Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Оптимизация лечения аллоиммунного бесплодия

На правах рукописи

сЛеуҐ-

Лейхнер Елена Константиновна

Оптимизация лечения аллоиммунного бесплодия 14.01.01 - акушерство н гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о 4 ОКТ 2012

Челябинск - 2012

005052445

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации на кафедре Акушерства и гинекологии

I Ыучш.ш руководитель

доктор медицинских наук, профессор Узлопа Татмш» Ваенльепна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, Ьрюхина Елена Владимировна

ГБОУ ВПО ЧелГМА Мннздравсоцразвитня России

заведующий 1«1федры Акушерства

и гинекологии факультета послевузовского

и дополнительного профессионального

образования

Доктор медицинских паук, профессор ОГмккалопа Татыша Анатольевна

ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Мннздравсоцразвитня России заведующим кафедрой Акушерства и гинекологии педиатрического факультета

Ведущая организация

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика ЕА. Вагнера» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 2012 года в часов на заседании диссертационного совета

Д 208.117.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации но адресу 454092, г. Челябинск, ул.Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан « » 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Казачклва Элла Алексеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Проблема бездетного брака остается одной из актуальных в современной гинекологии не только в Российской Федерации, но и в других странах. По данным разных регионов, до 15% населения Российской Федерации сталкиваются с этой проблемой. Эффективность экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) не превышает 30% (Светлаков A.B., 2004; Кулаков В.И., 2005; Elder К., 2008). По данным Российской Ассоциации Репродукции Человека за 2009 год, частота наступления беременности в циклах ЭКО в расчете на перенос эмбрионов составила 36,8%, на пункцию фолликула 34,0%. Родами завершилось 19,3% от общего количества начатых циклов. По отчету Европейского общества репродукции человека и эмбриологии за 2008 год, во Франции частота наступления беременности составила 23,5% (па пункцию), а частота родов 18,7% (на пункцию), в Германии 24,9% и 18,8% соответственно, в Великобритании 30,7% и 25.5% соответственно. Таким образом, лечение бесплодия, и в том числе поиск методов повышения эффективности процедуры ЭКО и переноса эмбрионов (ПЭ) остается актуальной проблемой.

Ряд проведенных отечественных и зарубежных исследований свидетельствует, что большинство неудач имплантации, как in vivo, так и в протоколах ЭКО, обусловлено нарушением иммуннологнческих взаимоотношений в системе бластоциста-эндометрпй (Дьяконов, С.А., 2006; Giudicc L.C., 2002). Одним нз вариантов подобных нарушений является иммунологическое отторжение бластоцисты как аллотрансплантанта, чужеродного для матери вследствие экспрессии отцовских антигенов и нарушения процессов блокирования киллерной активности клеток эндометрия (Hedrick P.W., 2002; Erlich H.A., 2006). Недостаточную продукцию блокирующих факторов и повышенную агрессию NK-клеток эндометрия женщины связывают с особенностями главного комплекса тканевой совместимости (МНС) родителей (Сндельникова В.М., 2002; Шахполян Я.Л., 2004; Тетруашвили Н.К., 2005). Ряд исследователей также полагают, что гены, локализованные в разных хромосомных локусах, кодирующих второй класс МНС, влияют на разные аспекты репродукции, и что совместимость по человеческим лейкоцитарным антигенам (HLA) может вызвать дефекты репродуктивного процесса (Болдырева М.Н., Хаитов P.M., 2004).

В тоже время некоторые исследователи не смогли установить прямой зависимости между совпадениями супругов по антигенам главного комплекса гистосовместимости и привычным невынашиванием (Gleicher N., 2002; Scott LR., 2006). Таким образом, вопрос о роли главного комплекса гистосовместимости в процессах сохранения беременности, необходимости включения типирования генов главного комплекса гистосовместимости в стандарты обследования бездетных пар остается открытым.

До сих пор отсутствуют четкие критерии, позволяющие прогнозировать

вероятность положительного исхода ЭКО для пары с конкретными антигенами системы человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) или рекомендовать парам донорские программы. Возможность наличия антигенов-протекторов и антигенов, способствующих репродуктивным неудачам, как у женщин, так и у мужчин, до сих пор обсуждаются (Петросян Л.А., 2009; Велиева Э.Э., 2010).

Даже признав роль системы HLA в процессах продолжения рода за научный факт, мы сталкиваемся с еще одним нерешенным, н потому крайне актуальным вопросом — разработкой методов, позволяющих избежать атаки хориона материнскими NK-клетками (Шахполян Я. Ш.,2006; Scott J.R., 2003). Одним из таких методов является лимфоцитоиммунотерапия (ЛИТ). Отношение к ЛИТ также крайне неоднозначно (Takeshita Т., 2004).

Цель исследования Оптимизировать эффективность лечения аллоиммунного бесплодия с учетом особенностей генотипа главного комплекса гпстосовместимости . Задачи исследования

1. Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов генов системы главного комплекса гпстосовместимости у пациенток с бесплодием с учетом этнических особенностей.

2. Установить ключевые факторы, особенности генотипов главного комплекса гистосовместимости, влияющие на наступление спонтанной беременности в парах с бесплодием и на эффективность программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.

3. Оценить эффективность лимфоцитоиммунотерапии в лечении бесплодия в качестве монотерапии и как дополнительного метода в программах экстракорпорального оплодотворения.

4. Разработать алгоритм ведения пар с бесплодием с учетом особенностей генотипов главного комплекса гпстосовместимости в программах экстракорпорального оплодотворения с использованием собственных и донорских гамет с определением прогноза реализации репродуктивной функции.

Научная новизна

Установлено, что в генезе репродуктивных неудач помимо совместимости супругов по более, чем трем антигенам системы главного комплекса гистосовместимости значимую роль играют: носительство определенных аллелей I и II класса в генетическом наборе женщины и\или мужчины в паре. При носительстве аллеля DQA1*01:03 HLA И класса у обоих партнеров вероятность наступления беременности крайне низкая. К репродуктивным неудачам предрасполагают аллели А*33,А*03, В*15, В*35, В*13,В*38, В*41, DRB1*5 , DQA1*05:01, DQA1*01:03, DQA1*02:01 и DQB1*03:01, сочетание аллелей DQA1*0I:03 и DQA1*02:01.

Впервые доказана негативная роль аллеля DQA1*01:03 HLA II класса в процессах репродукции.

