Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Клинико-иммунологические критерии прогноза результативности программ экстракорпорального оплодотворения

На правах рукописи

МАРКИНА Любовь Алексеевна

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ПРОГНОЗА РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ ПРОГРАММ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

14.00.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□034605<^

Москва-2008

003460572

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Баженова Людмила Григорьевна Зорина Раиса Михайловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Краснопольская Ксения Владиславовна

Козлов Иван Генрихович

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический

университет».

Защита состоится «_

200

г. в

ч. на

заседании диссертационного совета Д. 208.048.01 при ГУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» (101000, г. Москва, ул. Покровка, д. 22а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии»

Автореферат разослан «_

200 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор

Серова О.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Основной составляющей общего здоровья женщины и качества ее жизни является репродуктивное здоровье, а одним из важнейших его компонентов - способность к зачатию, вынашиванию и рождению детей. Утрата этой способности - трагедия семьи и общества, и с этих позиций бесплодие в браке - это современная медико-социальная проблема, требующая дальнейшего изучения. Современные подходы к диагностике и лечению бесплодных супружеских пар основаны на достижениях фундаментальных наук в области изучения молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе реализации процесса репродукции у человека (Сухих Г.Т., 2008). Метод экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в настоящее время — один из наиболее эффективных методов лечения как женского, так и мужского бесплодия. Потребность в этом методе высока в связи с тем, что в последние годы значительно расширился перечень показаний к применению ЭКО (Смольникова В.Ю., Леонов Б.В., 2002).

В последнее время все большее внимание уделяется изучению роли пито кинов и универсальных регуляторных субстанций в механизмах координации различных функций человеческого организма. К такому классу соединений относятся белки семейства макроглобулинов, играющие существенную роль на всех этапах реализации репродуктивной функции. Это позволяет рассматривать изучение их регуляторных свойств при ЭКО в качестве перспективного направления для решения задач по повышению результативности программ ЭКО, поскольку ряд авторов рассматривает их в качестве прогностических и диагностических критериев не осложненного течения беременности (Зорин Н.А., 2005; Maltseva N.V., Zorin N.A., 1997; Zorin N.A., 2005; Armstrong Р.В., Quigley J.P., 1999; Birkenmeier G., 2001).

Цель настоящего исследования состояла в определении прогностических критериев результативности программ экстракорпорального оплодотворения на основе оценки клинических и иммунологических показателей при трубно-перитонеальном бесплодии воспалительного генеза.

Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:

1. Оценить фолликулогенез у участниц программ ЭКО в ответ на стимуляцию суперовуляции в зависимости от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий и давности его последнего обострения.

2. Изучить сывороточное содержание цитокинов (Ш1-1Р,ИЛ-6, ФНО-а, ИНФ-у), белков острой фазы: альфа-2-макроглобулина (МГ), ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ), лактоферрина (ЛФ), антитрипсина (АТ), альбумина и специфических комплексов: МГ-1§0, ЛФ-1§0 и Плазмин-МГ (ПЛ-МГ) у участниц программ ЭКО в зависимости от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий и давности его последнего обострения.

3. Исследовать сывороточное содержание цитокинов, белков острой фазы и специфических комплексов в разные периоды проведения программы ЭКО (до программы, в день проведения ТУР, на 15 день после эмбриотранс-фера) у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза, с оценкой значимости исследуемых показателей в прогнозе результативности программ ЭКО.

4. Определить уровни цитокинов, белков острой фазы и специфических комплексов в составе фолликулярной жидкости и оценить их связь с результативностью программ ЭКО.

5. Провести сравнительную оценку изученных показателей при индуцированной и физиологической беременности.

Научная новизна

Впервые определены уровни ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеипа и специфических комплексов (МГ-^О, ЛФ-^О и ПЛ-МГ) в составе фолликулярной жидкости, а также их прогностическая значимость.

Впервые установлено, что при индуцированной беременности на 15 день гестации снижение содержания трофобластического 01 -глобулина сопровождается повышением уровня ассоциированного с беременностью а-2-гликопротеина, в сравнении с физиологической беременностью. Выявленные закономерности в показателях двух основных белков беременности на ранних этапах гестации при индуцированной беременности обосновывают механизмы сохранения ее на этапе раннего эмбриогенеза в позитивных про-

граммах ЭКО: первичная несостоятельность фетоплацешарлого комплекса компенсируется реакцией иммунной системы матери, обеспечивая сохранение беременности.

Выявлена статистически значимая взаимосвязь результативности программ ЭКО с уровнями цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1Р) в составе фолликулярной жидкости, а также концентраций АБГ и цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1(3) в сыворотке крови, определяемых на 15 день после эмбриотрансфера.

Практическая значимость работы

Полученные результаты продемонстрировали значимость определяемых белков, цитокинов и специфических комплексов у женщин с трубно-перитонеалышм бесплодием воспалительного генеза для прогноза последующей беременности.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Количество полученных ооцитов, общее количество и качество эмбрионов, а также процент оплодотворения эмбрионов у женщин, принявших участие в программах ЭКО, зависят от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий в анамнезе и давности его последнего обострения.

2. Исходно низкий уровень лактоферрина (менее 1,5 мг/л), повышенное содержание в фолликулярной жидкости ИЛ-6 (32,8±9,9 пкг/мл) и ИЛ-1Р (3,3±1,1 пкг/мл) и повышение в динамике в период раннего эмбриогенеза сывороточных концентраций белков беременности: АБГ (более 0,03 г/л), ТБГ (более 30 нг/мл), острофазового белка - лактоферрина (более 2,0 мг/л), иммуноглобулина О (более 10 г/л) является хорошим прогнозом для последующей реализации репродуктивной функции.

