Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Экспериментальная медико-биологическая оценка и разработка методов применения липосомальных глазных капель циклоспорина

ш

I МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза"

9 ИЮЛ 1ПЗ? На правах рукописи

Майчук Дмитрий Юрьевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПРИМЕНЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ГЛАЗНЫХ КАПЕЛЬ ЦИКЛОСПОРИНА

I

14.00.08 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в Межотраслевом научно-техническом комплексе "Микрохирургия глаза" МЗ России.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

акдемик РАМН С.Н.Федоров ■

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Э.В.Егорова

доктор медицинских наук, профессор, • член-корреспондент РАЕН

Р.А.Гундорова

Ведущее учреждение: Российская медицинская академия последипломного образования.

Защита состоится "_"_199_г. в 14 часов на заседании

диссертационного Совета Д.084.42.01 при Межотраслевом научно-техническом комплексе "Микрохирургия глаза" МЗ России.

Адрес института: 127486, Москва, Бескудниковский бульвар, 59а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Межотраслевого научно-технического комплекса "Микрохирургия глаза" МЗ России.

Автореферат разослан СгМ,/¿/^ 199у^г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Т.Л.Климова

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Актуальность применения иммуносупрессантиой терапии в офтальмологии обоснована в исследованиях последних лет, показавших трудности как в области кератопластики, так тт в лечении воспалительных заболеваний, в основе которых лежат иммунные нарушения. В работах С.Н. Федорова и З.И. Мороз (1995, 1996) подчеркивается, что несмотря на успехи микрохирургической техники, кератопластика остается серьезной проблемой гранеппантации в офтальмологии. К числу наиболее важных факторов риска этторжения трансплантата относится васкуляризация роговицы (Р. А. Гундорова и соавт. 1995; B.I. Копаева и соавт. 1995; С.Н. Федоров и соавт. 1996). Необходимость иммуномодулирующей терапии вытекает из научных исследований по увеитам (Н.С. Зайцева, 1995), симпатической офтальмии Л.Т. Архипова, 1995), хирургии катаракты (Э.В. Егорова и соавт. 1996).

Среди важнейших достижений офтальмологии за последние 25 лег в збласти фармакологии B.Gloor (1990) называет препарат циклоспорин, как тиболсс мощный иммуносупрессант.

Циклоспорин (Cyclosporin A, CsA) представляет собой мощный элективный иммуносунрессивный препарат, широко применяющийся в общей ■рансплантологии для профилактики реакции отторжения, и в лечешш юспалительных заболеваний. Выраженное терапевтическое действие (иклослорина было отмечено при различных состояниях с доказанным или федполагаемым иммунопатологическим механизмом развития.

В офтальмологической практике циклоспорин начал применяться в 80-х одах при кератопластике и в лечешш воспалительных и аллергических аболевапий глаз, в патогенезе которых лежат нарушения иммунной системы.

Основными лекарственными формами циклоспорина в общей 1едицинской практике и в офтальмологии остаются капсулы и пероральный 1аствор (Сандиммун, Sandoz, Швейцария). Из-за значительных колебаний во сасывании и выведении, дозы подбирают индивидуально в соответствии с

клинической реакцией, переносимостью и показателями концентрации препарата в крови.

В офтальмологической практике циклоспорин оказался высоко эффективным при кератопластике в условиях риска отторжения трансплантата (Т.М. ЫасШ е1 а1. 1984; МЖВеИп ег а1. 1989; С.Ш1егЬо1 й а1. 1989; Ш11 1989, 1994; ^Вгочуп й а1. 1995) и в лечении многих воспалительных и аллергических заболеваний глаз в патогенезе которых лежат нарушения иммунной системы: увеиты передние, средние и задние (К.В.№ззепЫаИ ег а1. 1983-1996; Ь.Савреге-Уе1и ег а1. 1989; Ь.В.Агтаса е1 а1. 1994; 1.КоПег е! а1. 1996), хориоидиты (А.аЗеса & а1. 1990; Р.Ь.Ноорег й а1. 1991), кератиты (1Т.Ье1§пег е1 а1. 1990), язва роговицы (1С.НШ, Р.РоПег 1987), склериты (ОЖакейес! сг а1, 1989), весенний кератоконыонктивит (О.ВепБгта й а1. 1986, 1988; A.G.Secci с! а1. 1990) и другие аллергические конъюнктивиты (С.8.8слуагЬ; е1 а1. 1991; М.МосЬгик! 1992), сухой кератоконъюнктивит (И.А.Ьа1Ьо\у1й й а1. 1993; К.Сип«1иг е1 а1. 1994; ВЯ^б 1995).

Все исследователи, подчеркивая уникальный селективный механизм избирательного иммуносупрессивного действия циклоспорина и высокую эффективность, обращают внимание на побочные эффекты препарата, среди которых наиболее серьезным является нефротоксическое действие и поражение функций печени. Другие побочные реакции, такие как артериальная гипертония, тремор, разрастание слизистых оболочек десен, судороги, рвота, боли в животе, отеки, встречающиеся у 4 - 28% больных, исчезают после прекращения лечения.