Доказана эффективность лимфоцитоиммунотерапии как монотерапии

аллоиммунного бесплодия в парах-носителях в генотипе HLA таких аллелей, как А*01, А* 11, А*25, В*44 - для женщин -и мужчин, А*24 для женщин, . А*02 для мужчин, DRB1*06, DQA1*01:02, DQA 1*05:02. Дополнены критерии проведения лнмфоцитоиммунотерапии, а именно исключение мужа из числа доноров лимфоцитов и подбор доноров на основании количества генов, по которым донор может иммунизировать реципнента. Впервые разработаны рекомендации для перехода к донорским программам вспомогательных репродуктивных технологий на основании анализа генотипа HLA пары, особенностей ответа женщины на стимуляцию суперовуляции и результатов протоколов экстракорпорального оплодотворения.

Теоретическая значимость работы

Расширены представления о роли главного комплекса гистосовместимости в процессах репродукции.

Определена группа пациентов повышенного риска репродуктивных неудач, у которых необходимо проведение иммуногенетического обследования. Выделена группа пациентов, у которых лимфоцитоиммунотерапия может быть единственным эффективным методом лечения бесплодия.

Оптимизирована тактика включения или исключения супруга из донорства лимфоцитов. При отсутствии антигенов во II классе или наличии всего 2х антигенов, но которым муж может иммунизировать супругу, рекомендуется исключать мужа из числа допоров лимфоцитов. :

Впервые разработан алгоритм определения прогноза нехода лечения бесплодия, в том числе процедуры экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, в зависимости от генотипа главного комплекса гистосовместимости пары.

Разработан алгоритм включения пары с аллоиммунным генезом бесплодия в программы экстракорпорального оплодотворения с применением донорских гамет.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Носительство аллелей 1 и 11 класса А*33,А*03, В* 15, В*35, В*13, В*38, В*41, DRB1*05 , DQA1*05:01, DQA1*01:03, DQA1*02:01 и DQB1*03:01 в генотипе главного комплекса гистосовместимости супругов снижает вероятность наступления беременности.

2. Совпадение супругов по аллели DQA1*01:03, сочетание аллеля DQA1*01:03 с гаплотипами 07\02:01\03:03, 07\02:01\03:01, 08\03:01\03:02 и 09\03:01\03:03, гомозиготность супругов по вышеперечисленным аллелям, наличие более одного совпадения в I классе главного комплекса гистосовместимости по аллелям А*33,А*03, В* 15, В*35, В*13, В*38, В*41 являются основой для формирования группы риска по отрицательным исходам в программах экстракорпорального- оплодотворения и переноса эмбрионов.

3. Учет особенностей генотипа главного комплекса гистосовместимости пар определяет дифференцированный подход к тактике ведения женщин с аллоиммунным бесплодием.

4. Использование алгоритма ведения пар с бесплодием с учетом особенностей генотипов главного комплекса гистосовместимости, применение прогностического индекса, применение территориальных карт и определение прогноза повышает эффективность преодоления бесплодия.

Апробация диссертации

Основные положения работы доложены на научной конференции кафедры Акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (2010), на междисциплинарной конференции ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови» (2011 г).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в педагогический процесс на кафедре Акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Издано методическое пособие для врачей акушеров-гинекологов «Дифференцированный подход к ведению пар с аллоиммунным бесплодием» (Челябинск, 2012). Алгоритм ведения пар с аллоиммунным бесплодием внедрен в практическую работу отделения вспомогательных репродуктивных технологий ЗАО «Жемчужина», г.Челябинск. Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура » объем диссертации

Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, включает 34 таблицы, 18 диаграмм, 4 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 175 литературных источников, из них 69 отечественных и 106 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе кафедры Акушерства и гинекологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная

медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в период с 2008 по 2012 гг. Для оценки влияния полиморфизма генов системы человеческих лейкоцитарных антигенов (система HLA) на процессы репродукции и эффективность экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов нами были отобраны 78 нар русской национальности с аллонммунным фактором бесплодия. Всем пациенткам выполнено клннико-лабораторное

обследование, по результатам которого были исключены инфекции, передающиеся половым путем, декомпилированные гормональные нарушения, органическая патология полового аппарата, мужской фактор бесплодия.

Критериями включения в группу являлись: совместимость в. паре по 2м и более генам системы HLA, репродуктивный возраст, диагноз «бесплодие», причем все женщины ранее состояли на диспансерном учете с данным диагнозом от 2х до 7лет, отсутствие галактореи, отсутствие патологии молочных желез, являющейся противопоказанием к включению женщины в протокол стимуляции суперовуляции, нормальное строение полового аппарата, регулярный менструальный цикл за последний год, что косвенно свидетельствует об отсутствии тяжелой гормональной патологии (наличие в анамнезе олнгомеиореи допускалось), нормальные значения гормонального скрининга, кариотип 46хх.

Критериями исключения являлись: патология полости матки, а именно гиперпластические процессы эндометрия, синехпн полости матки, наличие субмукозных миоматозных узлов, аденомиоз III-1V степени, наличие образований яичников на момент начала исследования, наличие миоматозных узлов более 2,5см в диаметре, тромбофилические нарушения, наличие мутантных гомозигот генов F5, F2, MTHFR, FGB, РАМ, GP lila, MTRR, аутоиммунная патология, соматическая патологии, являющаяся противопоказанием к включению в протоколы стимуляции суперовуляции и вынашиванию беременности.

Все пациентки были информированы о целях и задачах данного исследования, информированное согласие на этапы обследования и лечения было получено.

Группу контроля для изучения частоты встречаемости аллелей HLA составили 207 человек (открытое исследование случай-контроль). Группа контроля представлена населением Челябинской области, только русской национальности, в возрасте от 18 до 55 лет. В выборку вошли мужчины и женщины, доноры крови и ее компонентов, не имеющие соматической

патологии, имеющие детей.

Учитывая наличие совпадений в системе главного комплекса гистосовместимости, всем пациенткам из исследуемой группы рекомендовано проведение лимфоцитоиммунотерапии (ЛИТ) донорскнми лимфоцитами. На фоне проведения ЛИТ мы ожидали наступления спонтанной беременности, так как критерии отбора в группу позволяли предположить, что иммунный фактор бесплодия был па этапе отбора доминирующим у этих женщин. ЛИТ проводилась с использованием донорских лимфоцитов по схеме: на 2-5Й день менструального цикла, через 0-1-3-6 месяцев (где 0 — первая ЛИТ). При отсутствии спонтанной беременности через 6 месяцев от момента проведения 1й процедуры ЛИТ женщине назначался протокол стимуляции суперовуляции с дальнейшим проведением процедуры экстракорпорального оплодотворения.

Контролируемая овариапьная гиперстимуляция проводилась с применением аналогов гонадотропин рилизинг гормона: агонистов (АгГнРг) и антагонистов (АнтГнРг) по стандартным протоколам. Для стимуляции роста фолликулов использовались мочевые и рекомбинантиые гонадотропнны. В качестве триггера овуляции применялись: Прегнил и Овитрель. При наличии показаний к стимуляции добавлялись препараты эстрогенов.