3. Индуцированная беременность у женщин с трубпо-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза характеризуется низким содержанием трофобластического р-1 -глобулина (27,97±7,56 нг/мл) в период раннего эмбриогенеза, в сравнении с физиологически наступившей беременностью (133,0±24,61 нг/л). Это свидетельствует о первичной несостоятельности фе-топлацентарного комплекса, которая компенсируется реакцией иммунной системы матери в форме повышения уровня ассоциированного с беременностью а-2-гликопротеина (до 0,059±0,013 г/л), обеспечивая условия сохранения беременности.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на III Республиканской конференции «Актуальные проблемы эндокринологии» - Москва, 2003; 9-ом Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» - Москва, 2007; 2-ой Российской конференции «Иммунология репродукции» - Москва, 2007; 1-ой Всероссийской конференции «Проблемы женского здоровья и пути их решения» - Москва, 2007; первого регионального научного форума «Мать и дитя» - Казань, 2007, а также на межрегиональных, областных и городских конференциях.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Результаты исследования и основные рекомендации, вытекающие го них, используются в лечебной практике МЛПУ «Зональный перинатальный центр» города Новокузнецка и учебном процессе кафедры акушерства и гинекологии ГОУ ДПО «НГИУВ Росздрава». Основные рекомендации включены в семинары и лекции для врачей-курсантов, врачей-интернов, клинических ординаторов и аспирантов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав, посвященных анализу данных, полученных в ходе работы, обсуждение результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами, 10 рисунками. Библиография включает 183 литературных источника, из них 48 отечественных и 135 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Дизайн исследования представлен на рис. 1.

Рис.1. Дизайн исследования.

Основную группу составили 45 участниц программ экстракорпорального оплодотворения с трубно-перитонеальным фактором бесплодия воспалительного генеза. Участницы программ включались в исследование по критериям включения и исключения и были подобраны для сопоставимости групп, в зависимости от результативности программ ЭКО: 22 (48,9%) пациентки имели результативные программы и 23 (51,1%) женщины входили в оппозитную по наступлению беременности группу. Средний возраст пациенток с трубно-перитонеалыюй формой бесплодия воспалительного генеза составил 30,6+0,5 лет; 18 (40%) пациенток находились в раннем репродуктивном возрасте (от 25 до 29 лет), при этом одна (2,22%) женщина была моложе 25 лет. В позднем репродуктивном возрасте (от 30 до 34 лет) были 21 (46,67%) пациентка, из них старше 35 лет - 4 (8,89%) и старше 40-1 (2,22%). Средний возраст менархе соответствовал 12,2+0,23 годам, при этом своевременное наступление менархе (от 11 до 14 лет) отмечено у 37 (82,2%) женщин, раннее (с 10 лет) - у 4 (8,88%) и позднее наступление менархе (с 16 лет) установлено у 3 (6,7%) пациенток. Данные анамнеза свидетельствовали

о наличии нарушений менструального цикла по типу олигоменореи - у 8 (17,8%) пациенток, гиперполименореи - у 4 (8,9%) и альгоменореи - у 9 (20%). Продолжительность бесплодия: первичного - у 23 (51,1%) пациенток и вторичного - у 22 (48,9%), варьировала от 2 до 16 лет, составляя в среднем 7,0±0,5 лет. У 13 (28,9%) женщин в анамнезе были проведены реконструк-тивно-пластические операции (салышнгостоматопластика, сальпингоадге-зиолизис, адгезиолизис), которые не завершились восстановлением естественной фертильности, при этом у 6 (46,1%) из них в последующем возникли внематочные беременности. У 7 (15,6%) пациенток данной группы в анамнезе были роды, двое (4,4%) из которых закончились оперативным родоразре-шением, путем Кесарева сечения. Прерывание первой беременности медицинским абортом отмечено у 22 (48,9%) пациенток, при этом только у 6 (27,3%) из 22 женщин в послеабортном периоде проводилась реабилитационная терапия.

Согласно данным анамнеза, у 18 (40%) женщин было установлено наличие экстрагениталыюй патологии: тонзиллит - у 3 (6,7%), анемия - у 4 (8,9%), хронический гастрит - у 3 (6,7%), хронический холецистит - у 1 (2,2%). Патология щитовидной железы наблюдалась у 7 (15,6%) женщин, из них диффузный зоб - у 4 (8,8%), гипотиреоз - у 3 (6,7%). Состояние функций щитовидной железы было компенсировано к моменту начала программ экстракорпорального оплодотворения.

В структуре гинекологической заболеваемости у пациенток, включенных в данную группу, были: сальпингоофорит - у 27 (60,0%), хронический эндометрит - у 10 (22,2%), перенесенный в анамнезе пельвиоперитонит - у 5 (11,1%) и тубо-овариальный абсцесс - у 3 (6,6%).

Гормональный фон в этой группе женщин до начала проведения программ представлен следующими значениями: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) - 8,65±0,69 мМЕ/л; шотеинизиругоший гормон (ЛГ) - 7,0+0,69 мМЕ/л; эстрадиол (Е2) - 39,54±3,27 пг/мл; прогестерон - 40,16±3,83 Нм/л; уровень пролактина - 383,42±25,24 мМЕ/л. Наряду с этим, было отмечено значимое повышение уровня прогестерона у пациенток с трубно-перитонеалыюй формой бесплодия, имевших давность обострения воспалительного процесса от 3-х до 5 лет (53,75+8,26 Нм/л), в сравнении с теми, кто перенес последнее обострение давностью до 3-х лет (30,12±5,2 Нм/л; р=0,0361).

Группа сравнения представлена 15 беременными женщинами репродуктивного периода (25+2,08 лет), не принимавших с контрацептивной целью гормональные препараты в анамнезе. У пациенток данной группы беременность наступила в естественных циклах, срок гестационного периода соответствовал 3-4 неделям беременности.

