Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Клинико-иммунологические особенности течения острого иксодового клещевого боррелиоза в Приморском крае

На правах рукописи

МАНДРАКОВА НАДЕЖДА ВЛАДИМИРОВНА

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА В ПРИМОРСКОМ КРАЕ

14.00.36 - аллергология, иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток - 2005 г.

Работа выполнена в ГОУ ВПО Владивостокском государственном медицинском университете Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Маркелова Елена Владимировна

Научный консультант:

кандидат медицинских наук Иванис Виктория Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Потапов Владимир Николаевич доктор медицинских наук, профессор Леонова Галина Николаевна

Ведущее учреждение: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л. Пастера, г. Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится" " (Хи^^Д- 2005 г. в ^ часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.007.02 при ГОУ ВПО «Владивостокском государственном медицинском университете» МЗ и СР РФ по адресу 690990, г. Владивосток, проспект Острякова,2 (главный корпус).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета (корпус 3).

Автореферат разослан _" 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат медицинских наук, доцент / ^ / Р.Н. Диго.

'Актуальность проблемы.

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) - инфекционное, природно -очаговое, трансмиссивное заболевание человека, вызываемое спирохетами из рода Borrelia. Важность и актуальность этой инфекцйи определяется широким ее распространением в мире, высоким уровнем заболеваемости, частотой формирования хронических форм (3-60%) и возможной последующей инвалидизацией пациентов (Ананьева Л.П.,1995, Волегова Г.М., 1993, Коренберг Э.И., 1996, Лесняк О.М.,1995).

Полиморфизм клинических проявлений с поражением многих органов и систем (кожи, опорно-двигательного аппарата, нервной системы, сердечнососудистой системы, печени), склонность к рецидивирующему течению обуславливают значительные трудности в первичной диагностике болезни, особенно у пациентов, в клинике которых отсутствует патогномоничный первичный аффект - кожная мигрирующая эритема (МЭ).

С момента первых описаний ИКБ наиболее полные клинико-эпидемиологические исследования проведены в Северной Америке и Западной Европе. В России очаги ИКБ регистрируются повсеместно от Калининградской области до Южного Сахалина, где занимает одно из первых мест среди трансмиссивных природно-очаговых зоонозов (Коренберг Э.И., 1996,2001).

Отмечены различия в клиническом течении и исходах заболевания в различных регионах, что, вероятно, обусловлено видовым разнообразием боррелий (Коренберг Э.И., 1993, Воробьев H.H., 1998).

Ландшафтно-географические особенности Приморского края, высокая численность переносчиков возбудителя - клещей Ixodes persulcatus способствуют стабильно высокой заболеваемости ИКБ. Средний многолетний показатель составляет 8,8±0,83%о, превышая таковой по РФ в 1,7 раза (5,3±0,08 %о).

Интенсивное изучение ИКБ в последние годы выявило ряд наиболее дискутабельных проблем инфекции: клинической и лабораторной диагностики, механизмов персистирования боррелий, участия иммунокомпетентных клеток в патогенезе i го ответа, эффективного лечения.

Проведение комплексных исследований, направленных на решение этих проблем на территории Приморского края, представляется весьма важным и актуальным для науки и практического здравоохранения. Цель исследования:

Охарактеризовать некоторые аспекты иммунопатогенеза иксодового клещевого боррелиоза на территории Приморского края. Задачи исследования.

Г. Исследовать и установить значение в иммунопатогенезе разных форм ИКБ комплекса показателей клеточного иммунитета с идентификацией популяций и субпопуляций лимфоцитов С03,С04, СЭ8, СБ 16, С022 и экспрессии на них активационных маркеров СБ25, СЭ54, СЭ95.

3. Исследовать количественные показатели фагоцитоза и состояние кислородзависимых механизмов бактерицидности нейтрофилов у больных ИКБ.

4. Исследовать и оценить степень изменения факторов гуморального звена иммунитета: содержание основных классов иммуноглобулинов, уровень и размеры свободно циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и их взаимосвязь с уровнем специфических антител.

5. Оценить результаты мониторинга содержания в сыворотке крови цитокинов (ИЛ-4, ИНФ-у, ФНО-а) у больных с разными формами ИКБ.

6. Выявить степень информативности и роль в патогенезе ИКБ биохимического маркера воспаления и повреждения - оксида азота (N0). Научная новизна.

Впервые на основании комплекса иммунологических исследований проведена оценка состояния клеточного и гуморального звеньев иммунитета у больных ИКБ, выявленных на территории Приморского края, в зависимости от срока болезни и клинической формы (эритемной -ЭФ и безэритемной - БЭФ). Показано преобладание гиперактивации клеточных механизмов иммунного ответа при БЭФ, что предполагает большую вероятность диссеминации возбудителя и пролонгированность течения болезни.

Впервые проведен мониторинг цитокинов (ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-4) в сыворотке крови у больных ИКБ в Приморском крае, что позволило установить различные типы иммунного ответа при ЭФ и БЭФ и расширяет представления о функционировании цитокиновой сети при ИКБ.

Впервые проведенное динамическое определение содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче больных ИКБ свидетельствует о системном воспалительном ответе и может служить дополнительным критерием прогнозирования дальнейшего течения болезни.

Выявлены особенности гуморального ответа при разных клинических формах ИКБ и его сопряженность с динамикой титров специфических антител.

Практическая значимость работы:

На основании подробной клинико-иммунологической характеристики различных клинических форм острого 'периода ИКБ оптимизирована диагностика заболевания на госпитальном этапе. Степень активации показателей клеточных факторов иммунитета может служить дополнительным маркером диагностики клинических форм ИКБ. Для ЭФ характерно: увеличение уровня CD8, CD16, CD22, значительное повышение CD25, CD54, С095-лимфоцитов при нормальных показателях CD4 и тенденции к снижению уровня CD3. Также при ЭФ наблюдалось достоверное увеличение уровня IgA, IgM и ЦИК, недостаточная активность кислородзависимых механизмов бактерицидности. При БЭФ на фоне нормального уровня CD3 и низких показателей спонтанного НСТ-теста, регистрируется значительное (в 5-6 раз) повышение остальных показателей клеточного звена иммунитета при высоких показателях ЦИК, преимущественно крупных размеров, тогда как увеличение иммуноглобулинов всех классов регистрируется только на 2-й неделе заболевания и коррелирует с нарастанием титров специфических антител. Мониторинг уровня N0 в моче и сыворотке крови является дополнительным диагностическим и прогностическим критерием, который необходимо исследовать как у больных, так и у реконвалесцентов ИКБ.

-з-

Выявленные изменения предопределяют возможность применения иммунокоррегирующей терапии, особенно при БЭФ ИКБ. Экспериментально в НСТ-тесте обоснована возможность коррекции нарушений кислородзависимых механизмов активации нейтрофилов рекомбинантным ИЛ-2. Апробация материалов диссертации проведена на различных научных форумах международного, российского, регионального уровней: Международных:

Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (г. Пермь, 2003);

- Научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (г. Санкт-Петербург, 2004);

Российских:

- Российской научно-практической конференции «Клещевые боррелиозы» (г. Ижевск, 2002);

- IV Российской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (г. Сочи, 2003);

- X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2003);

Региональных:

- IV Российском съезде врачей-инфекционистов (г. Санкт-Петербург, 2003);

- IV Научно-практической конференции "Инфекционная патология в Приморском крае" (г. Владивосток, 2004);

- на заседании общества инфекционистов (г. Владивосток, 2004);

- на Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (г. Владивосток, 2004).

Публикации.

По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, в том числе 5 статей.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 130 страницах машинописного текста, проиллюстрирован 22 таблицами и 7 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций практическому здравоохранению, указателя литературы (131 отечественных и 113 иностранных источников). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ведущим механизмом патогенеза ИКБ является сложный комплекс активации иммунной системы. Выявлена гиперактивация клеточного иммунитета у больных ИКБ, особенно при БЭФ и недостаточная активность кислородзависимых механизмов бактерицидности фагоцитирующих клеток, предполагает возможность пролонгирования инфекционного процесса и персистенции возбудителя.

2. В иммунопатогенезе острого иксодового клещевого боррелиоза определяющую роль играют особенности соотношения продукции оппозитных цитокинов (ИЛ-4, ИНФ-у). У больных с ЭФ ИКБ, включая ранний период заболевания, наблюдается Th2 иммунный ответ, а при БЭФ -смешанный Thl/Th2 тип.