Перенос эмбрионов производился па 3 или 5 сутки после трансвагинальной пункции фолликулов. Через 14 дней после переноса эмбрионов у пациенток проводился анализ уровня XI" в крови, а через 21день после переноса выполнялось УЗИ.

При вступлении в протокол лимфоцитоиммунотерапию проводили по схеме: на 2й-5н день менструального цикла в месяце, предшествующему началу протокола стимуляции суперовуляции, затем на 2й день менструального цикла при вступлении в протокол стимуляции суперовуляции. Части женщин была проведена двусторонняя тубэктомия с целью подготовки женщины к экстракорпоральному оплодотворению до начала данного исследования. Этим женщинам лимфоцитоиммунотерапию проводили по схеме - на 2й-5й день менструального цикла в месяце, предшествующему началу протокола стимуляции суперовуляции, затем на 2й день менструального цикла при вступлении в протокол стимуляции суперовуляции.

Определение антигенов IIЬЛ I класса производилось на лимфоцитах периферической крови, путем использования стандартного метода «комплементзависимой цитотоксичности», разработанного П. Терасаки (1991). Для изучения распределения антигенов главного комплекса гистосовместимости (НЬА) II класса использовали метод полимеразной цепной реакции.

В зависимости от сроков и методов наступления беременности все обследованные. пары были разделены на 3 группы (открытое проспективное стратифицированное когортное исследование):

1. Группа 1.-21 пара - беременность не наступила ни в самостоятельных циклах, ни в протоколе экстракорпорального оплодотворения.

2. Группа 2. - 33 пары - беременность наступила в результате процедуры

экстракорпорального оплодотворения. 3. Группа 3. - 24 пары - беременность наступила спонтанно на фоне проводимой лимфоцитоиммунотерапии в срок 6 месяцев с момента начала ЛИТ.

Дизайн исследования

Веет 78 пар (156 человек) с днапіо'-іоіі аллопммупное бесплодие

Группа 1.21 пара. Беременность не наступила ни спонтанно на фоне ЛИТ ни в результате процедуре ЭКО и ГТЭ, проводимых па фоне ЛИТ

Группа 2. 33 пары. Беременность наступила в результате процедуры "ЗкО п Г1Э, проводимых на фойе ЛИГ

Группа 3. 24 пары. Беременность наступила самостоятельно на фоне проводимой ЛИТ

Полученные цифровые результаты обрабатывались методом вариационной статистики для параметрических и непарамегрических данных на компьютере ЫеН Реп1шт IV с использованием пакета прикладных программ для статистической обработки "ЕхеГ версия 7,0 раздел программы «Анализ данных», подраздел «Описательная статистика». Для определения ассоциаций определенных аллелей НЬА с возможностью развития бесплодия использовали критерий относительного риска по Вульфу. Различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05, р<0,01, р<0,001. Для построения уравнения прогноза применен метод днекриминантного анализа.

Результаты исследования п их обсуждение

В выделенных группах проведен анализ факторов, оказывающих воздействие на репродуктивную функцию: оценивался возраст, социально-экономический статус, наследственный анамнез, соматическая и гинекологическая патология, длительность бесплодия, становление и характер менструальной функции, особенности течения и исхода предыдущих беременностей, в т.ч. от прежних партнеров, качество овариальных циклов, особенности'маточных труб, особенности состояния полости матки и эндометрия, спермограмма партнера.

Средняя продолжительность бесплодия среди обследованных пар составила 5,1±0,5лет.

Продолжительность бесплодия в сравниваемых группах составила: в 1й группе - 5,2±0,6года, во 2й группе - 5,0±0,5года, в Зй группе - 5,1±0,4. Различий по группам не получено - критерий Крускала-Уолеса р=0,39

Возраст женщин из исследуемых пар колебался от 22х до 44х лет и составил в среднем 31,23±0,54 года.

Таким образом, в раннем репродуктивном возрасте находилась 62 (79,49%) женщина. В группе 1 на долю женщин раннего репродуктивного возраста приходится 85,7% женщин, в группе 2 - 66,67% соответственно, в группе 3 - 91,67% соответственно.

Все супружеские пары проживали в одинаковых клпмато-географическнх условиях (Челябинская область), принадлежали к среднему социально-экономическому классу, имели среднее и высшее образование. Условия труда обследованных женщин не были связаны с профессиональными вредностями.

Индекс соматической патологии в группе со спонтанно наступившими беременностями оказался выше, чем в 1й и 2й группе, таким образом частота экстрагенитальной патологии не связана с вероятностью наступления беременности.

Анализ паритета в первой группе по сравнению со 2й и Зй группой показал достоверное снижение общего числа беременностей в анамнезе (19,05% в группе 1 против 57,58% во второй группе и 54,17% в третьей, р< 0,001). Все беременности, закончившиеся родами и медицинскими абортами, наступали у пациенток в предшествующих браках от других половых партнеров.

При анализе гинекологической патологии обращает на себя внимание высокий процент воспалительных заболеваний п анамнезе (46,67% женщин имели в анамнезе хронический эндометрит), в том числе у каждой пятой среди исследуемых женщин - хламидиоз, однако все были пролечены и на момент начала исследования не имели инфекционных заболеваний.

По данным инструментальных методов обследования женщины во всех трех группах имели проходимые маточные трубы, овуляторный овариально-менструальный цикл и фертильную сперму партнеров, т.е. трубпо-перитонеальный и мужской фактор бесплодия были исключены.

При анализе патологии эндометрия у всех женщин в гистологическом его исследовании были признаки хронического неактивного эндометрита.

Таким образом, выделенные группы сопоставимы по клинико-лабораторным и инструментальным обследованиям.

При анализе числа совпадений между партнерами в исследуемых парах, общее количество совпадений составило 4,92±0,1, количество совпадений генов (Мер) в 1м классе - 1±0,07. количество совпадений генов (Мер) во Им классе - 3,92±0,16.

Анализ совпадений по группам показал: в группе 1 - с неудачными исходами попыток ЭКО (21 пара) - общее количество совпадений равно 4,2±0,3, число совпадений по генам I класса 1,2±0,2, количество совпадений по генам II

класса составило 3,1±0,2. В группе 2 с успешными попытками ЭКО (33 пары) общее количество совпадений равно 4,3±0,3; число совпадений по генам I класса 1,1*0,2, количество совпадений по генам II класса составило 3,2±0,2. В группе №3 (пары со спонтанно наступившей беременностью) общее количество совпадений равно 3,5±0,3, число совпадений по генам I класса 0,7 ±0,2, количество совпадений по генам II класса составило 2,8±0,3. При межгрупповом сравнении с использование критерия Крускала-Уоллеса достоверной разницы не получено. При попарном сравнении групп с использованием критерия Манна-Уитни частота общего количества совпадений между группой 3 и группой 1 статистически значима (р<0,05).