Контрольная группа была представлена 28 практически здоровыми женщинами репродуктивного возраста (средний возраст 24±1,2 лет), обследованными во II фазу менструального цикла, которые не принимали эстро-генгестагениые препараты с контрацептивной или регулягорной целями.

Все клинико-лабораторные исследования выполнялись после получения информированного согласия обследуемых женщин и включали:

1. Клиническое обследование пациенток, трансвагинальнос сканирование органов малого таза, определение уровня ФСГ. ЛГ, пролактина, ß-ХГЧ, эстрадиола и прогестерона методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов «Human» (Германия) и «Alcor bio» (Санкт Петербург).

2. Иммунохимическое исследование:

— определение уровней белков семейства макроглобулинов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости методом низковольтного ракетного имму-ноэлектрофореза; а содержание АБГ в фолликулярной жидкости - методом ИФА с использованием авторской тест системы (Зорин H.A. и соавт.,1992);

- исследование уровня IgG в сыворотке крови и фолликулярной жидкости - методом Mancini (1965);

- определение уровня иммунных комплексов МГ-IgG в сыворотке кроБи и фолликулярной жидкости ИФА-методом;

— концентрации интерлейкинов, ТБГ и ЛФ - ИФА-методом, с использованием тест систем «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Процедуры статистического анализа выполнялись с помощью статистических пакетов SAS 9, SPSS-16 и InStat 2.0 (Sigma, США). Проверка нормальности распределения признаков в группах сравнения проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова и Шапиро Уилка. Парное межгрупповое сравнение показателей производилось по критерию параметрического дисперсионного анализа, а в случае отсутствия нормальности рас-

пределения признаков, использовались непараметрические критерии Краске-ла-Валлиса и Ван дер Вардена. Для оценки взаимосвязи между результирующей качественной переменной и набором качественных и количественных предикторов, использовался метод логистической регрессии. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенного исследования установили зависимость фолли-кулогенеза в ответ на стимуляцию суперовуляции у участниц программ с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза от давности последнего обострения воспалительного процесса. При более длительной ремиссии (более 5 лет) количество преовуляторных фолликулов было максимальным: 19,06+0,49, что значимо (р=0,032) больше, чем в подгруппе пациенток с последним обострением воспалительного процесса до 3-х лет (17,23+0,92). Аналогичная тенденция выявлена и при определении количества полученных ооцитов, но при отсутствии статистически значимой разницы между группами. В подгруппе с последним обострением более 5 лет (16,18±0,58) их было больше на 14%, чем в подгруппе с обострением воспалительного процесса менее 3-х лет (13,94+1,11). Процеш' оплодотворения полученных ооцитов не зависел от давности последнего обострения воспалительного заболевания матки и придатков.

Наряду с этим, нами был установлен значимо низкий уровень прогестерона (30,12+5,2 Нм/л) во II фазу предшествовавшего программе цикла и РХГЧ на 15-й день после эмбриотрансфера (72,71 ±34,43 МЕ/л) у пациенток, имевших последнее обострение воспалительного заболевания до 3-х лет перед вступлением в программу ЭКО.

Кроме того, установлена зависимость уровня белка Р-ХГЧ от давности перенесенного обострения воспалительного процесса. При давности последнего обострения до 3-х лет уровень Р-ХГЧ был значимо ниже (72,71+34,43 МЕ/л;), по сравнению с более отдаленными сроками перенесенного воспалительного процесса - свыше 5-ти лет (244,63± 45,93 МЕ/л; р=0,0231).

Корреляционный анализ показал, что количество, а главное - качество эмбрионов, напрямую зависело от уровня альфа-1-антитипсина (АТ) и аль-фа-2-макроглобулина (МГ) в сыворотке крови пациенток, определяемого до начала проведения программ ЭКО (г-0,673; р<0,001 и г-0,484: р<0,014, соответственно), а также от концентрации альбумина в фолликулярной жидкости (г=0,348; р<0,02). Чем выше были концентрации АТ и МГ и комплексов МГ- 1§С в сыворотке крови, определяемых до программ ЭКО, тем больше эмбрионов хорошего качества мы получали. В то же время, высокая концентрация ФНО-а, и в сыворотке крови женщин до вступления в программу коррелировала с меньшим количеством полученных эмбрионов и более низкими их качественными характеристиками (г--0,416; р<0,04; г=-0,416; р<0,04 соответственно).

Проведенное исследование позволило выявить, что значимым в определении позитивного исхода программ является не только характеристики фолликулогенеза в ответ на стимуляцию суперовуляцни, но и характер перенесенного воспалительного заболевания в анамнезе у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза, а также давность перенесенного обострения. Чем ранее отзвучало обострение (более 5 лет), тем позитивнее мы получили ответ на проведенную стимуляцию суперовуляции (большее количество преовуляторных фолликулов и полученных ооцитов). Общее количество эмбрионов было так же больше и качественные показатели лучше.

Полученные нами данные наглядно демонстрируют, что результативность программ определена метаболическими изменениями, происходящими в организме женщины как до вступления программу, так и после переноса эмбриона.

Белки, цитокины и специфические комплексы в сыворотке крови и фолликулярной жидкости участниц программ ЭКО

Установлено, что у женщин до вступления в программу ЭКО сывороточные уровни общего белка и альбумина, АТ, ЛФ, у-ИФН, ФНО-а и специфических комплексов (МГ-^в, ЛФ-1§С, ПЛ-МГ) были статистически значимо выше, чем в группе здоровых небеременных женщин (табл. 1).

Таблица 1.