3. Изменения гуморального звена иммунитета зависят от клинической формы ИКБ. Определение высокого уровня ЦИК, преимущественно крупных размеров, особенно при БЭФ, может способствовать усилению процессов диссеминации возбудителя и возможности органных поражений.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

В соответствии с поставленными в работе задачами в исследование были включены 108 больных с острым иксодовым клещевым боррелиозом, находившихся на стационарном лечение в инфекционном отделение Краевой клинической больницы №2 (ККБ №2) и неврологическом отделение Краевой клинической больницы №1 (ККБ №1).

Из них 63 (58,4±4,7%) составили лица мужского пола и 45 (41,б±4,7%) -женского. Диагноз ИКБ устанавливали на основании комплекса клинико-эпидемиологических данных, а также результатов лабораторной верификации диагноза.

У 100% больных с БЭФ и 78% с ЭФ диагноз ИКБ подтвержден серологически нарастанием титра специфических антител в 4 раза и более в парных сыворотках крови, взятых с интервалом в 10-12 дней в НМФА.

Контрольную группу составили 50 человек доноров Краевой станции переливания крови. Средний возраст группы здоровых доноров и их соотношение по половому признаку были сопоставимы с обследуемыми больными.

Возрастной диапазон больных колебался от 15 до 79 лет (рис.1). Чаще болели лица 40 лет и старше: 40-49 лет (18,2±3,7%), 50-59 лет (18,6±3,7%), > 60 лет (24,5±4,1%). Наблюдается тенденция к увеличению удельного веса пожилых людей в структуре заболеваемости ИКБ, что можно объяснить проживанием на дачных участках лиц данной возрастной категории. Кроме того, старение организма сопровождается развитием иммунологической недостаточности, учащением аутоиммунных реакций, что может приводить к повышенной чувствительности к инфекциям в пожилом возрасте (Дунаевский O.A., 1981).

18,20%

015-19 лет □ 20-29 лет 0 30-39 лет Н 40-49 лет 050-59 лет ®> 60 лет

Рис.1. Возрастная структура больных ИКБ.

Среди больных преобладали городские жители - (79,6±3,9%) человек и

меньшее число пациентов, проживающих в сельской местности (20,4±3,9%).

Проведенный анализ заболеваемости ИКБ на территории Приморья

свидетельствует о том, что данная инфекция регистрируется на большинстве

-6-

административных территорий края. Рассматривая динамику заболеваемости И КБ в Приморском крае, мы подтвердили её волнообразные колебания по годам с максимальными показателями в 1999 и 2000 г. г., соответственно 10,1 и 11,7 на 100 тыс. населения (рис. 3).

И Российская Федерация □ Приморский край

Рис. 2. Заболеваемость ИКБ в Российской Федерации и Приморском крае (на 100 тысяч населения) за период 1999-2004 гг. Тяжесть заболевания у всех больных была классифицирована, как среднетяжелая. Известно, что патогномоничным симптомом раннего периода ИКБ является мигрирующая эритема (МЭ) появление которой прямо связано с присасыванием клеща. Наличие МЭ явилось признаком условного разделения больных на 2 клинические формы: эритемную (ЭФ) и безэритемную (БЭФ). В нашем наблюдении наличие МЭ отмечено у 74 (68,5±4,5%) больных и у 34 пациентов (31,5±4,5%) ИКБ протекал в БЭФ. Инкубационный период варьировал от 1 до 26 дней (10,0±1,5 дня). У большинства больных с ЭФ болезни (80,0±4,9%) он не превышал 2 недель. Средняя продолжительность составила 6,2±0,6 дней, при БЭФ 8,0±1,2 суток, причем достоверных различий длительности инкубационного периода при этих двух формах ИКБ получено не было (р>0,05). У 18 (16,6±3,6%) больных длительность этого периода болезни установить не удалось, так как у них не было в анамнезе присасывания клеща. У больных ЭФ заболевание в 79,8±4,7% случаев развивалось постепенно, и только у 20,2±4,7% - остро. Среди пациентов с БЭФ постепенное начало было отмечено реже - (52,9±8,6%), а острое

встречалось вдвое чаще - (47,1 ±8,6%). МЭ, как правило, располагалась в месте присасывания клеща и у 65 больных (87,8±3,8%) сочеталась с первичным аффектом, который, в зависимости от времени снятия клеща имел вид папулы, пигментированного пятна или корочки. Размеры эритемы варьировали от 3 до 30 см. Чаще возникновение эритемы не сопровождалось субъективными ощущениями, длительность существования МЭ составила от в среднем - 13,5±1,6 дней. Причем у 18,5% больных наблюдалась радиальное распространение ("ползучесть") МЭ. Наиболее часто МЭ располагалась на туловище - (67,6±5,4%) и конечностях - (20,3±4,7%), реже на голове -(6,8±2,9%) и шее - (4,1±2,3%). Типичный вид кольцевидной эритемы отмечен у в 29,7±5,3% пациентов. У большинства больных 70,2±5,3% окраска МЭ была гомогенной. У 8,1±3,2% отмечалось появление вторичных эритем. Появление МЭ сопровождалось регионарным лимфаденитом у 21,6±4,8% больных.

Клинические проявления у больных ИКБ в Приморском крае представлены в таблице 1. Среди перечисленных в таблице симптомов повышение температуры тела наблюдалось у большинства больных ЭФ (82,4±4,4%) и у всех с БЭФ болезни (р<0,001). Высота и продолжительность лихорадки оказались достоверно больше у пациентов с БЭФ. Следует отметить, что головная боль значительно чаще наблюдалась у больных БЭФ (85,2±6,1%) по сравнению с ЭФ - 63,5±5,6% (р<0,001). Подобная закономерность наблюдалась и при рассмотрении частоты миалгии, артралгии.

Сердечно-сосудистые нарушения в острую фазу ИКБ проявлялись болями в области сердца, сердцебиением, одышкой, головокружением, артериальной гипертензией. Отмечались боли в сердце, одышка, повышение артериального давления в начале заболевания. Представляло интерес выяснение частоты этих симптомов в зависимости от клинической формы ИКБ. Установлено, что кардиалгии одинаково часто встречались у больных разными формами болезни 8,1±3,2 и 17,6±6,5 (р>0,05). Они, как правило, были кратковременные, чаще колющего характера. Также не выявлено достоверной разницы частоты встречаемости таких симптомов, как одышка и повышение

артериального давления в зависимости от формы ИКБ (р>0,05), Продолжительность ведущих симптомов составила в среднем 5±1,3 дней.

Таблица 1.

Клинические проявления раннего периода ИКБ.

Клинические формы ИКБ

Симптомы ЭФ БЭФ

Абс. %, М±ш Абс. %, М±т Р

Лихорадка 61 82,4±4,4 34 100,0 <0,001

Озноб 29 39,2±5,7 20 58,8±8,4 >0,05

Головная боль 47 63,5±5,6 29 85,2±6,1 <0,001

Слабость и недомогание 42 56,8±5,8 18 52,9±8,6 >0,05

Миалгии 30 40,5±5,7 25 73,5±7,6 <0,01

Артралгии 21 28,4±5,2 17 50,0±8,6 >0,05

Головокружение 14 18,9±4,6 10 29,4±7,8 >0,05

Тошнота 3 4,1 ±2,3 3 8,8±4,9 >0,05

Катаральный синдром 5 6,8±2,9 4 11,8±5,0 >0,05

Кардиалгии 6 8,1 ±3,2 6 17,6±6,5 >0,05

Одышка 3 4,1 ±2,3 2 5,9±4,0 >0,05

Изменения на ЭКГ: 23 31,1±4,5 18 52,9±8,6 <0,05

- брадикардия 16 21,3±4,8 3 8,8±4,9 <0,05

- тахикардия 3 4,1 ±2,3 3 8,8±4,9 >0,05

- АУ- блокада 1 1,4±0,3 1 2,9±1,2 >0,05

- блокада пр.ножки Гисса 3 4,1±2,3 1 2,9±1,2 >0,05

Неврологические симптомы:

- корешковый синдром 3 4,1±2,3 - -

-астеновегетативный синдром 9 ^2,1 ±3,7 10 29,4±7,8 <0,05

Гепатомегалия 10 13,5±3,9 8 23,5±2,3 <0,05

Цитолиз 8 10,8±3,6 7 20,6+6,9 >0,05

Примечание: Р - статистическая достоверность различий показателей в группах ЭФ и БЭФ.

Анализ результатов ЭКГ проведен у пациентов до 50 лет, у которых в анамнезе нет заболеваний сердца. Различные нарушения на ЭКГ были выявлены впервые у 31,1±4,5% больных с ЭФ и у 52,9±8,6% пациентов с БЭФ (р<0,05). Наиболее часто регистрировались нарушения сердечного ритма.