При анализе частоты встречаемости аллелей 1А класса в парах с бесплодием на первом месте по распространенности аллель А*02, на втором А*03, на третьем А*01, на четвертом А*24, на пятом А* 11. Однако различия в частоте встречаемости А*03 в контроле и в группе с бесплодием не достоверны.

При анализе частоты встречаемости генов I класса группы А было выявлено достоверное повышение частоты встречаемости 1-ена А*33 по сравнению с контрольной группой. Критерий относительного риска 1111 для НЬА А*33 равен 4,07. В результате анализа частоты встречаемости генов класса 1А в группах пациенток с бесплодием было обнаружено достоверно значимое снижение частоты встречаемости гена А*01 в первой группе по сравнению с контролем. При сравнении частоты встречаемости генов класса 1А между исследуемыми группами достоверно увеличение частоты встречаемости гена А*25 в группе 3 по сравнению с группами 1 и 2, р 0,03 (отсутствие статистической значимости позволило объединить группы 1 и 2 в одну для данного конкретного гена). Также прослеживается тенденция к снижению частоты встречаемости гена А*03 в группе 3 по сравнению с группами 1 и 2. И достоверно повышение частоты встречаемости аллеля А*33 во всех трех группах по сравнению с контролем.

При анализе тендерных различий в частоте встречаемости генов класса 1А в парах с диагнозом «бесплодие» выявлено следующее: тенденция к снижению частоты встречаемости гена А*01 и А*02 у мужчин по сравнению с контролем и достоверное повышение частоты встречаемости гена А*33 по сравнению с контролем. Отмечается некоторый рост А*24. У женщин достоверно повышение гена А*33 по сравнению с контролем. При анализе частоты встречаемости генов класса 1В у пар с диагнозом бесплодие на первом месте по распространенности в популяции аллель В*07 (29,23%), на втором В*35 (26,92%), на третьем В44(18,46%), на четвертом В*40 (12,31%), на пятом - В*13 (12%).было выявлено статистически значимое снижение частоты встречаемости гена В*15 по сравнению с контролем (на седьмом месте по частоте встречаемости вместо четвертого места в контроле), а также повышение частоты встречаемости гена В*35 по сравнению с контролем. Также прослеживается тенденция к снижению частоты встречаемости В*51. В результате анализа частоты встречаемости

генов в выделенных группах по сравнению с контролем достоверно повышение частоты встречаемости гена В*35 в группе 2. Достоверно снижение частоты встречаемости в группе со спонтанно наступившими беременностями генов В* 15 (против 15,46% в контроле) и генов В*49, *50,*52, при том, что эти гены встречаются в группах 1 и 2 в частоте, сопоставимой с контролем. При сравнении выделенных групп доказано, что в группе 3 (спонтанная беременность после курса ЛИТ) достоверно чаще встречается ген В* 18. Кроме того в парах, направленных на эко статистически значимо повышение встречаемости гена В*35 не только по сравнению с контролем, но и с группой 3.

Критерий относительного риска для В*35 по репродуктивной патологии составил 4,9.

При анализе частоты встречаемости генов класса 1В у мужчин из исследуемых повышена частота встречаемости гена В*35 по сравнению с контролем. При анализе частоты встречаемости генов класса 1В НЬА у женщин достоверной разницы по отношению к контролю не обнаружено

Рис. 1. Частота встречаемости аллелей НЬА 1класса в парах с бесплодием по сравнению с контролем

Рис. 2. Частота встречаемости аллелей НЬА класса в выделенных группах и контроле

При исследовании частоты встречаемости генов II класса достоверно

повышение частоты встречаемости гена НЬА 01Ш1*05 по сравнению с контрольной группой, гена НЬА БС>А1*05:01 и НЬА ВрВ 1*03:01 по сравнению с контролем. Также достоверно снижение частоты встречаемости гена НЬА ЭС^В 1*04:01 по сравнению с контролем.

При сравнении частот распространенности генов НЬА И класса в выделенных группах обнаружено повышение частоты встречаемости гена НЬА 011В1*05 в группе пациентов, направленных на эко по сравнению с группой, в которой беременность наступила спонтанно на фоне проведения ЛИТ.

Доказано резкое повышение частоты встречаемости гена НЬА □рА1 *01:03 в группе пар с отрицательным результатом (беременность после эко не наступила), а именно в 5 раз по сравнению с группой 3. При сравнении распространенности этого гена в парах с наступившей беременностью и парами, направленными на эко также получено достоверное повышение частоты гена. Обратная корреляция обнаружена для гена НЬАБС>А1*01:02 -снижение частоты встречаемости гена в группе с отрицательным результатом эко в 2 раза по сравнению с группой 3.

Критерий относительного риска 1111 для аллеля НЬА 0(^А1*01:03 с развитием репродуктивной патологии равен 10,2.

Рис. 3. Частота встречаемости аллелей НЬА II класса в парах с бесплодием по сравнению с контролем

50.00% 45.00% 40.00% 35.00% 30.00% 25.00% 20.00% 15.00% 10.00% 5.00% 0.00%

Рис. 4. Частота встречаемости аллелей НЬА II класса в выделенных группах и контроле

При тендерном анализе распространенности генов II класса, доказано: у женщин повышение частоты встречаемости генов ГЖВ1*05 и 0Г)В1 *03:01 но сравнению с контролем. У мужчин достоверных отличий частоты встречаемости генов по сравнению с популяцией не обнаружено.

При анализе частоты распространенности гаплотипов в парах с диагнозом бесплодие достоверно чаще встречается гаплотип НЬА БШШОдАШдВ! - 05/05:01/03:01.

При анализе распределений гаплотипов по группам было доказано достоверное повышение частоты встречаемости гаплотипа 05/05:01/03:01 в группе 1 (с неудачными исходами попыток ЭКО) и в группе 2 (успешные попытки ЭКО) . В группе 3 частота гаплотипа 05/05:01/03:01 приближена к контрольной. Также доказано статистически значимое повышение частоты гаплотипа 13/01:03/06:00 в группе 1 - в 2 раза по сравнению с контролем, а также снижением частоты встречаемости этого же гаплотипа в 3 раза в группе 3 (спонтанная беременность на фоне ЛИТ) по сравнению с контролем.