Содержание белков, ФНО-а, специфических комплексов в сыворотке крови участниц ЭКО до вступления в программу е сравнении с показателями у здоровых небеременных женщин

Изучаемые показатели Группы обследованных женщин

здоровые небеременные (п=43) пациентки до программы ЭКО (п=25) достоверность различий (р)

Общий белок, г/л 70,12+1,25 79,26+1,49 р<0,0001

Альбумин, г/л 46,38+0,4 50,00+0,32 р< 0,0001

а-1-антитрипсин, г/л 2,23+0,06 2,52+0,12 р=0,02

Лактоферрин, мг/л 1,02+0,12 (0,71-1,32) 1,53+0,2 р=0,023

ФНО-а, пкг/мл 0,76+0,11 1,5+0,3 р-0,01

у-ИФН, пкг/мл 10,4+1,7 29,5+7,5 р=0,007

МГ-1"0, мг/л 0,71+0,04 1,18+0,27 р-0,02

ПЛ-МГ, мг/л 0,87+0,05 1,5+0,26 р=0,003

ЛФ- мг/л 0,94+0,1 1,46+0,11 р=0,001

Примечание: р - статистически значимые различия показателей в исследуемых группах; в скобках указаны стандартные отклонения значений для лактоферрина.

Выявлена зависимость некоторых из вышеперечисленных показателей (общий белок, ЛФ, иммунокомплексы МГ-^С) от давности последнего обострения воспалительног о процесса гешггалий. Так при давности обострения воспаления гениталий до 3-х лет содержание общего белка было максимальным в сравнении с женщинами, давность обострения у которых была более 5 лет (82,58+2,22 г/л и 75,94+2,бЗг/л; р<0,0001). Содержание иммунокомплексов МГ-^О в группе с обострением воспалительного процесса гениталий давностью более 5 лет назад также снижалось до 0,66+0,15 г/л в сравнении с показателями при обострении воспалительного процесса гениталий менее 3-х лет (1,01+0,095; р=0,05)и было сопоставимо с показателями здоровых небеременных женщин (р=0,003).

При обострении воспалительного процесса, отзвучавшего менее 3-х лет до начала программ, сывороточные показатели ЛФ у женщин имели максимальные значения, в сравнении с давностью обострения гениталий более 5-ти

лет (1,83±0,22мг/л и 1,21+0,36; р=Ч),023). Сывороточные концентрации ингибиторов протеиназ - АТ и МГ не зависели от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий и давности его последнего обострения.

Полученные данные позволяют предположить, что на момент вступления в программы ЭКО женщины с трубно-перитонеальным бесплодием, в большей или меньшей степени, имели остаточные явления воспаления (особенно, если оно отзвучало менее 3 лет назад) и характеризовались определенным дисбалансом цитокинового и белкового профиля. Применение стимуляции суперовуляции приводит к ряду метаболических изменений, приводящих к нормализации некоторых показателей и, таким образом, косвенно способствующих наступлению беременности.

Нами установлено, что проведенная стимуляция суперовуляции не влияла на показатели цитокинов, а также специфических' комплексов (МГ1цС, ЛФ-1«С и ГШ-МГ), содержание АТ, а также ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеиш и средний уровень лактоферрина. Концентрации вышеперечисленных белков не зависели и от характера перенесенного воспалительного процесса. Вместе с тем, гормональная подготовка способствовала снижению в сыворотке крови содержания общего белка (с 79,26+1,49г/л до 70,09± 1,1 г/л), альбумина (с 50,00+0,32 г/л до 46,75+0,28 г/л) и повышала уровень ингибитора протеиназ - а-2-макроглобулина (с 2,18+ 0,11 г/л до 2,76+0,12 г/л). При этом снижение уровней общего белка и альбумина не зависело от давности последнего обострения воспалительного процесса. В то время, максимальное повышение МГ и снижение ЛФ в сыворотке крови участниц программ ЭКО отмечалось при давности обострения воспалительного процесса гениталий до 3-х лет (МГ - от 2,18+0,16 г/л до 2,87+0,2 г/л; р=0,025 и ЛФ от 1,82+0,22 г/л до 1,16+0,12 г/л; р-0,008).

Отмеченное нами повышение уровня МГ нельзя объяснить влиянием повышенного уровня половых стероидов при стимуляции суперовуляции, поскольку мы не установили одновременного повышения уровня АБГ, который также является эстрогензависимым белком. Возможно, в данном случае повышение содержания МГ связано не столько с гормональным фоном, сколько с метаболическими реакциями, характерными для недавно перенесенного воспалительного процесса.

Оценивая выявленные изменения ряда сывороточных показателей через 15 дней после эмбриотрансфера, мы проанализировали их в зависимости от результативности программы и сравнили с показателями при физиологической беременности. Оказалось, что концентрации общего белка и острофазовых белков: альбумина, МГ и АТ не зависели от результативности программы ЭКО и не отличались от показателей, характерных для физиологической беременности в одинаковых сроках гестации. Подобные результаты, в определенной степени, предсказуемы - все три острофазовых белка являются белками-транспортерами, активно выводящими целый ряд метаболитов из циркуляции, и их уровни зависят от слишком многих факторов. Совершенно иные закономерности были выявлены для показателей основного белка беременности - АБГ, являющегося резервным ингибитором протеиназ. Нами установлено, что уровни АБГ, определяемые на 15 день после эмбриотрансфера, в результативных программах были значимо выше, чем в программах, оппозитных по наступлению беременности, при этом концешрация АБГ в группе при индуцированной беременности была в 3 раза выше, чем при физиологической беременности и не зависела от количества плодов (рис. 2).

г/л

0,06 0,05 -0,04 0,03 0,02 0,01 0

-0,059

0.012

0,01.6

^____0,014

0,006

Исходное значение

В день ТУР

15 день после эмбриотрансфера

ЭКО"+"

-ЭКО"-"

~ Физиологическая беременность

Рис.2. Сравнительный уровень АБГ (г/л) в сыворотке крови при физиологической беременности и на разных этапах проведения программ ЭКО, в зависимости от ее результативности.

