Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Клинико-лабораторная информативность исследования процесса структуризации капель мочи и других биологических жидкостей

На правах рукописи

ЗАЛЕСКИЙ Михаил Григорьевич

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ИНФОРМАТИВНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОЦЕССА СТРУКТУРИЗАЦИИ КАПЕЛЬ МОЧИ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.ПЛавлова

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Эманузль Владимир Леонидович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор

Говорун Вадим Маркович

доктор биологических наук Зыбина Наталья Николаевна

Ведущая организация: Государственное унитарное предприятие

Тульской области

НИИ Новых медицинских технологий

Защита состоится « 16 » февраля 2006 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

Автореферат разослан «_»_2006

Ученый секретарь диссертационного совета

Алексанин С. С.

zoo gft 2-147

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В последние годы, появилось новое научное направление - морфология биологических жидкостей, которое предоставляет медицине и биологии новые возможности в клинической лабораторной диагностике (Шатохина С.Н., 1995, Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001). Авторами предложен метод клиновидной дегидратации капель биологической жидкости, который позволяет получить сухую пленку - фацию (Ф), представляющую собой структурированные и расположенные в определенном порядке выпавшие в осадок минеральные и органические компоненты, растворенные в жидкости. Морфология Ф различных биожидкостей здоровых людей и лиц, страдающих различными заболеваниями, сильно отличаются между собой.

В результате научных поисков был разработан диагностикум «ЛИТОС-система» (ДЛС), (Приказ МЗ РФ №17 от 21 января 1997г.). Он позволил определять активность процесса камнеобразования в почках как при установленном диагнозе мочекаменной болезни (МКБ), так и на доклинической стадии заболевания.

Вместе с тем описанные закономерности структурирования при использовании метода клиновидной дегидратации охватывают далеко не все биологические жидкости. Трактовка механизма формирования Ф основывается исследователями в основном на теоретических положениях (С.Н.Шатохина, 1995; С.Н.Шатохина, В.Н. Шабалин, 1997; В.Н. Шабалин, С.Н.Шатохина, 2001).

При исследовании высыхающих капель ряд авторов отмечают в них различные гидродинамические явления, однако результаты наблюдений носят достаточно противоречивый характер (A.Zole,1995; R.D.Deegan, 2000).

Процесс структуризации капель биологических жидкостей представляет собой фазовый переход веществ из растворенного состояния в твердое, с формированием определенных структур - физико-химический процесс, принципы которого являются главенствующими в биологии (Титов В.Н., 2004).

Установление механизмов формирования структуры остатка выпаривания биологических жидкостей, одна из наиболее сложных задач физико-химической гидродинамики, теории массопереноса и фазовых переходов (Чашечкин Ю.Д.,2001), относящихся к приоритетным направлениям фундаментальных исследований РАН («Поиск», 1998). Недостатками исследования морфологии биологических жидкостей являются в основном описательный подход, и недостаточное использование морфометрических методов. '

Таким образом, исследование процессов структуризации биологических жидкостей человеческого организма, оптимизация возможностей метода

клиновидной дегидратации с разработкой новых методологических подходов и применением морфометрических методов, является актуальным. Цель исследования

Установить физико-химические механизмы процесса структуризации в ходе фазового перехода веществ из жидкого состояния в твердое в высыхающей капле мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью с использованием диагностикума «ЛИТОС-система» с применением морфометрических методов. Задачи исследования

1. Изучить гидродинамические процессы, возникающие в капле воды, мочи и других биожидкостях, при их высыхании.

2. Исследовать физико-химические закономерности фазового перехода компонентов из растворенного состояния в твердое, в высыхающих каплях мочи у здоровых людей и больных мочекаменной болезнью, растворов солей и белков с использованием диагностикума «ЛИТОС-система», с применением весовых методов, микрометрии, микроскопии и микрофотографии.

3. В моче больных мочекаменной болезнью установить природу фактора, формирующего в фациях структуры, указывающие на наличие этого заболевания.

4. Оценить процесс изменения камнеобразующей активности мочи у пациентов с мочекаменной болезнью в условиях спонтанного диуреза и процесса лечения на курорте «Краинка» минеральными водами курорта, в сочетании их с фармакологическими средствами.

5. Разработать модификацию методов оценки камнеобразующих свойств мочи для объективизации процесса исследования и документирования его результатов.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования Предложена новая трактовка механизмов структуризации, происходящих в капле высыхающей биологической жидкости, позволяющая объяснить процесс образование фаций с классических научных позиций гидро- и термодинамики, физической и коллоидной химии, и использовать результаты в клинической лабораторной диагностике.

Впервые выявлена закономерность гидродинамических процессов возникающих в высыхающих каплях водных растворов: наличие горообразных циркуляционных потоков и образование на периферии застойной краевой зоны. Установлены механизмы их возникновения.

На основании изучения хронометрической последовательности процессов, происходящих в высыхающей капле мочи, впервые установлены общие закономерности и принципиальные различия в ходе формирования фаций в пробах мочи у здоровых и больных мочекаменной болезнью.

Впервые установлена природа фактора, оказывающего влияние на формирование в фациях мочи больных мочекаменной болезнью характерных структур, имеющего муциновую основу.

Впервые описаны механизмы формирования фаций биожидкостей, объясняющие причины разделения их на краевые и центральные зоны.

Предложена гипотеза, объясняющая причины формирования различных фаций в каплях из проб мочи здоровых людей и страдающих мочекаменной болезнью при использовании диагностикума «ЛИТОС-система».

Установлено, что диагностикум «ЛИТОС-система» выявляет степень насыщения мочи муцином.