При анализе отличий распространенности гаплотипов между исследуемыми группами получены следующие данные: прогрессирующее снижение частоты встречаемости гаплотипа 13/01:03/06:00 от группы с неудачными попытками эко к группе со спонтанными беременностями. Также отмечена тенденция к увеличению частоты гаплотипов 02/01:02/05:024, 02/01:02/06:00 в группах с положительными исходами. Для гаплотипа 07/02:01/02:01, который в литературе ассоциируют с анэмбриониями изменения частоты в какой либо из групп при сравнении их между собой и с контролем не выявлено.

Таким образом, в паре с диагнозом «иммунологическое бесплодие» и совпадениями по генам системы НЬА прогноз благоприятный в плане спонтанной беременности на фоне лимфоцитоиммунотерапии при условии общего количества совпадений не более 4,28±1,3, совпадений по генам I класса не более 1,6 ±0,94, совпадений по генам II класса не более 3,64±1,24. При более высоком числе совпадений вероятность самостоятельного зачатия

снижается.

К генам I класса, при наличии которых в генотипе НЬА пары, прогноз благоприятный относятся: А*01, А*25, В*18, В*44, В*51. К генам, наличие которых в генотипе ПЬА может снижать вероятность наступления беременности относятся А*33 и А*03, В*13 и В*35, причем наличие В*35 в генотипе мужчины более неблагоприятно, чем в генотипе женщины. К генам, которые могут опосредовать отрицательный результат относятся А* 13, А*15 и А*39, т.к. в контрольной группе эти гены не встречаются и гены В*)5, В*49, В*51, *52, т.к. хотя частота встречаемости этих генов ниже или равна частоте встречаемости в контроле, но в группе со спонтанно наступившими беременностями эти гены не представлены.

Таким образом, к генам - «протекторам» беременности II класса относится НЬА II класса 13С)А1*01:02. Исходя из представленного анализа, можно сделать вывод, что пары, имеющие в генотипе главного комплекса гистосовместимости гаплотипы 02/01:02/05:02-4, 02/01:02/06:00,

13/01:02/06:00, 14/ 01:01/05:03, 04/03:01/03:04, 04/03:01/03:01, 08/04:01/04:02 имеют больше вероятность получить беременность.

Пары, носители гаплотипов НЬА В11В1ЯХЗА1/В(5В1 - 05/05:01/03:01, 13/01:03/06:00 имеют крайне низкие шансы на положительный исход.

В зависимости от исхода программы экстракорпорального оплодотворения все 54 пары были разделены на 2 группы - группа 1 с отрицательными результатами - 21 пара и группа 2 с положительными исходами-33 пары.

При исследовании особенностей стимуляции суперовуляции в выделенных группах сравнивались следующие параметры: среднее количество пунктированных фолликулов, достигших диаметра 18мм, среднее количество полученных ооцитов, среднее количество и долю зрелых ооцитов, среднее количество оплодотворенных яйцеклеток, среднее число полученных эмбрионов, среднее число перенесенных эмбрионов.

Среднее количество фолликулов диаметром 18мм в день введения овуляторной дозы рХГ в исследуемых группах составило: в группе 1 -10,06±0,99, в группе 2 - 16,78±2,03** (р=0,01). Среднее количество полученных ооцитов составило в группе 1 - 6,53±0,7, в группе 2 - 12,17±1,74, что достоверно выше, чем в группе 1.

Среднее количество зрелых ооцитов в группе 1 составило 5,18±0,625, в группе 2 - 10,13±1,39, что также достоверно выше, чем в группе 1. Доля зрелых ооцитов составила 79,33% в 1й группе и 83,24% во 2й группе соответственно.

Количество оплодотворенных ооцитов составило в 1й группе 4,76±0,58, во второй группе 8,39±1,17, р<0,05. Процент оплодотворяемости составил 91,89% и 82,82% в 1й и 2й группах соответственно. Среднее количество полученных эмбрионов в 1й и 2й группах составило - 4,47±0,58 и 7,87±0,73, р<0,05, соответственно. Среднее количество эмбрионов, перенесенных в полость матки женщины, составило 2,0 +/- 0,16 и 2,2+А0,13 в 1й п 2й

группах.

Таким образом, показатели фолликуло-, ово- и эмбриогенеза во второй группе достоверно превышали показатели первой группы. Доказано статистически значимое увеличение количества фолликулов, количества и качества полученных ооцитов, количества оплодотворенных яйцеклеток и эмбрионов. Беременность наступила у 57 (73,08%) исследуемых женщин. У 24 (30,77%) женщин беременность наступила спонтанно в течение 9 месяцев с момента проведения 1й лимфоцитоиммунотерапнн. 54 женщины были направлены на экстракорпоральное оплодотворение. У ЗЗх (42,31%) женщин попытка экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) закончилась наступлением беременности. Результативность ЭКО составила 61,11%. В результате клинико-статистического анализа были определены факторы, предрасполагающие к репродуктивным неудачам и неблагоприятному исходу программы ЭКО и ПЭ. С помощью дискриминантного анализа рассчитана оценка степени вклада каждого аллеля для репродукции.

Оценка степени вклада каждого фактора позволила выделить 3 важнейших параметра, имеющих наибольшее значение в прогнозировании наступления беременности'у пары с НЬА-совмсстимостыо в анамнезе

Таблица 1.

Важнейшие параметры прогноза наступления беременности.

Параметр Группа 1 N42 (отсутствие беременности) Группа 2 N114(беременность наступила) Р

Наличие в генотипе пары аллеля БОА 1*01:03 13 (30,95%) 16 (14,04%) 0,016

Наличие в генотипе пары аллеля БОА1*01:02 11 (26,19%) 48(42,11%) 0,017

Наличие беременностей в паре в анамнезе 5 (23,81%) 32 (56,14%) 0,011

Сущность способа прогнозирования наступления беременности заключается в определении прогностического индекса Р по формуле: Р= -1,237хХ1+0,975хХ2+1,461 хХЗ-0,529

Где XI - Наличие в генотипе пары аллеля DQA1*01:03 (если есть 1, если нет 0)

Х2 - Наличие в генотипе пары аллеля DQAI*01:02 (если есть 1, если нет0) ХЗ - Наличие беременностей в паре в анамнезе (если были 1, если нет 0) Const - -0,529

Данные подставляются в формулу и рассчитывается значение

прогностического индекса Р.

Если Р > 1,461, то прогноз благоприятный, вероятность, наступления беременности высокая.

Если Р <-1,237, то прогноз неблагоприятный Если Р>-1,237,но <1,461, прогноз сомнительный.

Модель прогноза, основанная на прогностическом индексе Р имеет эффективность 76,3%

Однако, данный способ прогнозирования наступления беременности не возможно применить, если в паре отсутствуют выше обозначенные критерии. Для более точного прогноза, позволяющего отнести пару к одной из трех выделенных групп - отрицательный результат попытки экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), положительный результат ЭКО, спонтанное наступление беременности мы применили мультифакторный дискриминантный анализ. Ненормированные канонические

дискриминаптные функции вычислены в центроидах 3 групп для всех имеющихся переменных. Значения ненормированных коэффициентов представлены в таблице 2.