Наряду с этим, нами установлено повышение в 29 раз концентрации ТБГ' через 15 дней после эмбриотрансфера в результативных программах, по сравнению с уровнями на день ТУР (в результативных программах: 0,94:10,51 нг/'мл - 27,97±7,56 иг/мл; р-0,005; в программах оппозитных по наступлению беременности: 0,67±0,29 иг/мл - 0 нг/мл). Кроме того при индуцированной беременности коннетрация ТБГ была в 4,7 раза ниже его содержания при физиологически наступившей беременности (133,37±24,61 нг/мл; р=0,0001). Вместе с тем, зависимости концентрации ТБГ от исхода беременности и количества плодов нами не выявлено. Установленные закономерности указывают на то, что формирующаяся фетонлацеитарная система плода при индуцированной беременности, в целом, не состоятельна, и повышение уровней АБГ, способного стимулировать пролиферацию, является компенсаторной реакцией организма матери, позволяющей сохранить плод.

При изучении динамики сывороточных уровней цитокинов нами установлено, что при индуцированной беременности уровни цитокинов на 15 день после эмбриотрансфера были сопоставимы с показателями, полученными в день проведения ТУР (табл. 2). В то же время, при нерезультативных программах отмечено статистически значимое снижение концентраций ИЛ-б и ФНО-а.

Таблица 2.

Динамика сывороточных уровней цитокинов у женщин до программы, в день ТУР, на 15 день после эмбриотрансфера в зависимости от результативности ЭКО и при физиологической беременности

Показатели Динамика концентраций цитокинов

ДО программы, п=45 ТУР на 15 эмбриот] день рансфера физиологическая беременность п=15

ЭКО «+» п-22 ЭКО «-» п=23 ЭКО «+» п=22 ЭКО «-» п=23

ИЛ-б 53,5±34,1 27,8±29,9 16,9±10,3 46,3±18,5 6,1 ±2,6* 5,9±3,2**

ИЛ-1Р 8,91:1,4 9,5±2,5 б,2±0,9 9,1±1,5 8,7±0,5 4,5±0,4**

ФНО-а 1,5±0,3 1,210,3 1,5±0,3 1,9±0,5 0,7±0,5* 1,2±0,4**

у-ИФН 29,5±7,5 17,01±5,88 20,99±4,06 17,45±4,40 22,5±7,08 31Д±13,6**

Примечание: *- достоверность различий между группами ЭКО «+» и ЭКО «-»; **- достоверность различий между индуцированной и физиологической беременностью.

Таким образом, выявленные закономерности свидетельствуют о том, что при результативных программах запускаются компенсаторные механизмы, способствующие имплантации: повышенные уровни ИЛ-1|3 противодействуют инфекции и тем самым предотвращают ранние репродуктивные потери, сниженные уровни ИФН-у косвенно улучшают доступность рецепторов, что компенсирует фетоплацентарную недостаточность, равно как и повышенные концентрации ИЛ-б.

Сывороточные концентрации специфических комплексов, определяемых на 15 день после эмбриотрансфера в результативных программах оставались практически неизменными, а в нерезультативных - значимо снижались, по сравнению с их уровнем в день проведения ТУР (рис.3, 4).

мг/л 1,80 -

!

1,20 -1 0,60 -0,00 4

Исходное ТУР На 15 день

эмбриотрансфера

—►-МТ-ДО -*— МГ-11Л - • - ЛФ-ГаО

Рис. 3. Динамика содержания специфических комплексов в сыворотке крови женщин в день проведения ТУР и на 15 день после эмбриотрансфера, в программах ЭКО, оппозитных по наступлению беременности.

Принимая во внимание транспортную роль комплекса ПЛ-МГ, способного активно переносить вещества в ткани эмбриона и стимулировать его рост и развитие, можно предположить, что выявленные нами высокие базовые уровни изученных комплексов при результативных программах ЭКО являются компенсаторным механизмом, позволяющим сохранить плод. А их низкие уровни в период раннего эмбриогенеза (особенно ЛФ-^в) в нерезультативных программах ассоциируются с невынашиванием беременности.

мг/л

1,78

1,80 -1

1,50

1,46

,20 -

0,93

0,60 -

0,00 ^

Исходное

ТУР

На 15 день эмбриотраисфера

- ■ - ЛФ-1°С

— - МГ-^О

—МГ-ПЛ

Рис. 4. Динамика содержания специфических комплексов в сыворотке крови женщин в день проведения ТУР и на 15 день поте эмбриотраисфера, в результативных программах ЭКО.

Нами установлено, что определяемая на 15 день после эмбриотраисфера сывороточная концентрация ЛФ у пациенток с индуцированной беременностью значимо повышалась (р<0,0001), по сравнению с его уровнем в день ТУР и была статистически значимо выше сывороточного уровня ЛФ при физиологически наступившей беременности такого же гестационного периода физиологической беременности - 1,54±0,15 мг/л. В нерезультативных программах ЭКО сывороточное содержание ЛФ оставалось неизменным в течение всего периода исследования (рис. 5).

Повышение уровней ЛФ может объясняться тем, что данный белок является не только острофазовым реактантом, но и обладает мощными противовоспалительными и антимикробными свойствами, а также является активным транспортером кислорода в ткани.

Это особенно важно для женщин с бесплодием трубно-перитонеальной формой бесплодия воспалительного генеза, страдающих, как показывают наши исследования, от остаточных явлений перенесенного ранее воспаления и характеризующихся целым рядом отклонений в микроокружении имплантирующегося эмбриона и формирующегося фето-плацентарного комплекса. Мы считаем, что продолженное повышение содержания ЛФ у женщин с индуцированной беременностью является компенсаторным механизмом, а не показателем острофазовой реакции.

3 ;

I

2,5 -

2 -! 1,5 1

0,5 -!

О I

мг/л

^Р 2,97

2,06

■ЭКО"-" • ЭКО"+"

-А— физиологическая беременность

исходное

на 15 день после эмбриотрансфера

Рис. 5. Динамика сывороточной концентрации лактоферрина (мг/л) на разных этинах проведения программ ЭКО, в зависимости от результативности и в сравнении с физиологической беременностью.