Поражения нервной системы также статистически достоверно чаще регистрировались у пациентов с БЭФ ИКБ, в виде выраженного астеновегетативного синдрома (29,4±7,8 % против 12,1±3,7 % , р<0,05). Мы отметили случаи выраженного корешкового синдрома у 3 больных с ЭФ (4,1±2,3 %) и неврита тройничного нерва у 1 пациента с БЭФ.

Гепатомегалия наблюдалась достоверно чаще у больных с БЭФ (20,6±6,9 % против 13,5±3,9 %, соответственно, р<0,05). У пациентов этой группы мы выявили цитолиз.

Таким образом, отличительными особенностями клинических проявлений ЭФ и БЭФ ИКБ раннего периода болезни являются короткий инкубационный период у больных ЭФ, а у больных с БЭФ статистически достоверно чаще и по продолжительности длиннее была лихорадка и поражения внутренних органов.

Всем пациентам, находившимся под наблюдением, проводился мониторинг клинико-иммунологических показателей: на 5 и 10 день болезни, через 6 месяцев. Направления, методы и объем исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Направления, методы и объем исследований.

№ Направление исследования Методы исследования Объем работ

1 2 3 4

1. Клинико- биохимические исследования 1 .Комплексное клинико-лабораторное обследование больных и лиц контрольной группы в динамике. 108 человек 108 человек

2. Серологическая диагностика ИКБ 2.0пределение антител к В. Burgdorferi непрямым методом флюоресцирующих антител 158/948 чел/проб

- ю-

(НМФА).

3. Характеристика клеточного звена иммунитета. 3.Оценка уровня В-лимфоцитов (CD22); 4.0пределение Т-лимфоцитов (CD3) и их субпопуляций (CD4, CD8); 5.Определение маркеров активации иммунокомпетентных клеток (CD25, CD95); б.Определение количества натуральных киллеров (CD 16); 7.0ценка уровня CD 54 -рецептора молекулы адгезии по А.А. Тотоляну с соавт. (1999) иммунолюминесцентным методом. 98/98 ■>■ чел/проб 196/196 чел/проб 196/196 чел/проб. 98/98 чел/проб 98/98 чел/проб

4. Характеристика гуморального звена иммунитета. 8.0пределение Ig М, Ig G, Ig А методом радиальной иммунодиффузии по G. Mancini (1965). 9.0пределение содержания циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови методом осаждения в ПЭГ - 6000 по Ю.А. Граневич, А.Н. Алферову (1981). Ю.Определение размера ЦИК по их осаждению в 3% и 4% ПЭГ-6000 методом JT.B. Стручкова с соавт. (1985). 80/480 * чел/проб 80/160 чел/проб 80/160 чел/проб

5. Характеристика фагоцитарной активности нейтрофилов 11.Оценка количественных показателей фагоцитоза (ФП, ФЧ). 12.Оценка кислородзависимых механизмов бактерицидности в НСТ-тесте по методу К.А. Лебедева с соавт. (1981). 80/320 чел/проб 80/220 чел/проб

6. Характеристика цитокинового статуса 13 .Определение содержания ИЛ-4, ИНФ-у, ФНО-а в сыворотке крови методом сендвич - варианта твердофазного ИФА по Т. Mossman (1998) с использованием реактивов «R&D Diagnostics Inc.». 80/270 чел/проб

7. Характеристика показателей окислительного метаболизма. М.Определение стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче спектрофотометрическим методом с использованием реактива Грейса (Roders N.E., et al., 1992; Brett S.J. et al., 1998, Tonisen L.L. et al.; Gratziou C. et al, 1999). 95/280 чел/проб

8. Статистическая обработка материала. 15.Математическая обработка полученных показателей проводилась методами описательной, вариационной статистики, на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5» и «Biostat». Для определения направления и формы связи между отдельными качественными признаками, измерению ее тесноты и оценки статистической значимости различий полученных результатов использовали метод корреляционного анализа — критерий j2 (Гланц С., 1999). Все показатели

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ведущим фактором в патогенезе ИКБ многие авторы считают (Коренберг Э.И., 1996, Якушева С.С., 2002, Steere A.C., 2000) не только повреждающее действие самого микроорганизма, но и характер иммунного ответа макроорганизма. Результаты комплексных исследований иммунного ответа выявили следующие события в раннюю стадию ИКБ.

При исследовании первой линии клеточной защиты — фагоцитоза, у больных с иксодовым клещевым боррелиозом была установлена статистически достоверная активация его количественных показателей (рис.3). Однако, повышение фагоцитарного показателя (ФП) и фагоцитарного числа (ФЧ) не зафиксировало зависимости от клинической формы болезни.

Доноры ЭФ БЭФ

| аа>п(%) ифч (ч.л.) \

Рис.3. Показатели фагоцитоза у больных с разными клиническими формами ИКБ.

У больных ИКБ в острой фазе болезни зарегистрировано снижение показателей спонтанного НСТ - теста (р<0,001), что свидетельствует о недостаточной активности кислородзависимых механизмов бактерицидности фагоцитирующих клеток in vivo, наиболее выраженных у больных БЭФ ИКБ. Инкубация лейкоцитов с рекомбинантным ИЛ-2 (в дозе 10 мкг/мл) in vitro обеспечила существенную активацию фагоцитирующих клеток и достоверное увеличение фагоцитарного резерва (рис.4).

Рис.4. Показатели НСТ-теста у больных с ИКБ в разные сроки болезни (ОДх103).

У больных с ИКБ в ранней стадии болезни установлена высокая степень активации иммунокомпетентных клеток, опосредующих все события раннего

иммунного ответа (табл. 3). Увеличивались не только клетки с цитотоксической функцией (С08,СБ16), но и Т-хелперы (СЭ4), В-лимфоциты (С022).

Таблица 3.

Показатели основных популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток у больных ИКБ, в зависимости от клинической формы.

Исследуемые параметры Доноры Больные ИКБ Р

ЭФ БЭФ

CD3 (г/л) (%) 1,37±0,16 ' 64,2±0,7 1,2±0,09 59,5±1,9 1,44±0,2 59,5±3,3 >0,05 >0,05

CD4 (г/л) (%) 0,85±0,09 38,5±0,9 0,8±0,07 49±2,5** 1,53±0,2*** 63,0±4,8*** <0,001 <0,01

CD8 (г/л) (%) 0,65±0,08 30,2±0,6 0,9±0,08* 52,4±2,4*** 1,43±0,3*** 54,9±4,5*** >0,05 >0,05

CD 16(г/л) (%) 0,3±0,03 14,0±0,4 0,9±0,1* 57,3±3,8 1,6±0^*** 65,6±2,7 <0,001 <0,05

CD22 (г/л) (%) 0,28±0,05 13,4±0,5 0,9±0,07*** 48,9±2,8*** 1,3±0,1*** 49,5±3,5*** <0,001 >0,05

Примечание: 1) Статистическая достоверность различий показателей с группой доноров: р<0,05 - *; р<0,01 - **; р<0,001 - ***. 2) Р - статистическая достоверность различий показателей в группах по клинической форме заболевания.

Выявлена гиперактивация факторов клеточного иммунитета (рис.5) у больных ИКБ. Так, в общей группе больных маркеры активации (СЭ95, СБ54) превышали показатели здоровых в 3-9 раз. Однако, активация была существенно ограничена высоким уровнем маркера апоптоза С095 (в 3 - 5 раза). Значительные сдвиги соотношений маркеров активации и апоптоза выявлены при БЭФ.

Рис. 5. Показатели экспрессии маркеров активации иммунокомпетентных клетках у больных ИКБ в зависимости от клинической формы (г/л).

Так, у больных с БЭФ существенно увеличен и уровень экспрессии маркеров

активации клеток (CD25,CD54). На этом фоне установлено значительное (в 5

раз) увеличение уровня CD95, что можно рассматривать, как механизм

ограничения активации иммунной системы. Однако степень его повышения

превалирует над степенью увеличения других маркеров активации.

Повышение CD25 при резком повышение CD95 может привести к развитию

индукционно-активационного апоптоза.

Выявлена прямая средняя корреляционная связь между уровнем CD16 и CD22 в крови больных ИКБ общей группы (г=0,75, р<0,001), при этом не отмечено корреляционной связи между количеством CD22 и IgA (г=0,14, р>0,05), IgM (r=0,22, р>0,05) IgG (г=0,3, р>0,05). Выявлена прямая средняя корреляционная связь между уровнем CD4 и CD8 в крови больных ИКБ общей группы (г=0,78, р<0,001). Мы считаем, что прямая средняя связь между CD8 и CD95, а также CD95 и CD4 (г=0,62 и г=0,55, р<0,05) закономерна и отражает регуляторные механизмы ограничения гиперфункций клеточно-опосредованных иммунных реакций.