Метод перорального применения циклоспорина в офтальмологической практике встретил существенные ограничения не только в связи с высокой частотой побочного действия, дороговизной препарата, применяемого длительное время, но и недостаточной абсорбцией тканями глаза. Я. ЫиззепЫай, опубликовавший большое число статей по системному и местному применению циклоспорина в офтальмологии, подчеркивает, что при

заболеваниях переднего отдела глаза являлась бы идеальной именно местная лекарственная терапия (1992). Очевидные преимущества местного применения лекарственных средств в глазной практике потребовали создания специальных глазных лекарственных форм циклоспорина.

Первыми прошли клинические испытания 2% масляные растворы циклоспорина А в связи с липофильными свойствами препарата (О.ВепНгга ^ а1. 1988; АО-Бесо. & а1. 1991; ТСХкигски: ег а1. 1994). Инстилпяции 2% масляных капель циклоспорина оказывали терапевтический эффект, но внутриглазная концентрация препарата оставалась очень низкой. Вместе с тем, масляные глазные капли требуют высокого содержания циклоспорина (2%), что приводит к побочной токсической и аллергической реакции как на препарат, так и на масляную основу. Попытки создания глазных капель циклоспорина с использованием в качестве лекарственной основы альфа-циклодекстрина (А.Каш1 е{ а1. 1988), мазевой основы (11.А.Ьа1ЬоуНх ег а1. 1993), озона (С.№\\'1оп е! а1. 1988), коллагеновых линз (Н.Е.КаиГтап 1993) не вышли за рамки экспериментальных исследований.

Новые возможности открывают липосомальные глазные капли 0,2% циклоспорина - Циклолип - созданные в Государственном Научном Центре по Антибиотикам - 1 НЦД (директор - проф. С.М.Навашин). Липосомы являются перспективной лекарственной формой применения лекарств благодаря своей способности защищать инкапсулированные субстанции от метаболических энзимов слезы и роговичного эпителия и повышают транспорт лекарств.

Первые экспериментальные исследования, опубликованные нами в 1992 году, позволили предположить, что глазные капли Циклолип открывают широкую перспективу местного применения циклоспорина в лечении глазных Золезней, но вместе с тем показали необходимость проведения большого эбъема медико-биологических исследований для получения разрешения Фармакологического Комитета на внедрение новой лекарственной формы в офтальмологическую практику.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Экспериментальное доклиническое исследование толерантности, токсичности и терапевтической эффективности липосомальных глазных капель Циклолип. Разработка методов применения препарата. Оценка толерантности и эффективности глазных капель Циклолип в клинической практике.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать и выполнить специфические методы исследования местной (включая конфокальную микроскопию) и общей толерантности глазных капель Циклолип в хроническом опыте.

2. Подобрать, разработать и выполнить методы исследования для изучения влияния глазных капель Циклолип на белковый состав слезной жидкости и оценки влияния препарата на некоторые функции глаза.

3. Исследовать влияние глазных капель Циклолип на экспериментальных моделях повреждения роговицы: эрозия роговицы, эпителиально - стромальный разрез роговицы.

4. Исследовать терапевтическую эффективность и разработать методы применения Циклолип на моделях неоваскуляризации роговицы, химического ожога роговицы, герпетического кератита, переднего аутоиммунного увеита,. при поЬлойной и сквозной пересадке роговицы.

5. Подготовить комплект нормативно - технических документов для Фармкомитета МЗ России на новый глазной препарат циклоспорина -липосомальные глазные капли Циклолип по итогам доклинического исследования.

.6. Оценить толерантность и терапевтическую эффективность глазных капель Циклолип при применении у больных с иммунно-воспалительными нарушениями.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые доказана хорошая местная и общая толерантность глазных каполь Циклолип в хроническом опыте, показано отсутствие нежелательного влияния глазных капель Циклолип на белковый состав слезы, на ткани глаза, ширину зрачка и ВГД.

Впервые использована прижизненная конфокальная микроскопия для оценки влияния нового лекарственного средства на тканевые структуры роговицы интактного и поврежденного глаза.

Впервые доказано отсутствие нежелательного влияния глазных капель Циклолип на заживление на моделях эрозии и линейного разреза роговицы.

Впервые показана терапевтическая эффективность глазных капель Циклолип на экспериментальных моделях неоваскуляризации роговицы, ожога роговицы, герпетического кератита, переднего аутоиммунного увеита, послойной и сквозной кератопластики.

Впервые дана оценка высокой клинической эффективности и толерантности глазных капель Циклолип в лечении увеитов, кератоувеитов, кератитов и болезни трансплантата.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Фармакологический Комитет Минздрава России решением от 19.12.1996 (протокол № 17) разрешил клинические испытания глазных капель Циклолип.