Научно-практическая значимость

Разработаны и внедрены в практику работы КДЛ ООО Санаторий (курорт) «Краинка» и Центре клинической лабораторной диагностики Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова модификации диагностикума «ЛИТОС-система», позволяющие объективизировать метод диагностики мочекаменной болезни:

- способ маркировки альбумина для определения его локализации в фациях;

- морфометрический способ определения объема фаций биожидкости.

Методы защищены рационализаторскими предложениями (2005г.). В результате работы получено обоснование для разработки нового способа лечения мочекаменной болезни с применением муколнгиков. Положения, выносимые на защиту

1. В высыхающих каплях жидкостей (биожидкостей) на горизонтальной подложке при комнатной температуре протекают гидродинамические процессы, характеризующиеся торообразными циркуляционными потоками и формированием застойной краевой зоны. Установлены механизмы их формирования, в основе которых лежат термодинамические, концентрационные и гидродинамические принципы.

2. При формировании фаций в каплях мочи здорового человека с использованием диагностикума «Литос-система», происходит формирование краевой белковой зоны. При образовании фации из капель проб мочи пациентов с почечным камнеобразованием, белковая зона не формируется и в краевой зоне происходит кристаллизация солей. Формирование фаций биожидкостей в ходе фазового перехода, происходит только в краевой зоне при достижении в ней перенасыщенной концентрации растворенных компонентов.

3. Камнеобразующая активность мочи, определяется присутствием в ней уромукоида. Модуляция свойств уромукоида in vitro уксусной кислотой, in vitro и in vivo муколитиками снижает уровень камнеобразующей активности в образцах мочи.

4. Механизмы формирования фаций из капли пробы мочи здорового человека определяются свойствами альбумина, который препятствует кристаллизации солей и совершает фазововый переход из золя в гель в краевой застойной зоне. Наличие уромукоида в моче у больных мочекаменной болезнью, препятствует проявлению защитных свойств альбумина и способности совершать фазовый переход из золя в гель. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на П Международном конгрессе по курортологии (2000г.), 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Морфология биологических жидкостей в диагностике и контроле эффективности исследований» (2001г.), научно-практической конференции «Проблемы диагностики донозологических состояний в профилактической и клинической медицине (2003г.), симпозиуме по проблеме «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина» (2004г.), Ш съезде Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (2005г.). По теме диссертации опубликовано 11 работ. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, и списка литературы. Работа иллюстрирована 52 рисунками, 10 таблицами. Список литературы содержит 135 отечественных и 20 иностранных источников.

Содержание работы Характеристика клинического материала и методов обследования

Обследовано 105 пациентов страдающих мочекаменной болезнью, которые проходили стандартное обследование и лечение в соответствии с «Методическими рекомендациями по лечению больных на курорте Краин-ка» [1978], на базе ООО Санаторий /курорт/ «Краинка» Тульской области с 2000 по 2005 гг.

Среди обследуемых пациентов, было 51,4% женщин (п=54), 48,6% мужчин (п=51). Средний возраст женщин 52,3±1,7 года, мужчин 57,5±1,9 года.

61 пациенту (58,1%), диагноз МКБ был установлен по месту жительства на основании клинической картины и проведенного обследования.

В санатории пациентам проводилось повторное обследование, включавшее УЗИ почек, лабораторные исследования (общий анализ мочи, анализ мочи по Нечипоренко, клинический анализ крови, уровень мочевины, креатинина, глюкозы, мочевой кислоты в сыворотке крови унифицированными методами, химический анализ мочевых камней по Краевскому В.Я.

[1976]). Гематологические исследования проводились на гематологическом анализаторе «Sistem 190+», биохимические на анализаторе «Stat fax». Диагностика и оценка активности процесса камнеобразования в почках у пациентов в пробах мочи проводилась с ДЛС.

У 44 пациентов (41,9%), диагноз МКБ был установлен впервые на курорте с использованием ДЛС и УЗИ.

Следует отметить, что у 38 пациентов (36,2%), с предварительно установленным диагнозом МКБ, проба с ДЛС была отрицательной. Из 44 пациентов, с вновь установленным диагнозом МКБ, проба с ДЛС так же была отрицательна у 12 пациентов (33,4%). Наличие отрицательных проб с ДЛС расценивалось специалистами как отсутствие активного камнеобразования в почках в момент обследования.

В контрольную группу были включены 20 пациентов без мочекаменной болезни: 7 человек с заболеваниями костно-мышечной системы и 13 человек с болезнями органов пищеварения. Пациенты контрольной группы были сопоставимы по полу и возрасту с труппой пациентов с МКБ.

Всего было проведено 111 УЗИ и 614 лабораторных исследований.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась методами вариационной статистики с выделением значимости различий по критерию t Стьюдента. Для сравнения однотипных ранговых признаков применялся непараметрический критерий Вилкоксона-Манна -Уитни. Для достоверного сравнения усредненных абсолютных величин, а также относительных показателей в процентах использовался метод непрямых разностей с использованием доверительных интервалов.

Результаты собственных исследований I. Гидродинамические процессы в высыхающих каплях водных растворов и биожидкостях

Исследуемые капли жидкости: воды, мочи, водных растворов хлористого натрия, помещенные на горизонтальную подложку имели форму сегмента шара и в вертикальном сечении напоминали сдвоенный клин.

Было установлено, что в каплях высыхающей жидкости (при температуре 18-30°С, влажности 50-70%), возникают конвекционные гидродинамические потоки. Жидкость с купола капли в радиальных направлениях движется на периферию к ее основанию, не достигая границы соприкосновения жидкости с подложкой, она совершает поворот и по дну капли поток начинает центростремительное движение. Достигнув центральной зоны капли, поток жидкости устремляется вверх к ее куполу, откуда вновь движется на периферию, образуя, таким образом, замкнутое кольцо. Течение жидкости в каппе имеет структуру тороидального вихря (рис. 1).