Для каждого члена пары вычисляются две канонические дискриминантные

функции - F1 и F2. Вычисление значения функции производится по формуле:

Fl= constH- lAxkl+ 2Axkl+ lBxkl+ 2Bxkl+ lDRBlxlcl+ 2DRBlxkl+

lDQAlxkl+ 2DQAlxkl+ lDQBlxkl+2DQBlxkl+gom xkl

F2= const2+ lAxlc2+ 2Axk2+ lBxk2+ 2Bxk2+ lDRBlxk2+ 2DRBlxk2+

lDQAlxk2+ 2DQAlxk2+ lDQBlxk2+2DQBlxk2+gom xlc2

Где constl и const2 - значения константы из таблицы 2.

kl - значение ненормированного коэффициента для определенного аллеля

для функции 1 с соответствующим знаком

к2 - значение ненормированного коэффициента для определенного аллеля

для функции 2 с соответствующим знаком

1А - первый аллель класса А

2А - второй аллель класса А

1В -первый аллель класса В

2В - второй аллель класса В

1DRB1 - первый аллель класса DRB1

2DRB1 - второй аллель класса DRB1

1DQA1 - первый аллель класса DQA1

2DQA1 - первый аллель класса DQA1

1DQB1 - первый аллель класса DQB1

2DQB1 - второй аллель класса DQB1

Gom - гомозиготность по определенному классу

Полученные значения Fin F2 позволяют отнести членов пары на территориальной карте (рисунок 5) к определенной группе или высчитать средние значения F1 и F2 для пары и отнести пару к определенной группе. Модель прогноза, основанная на применении территориальной карты имеет эффективность 87%.

Таблица 2.

Ненормиро^іщьіе^оз(|)фициентьі канонической дискриминантной функции

Л» Параметр Функция № Параметр функнпя

1 2 1 2

1 IMüii 11 класе 2,346 -,563 35 B39 1,361 3,068

2 В35 ,400 4,361 36 IM» 2,079 3,388

3 DQAI*0I02 3,093 -1,892 37 ВИ 2,838 ,413

4 DQAI*t>103 1,602 -3,401 38 B44 1,109 3,656

5 go ni А -1,428 1,046 39 B48 -2,990 -1.988

6 goni 1! -.786 3,925 40 1149 ,600 3,587

7 goni (Iqa -.144 -2,221 41 B50 -1,168 2,329

8 "(Mll (lr -4,807 -,023 42 B5I 1,145 1,988

9 goni (Iqb ,960 -1,074 43 B52 -1,215 3,700

10 Л0І ,743 2,089 44 B54 5,044 ,054

г— 11 A02 ,378 2,327 45 B55 2,281 1,296

•2 A03 ,106 2,385 46 B56 3,908 3,153

13 A09 -10.653 1,991 47 B57 2,206 2,042

14 All 1,651 ,502 48 B58 -1,311 2,477

15 Л23 -2,528 1.689 49 DQAl 101 5,289 -3,232

16 Л24 .575 ,812 50 DQAl 201 2,167 -4,698

.......... 17 A25 -,192 -.455 51 DQAl 301 3,070 -,958

18 A26 1,311 1,700 52 DQAl 401 ,773 -.663

19 A29 -,584 ,948 53 1)RB1'V01 -3,945 -1,126

20 A30 1,860 1,846 54 DRB1"03 -3.029 -3,526

¡21 A31 1,824 2,494 55 DRBI*04 -5,501 1,116

т......... 122 A32 ,614 1,723 56 DRB1*07 -3,484 1,300

І23 ЛЗЗ 2,155 1,625 57 DRBI*Ü8 -5,088 ,461

124 Л68 -1,249 ,987 58 DRB1*09 -4,179 -4,692

>25 A69 ,809 3,494 59 DRB1*05 (11,12) -3,213 -,866

г......... 126 B07 ,497 2,747 60 DRB16 (13_14) -3,247 ,027

І27 B08 -,752 3.978 61 DRBI2 (I5_16) -2,976 -.907

І28 ВІЗ -.094 2,356 62 DQBI_020I 3459 -,457

і 29 B14 -,918 3,650 63 DQB1_0301 2,231 -3,359

Ьо 1315 1,113 3,984 64 DQBI_0302 1,574 -5,422

1- іЗІ BIS 2,250 2,739 65 DQB1_0303 ,265 -,118

г-— 132 1327 -,093 2,890 66 DQB1J304 1,230 -,757

B37 2,657 4,029 67 DQB1_0402 3.713 -5,058

|34 B38 -,489 . 2,329 68 DQB1JJ502 ,213 -1,160

г ■ і (Константи) -2,556 -1.749

Каноническая дискриминантная функция 1 (оси х)

-6,0 "4,0 -2,0 ,0 О 4,0 6,0

фтттттттт тфтттт тттттфттт ттттттфтттттттттфтттт тттттфтттттттттф

6, О д Ф

И У

с У

к У

Р у

и У

4,0 22 2 2 2 2 2 222

М322 2211у

к 3322 2211 у

Н 33222 2211 у

а 33322 2211 у

н 3322 2211 у

2,0т 3322 2 2 2 2211 ф

Н 33222 2211 у

а 33322 * 2211 у

я 3322 2211 У

3322 2211 У

33222 2211 У

,0 - 3 3 33322 2 2211 1 1 ф

ф 3322 2211 У

у 3322211 У

н * 331 * У

к 31 У

ц 31 У

-2,0 и 3 3 фЗІ 1 1 ф

я 31 У

31 у

31 У

31 У

31 У

-4,0 2 3 3 фЗІ 1 1 ф

31 У

31 У

31 У

31 У

31 У

-6,0 - 31 ф' фтттттттттфтттттттттфтттттттттфтттттттттфтттттттттфтттттттттф

-6,0 -4,0 -2,0 ,0 2,0 4,0 6,0 Каноническая дискриминантная функция 1 (оси х)

Символы, используемые в территориальной карте:

1 - возможно спонтанное наступление беременности

2 - возможен положительный результат ЭКО

3 - отрицательный результат ЭКО *- указывает центр группы

Рис. 5. Территориальная карта

На основе формул прогноза нами разработан алгоритм ведения пар с бесплодием аллоиммунного генеза:

1. Определить прогностический индекс Р

2. Рассчитать расположение членов пары на территориальной карте

3. В зависимости от значений показателей 1 и 2 определить прогноз для

обратившейся пары.

1. Прогноз - самостоятельное зачатие возможно.