В нормативно - технические документы для Фармакологического

Комитета вошли следующие материалы по итогам работы:

- Литературная справка по циклоспорину

- Отчет по исследованию местной толерантности глазных капель Циклолип и влиянию на тканевые структуры глаза и некоторые функции глаза

Отчет по исследованию общей толерантности глазных капель

Циклолип

- Отчет по влиянию глазных капель Циклолип на заживление роговицы на экспериментальных моделях повреждения глаза

- Отчет по терапевтической эффективности глазных капель Циклолип на экспериментальных моделях неоваскуляризации роговицы, дозированного химического ожога роговицы, герпетического кератита, переднего аутоиммунного увеита, послойной и сквозной кератопластики

Программа открытого несравнительного клинического испытания глазных капель Циклолип

- Инструкция по применению глазных капель Циклолип.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Липосомальные глазные капли Циклолип являются перспективной глазной лекарственной формой мощного селективного иммуносупрессанта циклоспорина.

2. Использование липосом в качестве лекарственной основы глазных капель позволило в 10 раз по сравнению со стандартными масляными каплями уменьшить концентрацию циклоспорина без снижения терапевтической эффективности, но значительно повысив толерантность препарата.

I

3. Глазные капли Циклолип обладают хорошей местной и общей толерантностью, не оказывают нежелательного действия на функции и тканевые структуры глаза.

4. На экспериментальных моделях неоваскуляризации роговицы, ожога роговицы, герпетического кератита, переднего аутоиммунного увеита, послойной и сквозной кератопластики глазные капли Циклолип оказывают терапевтическое действие.

5. Первая фаза клинических испытаний показала хорошую переносимость глазных капель Циклолип, отсутствие аллергизирующего действия и терапевтическую эффективность в лечении воспалительных заболеваний глаз с иммунными нарушениями.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ

Проведенные экспериментальные медико-биологические исследования липосомальных глазных капель Циклолин позволили представить нормативно -технические документы в Фармакологический Комитет Минздрава России и послужили основанием для разрешения клинических испытаний Циклолип. Положительные результаты первой фазы клинических испытаний показали перспективность для офтальмологической практики мощного нммуносупрессивного препарата Цшсгалпп в повой оригинальной липосомальной основе:

Результаты исследований внедрены в практику работы МНТК "Микрохирургия глаза" и Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца.

В дальнейших клинических испытаниях применение глазных капель Циклолин показано в лечении глазных заболеваний, в патогенезе которых лежат иммунные нарушения: увеиты передние, средние, задние, гипопион-увеиты при болезни Бехчета, передние увеиты при системных заболеваниях, симпатическая офтальмия, стромальные кератиты с изъязвлением и без изъязвления роговицы, язва Мурена, краевые кератиты, эписклерит, склерит, аллергический конъюнктивит, сухой кератоконъюнктивит, болезнь трансплантата, кератопластика в условиях риска отторжения трансплантата.

I

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные материалы диссертационной работы доложены на X Международном конгрессе научных исследований глаза (1992), 6-м Российском конгрессе офтальмологов (1994), 2-м, 3-м и 4-м Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (1995, 1996, 1997), 27-м Международном офтальмологическом конгрессе (Канада, 1994),

международных офтальмологических конференциях (Финляндия 1993; США 1995, 1996, 1997), X Европейском офтальмологическом конгрессе (Италия, 1995),. клинической конференции МНТК "Микрохирургия глаза" (1997), межотделенческой конференции кафедры глазных болезней ММСИ и клинических отделов МНТК "МГ" (1997). Доклады, представленные на конкурс молодых ученых на X Европейском офтальмологическом конгрессе (Милан, 1995) и IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997), были отмечены грантами.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам исследований опубликовано 17 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 фотографиями, 11 таблицами, 7 рисунками.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя. Список использованной литературы включает в себя 226 наименований (19 - отечественных, 207 - зарубежных).

Работа выполнена в Межотраслевом научно-техническом комплексе "Микрохирургия глаза" и Московском медицинском стоматологическом институте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили с циклоспорином А в двух лекарственных формах: Циклолип - липосомальныё глазные капли, содержащие 0,2% циклоспорина А и масляные глазные капли 2% циклоспорина А.

Глазные капли Циклолип готовили в ГНЦЛ (Л.К. Граховская, Э.В. Коган, Л.Н. Березовская) на основе униламеллярных монодисперсных липосом диаметром 64 нм из липидной композиции яичного фосфатидилхолина методом детергентного диализа с содержанием циклоспорина А (в пересчете на активное вещество) - 0,2%. В качестве консерванта глазных капель использовали нипагин.

Экспериментальные исследования выполнены на 103 кроликах породы Шиншилла и Альбино средней массой 2,0-2,5 кг. В соответствии с методическими задачами экспериментальных исследований работа выполнялась на экспериментальных базах МНТК "Микрохирургия глаза", ГНЦА, Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца и Г лазного Центра Университета Луизианы (США).

Объем экспериментальных исследований включал широкую программу методических подходов, необходимых для полной доклинической оценки нового лекарственного средства в плане подготовки материалов для Фармакологического Комитета.

Программа доклинического исследования Циклолип включала три основных раздела с использованием следующих методов.

I. Методы исследования толерантности глазных капель Циклолип.

Глазная толерантность. 3 серии наблюдений, инсталляция 6 раз в день, продолжительность от 14 дней до 3 месяцев. Обследование щелевой лампой после окраски 0,5% флюоресцеином.