Между точкой поворота и краем капли по всему ее периметру формируется круговая полоса зоны застоя, ширина которой составляет 0,1-0,2 мм, и характеризуется малой толщиной слоя жидкости по сравнению с центральной зоной, снижением интенсивности гидродинамических процессов, повышением скорости испарения летучих компонентов жидкости, проявлением капиллярного эффекта (рис. 2).

Рис. 1. Схема циркуляции потоков жидкости, в высыхающей капле, помещенной на горизонтальную подложку. 1,2,3 - распределение маркировочных частиц и направление их движения на разных уровнях в капле жидкости; 4 - циркуляционные потоки жидкости в капле.

Рис. 2. Схема образования зоны застоя на краю высыхающей капли водного раствора.

а) общий вид капли;

б) вид краевой зоны.

1- пыльца, являющаяся маркером движения. 2 - потоки жидкости.

Описанные явления конвекции с характерной зоной застоя на периферии капли наблюдались в каплях всех исследуемых биологических жидкостей: сыворотки крови, слезы, мочи, а также в водных растворах различных солей, и дистиллированной воды. Это позволяет сделать вывод, что организованное таким образом циркуляционное течение в высыхающей капле и формирование застойной краевой зоны на ее периферии, характерно для всех изученных водных растворов.

Возникновение конвективной циркуляции зависело от ряда физических факторов, имеющих, прежде всего термодинамическую природу: термогра-

витационный, термокапиллярный термоконцентрационный механизмы, каждый из которых способен вызвать конвекционное движение сам по себе. Кроме этого определенную роль играли законы диффузии.

Сочетание физических процессов, локализованных в застойной краевой гелеобразующей зоне высыхающей капли, определяют условия, в которых происходят процессы фазовых переходов в процессе структуризации Ф, морфология которых используется для диагностики различных заболеваний.

П. Закономерности структуризации капель смеси мочи здоровых лиц и больных МКБ с ДДС

Взвешивание высыхающих капель, наблюдение за формированием структур в образующейся Ф, их измерение с помощью окуляр-микрометра и фотографирование, позволило установить, что в ходе структуризации капли мочи без камнеобразования образование краевой зоны - белковых

Врмм вини

Рис. 3. Динамика высыхания капель мочи из проб пациентов без камнеобразовани-ем в почках в смеси с ДЛС.

Дальнейшее увеличение ширины краевой белковой зоны продолжалось до момента, когда масса капли достигла 3,3±0,7% от первоначальной. Только после этого в центральной зоне происходило появление кристаллов, формирование краевой зоны к этому моменту уже было завершено.

У больных с МКБ белковая краевая зона не формируется, а процесс образования кристаллов солей на периферии капли начинался уже при испарении 17,5±1,7% первоначальной массы капли.

Общим принципом в процессе формирования двух различных Ф, является то, что структуризация начинается и в основном проходит в застойной краевой зоне, в центральной зоне этот процесс начинается тогда, когда структуризация в краевой зоне уже завершилась (рис. 4).

Рис. 4. Формирование краевой и центральной (солевой) зон в Ф капель мочи из проб пациентов без камнеобразованием в почках (1,2) и с камнеобразованием (3,4) в смеси с ДЛС. х320.

Принципиальным отличием образования Ф в капле мочи здорового человека и больного МКБ является то, что в Ф мочи с камнеобразованием краевой белковой зоны не образуется. Отсутствие процесса образования белковой краевой зоны в Ф мочи больных МКБ говорит о том, что в моче появился фактор, препятствующий этом процессу.

Ш. Закономерности структуризации смесей растворов хлористого натрия различной концентрации и 10% раствора альбумина в высыхающей капле жидкости

Использованный морфометрический подход позволил исследовать физико-химические закономерности фазового перехода в высыхающей капле водного раствора солей и белков, из растворенного состояния в твердое.

Изучено образование краевой белковой зоны в условиях возрастающей концентрации хлористого натрия (от 0,9% до 9,0%), в смеси с 10% раствором альбумина в соотношении 4:1.

Установлено, чем выше изначальная концентрация соли в растворе в смеси с раствором альбумина, тем медленнее идет образование краевой белковой зоны в высыхающей капле. Краевая белковая зона становится уже (рис.5). '

Постоянная циркуляция жидкости в центральной зоне высыхающей капли не позволяет ионам солей образовать там устойчивое локальное скопление. Водные растворы белков относятся, как и растворы солей к истинным растворам, они подчиняются законам диффузии и в водных растворах двигаться под действием ионов солей из зоны с низкой концентрацией в зону с высокой не могут.

Морфометрическими исследованиями физико-химических закономерностей фазового перехода солей и белков из растворенного состояния в твердое в капле высыхающей мочи установлено, что локализация альбумина на периферии Ф, не связана с увеличением концентрации солей.

« г

о

>Ж 3 § ■

ц

X

ж а

800 700 600 500 400 300 200 100 О

¿700

Л

\

\

I .210 196 --

»И

=1 0 0,9 1,8 2,7 3,6 4,5 5,4 6,3 7,2 8,1

Концентрации растворов хлористого натрия в %

Рис. 5. Зависимость ширины краевой белковой зоны от концентрации хлористого натрия в смеси с 10% раствором альбумина.

В системе вода—КаС1—альбумин повышение концентрации хлористого натрия затрудняет образование краевой (белковой) зоны, а при 9,0% его концентрации белковая зона не образуется.