Нами установлено, что по белковому составу и показателям биологически активных веществ фолликулярная жидкость во многом была идентична сыворотке крови. При этом концентрации макроглобулина (0,182±0,13 г/л) и антитрипсина (0,233±0,01 г/л) были ниже сывороточных в 15 и 12 раз соответственно, а содержание лактоферрина (0,470±0,05 г/л) в 3 раза меньше его значений в сыворотке крови. Зависимости концентраций изученных нами показателей в фолликулярной жидкости от характера перенесенного воспалительного заболевания в анамнезе и срока давности его обострения мы не выявили.

Анализ полученных данных установил, что средние концентрации всех изучаемых белков и специфических комплексов в составе фолликулярной жидкости не зависели от исхода проведенных программ ЭКО.

При этом средние уровни цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1Р) в фолликулярной жидкости у пациенток результативных программ были значимо выше в сравнении с теми, у кого беременность не наступила, ИЛ-6 в результатив-

ных программах - 32,8±9,9 пкг/мл, а в нерезультативных - 10,512,5 пкг/мл (р-0,038); ИЛ-1Р в позитивных программах - 3,3±1,1 пкг/мл, а в оппозит-ных по наступлению беременности - 0,7±0,4 пкг/мл (р-0,044). Показатели ФНО-а и у-ИФН в составе фолликулярной жидкости не зависели от результативности программы.

Данные результаты подтверждают высказанные ранее предположения о стимулирующей роли ИЛ-б и защитной ИЛ-1р для развития плода. Вероятно, данные цитокины не только способствуют успешной имплантации, но и оказывают благотворное влияние на развитие самого ооцита. Учитывая их высокие исходные уровни при успешных программах ЭКО, можно предположить их влияние на формирование более полноценных ооцитов с более высоким репродуктивным потенциалом и, вполне возможно, с гораздо меньшим количеством хромосомных аномалий, которые являются одной из основных причин ранних выкидышей. Кроме того, это может свидетельствовать о накоплении большого количества поврежденных белков-транспортеров (МГ и ЛФ) в процессе избыточного окисления в зоне воспаления, которые не способны выполнять свои функции и, в силу этого, распознаются иммунной системой как частично чужеродные, что и приводит к образованию комплексов.

ВЫВОДЫ

1. Количество полученных преовуляторных фолликулов и ооцитов, количество и качество эмбрионов, а также процент оплодотворения у женщин, принявших участие в программе ЭКО, зависят от давности обострения воспалительного заболевания гениталий в анамнезе.

2. Содержание общего белка, альбумина, антитрипсина, специфических комплексов (МГ-1§0, ЛФ-^О, ПЛ-МГ) и цитокинов (у-ИФН и ФНО-а) в крови пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного ге-неза, до вступления в программы ЭКО, статистически значимо повышено в сравнении со здоровыми небеременными женщинами.

3. У пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием при давности перенесенного обострения воспалительного процесса до 3-х лет перед вступлением в программы ЭКО, имеются исходно высокие сывороточные значения общего белка и лактоферрина, а в ответ на стимуляцию суперовуляции отмечается значимое повышение уровня алъфа-2-макроглобулина и снижение лактоферрина в сыворотке крови.

4. У женщин с наступившей беременностью в результате применения программы ЭКО наблюдается исходно нормальный уровень сывороточного лактоферрина (менее 1.5 мг/л); повышенное содержание некоторых цитоки-нов в фолликулярной жидкости (ИЛ-6 > 22 икг/мл, ИЛ-1Р > 2,0 пкг/мл) и увеличение концентраций белков беременности (АБГ > 0,03 г/л и ТБГ > 30 нг/л), а также лактоферрина > 2,0 мг/л и !«С > 10 г/л в сыворотке крови на 15-й день после эмбриотрансфера.

5. При индуцированной беременности на 15 день после эмбриотрансфера сывороточные концентрации АБГ и ЛФ выше (в 4 и 1,9 раза соответственно), а ТБГ в 4,7 раза ниже, в сравнении с таковыми при физиологической беременности сроком 3-4 недели гестации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При определении до начала программы сывороточных уровней ФНО-а - более 1,0 пкг/мл., концентрации лактоферрина - более 1,3 мг/л., общего белка - более 73 г/л, альбумина - более 47 г/л и антитриисина - более 2,4 г/л необходимо рекомендовать дополнительное обследование и проведение курса противовоспалительной и реабилитационной терапии.

2. Уровни цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1Р) в составе фолликулярной жидкости могут использоваться в качестве дополнительного прогностического критерия результативности программ ЭКО. Показатели ИЛ-6, превышающие 22 пкг/мл, а ИЛ-1Р - 2,0 пкг/мл, определяют высокую вероятность позитивного исхода. Низкие уровни данных цитокинов (ИЛ-6<13 пкг/мл и ИЛ-1р<1,0 пкг/мл) свидетельствуют о нерезультативности программ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Маркина Л.А., Зорина В.Н., Зорина P.M. Альфа-2-макроглобулип и его комплексы с IgG в сыворотке крови у женщин при экстракорпоральном оплодотворении// Материалы 1-й Всероссийской конференции «Проблемы женского здоровья и пути их решения». - М., 2007. - С.35.

2. Мальцева Н.В., Маркина Л.А., Баженова Л.Г. Сравнительный анализ содержания a-2-макроглобулина и ассоциированного с беременностью а-2-гликопротеина в сыворотке крови женщин при экстракорпоральном оплодотворении.// Сибирский медицинский журнал - 2007. -Т.22. - №4. - С.60-65.