Влияние на ширину зрачка и ВГД. Использовали пупиллометрию по шкале' тестирования и тонометрию ВГД аппликационным тонометром Маклакова грузом массой 10 г.

Влияние на белковый состав слезы. Метод капиллярного электрофореза на аппарате Beckman Instrument CA, USA, модель 2000. Метод лазерной молекулярно-весовой спектрометрии на матрикс-ассистентном лазерном дессорбционно-ионизирующем массоспектрометре Voyager Biospectrometry Workstation MALDI, USA.

Влияние на тканевые структуры. Метод прижизненной конфокальной микроскопии с использованием конфокального микроскопа с 20-ти кратным аппликационным объективом, позволяющий послойное обследование с увеличением до уровня клеточных структур слезной пленки, конъюнктивы, эпителиального, стромального и эндотелиального слоев роговицы. Гистологические исследования энуклиированных глаз кроликов с окраской гематоксилин-эозином.

Общая токсикология. Оценивали по следующим показателям: поведение животных, прием пищи, динамика нарастания массы тела, биохимические показатели крови.

II. Методы исследования влияния глазных капель Цнклолнп на экспериментальных моделях повреждения роговицы:

Эрозия роговицы. Опыты выполнены в 2 сериях с эрозией роговицы диаметром 3 мм и 8 мм.

Линейный эпителиалыю-стромальный разрез роговицы длиной 5 мм и глубиной до 1/3 роговицы. Заживление в условиях инсталляции глазных капель Циклолип оценивали под контролем прижизненной конфокальной микроскопии с фотографированием и биомикроскопии.

П1. Методы исследования терапевтической эффективности Циклолип на экспериментальных моделях:

Роговичная иеоваскуляризация. Моделировали наложением одиночного, не проникающего в переднюю камеру, шва (шелк 10-8). Исследование проводили с помощью сканирующего конфокального микроскопа и щелевой лампы.

«

Дозированный химический ожог. Вызывали аппликацией на роговицу диска фильтровальной бумаги диаметром 3 мм, пропитанного 50% едкой щелочью.

Герпетический кератит. Для инфицирования использовали вирус простого герпеса, штамм "Коптев", предварительно оживленный пассированием через мозг белых мышей. Для заражения кроликов использовали 10% суспензию мозга мышей. Суспензию закапывали в нижний копъюнктивальный мешок и осторожно втирали в роговину, на которой предварительно делали поверхностные насечки в виде решетки. Лечение начинали на 3-е сутки, когда развивалась картина точечного герпетического кератита.

Передний аутоиммунный увеит. Моделирование производили путем 4-х кратной сенсибилизации нормальной лошадиной сывороткой с последующим введением в переднюю камеру кроликов разрешающей дозы антигена (0,1 мл лошадиной сыворотки). Признаки увеита выявлялись через 2 суток и достигали наибольшей выраженности на 5 - 6 сутки. В сравнительных опытах использовали глазные капли Циклолип и масляные капли циклоспорина, контрольную группу оставляли без лечения.

Кератопластика. Выполнено три серии опытов: I - послойная с гомотрансплантатом на интактных глазах, II - послойная кератопластика с гетеротрансплантатом, 111 - сквозная кератопластика па модели васкуляризированНого кератита после ожога роговицы.

Влияние Циклолип на белковый состав влаги передней камеры при кератопластике. Использовали метод лазерного корреляционного анализа влаги передней камеры.

Методы исследования терапевтической эффективности, толерантности и аллергезирующего действия глазных капель Циклолнп в клинике.

Решением Фармакологического Комитета от 19.12.1996 г., протокол № 17, липосомальные глазные капли Циклолип были разрешены для клинического испытания в МНТК "Микрохирургия Глаза" и МНИИ 115 им. Гельмгольца. Отбор больных производился в соответствии с "Программой открытого несравнительного клинического испытания глазных капель Циклолип". Проанализированы результаты применения глазных капель Циклолип в лечении 68 больных, в том числе: увеиты - 17, кератоувеиты - 15, кератиты - 20, язва Мурена - 2, болезнь трансплантата - 3, эписклериты - 2, аллергический и сухой кератоконъюнктивиты - 9.

Учитывая характер заболеваний, специальное внимание уделялось общему клиническому обследованию больных и иммунологическому обследованию. . Проводилось обычное клинико-инструментальное обследование офтальмологического статуса больных, исследование внутриглазного давления, биомикроскопия с использованием щелевой лампы. Для выявления признаков синдрома сухого глаза использовали пробу Ширмера с французскими тестерами на 3 мин, определяли время разрыва слезной пленки, применяли окраску бенгаль-роз. .Микробиологическое исследование включало мазки и посевы для выявления бактериальной микрофлоры и вирусологическое - соскобы конъюнктивы на иммунофлюоресцентный анализ для выявления антигена герпеса.

В Программе клинических испытаний определены критерии оценки нетолерантности глазных капель Циклолип по появлению и степени

4

выраженности признаков аллергических и токсических осложнений на глазные инсталляции. Общая аллергизация определялась методом . кожных аллергических проб с препаратом Циклолип и другими препаратами.