IV. Распределение структурирующегося материала в фациях капель мочи без камнеобразования и с камнеобразованием в почках в смеси с ДЛС

Ф мочи в отсутствие белка не имеют выраженного рельефа. Краевая зона Ф мочи здорового человека в смеси с ДЛС, образованная белковым компонентом, формирует на периферии отчетливый вал, в то время как центральная зона представляет собой впадину (рис. 6.1). У лиц с выраженным процессом камнеобразования в почках высота Ф мочи с белковым компонентом по всей поверхности была одинаковой (рис. 6.2).

1 2 Рис. 6. Чашеобразная структура Ф капли смеси мочи без камнеобразования (1) и плоская с наличием камнеобразования в почках (2).

Морфометрическим способом определены объемы Ф биожидкости. Средняя высота краевых и центральных зон Ф в моче без камнеобразования в смеси с ДЛС составляет 49±4,7 мкм и 17,5±1,6 мкм, а в Ф мочи с камне-образованием соответственно 38,6±4,2мкм и 37±4,5мкм. Площади краевых и центральных зон Ф мочи без камнеобразования составляют соответственно 35,8±5,7 и 64±5,4% от всей площади фации, а объем зон Ф 88,6±4,9 и 11,4±2,1% от всего объема фации.

Маркировка альбумина метиленовым синим показала, что альбумин в моче без камнеобразования в смеси с ДЛС локализуется в краевой зоне Ф, и равномерно распределяется по всей поверхности Ф в моче с камнеобразо-ванием. Эти данные совпадают с результатами полученными методом измерения сечения Ф и подтверждаются результатами статистической обработки данных микрорентгеноструктурного анализа Ф мочи здоровых лиц и пациентов с МКБ, приводимых в работе С.Н.Шатохиной [1995].

Данные использованной нами модификации методов ДЛС, позволяют объективизировать диагностический процесс определения активности камнеобразования.

V. Изменение содержания белков в капле сыворотки крови при ее высыхании

С целью изучения процесса структуризации других биологических жидкостей было прослежено изменение содержание белковых фракций в жидкой части капли сыворотки крови в процессе ее высыхания у 5 пациентов, в том числе и страдающих МКБ (рис.7). Установлено, что при застудневании капли сыворотки крови и образовании широкого краевого гелевого кольца, первоначальное содержание белковых фракций в ее жидкой части практически не изменялось в течение 45 мин. В процессе дальнейшего структурирования и формирования центральной зоны Ф в последних двух пробах сыворотки на протяжении 30 мин наблюдается снижение альбумина и тенденция к увеличению глобулиновых фракций.

Постоянный уровень концентрации белковых компонентов в сыворотке крови объясняется тем, что процесс структуризации белков подчиняется тем же законам, что и у низкомолекулярных соединений. Структуризация начинается при достижении состояния перенасыщенного раствора белков, а данная характеристика раствора имеет для каждого вида жидкостей с определенным химическим составом постоянную величину. Переход белков из растворенного состояния - золя в гель, вызывается постоянным испарением жидкости. В высыхающей капле благодаря торообразной конвекции происходит постоянное перемешивание жидкости, и высокая концентрация белка будет равномерно распределяться во всем объеме капли.

Врамяамии

Рис. 7. Содержание белковых компонентов в высыхающей капле сыворотке крови больного МКБ.

1 - альбумин; 2 - у-глобулин; 3 - [З-глобулин; 4 - а2- глобулин; 5 - а1- глобулин.

Результаты наших экспериментов показали, что формирующиеся в процессе высыхания капли сыворотки крови концентрические структуры, образованные ассоциированными молекулами в результате застудневания сыворотки в пределах одной зоны должны быть идентичными по химическому составу.

VI. Изменение уровня активности камнеобразования в пробах мочи под действием химических факторов

Растворимый муцин мочи, может является фактором, препятствующим альбумину образовывать белковое кольцо на периферии Ф камнеобразую-щей мочи. Для осаждения из мочи муцина, характерного дня больных МКБ, была использована модифицированная методика выделения муцина из слюны 20-процентной уксусной кислотой. К 44 образцам мочи пациентов с активным процессом камнеобразования в почках, добавлялась уксусная кислота. При повторном исследовании с ДЛС проб с добавленной уксусной кислотой, даже без центрифугирования, в 42 из них (95,4%), сформировалась белковая краевая зона, как правило, рассеченная трещинами, характерная для мочи без камнеобразования (рис. 8).

1 2

Рис. 8. Фотография Ф мочи с активным камнеобразованием в смеси с ДЛС до (1), и после (2) добавления 20% уксусной кислоты, без центрифугирования.

Предположив, что различные муколитики способны воздействовать на муцин, в пробы исследуемой мочи больных с установленным процессом камнеобразования в почках, объемом 1мл, вносили по 0,02 г бромгексина и или 0,05г мукалтина. И после термостатирования смесей при комнатной температуре и Зб'С с различной экспозицией проводился повторно анализ с

длс.

Результаты экспериментов показали, что уксусная кислота, внесенная в пробы мочи пациентов с выраженной активностью камнеобразования в почках, муколитики (мукалтин и бромгексин), вызывают снижение уровня ее камнеобразующей активности, определяемой по ДЛС. Происходило четкое формирование краевой белковой зоны. Это подтверждает, что фактором, определяющим камнеобразующие свойства мочи при использовании ДЛС является муцин.

На основании проведенных экспериментальных исследований было изучено действие муколитиков (мукалтина и бромгексина), официально разрешенных применению препаратов, на активность процессов камнеобразования в почках, на фоне санаторно-курортного лечения МКБ.

Была разработана и утверждена администрацией курорта «Курорта» схема применения муколитиков в ходе санаторно-курортного лечения пациентов с МКБ. Все пациенты, участвующие в исследовании заполняли форму информированного согласия.

В исследовании участвовали пациенты с установленным, с использованием ДЛС, активным процессом камнеобразования в почках.