3. Зорина В.Н., Маркина Л.А., Архипова C.B. Уровни цитокинов, альфа-2-макроглобулина и его активной транспортной формы у женщин с бесплодием трубного генеза при экстракорпоральном оплодотворении.// Медицинская иммунология. - 2007. - Т.9. - №4-5. - С.389-397

4. Маркина Л.А., Баженова Л.Г., Зорина P.M. Белки и провоспалитель-ные цитокины фолликулярной жидкости у женщин с бесплодием в программах ЭКО и ПЭ// Материалы 2-й Российской конференции «Иммунология репродукции». - Сочи, 2007. - Р.1.- С.16.

5. Маркина Л.А., Мальцева Н.В., Баженова Л.Г. Ассоциированный с беременностью альфа-2-гикопротеин и трофобластический ß-глобулин при экстракорпоральном оплодотворении// Материалы 9-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М„ 2007. - С.158-159.

6. Маркина Л.А., Зорина В.Н., Шрамко C.B. Содержание реактантов воспаления в сыворотке крови женщин при воспалительных заболеваниях придатков матки и участвующих в программе экстракорпорального оплодотворения.// Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - №2. - С.15-17.

7. Маркина Л.А., Зорина P.M., Зорина В.Н. «Белки, цитокины и анти-генспецифические иммунокомплексы фолликулярной жидкости и сыворотки крови у женщин при экстракорпоральном оплодотворении».// Вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии - 2008 - Т.7. - №5.- С.29-32.

Подписано в печать 23.12.2008 г. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,5. Бумага ксероксная. Печать на ризографе 112-300 ЕР. Тираж 100. Заказ №785. Отпечатано в типографии ГОУ ДПО «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». 654005, г. Новокузнецк, пр. Строителей, 5.

Актуальность исследования.

Важнейшей составляющей общего здоровья женщины и качества ее жизни является репродуктивное здоровье, а одним из важнейших его компонентов — способность к зачатию, вынашиванию и рождению детей. Утрата этой способности - трагедия семьи и общества, и с этих позиций бесплодие в браке — это современная медико-социальная проблема, требующая дальнейшего изучения, тем более, что в России каждая 4-5-я супружеская пара бесплодна (Кузьмичев Л.Н., 2001; Колпащикова Г.И., 2002). Возрастающий интерес к развитию вспомогательных репродуктивных технологий во всем мире обусловлен приоритетностью проблемы бесплодия. Современные подходы к диагностике и лечению бесплодных супружеских пар основаны на достижениях фундаментальных наук в области изучения молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе реализации процесса репродукции у человека. Расшифровка механизмов гормональной регуляции репродуктивной системы способствовала созданию и эффективному использованию различных классов соединений, воздействующих на ее различные уровни (Кулаков В.И., 2005). Внедрение эндоскопического метода существенно расширило представления о патобиологии ряда заболеваний женской репродуктивной системы (Адамян Л.В., 2008), а внедрение методов ВРТ способствовало углубленному изучению процесса репродукции и существенно расширило возможности восстановления репродуктивной функции при наиболее тяжелых формах женского и мужского бесплодия (Фанченко Н.Д. и соавт., 2000).

Вместе с тем, результативность проведенных программ ЭКО и ПЭ не совсем удовлетворяет специалистов по репродуктивной, медицине: частота наступления беременности после ЭКО все еще остается низкой — около 28% для женщин до 35 лет (HFEA Guide to infertility. 2006/2007). Частота преждевременных родов составляет 33,6%, а у каждой 5 женщины беременность прерывается до 20 недель гестации (Сидельникова В.М. и соавт., 2005).

Для улучшения эффективности программ ЭКО и снижения плодовых потерь исследователи оценивают овариальный резерв яичника, который определяет способность последнего к развитию здорового фолликула с полноценным ооцитом и к адекватному ответу на стимуляцию (Боярский К.Ю., 2000, 2005), предлагают новые схемы стимуляции суперовуляции (Смольникова В.Ю., 2001, 2005), разрабатывают новые, более эффективные и менее затратные критерии оценки качества эмбрионов (Панков А.В., 2005) и ведут поиск маркеров результативности проведенных программ.

Нарушение процессов стероидо- и фолликулогенеза, оплодотворения, раннего эмбриогенеза, секреторной трансформации эндометрия и имплантации являются важными, но, вместе с тем, малоизученными причинами неэффективных исходов программ ЭКО. В последнее время все большее внимание уделяется изучению роли цитокинов и универсальных регуляторных субстанций в механизмах координации различных функций человеческого организма. К такому классу соединений относятся белки семейства макроглобулинов, играющих существенную роль на всех этапах реализации репродуктивной функции. Это позволяет рассматривать изучение их регуляторных свойств при ВТР в качестве перспективного направления для решения задач по повышению результативности программ ЭКО, поскольку ряд авторов рассматривает их в качестве прогностических и диагностических критериев не-осложненного течения беременности (Зорин Н.А. и соавт., 2005; Bany В.М., McRae А.С., 1992; Petersen С.М., 1993; Maltseva N.V., Zorin N.A., 1997; Armstrong P.B., Quigley J.P., 1999; Birkenmeier G., 2001;).

Цель работы состояла в определении прогностических критериев результативности программ экстракорпорального оплодотворения на основе оценки клинических и иммунологических показателей при трубно-перито-неальном бесплодии воспалительного генеза.

Задачи исследования:

1. Оценить фолликулогенез у участниц программ ЭКО в ответ на стимуляцию суперовуляции в зависимости от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий и давности его последнего обострения.

2. Изучить сывороточное содержание цитокинов (ИЛ-1(3,ИЛ-6, ФНО-а, ИНФ-у), белков острой фазы: альфа-2-макроглобулина (МГ), ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ), лактоферрина (ЛФ), антитрипсина (AT), альбумина и специфических комплексов: МГ-IgG, ЛФ- IgG и Плазмин-МГ (ПЛ-МГ) у участниц программ ЭКО в зависимости от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий и давности его последнего обострения.