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Толерантность глазных капель Циклолип

Глазная переносимость. Инсталляция глазных капель Циклолип в

интенсивном режиме 6 раз в день во всех 3-х сериях наблюдений (14 дней, 21

день и 3 мес.) хорошо переносится тканями глаза и не оказывает токсико-

аллергического воздействия на роговицу. В контрольной группе кроликов, i

получавших 2% масляный раствор циклоспорина, отмечено уже в первые дни

раздражающее действие, сопровождающееся гиперемией конъюнктивы и

появлением кератопатии во всех случаях.

Влияние на тканевые структуры глаза. Оценивали гистологическим

исследованием глаз, удаленных после завершения курса инсталляций (1-я и 2-я

серии) и методом прижизненной конфокальной микроскопии (3-я серия). При

гистологическом исследовании глаз получавших Циклолип видимых

патологических изменений не обнаружено. Конфокальное исследование

проводили с помощью двойного сканирующего конфокального микроскопа с

20-ти кратным аппликационным объективом, позволяющее послойное

исследование с увеличением до уровня клеточных структур in vivo i

поверхностных слоев конъюнктивы, слезной пленки, эпителиального, стромального и эндотелиалыюго слоев роговицы. Исследования, проводимые в динамике каждые 4 дня, каких-либо нарушений в тканях глаза пс выявили.

Влияние на ширину зрачка и внутриглазное давление (ВГД). Пупиллометрию производили в последний день ипстилляций Циклолип спустя 2 часа после утреннего лечения. Ширина зрачков составила в среднем, в ípynne Циклолип -10±0,5 х 9±0,5 мм, в группе плацебо - 10+0,4 х 9±0,8 мм.

Измерение ВГД производили утром и вечером тонометром Маклакова. Показатели ВГД оказались одинаковыми в контрольной и леченной группах. Таким образом, инсталляции Циклолип не оказывают влияния на такие функциональные показатели глаз, как ширина зрачка и ВГД.

Влияние на белковый состав слезы. Исследование слезы проводили с использованием 2-х высоко чувствительных методов: капиллярного электрофореза и лазерной молекулярно-весовой спектрометрии. Спектры, полученные при исследовании слезной жидкости содержали одинаковое количество ярко выраженных пиков при сравнении до и после 3-х недельных инсталляций. Использование двух высокочувствительных методов позволило заключить, что инстилляция глазных капель иммуносупрессанта циклоспорина не приводит к изменениям состава белков ни в спектре белков с высоким молекулярным весом (куда входят иммуноглобулины ^А, 1цМ, ^Е), ни в спектрЬ белков с низким молекулярным весом (куда входят факторы роста).

Влияние на общее состояние животных. Инстилляция глазных капель Циклолип в интенсивном режиме 6 раз в день, как в группе 2-х недельного наблюдения, так и в течение 3-х месяцев, не выявила общего токсического действия препарата: не обнаружено отклонений в поведении животных и в приеме пищи. Нарастание массы тела было таким же, как и у других животных вивария, не обнаружено отклонений в анализах крови и мочи. Гистологические исследования внутренних органов не выявили патологических изменений.

Исследование влияния глазных капель Циклолип на экспериментальных моделях повреждения роговицы.

Влияние на реэпителизацию на модели эрозии роговицы. Выполнено 2. серии' опытов с различной зоной дефекта при использовании трепанов диаметром 3 мм и 8 мм. Сроки восстановления эпителиального покрова роговицы были одинаковы, как на глазах получавших Циклолип 6 раз в день, так и плацебо, но зависели от величины дефекта, в первой серии - 2 дня, во второй серии опытов - 5 дней. Таким образом Циклолип не задерживает сроки реэпителизации роговицы и не оказывает раздражающего действия в условиях эрозии роговицы.

Влияние на заживление эпителиально-стромального разреза. На обоих глазах кроликов в центральной части глазным скальпелем наносили разрез

длинной 5 мм и глубиной не более 0,5 мм. Результаты заживления исследовались in vivo конфокальным микроскопом и с помощью щелевой лампы ежедневно в течении 10 дней. Реэпителизация разрезов наступила одновременно в глазах, получавших Цшслолип и в контрольных глазах. Заживление стромального дефекта происходило одинаково в обеих группах.

Терапевтическая эффективность глазных капель Цнклолип на экспериментальных моделях.

Эффективность при нёоваскуляризации роговины. На обоих глазах кроликов на расстоянии 2-х мм от лимба накладывался одиночный, не проникающий в переднюю камеру, шов (шелк, 10-8). Ежедневный осмотр проводился в течении 10 дней с помощью конфокального микроскопа и щелевой лампы. На 10 день па глазах, получавших плацебо, была обнаружена зона нёоваскуляризации, начинавшаяся от лимба и доходившая до шва па всю глубину роговицы. Ширина неоваскуляризированной зоны - 3 мм. На глазах, получавших инсталляции Циклолип 4 раза в дет, было обнаружено расширение сосудов у лимба, но не было зафиксировано проникновение сосудов в ткань роговицы.