В первую группу (п=40), вошли пациенты с активным камнеобразова-нием, которые получали стандартное санаторно-курортное лечение: минеральные воды, физиотерапия. Пациенты второй группы (п=3б), наряду с традиционным лечением принимали бромгексин и мукалтин в терапевтических дозах течение 7 дней.

Результаты наблюдений за пациентами показали уменьшение активности камнеобразования в контрольной группе в 50,0% , а в опытной, где пациенты получали муколитики, в 80,6% случаев (р<0,05). Отсутствие эффекта от лечения в группе пациентов, получавших стандартное санаторно-курортное лечение было 30,0%, а в группе получавших муколитики -11,1% (р<0,05). Усиление активности камнеобразования выявлено в 20,0% случаев в контрольной группе и только у 8,3% пациентов, получавших муколитиче-ские препараты, (р<0,05).

Таким образом, применение муколитических препаратов наряду со стандартным санаторно-курортным лечением, оказывает достоверное снижение уровня активности камнеобразования в моче у больных с МКБ, а в ряде случаев вызывает его полное прекращение.

УП. Механизм формирования Ф биожидкостей и разделение их на краевую и центральную зоны

Разделение Ф на зоны в высыхающей капле сыворотки крови, на горизонтальной подложке, как других биожидкостей, связано с тем, что в связи с образованием краевой застойной зоны, структуризация белков начинает происходить только на периферии высыхающей капли и продолжается до тех пор, пока оставшийся объем жидкости не локализуется внутри образовавшегося белкового валика. Большая часть растворенного в жидкости структурообразующего материала совершает фазовый переход в гелеобраз-ное состояние в то время, когда слой жидкости в капле еще достаточно высок. Объем капли при высыхании сокращается, уменьшается ее площадь и высота, линия контакта жидкости с подложкой перемещается вслед за образующимися концентрическими структурами внутрь чашеобразной Ф. Когда жидкости остается мало - 10-20% объема капли (соответственно и растворенных структуробразующих компонентов), она локализуется в центральной зоне и приобретает в вертикальном сечении плоско-параллельное строение. Испарение и структуризация в этом случае происходит равномерно по всей покрытой оставшейся жидкостью поверхности. Образующаяся структурированная пленка, в центральной зоне значительно тоньше, чем в краевых структурах и механически менее прочная.

Образование в Ф биожидкости краевой и центральной зон, связано со свойством входящих в их состав белков, в условиях застойной гелеобра-зующей краевой зоны, переходить из золя в гель и локализоваться в основном на периферии Ф. Условия структуризации в центральной зоне отличаются от таковых в краевой.

Проведенные эксперименты показали, что описанный механизм образования Ф имеет универсальный характер и свойственен иным биологическим жидкостям.

УП1. Механизмы образования Ф в белковой моче пациентов без камнеобразования и с камнеобразованием в почках

В ходе высыхания капли белковой мочи (нативный патологический белок или из ДЛС), происходит испарение жидкости и возникновение конвекционных потоков -горообразной формы, вызывающих перемешивание содержимого капли. На периферии капли, где испарение происходит более интенсивно, и гидродинамические процессы замедляются, формируется застойная краевая зона. При отсутствии, активности процесса камнеобразования в почках в этой зоне, из молекул альбумина формируется коагуляционная слъ -студень (гель-фаза) в котором ионы солей мочи, в том числе и камнеобра-зующие, не объединяются в молекулы и кристаллов не образуют. Это связано

с тем, что молекулы альбумина, проявляя защитные свойства, препятствуют росту микрокристаллов и выпадению их в осадок. Большая часть альбумина локализуется в краевой зоне, формируя Ф чашеобразной формы.

При наличии, у обследуемого процесса камнеобразования в почках, в моче появляется большого количества слизи (муцина) и особенно его низко молекулярных фракций. Молекулы муцина блокируют молекулы альбумина, препятствуют их агрегации и образованию коагуляционной белковой сети в краевой зоне, даже при высыхании капли белковой мочи и достижении альбумином перенасыщенной концентрации. Краевая белковая зона не образуется совсем или образуется очень медленно.

В этих условиях защитные свойства альбумина снижаются, кристаллы камнеобразующих солей, в силу их очень низкой растворимости, выпадают в осадок раньше других солей мочи и формируют в краевой зоне кольцо из мелких кристаллов. Белок не переходит из растворенного состояния в геле-образное и равномерно распределяется по всей площади фации.

Таким образом, при диагностике МКБ с использованием ДЛС, определяет степень насыщенности мочи уромукоидами, или продуктами их гидролиза, протеолиза, которые являются обязательными компонентами при воспалительном процессе слизистых оболочек мочевых путей, провоцирующими процесс камнеобразования.

Выводы

1. Выявлена закономерность гидродинамических процессов, возникающих в высыхающих каплях в водных растворов (биожидкостей) - наличие горообразных циркуляционных потоков, и образование на периферии капли застойной краевой зоны. Механизмами их возникновения являются термодинамические и концентрационные факторы.

2. В эксперименте с использованием методов морфометрии доказана хронометрическая последовательность процессов происходящих в капле мочи при ее структуризации у здоровых людей и больных МКБ. Одновременно установлены и принципиальные различия в процессе формирования Ф у здоровых людей и больных МКБ.

3. Предложена гипотеза, объясняющая механизм структуризации Ф мочи пациентов с активным камнеобразованием и здоровых людей. При формировании Ф из смеси мочи здорового человека и ДЛС происходит формирование краевой белковой зоны, связанное со свойствами альбумина, проявлять защитные свойства в отношении кристаллов солей и совершать фазовый переход из золя в гель в краевой застойной зоне. При образовании Ф из мочи с камнеобразованием, белковая зона не формируется и в краевой зоне происходит кристаллизация солей. Формирование Ф капли камнеобразующей мочи, определяется

действием уромукоида, присутствующим в ней, и препятствующим альбумину проявлять защитные свойства и совершать фазовый переход из золя в гель в краевой застойной зоне.