Вопрос о значении гуморального звена иммунитета и роли циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в патогенезе ИКБ остается

важным и спорным до настоящего времени. Нами выявлены особенности гуморального ответа при разных формах ИКБ.

При ЭФ - достоверное увеличение ^А, 1§М (1,3±0,06 г/л против 0,9±0,06 г/л, р<0,001 и 3,0±0,03 г/л против 2,65±0,15 г/л, р<0,05) уже на 1-й неделе болезни (рис.6), с последующим их нарастанием, что подтверждает превалирование ТЬ2 иммунного ответа. При БЭФ в ранние сроки заболевания определяются нормальные показатели ^А (2,6±0,1 г/л), (1,0±0,03 г/л) и тенденция к снижению ^ (9,3±0,2 г/л), уровень которых нарастает позже, на 2-й неделе болезни.

Доноры

1 неделя | 2 неделя Общ.группа

1 неделя | 2 неделя ЭФ

1 неделя | 2 неделя БЭФ

CSIgA

llgM DlgG

Рис.6. Показатели иммуноглобулинов основных классов у больных ИКБ, в зависимости от клинической формы (г/л).

Нами обнаружена связь высокого уровня IgA в крови больных в ранней стадии ИКБ и частоты поражения кожных покровов в месте присасывания клеща (%2 =3,6 при уровне значимости р=0,5, 3-ей степени свободы), а также корреляционная связь средней силы иммуноглобулинов основных классов и титром специфических антител (г=6,4, р<0,01).

Анализ данных результатов исследований ЦИК при различных формах острого ИКБ представлен на рисунке 7. Характерно, что у больных с БЭФ показатели ЦИК в сыворотке крови были выше. Так, на 1-й неделе болезни у больных ЭФ уровень ЦИК был статистически достоверно повышен в 1,8 раза и составил (80,7±1,3 у.е.), а у больных БЭФ в 2 раза - (85,1 ±2,0 у.е.).

-16-

01 неделя □ 2 неделя

Рис. 7. Уровень ЦИК у больных ИКБ в зависимости от клинической формы (усл.ед).

На 2-й неделе заболевания у пациентов с ЭФ и БЭФ уровень ЦИК еще более увеличивался, у больных с БЭФ динамика роста ЦИК статистически достоверно выше (121,54±2,1, р<0,001).

У больных с БЭФ в динамике наблюдения, как на первой неделе (77%), так и на второй (69%), преимущественно регистрировались крупные размеры ЦИК, а у пациентов с ЭФ через неделю превалировал средний размер ЦИК. Мы считаем, что высокий уровень ЦИК преимущественно крупного размера при БЭФ ИКБ свидетельствует о продолжении диссеминации, а, возможно, и персистенции возбудителя, а также инициирует тканевые повреждения в различных органах и системах. Это подтверждается обнаружением связи высокого уровня крупного размера ЦИК в крови больных БЭФ в раннюю стадию ИКБ и длительности общеинтоксикационного синдрома (%2 =10,2 при уровне значимости р—0,01, 1-й степени свободы). Кроме того, установлена обратная средняя корреляционная связь между уровнями ЦИК и ИНФ-у (г=-0,55, р<0,05) у больных с ЭФ и прямая сильная корреляционная связь (г=0,82, р<0,01) у пациентов с БЭФ ИКБ.

Таким образом, выявленная нами динамика ЦИК отражает, с одной стороны, механизмы защиты в отношении чужеродных антигенов, а с другой стороны - нарушение процесса их элиминации у больных с БЭФ ИКБ.

При оценке продукции цитокинов у больных, в зависимости от

-1 / -

клинической формы, отмечены следующие изменения. При ЭФ ИКБ (рис.8) мы отметили повышение ИЛ-4 (10,73±3,0 пг/мл, р<0,01) в 3 раза уже на 1-й неделе болезни, при незначительном повышении - ИНФ-у (19,68±9,8 пг/мл, р<0,05), что позволяет говорить о превалировании ТЬ2-типа иммунного ответа, обеспечивающего защитный эффект и элиминацию возбудителя.

25т"

ФНО-а

ИНФ-у

ИЛ-4

9 Доноры П1 неделя Ш 2 неделя ЕЭ 6 месяцев

Рис. 8. Показатели уровня цитокинов у больных с эритемной формой ИКБ (пг/мл).

На 2-й неделе болезни в этой группе больных уровень ИЛ-4 нарастал в 5 раз (14,18±3,4 пг/мл) при статистически достоверном снижении уровня ИНФ-у (10,22±4,4 пг/мл). Динамика уровней ФНО-а отмечалась высокими статистически достоверными значениями в ранние сроки болезни (21,31±6,4, р<0,01 и 15,32±4,9, р<0,05). Через 6 месяцев у пациентов с ЭФ ИКБ мы также отметили преимущественно ТЬ2 - тип клеточного иммунитета, учитывая повышенный уровень ИЛ-4 в 3 раза (11,5±3,5 пг/мл), при сниженном содержании ИНФ-у (3,3±1,0 пг/мл) и ФНО-а (3,08±1,7 пг/мл).

Статистически достоверное повышение ИЛ-4 в 6 раз (20,1 ±3,5 пг/мл) и ИНФ-у (24,5±10,1 пг/мл) в 2 раза на 1-й неделе болезни у больных БЭФ ИКБ свидетельствует о смешанном иммунном ответе ТЫ/ТЪ2 (рис.9). В динамике заболевания через неделю уровни ИНФ-у и ИЛ-4 повысились (45,57±11,5 пг/мл, р<0,05 и 41,47±11,5 пг/мл, р<0,001). У реконвалесцентов БЭФ ИКБ,. через 6 месяцев оставался повышенным уровень ИЛ-4 (10,06±1,7 пг/мл) при тенденции к нормализации ФНО-а (3,7±1,4 пг/мл) и ИНФ-у (7,6±2,4 пг/мл), что

говорит о переключении на ТЪ2 иммунный ответ.

-18-

ФНО-а

ИНФ-у

ИЛ-4

Я Доноры 01 неделя 0 2 неделя Е36 месяцев

Рис.9. Показатели уровня цитокинов у больных с безэритемной формой ИКБ (пг/мл).

Учитывая известную роль оксида азота, как микробицидного фактора и физиологического иммунорегулятора, мы исследовали уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче в зависимости от клинической формы ИКБ (рис.10).

Доноры

1 нед. 2 нед. 1 нед. | 2 нед. 1 нед. 2 нед.

Общ.группа

ЭФ

БЭФ

Н Сыворотка крови

□ Моча

Рис.10. Уровень метаболитов N0 в сыворотке крови и моче больных ИКБ в зависимости от клинической формы (мкМоль/л).

Так, у больных с БЭФ ИКБ уровень стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче на 1-й неделе болезни был достоверно выше по сравнению с группой доноров (9,0±0,4 мкМ/л и 6,6±0,8 мкМ/л против 6,7±0,9 мкМ/л и 4,7±0,46 мкМ/л; при р<0,05). На 2-й неделе в сыворотке крови данный

- 19-

показатель снижался, и был близок к уровню доноров (6,1±0,3 мкМ/л, р<0,001). В моче, напротив, уровень метаболитов оставался стабильно высоким (6,4±0,6 мкМ/л, р>0,05).

У больных с ЭФ ИКБ на 1-й неделе уровень стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови не отличался от показателей здоровых (6,3±0,2 мкМ/л, р>0,05). На 2-й неделе он был достоверно ниже (5,0±0,1 мкМ/л, р<0,001). В моче содержание метаболитов оксида азота у больных с ЭФ достоверно увеличивалось на 1 неделе (6,6±0,4 мкМ/л, р<0,01) и фактически не отличалось от показателя в группе с БЭФ заболевания (б,6±0,8 мкМ/л, р>0,05). На 2-й неделе заболевания уровень стабильных метаболитов у больных с ЭФ ИКБ достоверно снижался (4,5±0,2 мкМ/л, р<0,001) и достигал уровня здоровых доноров.

Мы выявили прямую среднюю корреляционную связь между содержанием метаболитов оксида азота сыворотки крови и ИНФ-у (г=0,75, р<0,05), а также ФНО-а (г=0,69, р<0,05) при обеих формах ИКБ, что указывает на существенную связь продукции метаболитов оксида азота и функционированием цитокиновой сети при ИКБ.

Таким образом, анализ полученных данных выявил наличие нитроксидергических сдвигов у пациентов в раннюю стадию иксодового клещевого боррелиоза. Установлена зависимость между уровнем метаболитов оксида азота и формой заболевания, а также уровнем провоспалительных цитокинов ИНФ-у, ФНО-а. При БЭФ высокий уровень метаболитов оксида азота регистрируется и через неделю наблюдения, что может быть признаком системного воспалительного ответа и возможной дальнейшей диссеминации возбудителя, а также позволяет считать эндотелий сосудов одной из клеток - мишенью боррелий.