Эффективность при химическом ожоге роговицы. Исследования проводились на модели дозированного химического ожога роговицы, вызываемого аппликацией на роговицу диска фильтровальной бумаги, пропитанного раствором едкой щелочи. Патологические изменения роговицы развиваются уже в первые часы после аппликации: отек роговицы, дефект эпителия в зоне аппликации, раздражение глаз. Через сутки отмечаются-признаки неоваскуляршацин роговицы - врастание сосудов со стороны лимба. На б - 7 день область ожога отечна с глубокой стромальной инфильтрацией и новообразованными сосудами. Инсталляция Циклолип 6 раз в день снижает воспалительную реакцию, предупреждает развитие нёоваскуляризации роговицы, ускоряет эпителизацию роговицы на площади дефекта примерно в три раза, способствует формированию более тонкого помутнения роговицы.

Эффективность на модели герпетического кератита. Для оценки влияния Циклолип на воспалительные заболевания роговицы использована модель экспериментального герпетического кератита на кроликах. В качестве инфицирующего агента применили вирус герпеса простого 1 типа, штамм "Коптев". На 3-й сутки после инфицирования, когда развивалась картина поверхностного кератита, кроликов делили на 3 равноценные по клиническим признакам группы, по 5 кроликов (10 глаз) в каждой. Опытная группа в качестве лечения получала Циклолип, вторая группа - ИДУ-Офтан, контрольная группа - плацебо. В качестве критериев терапевтической оценки рассматривали: возможность предупреждать образование изъязвления и развитие иридоциклита, сроки эпителизации. Установлено, что инсталляция глазных капель Циклолип не осложняла течение экспериментального офтальмогерпеса кроликов, не задерживала сроки эпителизации роговицы и в некоторой степени снижала тяжесть течения воспалительного процесса.

Эффективность на модели аутоиммунного переднего увеита, развивающегося на введение разрешающей дозы аллергена в переднюю камеру. На 3-ий день, на фоне клинической картины переднего увеита, кролики были разделены на 3 группы. Ежедневно инсталлировали 4 раза в день: в первой группе - Циклолип, во второй - масляный циклоспорин 2%, третья группа оставалась без лечения - контроль. Оценивали по трехбалльной системе тяжесть следующих признаков: раздражение глаз, преципитаты на роговице, помутнение влаги передней камеры, изменения радужки, синехии, ширину зрачка, внутриглазное давление. Циклоспорин приводит к более быстрому разрешению явлений ирита. Отмечена одинаковая эффективность Циклолип (0,2% циклоспорина) и масляных капель 2% циклоспорина, однако масляные капли циклоспорина переносятся хуже, чем Циклолип, вызывают раздражение, глаз. '

Эффективность при экспериментальной кератопластике.

В I серии опытов производилась послойная кератопластика 6 мм с гомотрансплантатом ira ингактных глазах. Операцию проводили одновременно на обоих глазах. Состояние глаз оценивали на день 3, 6, 9, 12, 14, 20. Существенной разницы в состоянии глаз, находящихся в разном клиническом режиме, отмечено не было. На глазах, получавших Циклолип, отек трансплантата и окружающей роговицы был выражен в несколько меньшей степени. По оценке на 12-й день разница практически не определялась.

tío I! серии опытов производилась послойная пересадка роговицы С гетеротрансплантатом, т.е. в заведомо несовместимых условиях, обычно заканчивающихся быстрым отторжением трансплантата. Операция выполнялась на обоих глазах кроликов, в качестве трансплантата использовали свиную роговицу. На глазах, получавших Циклолип, отек роговицы оставался легким по рубцу в течение 2-х недель наблюдений. В контрольных глазах наблюдали бурную реакцию отторжения трансплантата: отек лоскута и его помутнение, утолщение в 1,5-2 раза, отек роговицы реципиента, активную неоваскуляризацию.

В Ш серии опытов производили сквозную кератопластику на модели васкуляризированного помутнения роговицы после химического ожога глаза. Кератопластику производили спустя 3 месяца после ожога глаз в условиях формирования интенсивного помутнения роговицы с обильной васкуляризацией и участками дефекта эпителия. Па глазах, получавших Циклолип, трансплантат оставался прозрачным, врастания сосудов не отмечено. На контрольных глазах, получавших плацебо, уже после первой недели отмечен выраженный отек трансплантата и легкий отек роговицы реципиента, обнаружено врастание сосудов до половины поверхности трансплантата. Таким образом, опыты на кроликах в различных условиях кератопластики показали, что инсталляция глазных капель Циклолип обеспечивает значительно лучшее приживление трансплантата и предупреждает болезнь трансплантата.

Исследование методом лазерного корреляционного анализа влаги передней камеры кроликов после кератопластики показало большое количество иммуноглобулинов с высокой молекулярной массой, являющихся медиаторами воспаления, в контрольной группе, в то время как в группе, получавшей Циклолип, их присутствия обнаружено не было. Полученные данные позволяют предположить, что липосомальный циклоспорин проникает в глазные жидкости и подавляет иммунный ответ, приводящий к болезни и отторжению трансплантата.