3. Исследовать сывороточное содержание цитокинов, белков острой фазы и специфических комплексов в разные периоды проведения программы ЭКО (до программы, в день проведения TVP, на 15 день после эмбриотранс-фера) у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза, с оценкой значимости исследуемых показателей в прогнозе результативности программ ЭКО.

4. Определить уровни цитокинов, белков острой фазы и специфических комплексов в составе фолликулярной жидкости и оценить их связь с результативностью программ ЭКО.

5. Провести сравнительную оценку изученных показателей при индуцированной и физиологической беременности.

Научная новизна.

Впервые определены уровни ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина и специфических комплексов (МГ-IgG, ЛФ- IgG и ПЛ-МГ) в составе фолликулярной жидкости, а также их прогностическая значимость.

Впервые установлено, что при индуцированной беременности на 15 день гестации снижение содержания трофобластического pi-глобулина сопровождается повышением уровня ассоциированного с беременностью а-2гликопротеина в сравнении с физиологической беременностью. Выявленные закономерности в показателях двух основных белков беременности на ранних этапах гестации при индуцированной беременности обосновывают механизмы сохранения ее на этапе раннего эмбриогенеза в позитивных программах ЭКО: первичная несостоятельность фетоплацентарного комплекса компенсируется реакцией иммунной системы матери, обеспечивая сохранение беременности.

Выявлена статистически значимая взаимосвязь результативности программ ЭКО с уровнями цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-1р) в составе фолликулярной жидкости, а также концентраций АБГ и цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-10) в сыворотке крови, определяемых на 15 день после эмбриотрансфера.

Практическая значимость работы. Полученные результаты продемонстрировали значимость определяемых белков, цитокинов и специфических комплексов у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза для прогноза последующей беременности.

Положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Количество полученных ооцитов, общее количество и качество эмбрионов, а также процент оплодотворения эмбрионов у женщин, принявших участие в программах ЭКО, зависят от характера перенесенного воспалительного заболевания гениталий в анамнезе и давности его последнего обострения.

2. Исходно низкий уровень лактоферрина (менее 1,5 мг/л), повышенное содержание в фолликулярной жидкости ИЛ-6 (32,8±9,9) и ИЛ-ip (3,3±1,1) и повышение в динамике в период раннего эмбриогенеза сывороточных концентраций белков беременности: АБГ (более 0,03 г/л), ТБГ (более 30 нг/мл), острофазового белка - лактоферрина (более 2,0 мг/л), иммуноглобулина G (более 10 г/л) является хорошим прогнозом для последующей реализации репродуктивной функции.

3. Индуцированная беременность у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза характеризуется низким содержанием трофобластического Р-1-глобулина (27,97±7,56 нг/мл) в период раннего эмбриогенеза, в сравнении с физиологически наступившей беременностью (133,0±24,61 нг/л). Это свидетельствует о первичной несостоятельности фе-топлацентарного комплекса, которая компенсируется реакцией иммунной системы матери в форме повышения уровня ассоциированного с беременностью а-2-гликопротеина (до 0,059±0,013 г/л), обеспечивая условия сохранения беременности.

ВЫВОДЫ

1. Количество полученных преовуляторных фолликулов и ооцитов, количество и качество эмбрионов, а также процент оплодотворения у женщин, принявших участие в программе ЭКО, зависят от давности обострения воспалительного заболевания гениталий в анамнезе.

2. Содержание общего белка, альбумина, антитрипсина, специфических комплексов (MT-IgG, ЛФ-IgG, ПЛ-МГ) и цитокинов (у-ИФН и ФНО-а) в крови пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием воспалительного генеза, до вступления в программы ЭКО, статистически значимо повышено в сравнении со здоровыми небеременными женщинами.

3. У пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием при давности перенесенного обострения воспалительного процесса до 3-х лет перед вступлением в программы ЭКО имеются исходно высокие сывороточные значения общего белка и лактоферрина, а в ответ на стимуляцию суперовуляции отмечается значимое повышение уровеня альфа-2-макроглобулина и снижение лактоферрина в сыворотке крови.

4. У женщин с наступившей беременностью в результате применения программы ЭКО наблюдается исходно нормальный уровень сывороточного лактоферрина (менее 1,5 мг/л); повышенное содержание некоторых цитокинов в фолликулярной жидкости (ИЛ-6 > 22 пкг/мл, ИЛ-1(3 > 2,0 пкг/мл) и увеличение концентраций белков беременности (АБГ > 0,03 г/л и ТБГ >30 нг/л), а также лактоферрина > 2,0 мг/л и IgG > 10 г/л в сыворотке крови на 15-й день после эмбриотрансфера.

5. При индуцированной беременности на 15 день после эмбриотрансфера сывороточные концентрации АБГ и ЛФ выше (в 4 и 1,9 раза соответственно), а ТБГ в 4,7 раза ниже, в сравнении с таковыми при физиологической беременности сроком 3-4 недели гестации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При определении сывороточных уровней ФНО-а - более 1,0 пкг/мл, концентрации ЛФ - более 1,3 мг/л, общего белка - более 73 г/л, альбумина -более 47 г/л и антитрипсина - более 2,4 г/л необходимо рекомендовать дополнительное обследование и проведение курса противовоспалительной и реабилитационной терапии.

2. Уровни цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-lp) в составе фолликулярной жидкости могут использоваться в качестве дополнительного прогностического критерия результативности программ ЭКО. Показатели ИЛ-6, превышающие 22 пкг/мл, а ИЛ-1р - 2,0 пкг/мл, определяют высокую вероятность позитивного исхода. Низкие уровни данных цитокинов (ИЛ-6 <13 пкг/мл и ИЛ-1р < 1,0 пкг/мл) свидетельствуют о нерезультативности программ.