Выявленные изменения: активация клеточного звена иммунитета, дисбаланс цитокинов и нарушения гуморального иммунитета, по нашему мнению, являются главными составляющими иммунопатогенеза различных клинических форм острого ИКБ.

выводы

1. У больных ИКБ, установлена активация системы клеточного иммунитета, которая отличается в зависимости от клинической формы ИКБ. При БЭФ увеличен уровень клеток с цитотоксической функцией, В-лимфоцитов и Т-хелперов. Существенно увеличен уровень экспрессии маркеров активации клеток (CD25,CD54). На этом фоне установлено значительное (в 5 раз) увеличение уровня CD95, что можно рассматривать, как механизм ограничения активации иммунной системы. Для ЭФ характерно: увеличение уровня CD8, CD 16, CD22, значительное повышение CD25, CD54, CD95-лимфоцитов при нормальных показателях CD4 и тенденции к снижению уровня CD3.

2. Выявлены дефекты фагоцитарно-клеточной защиты при ИКБ: на фоне повышения количественных показателей фагоцитоза у больных, особенно при БЭФ, зафиксирована недостаточная активность кислородзависимых механизмов бактерицидности фагоцитирующих клеток.

3. Выявлены особенности гуморального ответа при разных формах ИКБ. В ранние сроки заболевания при БЭФ определяются нормальные показатели IgA, IgM и тенденция к снижению IgG, уровень которых нарастает позже, на 2-й неделе болезни и коррелирует с титром специфических антител. При ЭФ - достоверное увеличение IgA, IgM регистрируется уже на 1-й неделе болезни, с последующим их нарастанием, что подтверждает превалирование Th2 иммунного ответа.

4. Высокий уровень ЦИК и преобладание их крупных размеров коррелирует с недостаточной активностью кислородзависимых механизмов бактерицидности нейтрофилов и высоким уровнем ФНО-а, что является дополнительным отягощающим фактором течения ИКБ.

5. Цитокиновый профиль больных с ЭФ ИКБ, учитывая выраженное повышение уровня ИЛ-4 (в 4 раза) на фоне относительно низкого содержания ФНО-а, ИНФ-у, свидетельствует о превалировании Th2-rana иммунного ответа.

6. У больных с БЭФ ИКБ, регистрируемая уже в ранние сроки заболевания

гиперцитокинемия, как провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИНФ-у, так и ИЛ-4 говорит о смешанном ТЫ/ТЫ ответе. Отдаленные результаты наблюдения реконвалесцентов с ЭФ и БЭФ ИКБ показали достоверное повышение уровня ИЛ-4 при нормальных ФНО-а и ИНФ-у и переключение на ТИ2 иммунный ответ.

7. Высокий уровень метаболитов N0 в моче больных ИКБ в ранний срок заболевания, который сохранялся повышенным в динамике наблюдения у пациентов с БЭФ, а также увеличение метаболитов оксида азота в сыворотке крови, свидетельствуют о развитии системного воспалительного ответа и позволяет предположить, что клетки эндотелия сосудов являются мишенью для боррелий.

Рекомендации для внедрения результатов исследований в медицинскую науку и практическое здравоохранение:

1. Выявленная связь показателей цитокинового статуса, гуморального иммунного ответа может быть использована в клинике для мониторинга характера течения заболевания, оценки эффективности проводимой терапии и прогнозировании хронизации заболевания.

2. В диагностике и лечении иксодового клещевого боррелиоза следует учитывать ни только клинико-лабораторные данные, но и количественные показатели оппозиционных цитокинов (ИЛ-4, ИНФ-у).

3. Мониторинг уровня активных метаболитов N0 в моче и сыворотке крови является дополнительным диагностическим и прогностическим критерием, который необходимо исследовать как у больных, так и у реконвалесцентов ИКБ.

4. Гиперактивация системы клеточного иммунитета, которая отличается в зависимости от клинической формы ИКБ, не исключает включение аутоиммунных механизмов в повреждение тканей, что предопределяет необходимость дальнейших исследований в данном направлении.

5. Экспериментально в НСТ-тесте обоснована возможность коррекции нарушений кислородзависимых механизмов активации нейтрофилов рекомбинантным ИЛ-2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Маидракова. Н.В., Симакова А.И., Маркелова Е.В., Журавлева A.C., Клепцова И.П. Некоторые аспекты изменения провоспалительных цитокинов (ИЛ-1а и ФНО-а) у больных с разными формами иксодовых клещевых боррелиозов в Приморском крае // IV Конференция 'Томеостаз и инфекционный процесс". - Сочи. - 2003. - С. 125.

2. Маидракова Н.В., Симакова А.И, Маркелова Е.В. Концентрация оппозиционных цитокинов в сыворотке крови больных иксодовым клещевым боррелиозом // Internat. J. Immunorehabilit. -2003. - №1, Т5. - Р.68.

3. Маидракова Н.В., Симакова А.И., Петухова С.А., Кущ Г.П., Липовская О.И. Оценка эффективности применения доксициклина у больных с разными формами иксодового клещевого боррелиоза // X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство: Сб. материалов. - М., 2003. - С.59.

4. Маидракова Н.В., Симакова А.И., Маркелова Е.В., Кипоть Т.А. Некоторые особенности течения клиники иксодовых клещевых боррелиозов с учетом лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) в Приморском крае // IV Российского съезда врачей-инфекционистов: Сб.материалов. - СПб., 2003. - С. 237.

5. Симакова А.И., Маидракова Н.В., Маркелова Е.В. Значение изменения уровня ИЛ-1а в прогнозировании тяжести течения и исходов у больных иксодовыми клещевыми боррелиозами в Приморском крае // Аллергология и иммунология. - 2003. - №2, Т4. - С. 118.

6. Симакова А.И., Маидракова Н.В., Маркелова Е.В. Оценка уровня ФНО-а у больных с разными формами иксодового клещевого боррелиоза в Приморском крае // Мед. иммунология. - 2003. - №3-4, Т5. - С.322.

7. Молдованов М.А., Тарасенко В.Е., Наумчук Г.А., Маидракова Н.В. Клинические проявления Лайм-боррелиоза в Приморском крае // Тезисы докладов IV Тихоокеанской конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической Медицины». - Владивосток, 2003. - С.35.

8. Симакова А.И., Маидракова Н.В., Маркелова Е.В., Иванис В.А. Цитокиновый

статус у больных иксодовыми клещевыми боррелиочами // IV Российского съезда врачей-инфекционистов: Сб.материалов. - СПб., 2003. - С.352-353.

9. Мандракова Н.В., Симакова А.И., Черникова А.А.Изменения уровня ИЛ- 1а у больных с разными формами иксодовых клещевых боррелиозов в Приморском крае // Тезисы докладов V Тихоокеанской конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины». - Владивосток, 2004. - С. 196.

10. Симакова А.И., Мандракова Н.В., Маркелова Е.В., Иванис В.А. Цитокиновый профиль у больных с иксодовым клещевым боррелиозом // Цитокины и воспаление. - 2004. - ТЗ, №4. - С. 21-24.

И. Мандракова Н.В., Симакова А.И., Маркелова Е.В. Показатели спонтанного НСТ-теста у больных с разными формами иксодового клещевого боррелиоза // IV Научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае»: Сб.материалов. - Владивосток, 2004. - С.4.

12. Симакова А.И., Мандракова Н.В., Маркелова Е.В. Некоторые клинико-иммунологические аспекты иксодовых клещевых боррелиозов в Приморском крае // Материалы Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (19-25 мая). - Пермь, 2003. - С.254-256.

13. Симакова А.И., Мандракова Н.В., Маркелова Е.В. Изменение уровня ИЛ-13 у больных с разными формами иксодовых клещевых боррелиозов в Приморском крае // Internat. J. Immunorehabilit. - 2004. - №1, Т5. - Р.69.

14. Иванис В.А., Маркелова Е.В., Скляр Л.Ф., Мандракова Н.В., Симакова А.И. Значение цитокинового статуса в изучении иммунопатогенеза инфекционных болезней // Тихоокеан. мед. журн. - 2004. - №2. - С.36 - 39.

15. Иванис В.А., Маркелова Е.В., Скляр Л.Ф., Симакова А.И., Мандракова Н.В. Роль изучения цитокинового профиля в иммунопатогенезе вирусных и бактериальных инфекций // Применение современных медицинских технологий в Дальневосточном Федеральном округе. - Сб. трудов / Под ред. В.А. Дубинкина. - Владивосток, 2004. - С. 191-195.