Р > 1,461, оба члена пары по территориальной карте относятся к группе 1. Проводится лимфоцитоиммунотерапия лимфоцитами мужа и/или донора в количестве 100-150 млн. клеток по схеме 0-1-3-6 месяцев, где 0 - первая лимфоцитоиммунотерапия. В случае отсутствия беременности в течение 6 месяцев с момента начала лимфоцитоиммунотерапии пара направляется на ЭКО с использованием собственных гамет.

2. Прогноз - положительный результат процедуры экстракорпорального оплодотворения.

Р>-1,237,но <1,461, оба члена пары по территориальной карте относятся к группе 1 нлп 2, или один из членов пары по территориальной карте относится к группе 1, а второй к группе 2. Пара направляется на процедуру экстракорпорального оплодотворения с предварительным проведением лимфоцитоиммунотерапии двукратно перед назначением протокола стимуляции и на 2й-5й день в протоколе стимуляции суперовуляцин.

3. Прогноз - отрицательный результат процедуры экстракорпорального оплодотворения.

Р < -1,237, оба члена пары относятся по территориальной карте к группе 3 или один из членов пары относится по территориальной карте к группе 2, а второй к группе 3. В данном случае мы рекомендуем направлять пару на процедуру экстракорпорального оплодотворения с использованием донорских гамет. Донорство яйцеклетки или спермы зависит от того, кто из супругов находится в группе 3 на территориальной карте, либо является носителем аллелей, предрасполагающих к репродуктивным неудачам. Мы также рекомендуем направлять на процедуру экстракорпорального оплодотворения с использованием донорских гамет пару, у которой в анамнезе уже были две отрицательные попытки экстракорпорального оплодотворения с предварительной подготовкой лимфоцитоиммунотерапией. Схематически алгоритм ведения пациентов с аллоиммунным бесплодием представлен на рисунке 6.

Рис. 6. Алгоритм ведения пациентов с аллоиммуиным бесплодием

ВЫВОДЫ

1. В генотипе пар русской национальности, проживающих на Южном Урале, с аллоиммуиным фактором бесплодия достоверно чаще, чем в популяции встречаются аллели А*33, В*35, НЬА DR.fi 1*05, НЬА Б(2А1*05:01 и НЬА 0(^1*03:01 . и гаплотип 05/05:01/03:01. Достоверно реже встречаются аллели В*15 и ОЯВРО.

2. Наличие в генотипе НЬА пары аллелей А*01, А*25, В*49,В*50, В*52, БРА 1*01:02 ассоциировано с положительным результатом лечения аллоиммунного бесплодия как при естественном зачатии, так и в процедурах экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Данные аллели можно отнести к аллелям -протекторам. Аллели В*15, В*35, DRB1*05, 0(^1*01:03, гаплотипы НЬА 05/05:01/03:01 и 13/01:03/06:00 ассоциированы с репродуктивными неудачами и снижением . эффективности программы

экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и являются аллелями - маркерами репродуктивных неудач.

3. Применение лимфоцитоиммунотерапии в качестве монотерапии бесплодия эффективно у пар, в генотипе главного комплекса гнстосовместнмости которых присутствуют аллели-протекторы. Применение лимфоцитоиммунотерапии в качестве способа подготовки к программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов пар с аллоиммунным бесплодием и совпадениями по 2 и более генам в системе главного комплекса гнстосовместнмости позволяет повысить эффективность программы экстракорпорального оплодотворения.

4. Алгоритм ведения пациенток на основе прогностического индекса позволяет формировать группы риска по неблагоприятному исходу программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и производить отбор пациентов, потенциально перспективных для преодоления бесплодия методами вспомогательной репродукции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Показаниями для определения генотипа главного комплекса гнстосовместнмости в паре с бесплодием являются: диагноз «бесплодие неясного генеза», отрицательный результат процедуры экстракорпорального оплодотворения, репродуктивные потери после процедуры экстракорпорального оплодотворения при нормальном кариотипе эмбриона.

2. При наличии совпадений в системе главного комплекса гистосовместимостн, наличии в генотипе аллелей маркеров репродуктивных неудач целесообразно определять прогностический индекс и группу риска по территориальной карте.

3. Прогностический индекс и определение варианта исхода лечения бесплодия по предложенной территориальной карте в парах с совпадениями в системе главного комплекса гнстосовместнмости и бесплодием использовать для формирования группы высокого риска по неблагоприятному исходу программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и отбора пациентов, перспективных для преодоления бесплодия методами вспомогательной репродукции.

4. В случае перехода к донорским программам - донорство яйцеклеток, спермы, определять генотип главного комплекса гистосовместимостн донора.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лейхнер, Е.К. Анализ частоты встречаемости аллелей у женщин из супружеских пар с НЬА-совместимостыо/ Е.К. Лейхнер, Т.В. Узлова, О.В. Маркина //Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя».- Москва, 2011 - С. 348-349.

2. Лейхнер, Е.К. НЬА-типирование и бездетный брак / Е. К. Лейхнер, Т.В. Узлова, О.В. Маркина// Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - Москва, 2011 - С. 349-350.

3. Лейхнер, Е.К. Иммунологическое бесплодие: проблемы и возможности /Т. В. Узлова, Е. К. Лейхнер, О.В. Маркина // Вестник Южно-Уральского Государственного Университета, серия образование, здравоохранение, физическая культура. -2011 -выпуск 28, № 26 (243). - С. 100-103.

4. Лейхнер, Е.К. Особенности фенотипов НЬА у мужчин в бесплодном браке/Е.К. Лейхнер , О.В. Маркина, Т.В. Узлова // Вестник ЮжноУральского Государственного Университета, серия образование, здравоохранение, физическая культура. - 2012 - выпуск 30, №8 (267). С.-95-97.

5. Лейхнер, Е.К. Возможные причины репродуктивных неудач / Е.К. Лейхнер, О.В. Маркина, СЛ. Суздалева, Т.В. Узлова // «Известия высших учебных заведений».-2012.- №1,-С. 136-143.

6. Лейхнер, Е.К. Методическое пособие для врачей акушеров-гинекологов «Дифференцированный подход к ведению пар с аллоиммунным бесплодием»/Т.В. Узлова, Е.К. Лейхнер//Челябинск, 2012. - 17стр.

На правах рукописи

Леііхнср Елена Константиновна

ОПТИМИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ АЛЛОИММУННОГО БЕСПЛОДИЯ 14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата мсдпцннскнх наук

Челябинск - 2012

Отпечатано в центре оперативной полиграфии «Профессорский», 454080, г. Челябинск, ул. Энтузиастов, 5. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16 Подписано в печать 11.09.2012 г. Заказ № 29

Актуальность темы.