Проведенные экспериментальные доклинические исследования показали, что глазные капли Циклолип хорошо переносятся тканями глаза, не оказывают нежелательного действия на функции глаза и защитный белковый состав слезы, не задерживают реэпителизации скарифицированной роговицы и заживления раны роговицы, обладают хорошей общей толерантностью.

Благодаря выраженному специфическому действию глазные капли Циклолип оказывают терапевтический эффект на различных экспериментальных моделях: неоваскуляризация роговицы, дозированный ожог роговицы, герпетический кератит, передний аутоиммунный увеит, послойная и сквозная кератопластика.

Результаты экспериментальных доклинических исследований вошли в нормативно - технические материалы Временной Фармакологической статьи, направленной в Фармакологический Комитет Минздрава России.

Оценка первой фазы клинических испытаний эффективности, толерантности и аллергизнрующего действия глазных капель Циклолип

Учитывая, что в перечень воспалительных аллергических аутоиммунных заболеваний глаз, при которых рекомендовано провести клинические испытания, включены: увеиты, склериты, кератиты, язва роговицы, аллергические конъюнктивиты, сухой кератоконъюнктивит, а также

кератопластика в условиях риска отторжения трансплантата, такие испытания в полном объеме потребуют месяцы наблюдений, особенно за последней группой больных. Поэтому, для Фармакологического Комитета подготовлен отчет по оценке первой фазы клинических испытаний эффективности и толерантности в лечении 68 больных.

Показана эффективность глазных капель Циклолип в лечении больных с увеитами (17), в том числе с рецидивирующим гипопион-увситом при болезни Бехчета, с кератоувеитами (15), с кератитами, главным образом со стромальными (18), с язвой Мурена, при болезни трансплантата, эписклеритах, аллергическом и сухом кератоконъюнктивитах. Глазные капли Циклолип закапывали при острых воспалениях глаз 6-8 раз в день, снижая число инсталляций к концу первой недели до 4 раз в день, при необходимости, в состоянии ремиссии продолжали применять Циклолип 2 раза в день. При инфекционных кератитах инсталляции Циклолип сочетали с противоинфекционнойтерапией.

Инсталляции глазных капель Циклолип 4-6 раз в день' хорошо переносятся больными. Не обнаружено токсического или аллергического действия препарата. Ни в одном случае препарат не отменялся по причине общей или местной непереносимости. У 45 больных, получавших Циклолип, поставлены кожные аллергологические пробы. Положительная реакция обнаружена только у одного больного, в то время как у ряда больных выявлена повышенная чувствительность к другим глазным препаратам (до 15,4%).

Проведенные экспериментальные исследования и клинические наблюдения позволяют рекомендовать в офтальмологическую практику мощный иммуносупрессивный препарат циклоспорин в новой лекарственной форме - липосомальные глазные капли - Циклолип. Использование липосомалыюй суспензии повышает транспорт препарата в ткани глаза, что позволяет в 10 раз, до 0,2%, уменьшить концентрацию циклоспорина при той же эффективности, что и принятые за рубежом 2% масляные капли. Причем, в

отличие от последних, переносимость Циклолип гораздо лучше в связи с уменьшением лекарственной дозы препарата и отказом от масляной основы, нередко вызывающей раздражение глаз.

Внедрение в практику глазных капель Циклолип позволит отказаться, по крайней мере в большинстве случаев, от необходимости системного применения Циклоспорина, часто вызывающего тяжелые осложнения,

I

требующие постоянного лабораторного контроля для дозирования, имеющее большое число ограничений и высокую стоимость лечения.

Липосомальная лекарственная глазная форма экономически более выгодна, ее применение не требует лабораторного контроля дозирования у больных, не имеет противопоказаний, позволяет длительное применение, что необходимо при аутоиммунных заболеваниях. Липосомальная глазная форма обеспечивает более высокую эффективность благодаря повышению биодоступности препарата и более высокой внутриглазной абсорбции.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования и первые клинические наблюдения • показали перспективность внедрения в офтальмологическую практику принципиально новой лекарственной формы

I

мощного иммунодепрессанта циклоспорина - липосомальные глазные капли Циклолин.

ВЫВОДЫ

1. Липосомальные глазные капли циклоспорина - Циклолип - обладают хорошей толерантностью в хроническом опыте до 3-х месяцев, хорошо переносятся тканями глаза, не оказывают токсико-аллергического воздействия на роговицу, не оказывают общего токсического действия. Конфокальная прижизненная микроскопия и гистологические исследования не выявили патологического влияния на структуры глаза.

2. Глазные капли Циклолип не оказывают нежелательного воздействия на белковый состав слезы по данным капиллярного электрофореза и лазерной

молекулярно-весовой спектрометрии, не оказывают влияния на ширину зрачка и уровень внутриглазного давления, не задерживают реэпителизацию эрозии роговицы и заживление разреза роговицы.

3. Обладая выраженным иммуносупрессивным действием, глазные капли Циклолип оказывают терапевтический эффект на различных экспериментальных моделях: неоваскуляризация роговицы, дозированный химический ожог роговицы, герпетический кератит, передний аутоиммунный увеит.