16. Симакова А.И., Мандракова Н.В., Маркелова Е.В., Леонова Г.Н., Дадалова О.Б., Петухова С.А. Применение ронколейкина в комплексной терапии

больных иксодовым клещевым боррелиозом // Научная конференция с международным участием "Современные средства иммунодиагностики иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций". - Сб. материалов. -СПб., 2004.-С. 167.

17. Симакова А.И., Мандракова Н.В., Маркелова Е.В., Кущ Г.П., Журавлева A.C., Леонова Г.Н. Оценка активности клеточного звена иммунитета у больных с эритем ной формой иксодовых клещевых боррелиозов // Материалы Ц конгресса иммунопатологии и аллергологии. - Таиланд, 2004. С.48.

18. Симакова А.И., Мандракова Н.В., Маркелова Е.В. Иксодовые клещевы<: боррелиозы в Приморском крае // Инф. патология в Приморском крае: Тез. докл. научн. - практ. конф. - Владивосток, 2004. - С. 100.

19. Симакова П.И, Мандракова Н.В., Леонова Г.Н. Цитокиновый статус у больных иксодовым клещевым боррелиозом // Инф. патология в Приморском крае: Тез. докл. научн. - практ. конф. - Владивосток, 2004. -С.24.

20. Симакова А.И., Мандракова Н.В., Маркелова Е.В., Чикаловец И.В. Роль иммунных механизмов в клиническом течении боррелиоза // Russian J, Immunology. - 2004.-Vol.9, №2.-P.181.

21. Мандракова H.B., Симакова А.И., Иванис В.А. Оценка некоторых иммунологических параметров у больных иксодовым клещевым боррелиозом в Приморском крае // Дальневосточ. мед. журн. - 2005. - №1. - С. 15-19.

РНБ Русский фонд

2005-4 46411

2074

Актуальность проблемы.

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) - инфекционное, природно -очаговое, трансмиссивное заболевание человека, вызываемое спирохетами из рода Borrelia. Важность и актуальность проблемы этой инфекции определяется широким ее распространением в мире, высоким уровнем заболеваемости, частотой формирования хронических форм (3-60%) и возможной последующей инвалидизации пациентов [4, 48, 57, 71, 88].

Полиморфизм клинических проявлений с поражением многих органов и систем (кожи, опорно-двигательного аппарата, нервной системы, сердечнососудистой системы, печени), склонностью к рецидивирующему течению обуславливают значительные трудности в первичной диагностике болезни, особенно у пациентов, в клинике которых отсутствует патогномоничный первичный аффект - мигрирующая эритема (МЭ).

С момента первых описаний ИКБ наиболее полные клинико-эпидемиологические исследования проведены в Северной Америке и Западной Европе. В России очаги ИКБ регистрируются повсеместно от Калининградской области до Южного Сахалина, где ИКБ занимает одно из первых мест среди трансмиссивных природно-очаговых зоонозов [60]. Отмечены различия в клиническом течении и исходах заболевания в различных регионах, что, вероятно, обусловлено видовым разнообразием боррелий [24, 56].

Ландшафтно-географические особенности Приморского края, высокая численность переносчиков возбудителя - клещей Ixodes persulcatus способствуют стабильно высокой заболеваемости ИКБ [68, 128]. Средний многолетний показатель в Приморье составил 8,8±0,83%о, он превышает таковой по РФ в 1,7 раза (5,3±0,08 %о).

Интенсивное изучение ИКБ в последние годы выявило ряд наиболее дискутабельных проблем инфекции: клинической и лабораторной диагностики, механизмов персистирования боррелий, участия иммунокомпетентных клеток в патогенезе и особенностей иммунного ответа, эффективного лечения.

Проведение комплексных исследований, направленных на решение этих проблем на территории Приморского края, представляется весьма важным и актуальным для науки и практического здравоохранения. Цель исследования:

Охарактеризовать некоторые аспекты иммунопатогенеза иксодового клещевого боррелиоза на территории Приморского края. Задачи исследования.

1. Исследовать и установить значение в иммунопатогенезе разных форм ИКБ комплекса показателей клеточного иммунитета с идентификацией популяций и субпопуляций лимфоцитов CD3,CD4, CD8, CD16, CD22 и экспрессии на них активационных маркеров CD25, CD54, CD95.

2. Исследовать количественные показатели фагоцитоза и состояние кислородзависимых механизмов бактерицидности нейтрофилов у больных ИКБ.

3. Исследовать и оценить степень изменения факторов гуморального звена иммунитета: содержание основных классов иммуноглобулинов, уровень и размеры свободно циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и их взаимосвязь с уровнем специфических антител.

4. Оценить результаты мониторинга содержания в сыворотке крови цитокинов (ИЛ-4, ИНФ-у, ФНО-а) у больных с разными формами ИКБ.

5. Выявить степень информативности и роль в патогенезе ИКБ биохимического маркера воспаления и повреждения - оксида азота (NO). Научная новизна.

Впервые на основании комплекса иммунологических исследований проведена оценка состояния клеточного и гуморального звеньев иммунитета у больных ИКБ, выявленных на территории Приморского края, в зависимости от срока болезни и клинической формы (эритемной -ЭФ и безэритемной - БЭФ). Показано преобладание гиперактивации клеточных механизмов иммунного ответа при БЭФ, что предполагает большую вероятность диссеминации возбудителя и пролонгированность течения болезни.

Впервые проведен мониторинг цитокинов (ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-4) в сыворотке крови у больных ИКБ в Приморском крае, что позволяет установить различные типы иммунного ответа при ЭФ и БЭФ и расширяет представления о функционировании цитокиновой сети при ИКБ.

Впервые проведенное динамическое определение содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче больных ИКБ свидетельствует о развитии системного воспалительного ответа и может служить дополнительным критерием прогнозирования дальнейшего течения болезни.

Выявлены особенности гуморального ответа при разных клинических формах ИКБ и его сопряженность с динамикой титров специфических антител. Практическая значимость работы:

На основании подробной клинико-иммунологической характеристики различных клинических форм острого периода ИКБ оптимизирована диагностика заболевания на госпитальном этапе. Степень активации показателей клеточных факторов иммунитета может служить дополнительным маркером диагностики клинических форм ИКБ. Для ЭФ характерны: увеличение уровня CD8, CD 16, CD22, значительное повышение CD25, CD54, СБ95-лимфоцитов при нормальных показателях CD4 и тенденции к снижению уровня CD3. Также при ЭФ наблюдалось достоверное увеличение уровня IgA, IgM и ЦИК, недостаточная активность кислородзависимых механизмов бактерицидности. При БЭФ на фоне нормального уровня CD3 и низких показателей спонтанного НСТ-теста, регистрируется значительное (в 5-6 раз) повышение остальных показателей клеточного звена иммунитета при высоких показателях ЦИК, преимущественно крупных размеров, тогда как увеличение иммуноглобулинов всех классов регистрируется только на 2-й неделе заболевания и коррелирует с нарастанием титров специфических антител. Мониторинг уровня N0 в моче и сыворотке крови является дополнительным диагностическим и прогностическим критерием, который необходимо исследовать как у больных, так и у реконвалесцентов ИКБ.

Выявленные изменения предопределяют возможность применения иммунокоррегирующей терапии, особенно при БЭФ ИКБ. Экспериментально в НСТ-тесте обоснована возможность коррекции нарушений кислородзависимых механизмов активации нейтрофилов рекомбинантным ИЛ-2.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ведущим механизмом патогенеза ИКБ является сложный комплекс активации иммунной системы. Выявлена гиперактивация клеточного иммунитета у больных ИКБ, особенно при БЭФ и недостаточная активность кислородзависимых механизмов бактерицидности фагоцитирующих клеток, что предполагает возможность пролонгирования инфекционного процесса и персистенции возбудителя.

2. В иммунопатогенезе острого иксодового клещевого боррелиоза определяющую роль играют особенности продукции оппозитных цитокинов (ИЛ-4, ИНФ-у). У больных с ЭФ ИКБ, включая ранний период заболевания, наблюдается Th2 иммунный ответ, а при БЭФ - смешанный Thl/Th2 тип.

3. Изменения гуморального звена иммунитета отличаются в зависимости от клинической формы ИКБ. Определение высокого уровня ЦИК, преимущественно крупных размеров, особенно при БЭФ, может способствовать усилению процессов диссеминации возбудителя и возможности органных поражений.

