместном заседании проблемных комиссий «Теоретические проблемы медицины» и «Кожные и венерические болезни» Красноярской государственной медицинской академии (2003, 2007), краевой научно-практической конференции «60 лет онкологической службе красноярского края» (Красноярск, 2005), заседаниях кафедр биохимии, дерматологии Университета Джорджтаун (Вашингтон, США, 2005), областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (Иркутск, 2006), XI Сибирской научно-практической конференции с международным участием «Дерматовенерология: наука и практика» (Новосибирск, 2007), 16-м международном конгрессе европейской ассоциации дерматовенерологов (Вена, 2007), II региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2007).

Выполненная работа поддержана грантами Красноярского краевого фонда науки (2005, 2006, 2007гг.), грантом фонда Boehringer Ingelheim для фундаментальных биомедицинских исследований (2004г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ, в том числе 8 в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования статей, содержащих результаты диссертационных исследований, 3 учебно-методических пособия.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 247 страницах текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 82 рисунка, 43 таблицы. Библиографический список включает 411 источников, из которых 42 отечественных и 369 иностранных авторов.

выводы

1. На территории Красноярского края в период с 1999 по 2005гг. регистрируется повышение уровня заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи, наиболее высокие показатели отмечаются в южных, центральных, западных регионах края, в лесосибирской группе районов. Выше заболеваемость злокачественными новообразованиями кожи среди лиц женского пола. В структуре базально-клеточного рака превалирует нодулярная форма (81,8%), меланомы кожи — поверхностно распространяющаяся форма (97%). У лиц мужского пола чаще, чем у лиц женского пола регистрируется базально-клеточный рак и меланома кожи в области туловища, плоскоклеточный рак - в области нижней губы.

2. У больных с базально-клеточной карциномой, плоскоклеточным раком кожи и меланомой кожи происходит снижение апоптоза и повышение клеточной пролиферации, снижение уровня экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора; при распространенном псориазе определяется снижение уровня экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в стадию регрессирования заболевания. При базально-клеточном раке в опухолевых комплексах ПБР+ клетки определяются диффузно, менее интенсивно рецептор экспрессируется по периферии очагов в палисадообразно расположенных клетках. При плоскоклеточном раке кожи снижение экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора определяется как снижение интенсивности окраски ПБР+ клеток. При плоскоклеточном раке и при меланоме кожи определяется уменьшение экспрессии рецептора в базальном слое эпидермиса. Наблюдается положительная корреляция между уровнем клеточной пролиферации и экспрессией периферического бензодиазепинового рецептора при различных морфологических типах базально-клеточной карциномы (г=0,90, а=0,02).

3. При воздействии УФО в опухолевых и нормальных клетках кожи происходит изменение экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора, изменение соотношения уровня мономеров и полимеров периферического бензодиазепинового рецептора; уровень клеточной пролиферации во всех исследуемых типах • клеток изменяется однонаправлено с изменениями уровней полимеров периферического бензодиазепинового рецептора; помимо способности вызывать полимеризацию рецептора, УФО также обладает способностью индуцировать деполимеризацию периферического бензодиазепинового рецептора. При этом повышение уровня полимеров рецептора сопровождается с повышением уровня клеточной пролиферации, в то время как деполимеризация - снижением уровня клеточной пролиферации.

4. Синтетический лиганд периферического бензодиазепинового рецептора РКП 195 обладает модулирующим эффектом на уровень экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора в нормальных и опухолевых клетках кожи; интенсивность клеточной пролиферации меняется однонаправлено с изменениями экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора при воздействии УФО в присутствии РКП 195, что позволяет рассматривать модуляцию лигандами периферического бензодиазепинового рецептора клеточной пролиферации как новый метод в терапии заболеваний кожи, ассоциированных с нарушениями интенсивности клеточной пролиферации. В опухолевых клетках кожи регистрируется снижение уровня эндогенного лиганда периферического бензодиазепинового рецептора - DBI.

5. В клетках плоскоклеточного рака кожи и меланомы кожи происходит снижение экспрессии цитохрома P450scc по сравнению с нормальными кератиноцитами и меланоцитами; в трансфектированных клетках плоскоклеточного рака и меланомы кожи не было выявлено колокализации периферического бензодиазепинового рецептора и цитохрома P450scc.

6. Периферический бензодиазепиновый рецептор является фоточувствительным белком клеток кожи, принимающим участие в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза в коже.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Требуется оптимизация методов ранней диагностики злокачественных новообразований кожи, повышение информированности населения о данной патологии, совершенствование системы профилактических осмотров с целью повышения уровня ранней диагностики злокачественных новообразований кожи на территории Красноярского края.

2. Необходимо совершенствование профессиональной подготовки и повышение квалификации врачей дерматологов и онкологов в области дерматоонкологии, обеспечение преемственности между онкологическим и кожно-венерологическим диспансерами при динамическом наблюдении за больными с доброкачественными и злокачественными новообразованиями кожи.

3. Особенное внимание в плане развития меланомы кожи необходимо уделить лицам женского пола в связи с увеличением уровня заболеваемости меланомой кожи в данной группе населения.

4. Регистрация экспрессии периферического бензодиазепинового рецептора при базально-клеточном раке кожи может быть использована в качестве маркера интенсивности клеточной пролиферации в опухолевых клетках и может применяться при изучении биологического поведения опухоли, оценки эффективности противоопухолевой терапии.