4- В опытах с послойной кератопластикой с гомо- и гетеротрансплантатом на интактных глазах и сквозной кератопластикой в условиях высокого риска отторжения инсталляция глазных капель Циклолип обеспечивает значительно лучшее приживление трансплантата и предупреждает болезнь трансплантата. Методом лазерного корреляционного анализа влаги передней камеры при пересадке роговицы показано, что липосомальньтй циклоспорин подавляет иммунный ответ, приводящий к болезни и отторжению трансплантата.

5. Результаты экспериментальных исследований, показавшие местную и общую толерантность глазных капель Циклолип и выявившие терапевтическую иммуносупрессивную активность на различных моделях заболеваний глаз, разработанные программа клинических испытаний и инструкция но применению вошли в нормативно-технические документы, на основе которых Фармакологический Комитет Минздрава России разрешил клинические испытания липосомальных глазных капель циклоспорина - Циклолип.

6. Анализ клинических испытаний глазных капель Циклолип, примененных у 68 больных, показал эффективность препарата в лечении воспалительных заболеваний глаз с иммунными нарушениями. Глазные капли Циклолип хорошо переносятся больными, не обнаружено токсического или аллергического действия препарата.

. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Майчук Д.Ю. Экспериментальная оценка липосомального препарата глазных капель циклоспорина. // XL итоговая студенческая научная конференция. Тезисы. -Москва-1992.-С.40.

2. Maitchouk D.Y., Beresovskaja L.N., Chabrova L.S., Jarceva N.S. Experimental assessment of topical liposomal cyclosporin. // 10th International Congress of Eye Research. Abstracts,-Italy.-1992.-P.56.

3. Майчук Д.Ю., Ярцева H.C. Крупнопапиллярный конъюнктивит: дифференциальная диагностика и лечение. // Офтальмол. acypH.-1993.-N2.-С.115-118.

4. Chabrova L.S., Maichuk D.Y., Beresovskaja L.N. Ocular topical liposomal, cyclosporin. // International Symposium on Methods to Overcome Biological Barriers in Drug Delivery. -Finland.-1993 .-P.94.

5. Чаброва Л.С., Майчук Д.Ю., Березовская Л.Н., Джавришвили Г.В. Экспериментальная оценка липосомальной глазной формы циклоспорина при кератопластике. // VI съезд офтальмологов России. Тезисы.- Москва -1994.-С.325.

6. Maitchouk D.Y. Use of the liposome-encapsulated form of cyclosporin. // 27th International Congress of Ophthalmology. Abstracts. -Canada.-1994.-P.164.

7. Майчук Д.Ю. Липосомальный циклоспорин в профилактике и лечении болезни роговичного трансплантата. // II Российский национальный конгресс "Человек и Лекарство". Тезисы.-Москва.-1995.-С.280-281.

Maitchouk D.Y. Liposomal Cyclosporin Eye Drops in experimental corneal bums. // 10th Congress European Society of Ophthalmology. Abstracts.-Italy.-1995.-P.245.

9, Щипанова А.И., Майчук Д.Ю. Липосомальный циклоспорин при экспериментальном офтальмогерпесе кроликов. // III Российский национальный конгресс "Человек и Лекарство". Тезисы.-Москва.-1996. -С.244.

10. Майчук Д.Ю. Циклоспорин в терапии глазных болезней. // Офтальмол. журн.-1996.-N5-6.-C.316-320.

11. Майчук Д.Ю., Мороз З.И. Циклоспорин при кератопластике (обзор литературы). // Офтальмохирургия.-1996.-Ш.-С.56-63.

12. Maitchouk D.Y., Varnell R.J., Beuerman R.W., Yan J. Analyzing proteins in tears from patients with dry eye syndrome, with contact lenses, or undergoing photorefractive keratectomy. // ARVO Abstract.-1996.-P.18.

13. Varnell R.J., Maitchouk D.Y., Beuerman R.W., Carlton J.E., Haag A. Analysis of rabbit tear proteins using capillary electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. // ARVO Abstract.-1996.-P.848.

14. Maitchouk D.Y., Varnell R.J., Beuerman R.W. Capillary electrophoretic analysis of proteins in tear fluid before and after wounding of the cornca. // 8th Annual LSU Neuroscience Center Retreat. Abstract. -1996.-P.64.

15. Щипанова А.И., Майчук Д.Ю. Эффективность липосомального и мазевого циклоспорина при экспериментальном увейте. // IV Российский национальный конгресс "Человек и Лекарство". Тезисы.-Москва.-1997.-С.305.

16. Kaufman S.C., Maitchouk D.Y., Yaylali V., Beuerman R.W., Laird J. Confocal Microscopic Analysis of Corneal Neovascularisation in Rabbits. // ARVO Abstracts.-1997.-P.645.

17. Yaylali V., Maitchouk D.Y., Kaufman S.C., Beuerman R.W., Laird J. Coniocal Microscopy of the Rabbit Conjunctiva and Cornca and the Response to Wounding. // ARVO Abstracts.-1997.-P.742.