ВЫВОДЫ

1. У больных ИКБ, установлена активация системы клеточного иммунитета, которая отличается в зависимости от клинической формы ИКБ. При БЭФ увеличен уровень клеток с цитотоксической функцией, В-лимфоцитов и Т-хелперов. Существенно увеличен уровень экспрессии маркеров активации клеток (CD25,CD54). На этом фоне установлено значительное (в 5 раз) увеличение уровня CD95, что можно рассматривать, как механизм ограничения активации иммунной системы. Для ЭФ характерны: увеличение уровня CD8, CD16, CD22, значительное повышение CD25, CD54, С095-лимфоцитов при нормальных показателях CD4 и тенденции к снижению уровня CD3.

2. Выявлены дефекты фагоцитарно-клеточной защиты при ИКБ: на фоне повышения количественных показателей фагоцитоза у больных, особенно при БЭФ, зафиксирована недостаточная активность кислородзависимых механизмов бактерицидности фагоцитирующих клеток.

3. Выявлены особенности гуморального ответа при разных формах ИКБ. В ранние сроки заболевания при БЭФ определяются нормальные показатели IgA, IgM и тенденция к снижению IgG, уровень которых нарастает позже, на 2-й неделе болезни и коррелирует с титром специфических антител. При ЭФ - достоверное увеличение IgA, IgM регистрируется уже на 1-й неделе болезни, с последующим их нарастанием, что подтверждает превалирование Th2 иммунного ответа.

4. Высокий уровень ЦИК и преобладание их крупных размеров коррелирует с недостаточной активностью кислородзависимых механизмов бактерицидности нейтрофилов и высоким уровнем ФНО-а, что является дополнительным отягощающим фактором течения ИКБ.

5. Цитокиновый профиль больных с ЭФ ИКБ, учитывая выраженное повышение уровня ИЛ-4 (в 4 раза) на фоне относительно низкого содержания ФНО-а, ИНФ-у, свидетельствует о превалировании ТЬ2-типа иммунного ответа.

6. У больных с БЭФ ИКБ, регистрируемая уже в ранние сроки заболевания гиперцитокинемия, как провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИНФ-у, так и ИЛ-4 говорит о смешанном Thl/Th2 ответе. Отдаленные результаты наблюдения реконвалесцентов с ЭФ и БЭФ ИКБ показали достоверное повышение уровня ИЛ-4 при нормальных ФНО-а и ИНФ-у и переключение на Th2 иммунный ответ.

7. Высокий уровень метаболитов NO в моче больных ИКБ в ранний срок заболевания, который сохранялся повышенным в динамике наблюдения у пациентов с БЭФ, а также увеличение метаболитов оксида азота в сыворотке крови, свидетельствуют о развитии системного воспалительного ответа и позволяет предположить, что клетки эндотелия сосудов являются мишенью для боррелий.

Рекомендации для внедрения результатов исследований в медицинскую науку и практическое здравоохранение:

1. Выявленная связь показателей цитокинового статуса, гуморального иммунного ответа может быть использована в клинике для мониторинга характера течения заболевания, оценки эффективности проводимой терапии и прогнозировании хронизации заболевания.

2. В диагностике и лечении иксодового клещевого боррелиоза следует учитывать ни только клинико-лабораторные данные, но и количественные показатели оппозиционных цитокинов (ИЛ-4, ИНФ-у).

3. Мониторинг уровня активных метаболитов NO в моче и сыворотке крови является дополнительным диагностическим и прогностическим критерием, который необходимо исследовать как у больных, так и у реконвалесцентов ИКБ.

4. Гиперактивация системы клеточного иммунитета, которая отличается в зависимости от клинической формы ИКБ, не исключает включение аутоиммунных механизмов в повреждение тканей, что предопределяет необходимость дальнейших исследований в данном направлении.

5. Экспериментально в НСТ-тесте обоснована возможность коррекции нарушений кислородзависимых механизмов активации нейтрофилов рекомбинантным ИЛ-2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большие успехи, достигнутые в изучении иксодового клещевого боррелиоза в последние годы, связаны с открытием возбудителя, изучением эпидемиологии, усовершенствованием методов диагностики [3, 43, 49, 69, 128, 142, 153, 161, 198, 236].

Однако, высокий уровень заболеваемости иксодовым клещевым боррелиозом, возможность хронизации и инвалидизации, свидетельствуют о том, что многие аспекты данной проблемы остаются не решенными. Существуют отличия в клиническом течении и исходах заболевания в отдельных регионах, что обусловлено видовым разнообразием возбудителя. Изучение проблемы ИКБ с позиции клинической иммунологии в последние годы позволило доказать ключевую роль иммунопатологических реакций в патогенезе клинических форм ИКБ.

Однако, остается достаточно много нерешенных вопросов и противоречивых суждений, касающихся механизмов отдельных звеньев иммунопатогенеза, клинической диагностики, классификации, эффективности различных методов в комплексе лечения.

Поэтому изучение клинических проявлений и особенности иммунопатогенеза на конкретной эндемичной территории важно как в научном, так и в практическом плане.

Проведенный анализ заболеваемости ИКБ на территории Приморья свидетельствует о том, что данная инфекция региструется на большинстве административных территорий края. Ландшафтно-географические особенности Приморского края, высокая численность переносчиков возбудителя - клещей Ixodes persulcatus способствуют стабильно высокой заболеваемости ИКБ [68, 128]. Средний многолетний показатель составил 8,8±0,83%о, он превышает таковой по РФ в 1,7 раза (5,3±0,08 %о).

Нами было обследовано 108 больных с ИКБ, которые условно были разделены на 2 формы - эритемную (ЭФ) и безэритемную (БЭФ) по наличию ведущего патогномоничного синдрома - мигрирующей эритемы (МЭ). Из них 63 лица мужского пола (58,4±4,7%) и 45 (41,6±4,7%) - женского. У 100% больных с БЭФ и 78% с ЭФ диагноз ИКБ подтвержден серологически нарастанием титра специфических антител в 4 раза и более в парных сыворотках крови, взятых с интервалом в 10-12 дней в НМФА. Клиника ИКБ характеризовалась типичными проявлениями заболевания. В ходе изучения клинических проявлений ИКБ нами выявлены некоторые особенности в течении клинических форм раннего периода болезни. Так, у больных с БЭФ инкубационный период был длиннее, а лихорадка продолжительнее.

Температурная реакция при БЭФ отличалась более высокими значениями. Выраженность общеинтоксикационного синдрома и частота органных патологии также была более свойственна БЭФ ИКБ. Это позволяет характеризовать БЭФ, как более тяжелую форму со склонностью к дальнейшей хронизации.

Ведущим фактором в патогенезе ИКБ многие авторы считают не только повреждающее действие самого микроорганизма, но и характер иммунного ответа макроорганизма [73, 114, 231, 233]. Это подтверждается и тем, что попытка лечения ИКБ антибиотиками не всегда дает ожидаемые результаты [12, 46, 72, 87, 106, 218].

Проведенные нами исследования комплекса параметров, характеризующих реакции клеточного и гуморального механизмов иммунитета, в значительной мере подтверждают ведущую роль клеточного иммунного ответа в патогенезе различных клинических форм ИКБ.

Результаты исследований иммунного ответа выявили следующие события в раннюю стадию ИКБ. При исследовании клеточного фактора первой линии иммунной защиты - фагоцитоза у больных с иксодовым клещевым боррелиозом была установлена статистически достоверная активация его количественных показателей. Во всех обследуемых группах мы отметили повышение фагоцитарного показателя (ФП) и фагоцитарного числа (ФЧ), однако у больных с БЭФ эти показатели оказались выше, что, возможно, связано с ранней и достаточно массивной диссеминацией боррелий при данной клинической форме ИКБ.

Известно, что при фагоцитозе поглощение инфекционных агентов не обязятельно сопровождается их перевариванием [129, 164]. В случае отсутвия последнего (незавершенный фагоцитоз), боррелии могут размножаться внутри фагоцита и приводить к подострому и хроническому течению заболевания.

У больных ИКБ в острой фазе наблюдается снижение спонтанного НСТ - теста, при этом фагоцитарный резерв (ФР) был достоверно выше по сравнению с группой доноров. Учитывая эти данные, можно говорить о недостаточной активности кислородзависимых механизмов бактерицидности фагоцитирующих клеток, наиболее выраженых у больных БЭФ ИКБ.

Следующим важным результатом наших исследований явилось определение у больных с ИКБ активации иммунокомпетентных клеток, опосредующих все события раннего иммунного ответа. Гиперактивация факторов клеточного иммунитета выявлена больше у больных БЭФ, когда зарегистрировано увеличение не только клеток с цитотоксической функцией (CD8,CD16), но и Т-хелперов (CD4), а также В-лимфоцитов (CD22). Отмечена четкая корреляция между количеством CD4 и CD8 (г=0,75, р<0,001). У большинства больных был существенно увеличен уровень экспрессии маркеров активации клеток (CD25,CD54), что свидетельствует об усилении адгезионности эндотелия сосудов, усилении рецепции ИЛ-2, который инициирует Т и В — клеточные составляющие адаптивного иммунного ответа.