4. Показано снижение камнеобразующей активности мочи под действием in vitro уксусной кислоты и муколитиков, и in vivo под действием муколи-тиков на фоне санаторно-курортного лечения, что указывает на роль уромукоидов в формировании камнеобразующих характеристик мочи.

5. Вскрыт и описан механизм формирования Ф биожидкостей и разделение их на краевую и центральную зоны. В его основе лежит свойство биожидкости в высыхающей капле образовывать структуры только в краевой зоне, которые в пределах одной зоны образуют концентрические окружности идентичные по своему химическому составу. Формирования Ф биожидкостей в ходе фазового перехода происходит только в краевой зоне при достижении критической концентрации растворенных компонентов. Центральная зона формируется в условиях отсутствия фактора воздействия краевой застойной зоны.

6. Разработана модификация методов оценки камнеобразующих свойств мочи, позволяющих объективизировать диагностический процесс обнаружения МКБ с использованием ДЛС: способ маркировки альбумина метиленовым синим, морфометрический способ измерения объема Ф биожидкостей, а также способ получения документированного изображения биожидкостей.

Практические рекомендации

При проведении исследований мочи на камнеобразующую активность с использованием ДЛС, для улучшения диагностической эффективности рекомендуется маркировать альбумин, входящий в состав диагности-кума метиленовым синим.

При проведении исследований мочи у пациентов с мочекаменной болезнью на камнеобразующую активность с использованием ДЛС, необходимо учитывать, что прием муколитиков снижает уровень камнеобразующей активности мочи.

Для объективизации полученных результатов исследования структуризации капель биожидкостей, предлагается способ получения документированного изображения фаций без использования фотоаппаратов и видеокамер.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дерябина H.H., Залеский М.Г. Содержание белковых компонентов в капле сыворотки крови при ее высыхании // Вестник новых медицинских технологий. -2005. - Т. XII. - № 1. - С. 85-87.

2.

3.

2. Залеский М.Г. Опыт использования Литос-теста в диагностике МКБ на курорте «Краиика» И Материалы Международного конгресса по курортологии, 19-20 декабря 2000 г. - М, 2000. - С. 62-63.

3. Залеский М.Г. К механизму феномена патологической кристаллизации камне-образующих солей мочи в белковой среде - системе «Литое» // Сборник научных трудов 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Морфология биологических жидкостей в диагностике и контроле эффективности лечения», 22-23 ноября 2001 г. - Москва, 2001. - С. 53-56.

4. Залеский М.Г. Использование свойств компонентов биологических жидкостей в диагностике донозологических состояний на примере диагностикума «ЛИТОС-система» // Материалы научно практической конференции «Проблемы диагностики донозологических состояний, 17-19 декабря 2003 г. - Москва, 2003. - С. 47-48.

5. Залеский М.Г., Эмануэль В.Л., Краснова М.В. Физико-химические закономерности структуризации капли биологической жидкости на примере диагностикума «ЛИТОС-система» // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. -№ 8,- С. 20-24.

6. Залеский М.Г. Распределение минеральных и белковых компонентов в фации капли смеси мочи и диагностикума «ЛИТОС-система» // Вестник новых медицинских технологий. - 2005. - Т. XII. - № 2. - С.93-94.

7. Залеский М.Г., Гетлинг A.B. Конвективные потоки в каплях воды и в биологической жидкости (Литос-система) на твердой горизонтальной подложке // Вестник новых медицинских технологий. - 2005. - Т. XII. - № 3-4. - С. 43-45.

8. Залеский М.Г., Мещеряков И.В., Захарова Л.И., Павлика Н.В., Доброквашин

B.В., Алексеев В.А. Динамика показателей диагностикума «ЛИТОС-системы» у больных с мочекаменной болезнью на фоне приема муколитиков и санаторно-курортного лечения // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 10. -

C. 70.

9. Залеский М.Г., Эммануэль В.Л. Роль муцина в формировании уровня литоген-ности мочи И Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - Jfe 10. - С. 70-71.

10. Залеский М.Г. Физико-химические закономерности образования фаций в каплях смесей мочи с диагностикумом «ЛИТОС-системой» у здоровых людей и и больных мочекаменной болезнью // Клиническая лабораторная диагностика. -2005. - № 10. - С. 69-70.

11. Залеский М.Г., Эммануэль В.Л. Физико-химическая интерпретация результатов исследования литогенной мочи с помощью диагностикума «ЛИТОС-система» // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 12. - С. 19-23.

i

2.006 (У Я.Н 7

<7

Лицензия от ИД № 00597 от 15.12.99 Подписано в печать 30.12.2005 Усл. печ. л. 1,25 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз. Заказ 746/05 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого 6-8 Издательство СПбГМУ

Несмотря на большое количество предлагаемых в настоящее время методов исследований биологических субстратов, новые подходы к уже известным методам позволяют увидеть новые горизонты в клинической лабораторной диагностике.

С.Н.Шатохиной и В.Н.Шабалиным [1995], предложен метод клиновидной дегидратации капель биологической жидкости, который позволяет получить сухую пленку - фацию, представляющую собой структурированные и расположенные в определенном порядке выпавшие в осадок минеральные и органические компоненты, растворенные в жидкости. Морфология фаций различных биожидкостей здоровых людей и лиц, страдающих различными заболеваниями, сильно отличаются между собой.

В ходе исследований структуризации капель мочи установлено, что у лиц, страдающих мочекаменной болезнью, при высыхании капель мочи, содержащей белок, происходит кристаллизация камнеобразующих солей в белковой среде - феномен Шатохиной-Шабалина.

В результате научных поисков был разработан диагностикум «ЛИТОС-система», (Приказ МЗ РФ №17 от 21 января 1997г.). Он позволил определять активность процесса камнеобразования в почках как при установленном диагнозе мочекаменной болезни, так и на доклинической стадии заболевания. Диагностикум успешно используется в практике диагностических лабораторий (Зарубина М.А., Ступина Л.И., 2001, Дасаев Л.А., Шилова Е.М., 2003, Шилова Е.М. и соавт. 2004).

По существу, появилось новое научное направление - морфология биологических жидкостей, которое предоставляет медицине и биологии новые возможности в клинической кристаллографии (Шатохина С.Н., 1995, Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001). Данной научному направлению были посвящены две Всероссийские научно- практические конференции в 1997 и в 2001 гг. [62,81].

Вместе с тем, описанные закономерности структурирования при использовании метода клиновидной дегидратации охватывают далеко не все биологические жидкости. Трактовка механизмов формирования их фаций основывается в основном на теоретических положениях (С.Н.Шатохина, 1995; С.Н.Шатохина, В.Н. Шабалин, 1997; С.Н.Шатохина, В.Н. Шабалин, 1998(1,2)).

Ряд биологических жидкостей человека имеют близкие значения плотности, содержания белка и их фации имеют похожее морфологическое строение (Семенов, Н.В.,1971; Козинец Г.И. 2000; Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001). Это позволяет предположить существование общего механизма формирования этих фаций.

При исследовании высыхающих капель ряд авторов отмечают в них различные гидродинамические явления, однако результаты наблюдений носят достаточно противоречивый характер (A.Zole,1995; R.D.Deegan, 2000).

Показано, что при высыхании капель жидкостей содержащих различные компоненты происходило образование фаций с похожими морфологическими структурами (A.Zole, 1955, J.Conwey et al., 1977; E.Parisse C.Allain, 1977).

Процесс структуризации капель биологических жидкостей представляет собой фазовый переход веществ из растворенного состояния в твердое, с формированием определенных структур - физико-химический процесс, принципы которого являются главенствующими в биологии (Титов В.Н., 2004).

Установление механизмов формирования структуры остатка выпаривания биологических жидкостей, одна из наиболее сложных задач физико-химической гидродинамики, теории массопереноса и фазовых переходов (Чашечкин Ю.Д.,2001), относящихся к приоритетным направлениям фундаментальных исследований РАН («Поиск», 1998).

Недостатками исследований морфологии биологических жидкостей является описательный подход и недостаточное использование морфометрических методов.

Для разрешения имеющихся противоречий между результатами различных исследований и теоретическими положениями, являющимися основой метода клиновидной дегидратации, мы решили провести исследования процессов структуризации капель мочи, сыворотки крови, смеси растворов солей и альбумина с использованием данного лабораторного метода, с целью оптимизации его возможностей и разработки нового методологического подхода к исследованию морфологического анализа биожидкостей, с применением морфометрических методов.

Цель исследования

Установить физико-химические механизмы процесса структуризации в ходе фазового перехода веществ из жидкого состояния в твердое в высыхающей капле мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью с использованием диагностикума «ЛИТОС-система» с применением морфометрических методов.

Задачи исследования

1. Изучить гидродинамические процессы, возникающие в капле воды, мочи и других биожидкостях, при их высыхании.

2. Исследовать физико-химические закономерности фазового перехода компонентов из растворенного состояния в твердое, в высыхающих каплях мочи у здоровых людей и больных мочекаменной болезнью, растворов солей и белков с использованием диагностикума «ЛИТОС-система», с применением весовых методов, микрометрии, микроскопии и микрофотографии.

3. В моче больных мочекаменной болезнью установить природу фактора, формирующего в фациях структуры, указывающие на наличие этого заболевания.

4. Оценить процесс изменения камнеобразующей активности мочи у пациентов с мочекаменной болезнью в условиях спонтанного диуреза и процесса лечения на курорте «Краинка» минеральными водами курорта, в сочетании их с фармакологическими средствами.

5. Разработать модификацию методов оценки камнеобразующих свойств мочи для объективизации процесса исследования и документирования его результатов.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования

Предложена новая трактовка механизмов структуризации, происходящих в капле высыхающей биологической жидкости, позволяющая объяснить процесс образования фаций с классических научных позиций гидро- и термодинамики, физической и коллоидной химии, и использовать результаты в клинической лабораторной диагностике.

Впервые выявлена закономерность гидродинамических процессов возникающих в высыхающих каплях водных растворов: наличие торообразных циркуляционных потоков и образование на периферии застойной краевой зоны. Установлены механизмы их возникновения.

На основании изучения хронометрической последовательности процессов, происходящих в высыхающей капле мочи, впервые установлены общие закономерности, и принципиальные различия в ходе формирования фаций в пробах мочи у здоровых и больных мочекаменной болезнью.

Впервые установлена природа фактора, оказывающего влияние на формирование в фациях мочи больных мочекаменной болезнью характерных структур, имеющего муциновую основу.

Впервые описаны механизмы формирования фаций биожидкостей, объясняющие причины разделения их на краевые и центральные зоны.

Предложена гипотеза, объясняющая причины формирования различных фаций в каплях из проб мочи здоровых людей и страдающих мочекаменной болезнью при использовании диагностикума «ЛИТОС-система».

Установлено, что диагностикум «ЛИТОС-система» выявляет степень насыщения мочи муцином.

Научно-практическая значимость.