На этом фоне установлено значительное (в 5 раз) увеличение клеток, экспрессирующих CD95, что можно рассматривать, как механизм ограничения активации иммунной системы. Причем степень его повышения превалировала над степенью увеличения других маркеров активации. Кроме того, увеличение CD25 при резком повышении экспрессии CD95 может привести к развитию индукционно-активационного апоптоза и опосредовать в последующем развитие дефицита Т-хелперов.

Выявлена прямая средняя корреляционная связь между уровнем CD4 и CD8 в крови больных ИКБ общей группы (г=0,78, р<0,001). Мы считаем, что прямая средняя связь между CD8 и CD95, а также CD95 и CD4 (г=0,62 и г=0,55, р<0,05) закономерна и отражает регуляторные механизмы ограничения гиперфункций клеточно-опосредованных иммунных реакций.

Все выявленные количественные изменения иммунокомпетентных клеток были статистически достоверны и более выражены в группе больных БЭФ по сравнению с ЭФ.

Вопрос о значении гуморального звена иммунитета и роли циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в патогенезе ИКБ остается важным и спорным до настоящего времения [3, 73, 226]. Выявлены особенности гуморального ответа при разных формах ИКБ. При ЭФ -достоверное увеличение IgA, IgM уже на 1-й неделе болезни, с последующим их нарастанием, что подтверждает превалирование Th2-типа иммунного ответа. Тогда, как при БЭФ в ранние сроки заболевания определялись нормальные показатели IgA, IgM и тенденция к снижению IgG, уровень которых нарастал позже, на 2-й неделе болезни.

Нами обнаружены связь высокого уровня IgA в крови больных в ранней стадии ИКБ и частоты поражения кожных покровов в месте присасывания клеща (%2 =3,6 при уровне значимости р=0,5, 3-ей степени свободы), а также уровнем иммуноглобулинов и специфических антител. При этом не отмечено корреляционной связи между количеством CD22 маркера зрелых В-клеток и IgA (r=0,14, р>0,05), IgM (r=0,22, р>0,05) IgG (г=0,3, р>0,05).

Исследование иммунокомплексных механизмов выявило повышенное содержание ЦИК у большинства больных ИКБ. Интенсивость образования циркулирующих иммунных комплексов обусловлена, вероятно, различными причинами, ведущими из которых, по нашему мнению, являются более продолжительная и высокая бактериальная нагрузка у больных с БЭФ иксодового клещевого боррелиоза. Характерно, что у больных этой группы показатели ЦИК в сыворотке крови были достоверно выше. Так, на 1-й неделе болезни у больных ЭФ уровень ЦИК был повышен в 1,8 раза, а у больных БЭФ в 2 раза. На 2-й неделе заболевания уровень ЦИК продолжал нарастать, причем у больных с БЭФ статистически достоверно выше, что, в определенной мере, позволяет объяснить недостаточность IgG и снижение IgM, IgA у больных этой клинической формой в дебюте болезни.

Кроме того, у больных с БЭФ в динамике наблюдения, как на первой неделе (77%), так и на второй (69%) преимущественно встречались у крупные размеры ЦИК в отличие от пациентов с ЭФ, где превалировал средний размер ЦИК. Это свидетельствует о высокой антигенной нагрузке в ранние сроки болезни именно у этой категории больных (БЭФ ИКБ). Данный факт подтверждается обнаружением связи высокого уровня крупного размера ЦИК в крови больных БЭФ и длительностью общеинтоксикационного синдрома (% =10,2 при уровне значимости р=0,01, 1-й степени свободы).

Установлена обратная средняя корреляционная связь между уровнями ЦИК и ИНФ-у (г=-0,55, р<0,05) у больных с ЭФ и прямая сильная связь у пациентов с БЭФ ИКБ (г=0,82, р<0,01). Также установлена обратная корреляционная связь средней силы между уровнями ЦИК и ФНО-а (г=-0,63, р<0,05), что можно объяснить цитотоксическими эффектами этих цитокинов в ранний период ИКБ.

Выявленная нами динамика ЦИК отражает, с одной стороны, механизмы защиты в отношении чужеродных антигенов, а с другой стороны - нарушение процесса их элиминации у больных с БЭФ ИКБ.

Результаты анализа цитокинового статуса выявили зависимость отдельных цитокинов от клинической формы ИКБ. При оценке продукции цитокинов у больных с ЭФ ИКБ мы отметили повышение ИЛ-4 в 3 раза уже на 1-й неделе болезни, при незначительном повышении — ИНФ-у, что свидетельствует о доминирование Th2 - типа иммунного ответа. На 2-й неделе болезни в этой группе больных уровень ИЛ-4 увеличивался в 5 раз при статистически достоверном снижении уровней ИНФ-у и ФНО-а. Через 6 месяцев у пациентов с ЭФ ИКБ мы отметили сохранение преимущества Th2 - типа иммунитета, учитывая повышенный уровень ИЛ-4 в 3 раза, при почти нормальных показателях ИНФ-у и ФНО-а.

У больных БЭФ ИКБ статистически достоверное повышение ИЛ-4 в 6 раз и ИНФ-у в 2 раза на 1-й неделе болезни свидетельствует о смешанном типе иммунного ответа - Thl/Th2.

В динамике заболевания уровни ИНФ-у и ИЛ-4 равномерно повышались. У реконвалесцентов БЭФ ИКБ через 6 месяцев оставался повышенным уровень ИЛ-4 при тенденции к нормализации содержания ФНО-а и ИНФ-у, что позволяет говорить о переключении иммунного ответа на Th2-ran.

Известно, что интенсивность и характер иммунных реакций зависят от состояния внутриклеточного оксидативного и нитроксидного статусов. В литературном обзоре нами освещены наиболее важные физиологические эффекты оксида азота. Установлено, что индукция оксида азота сопровождает любую воспалительную реакцию, оказывает микробицидное действие, сосудорегулирующие эффекты на системном и микроциркуляторном уровне [98]. В последние годы обнаружена и иммунорегуляторная функция оксида азота - способность избирательно ингибировать Thl, угнетать продукцию ИНФ-у, одновременно повышая активность ИЛ-4, следовательно, изменять дифференцировку Т-хэлперов в сторону Th2 - иммунного ответа.

При анализе результатов исследования метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче больных ИКБ мы получили интересные данные, свидетельствующие о несомненном участии этой молекулы в патогенезе болезни. Установлена зависимость между уровнем метаболитов оксида азота и клинической формой заболевания. Так, у больных с БЭФ уровень метаболитов оксида азота повышался на 1-й неделе болезни, а через 2 недели статистически достоверно снижался и достигал показателей группы доноров. У больных с ЭФ, напротив, эти показатели оказались ниже уровня доноров в течение всего заболевания. Эти данные прямо указывают на участие оксида азота в системном воспалительном ответе и диссеминации возбудителя у больных БЭФ ИКБ.

Исследование метаболитов оксида азота в моче оказалось еще более информативным. Выявлены высокие уровени метаболитов оксида азота в моче уже на 1-й неделе болезни.

Причем, если при ЭФ содержание метаболитов вскоре снижалось, то при БЭФ высокий уровень оксида азота в моче регистрировался весь срок наблюдения. По нашему мнению этот факт может быть признаком формирования органной патологии и возможной дальнейшей диссеминации возбудителя. Отчетливое различие уровней метаболитов оксида азота в сыворотке крови и моче при разных клинических формах ИКБ, вероятно, может служить одним из критериев оценки тяжести и прогнозе болезни.

Мы выявили прямую среднюю корреляционную связь между содержанием NO сыворотки крови и ИНФ-у (г=0,75, р<0,05), а также ФНО-а (г=0,69, р<0,05), что позволяет предполагать важное значение нитроксидемии в патогенезе ранней фазы ИКБ и считать эндотелий клеткой-мишеныо возбудителя.

Таким образом, активация клеточного звена иммунитета, дисбаланс цитокинов и нарушения гуморального иммунитета, являются главными составляющими иммунопатогенеза различных клинических форм острого ИКБ.

Учитывая выявленные изменения, считаем, что активация клеточного иммунитета с преимущественным Th2 иммунным ответом ранним синтезом специфических антител и уровнем метаболитом оксида азота носит защитно-приспособительный характер и обеспечивает элиминацию возбудителя, тогда, как гиперактивация клеточного иммунитета и особенно Thl клеток у больных с БЭФ ИКБ, может приводить к запуску тканевых повреждений, в том числе аутоиммунного характера.

102