Разработаны и внедрены в практику работы клинико-диагностической лаборатории ООО Санаторий (курорт) «Краинка» и в Центре клинической лабораторной диагностики Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова методы диагностики мочекаменной болезни, позволяющие объективизировать исследования структуризации капель биологических жидкостей:

- способ получения документированного изображения фаций, удостоверение на рационализаторское предложение №1466 от 20 октября 2005г, выданное СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова;

- способ маркировки альбумина для определения его локализации в фациях биожидкости, удостоверение на рационализаторское предложение №1467 от 20 октября 2005г, выданное СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова;

- морфометрический способ определения объема фаций биожидкости, удостоверение на рационализаторское предложение №1468 от 20 октября 2005г, выданное СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова;

В результате работы получено обоснование для разработки нового способа лечения мочекаменной болезни.

Положения, выносимые на защиту

1 .В высыхающих каплях жидкостей (биожидкостей) на горизонтальной подложке при комнатной температуре протекают гидродинамические процессы, характеризующиеся торообразными циркуляционными потоками и формированием застойной краевой зоны. Установлены механизмы их формирования, в основе которых лежат термодинамические, концентрационные и гидродинамические принципы.

2. При формировании фаций в каплях мочи здорового человека с использованием диашостикума «Литос-система», происходит формирование краевой белковой зоны. При образовании фации из капель проб мочи пациентов с почечным камнеобразованием, белковая зона не формируется и в краевой зоне происходит кристаллизация солей. Формирование фаций биожидкостей в ходе фазового перехода, происходит только в краевой зоне при достижении в ней перенасыщенной концентрации растворенных компонентов.

3. Камнеобразующая активность мочи, определяется присутствием в ней уромукоида. Модуляция свойств уромукоида in vitro уксусной кислотой, in vitro и in vivo муколитиками снижает уровень камнеобразующей активности в образцах мочи.

4. Механизмы формирования фаций из капли пробы мочи здорового человека определяются свойствами альбумина, который препятствует кристаллизации солей и совершает фазовый переход из золя в гель в застойной краевой зоне. Наличие уромукоида в моче у больных мочекаменной болезнью, препятствует проявлению защитных свойств альбумина и способности совершать фазовый переход из золя в гель.

Апробация работы

Материалы конференции были доложены на II Международном конгрессе по курортологии- 2000г., 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Морфология биологических жидкостей в диагностике и контроле эффективности исследований», 2001г., научно-практической конференции «Проблемы диагностики до нозологических состояний в профилактической и клинической медицине» в рамках работы пленума «Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды»,2003г. Научно-практическом симпозиуме по проблеме

Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина»,2004г., Ill (VII) съезде Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики, 2005.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, и списка литературы. Работа иллюстрирована 52 рисунками, 10 таблицами, Список литературы содержит 135

Выводы

1. Выявлена закономерность гидродинамических процессов, возникающих в высыхающих каплях водных растворов (биожидкостей) -наличие торообразных циркуляционных потоков, и образование на периферии капли застойной краевой зоны. Механизмами их возникновения являются термодинамические и концентрационные факторы.

2. В эксперименте с использованием методов морфометрии доказана хронометрическая последовательность процессов происходящих в капле мочи при ее структуризации у здоровых людей и больных МКБ. Одновременно установлены и принципиальные различия в процессе формирования Ф у здоровых людей и больных МКБ.

3. Предложена гипотеза, объясняющая механизм структуризации Ф мочи пациентов с активным камнеобразованием и здоровых людей. При формировании Ф из смеси мочи здорового человека и ДЛС происходит формирование краевой белковой зоны, связанное со свойствами альбумина, проявлять защитные свойства в отношении кристаллов солей и совершать фазовый переход из золя в гель в застойной краевой зоне. При образовании Ф из мочи с камнеобразованием, белковая зона не формируется и в краевой зоне происходит кристаллизация солей. Формирование Ф капли камнеобразующей мочи, определяется действием уромукоида, присутствующим в ней, и препятствующим альбумину проявлять защитные свойства и совершать фазовый переход из золя в гель в застойной краевой зоне.

4. Показано снижение камнеобразующей активности мочи под действием in vitro уксусной кислоты и муколитиков, и in vivo под действием муколитиков на фоне санаторно-курортного лечения, что указывает на роль уромукоидов в формировании камнеобразующих характеристик мочи.

5.Вскрыт и описан механизм формирования Ф биожидкостей и разделение их на краевую и центральную зоны. В его основе лежит свойство биожидкости в высыхающей капле образовывать структуры только в краевой зоне, которые в пределах одной зоны образуют концентрические окружности идентичные по своему химическому составу. Формирования Ф биожидкостей в ходе фазового перехода происходит только в краевой зоне при достижении критической концентрации растворенных компонентов. Центральная зона формируется в условиях отсутствия фактора воздействия застойной краевой зоны.

6. Разработана модификация методов оценки камнеобразующих свойств мочи, позволяющих объективизировать диагностический процесс обнаружения МКБ с использованием ДЛС: способ маркировки альбумина метиленовым синим, морфометрический способ измерения объема Ф. биожидкостей, а также способ получения документированного изображения биожидкостей.

Практические рекомендации

1. При проведении исследований мочи на камнеобразующую активность с использованием ДЛС, для улучшения диагностической эффективности рекомендуется маркировать альбумин, входящий в состав диагностикума метиленовым синим.

2. При проведении исследований мочи у пациентов с мочекаменной болезнью на камнеобразующую активность с использованием ДЛС, необходимо учитывать, что прием муколитиков снижает уровень камнеобразующей активности мочи.

3. Для объективизации полученных результатов исследования структуризации капель биожидкостей, предлагается способ получения документированного изображения фаций без использования фотоаппаратов и видеокамер.