Проблема бездетного брака остается одной из актуальных в современной гинекологии не только в Российской Федерации (РФ), но и в других странах. Процент диагнозов «бесплодие», несмотря на лавинообразное накопление новых научных данных, появление новых методов лечения и развитие вспомогательных репродуктивных технологий на протяжении последних лет все так же не имеет тенденции к снижению. По данным разных регионов до 15% населения РФ сталкиваются с невозможностью иметь ребенка. Эффективность же экстракорпорального оплодотворения не превышает 30% (16,19,20,21,24,31,54,69). По данным РАРЧ (Российская Ассоциация Репродукции Человека) за 2009 год, частота наступления беременности в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в расчете на перенос эмбрионов составила 36,8%, на пункцию фолликула 34,0%. Родами (28 недель и более) завершилось 19,3% от общего количества начатых циклов. По отчету ESHRE (European Society of Human Reproduction and Embryology) за 2008 год, во Франции частота наступления беременности составила 23,5% (на пункцию), а частота родов 18,7% (на пункцию), в Германии 24.9% и 18,8% соответственно, в Великобритании 30,7% и 25.5% соответственно. Таким образом, лечение бесплодия, и в том числе поиск методов повышения эффективности процедуры ЭКО и переноса эмбрионов остается актуальнейшей проблемой.

Ряд проведенных отечественных и зарубежных исследований свидетельствует, что большинство неудач имплантации, как in vivo, так и в протоколах экстракорпорального оплодотворения обусловлено нарушением иммунологических взаимоотношений в системе бластоциста-эндометрий (14, 17,22,24,31,81,113). Одним из вариантов подобных нарушений является иммунологическое отторжение бластоцисты как аллотрансплантанта, чужеродного для матери вследствие экспрессии отцовских антигенов и нарушения процессов блокирования киллерной активности клеток эндометрия (107-109, 112,119, 157-159, 164,174). Недостаточную продукцию блокирующих факторов и повышенную агрессию NK-клеток эндометрия женщины связывают с особенностями главного комплекса тканевой совместимости (МНС) родителей. Согласно мнению ряда исследователей, при совместимости супругов более чем по трем антигенам системы человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA), без проведения терапии, риск отторжения плода составляет 100% (36-38, 44,52). Ряд исследователей также полагает, что гены, локализованные в разных хромосомных локусах, кодирующих Нй класс, влияют на разные аспекты репродукции, и что совместимость по антигенам HLA может вызвать дефекты репродуктивного процесса (1,2,7,122).

В тоже время некоторые исследователи не смогли установить прямой зависимости между совпадениями супругов по антигенам главного комплекса гистосовместимости и привычным невынашиванием (72,115,152, 163,164). Существуют пары, имеющие более Зх совпадений в комплексе HLA, и в этих парах беременности наступали спонтанно, протекали без осложнений и заканчивались рождением здоровых детей. Таким образом, вопрос о роли главного комплекса гистосовместимости в процессах сохранения беременности, необходимости включения HLA-типирования в стандарты обследования бездетных пар остается открытым.

Ряд исследователей относит к факторам, определяющим нарушения имплантации при применении вспомогательных репродуктивных технологий не только совместимость супругов более чем по 3 антигенам системы HLA, но и наличие гомозиготных генотипов у женщин и мужчин, наличие аллелей-маркеров высокого генетического груза (1,2,10,11,20,31,35,36,40,42-44,55,56). Однако до сих пор отсутствуют четкие критерии, позволяющие прогнозировать вероятность положительного исхода беременности либо ЭКО для пары с конкретными антигенами системы HLA, либо рекомендовать парам донорские программы. Возможность наличия антигенов-протекторов и антигенов, способствующих репродуктивным неудачам, как у женщин, так и у мужчин, до сих пор обсуждаются.

Даже признав роль системы НЬА в процессах продолжения рода за научный факт, мы сталкиваемся с еще одним нерешенным, и потому крайне актуальным вопросом — разработкой методов, позволяющих изменить состояние иммунной системы матери в сторону эмбриона (10,25, 31, 65, 67, 72, 165). Одним из таких методов является лимфоцитоиммунотерапия (ЛИТ). Отношение к ЛИТ также крайне неоднозначно (152,164). Кроме того, до сих пор нет ответа на вопрос — всегда ли эффективна лимфоцитоиммунотерапия или есть пары, особенности генотипа НЬА которых не предрасполагают к возможности появления потомства в этой паре.

Цель исследования повышение эффективности лечения аллоиммунного бесплодия, в том числе программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов на основе определения роли полиморфизма генов главного комплекса гистосовместимости.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов генов системы главного комплекса гистосовместимости у пациенток с бесплодием с учетом этнических особенностей.

2. Установить ключевые факторы, особенности генотипов главного комплекса гистосовместимости, влияющие на наступление спонтанной беременности в парах с бесплодием и на эффективность программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.

3. Оценить эффективность лимфоцитоиммунотерапии в лечении бесплодия в качестве монотерапии и как дополнительного метода в программах экстракорпорального оплодотворения.

4. Разработать алгоритм ведения пар с бесплодием с учетом особенностей их НЬА-генотипов в программах экстракорпорального оплодотворения с использованием собственных и донорских гамет с определением прогноза реализации репродуктивной функции.

Научная новизна.

Установлено, что в генезе репродуктивных неудач помимо совместимости супругов по более, чем Зм антигенам системы НЬА значимую роль играют: носительство определенных аллелей I и II класса в генетическом наборе женщины и\или мужчины в паре. При наличии аллеля БС)А1*01:03 НЬА II класса у обоих партнеров, вероятность наступления беременности крайне I низкая. К репродуктивным неудачам предрасполагают аллели А*33,А*03, В* 15, В*35,В*13,В*38,В*41,БКВ1*05 , 0(^1*05:01, Б(2А1*01:03, 0(^1*02:01 и ОС>В1*03:01, сочетание аллелей БС>А1*01:03 и !ОС>А1*02:01, гаплотипы 07\02:01\03:03, 07\02:01\03:01, 08\03:01\03:02 и 09\03:01\03:03.

Впервые доказана негативная роль аллеля 0<ЗА1*01:03 НЬА II класса в процессах репродукции. I

Доказана эффективность лимфоцитоиммунотерапии как монотерапии лечения аллоиммунного бесплодия в парах-носителях в генотипе НЬА таких аллелей, как А*01, А*11, А*25, В*44 - для женщин и мужчин, А*24 для женщин, А*02 для мужчин, ОЫВ1*06, ОС>А1*01:02,'ОС>А1*05:02. Дополнены критерии лимфоцитоиммунотерапии, а именно исключение мужа из числа доноров лимфоцитов и подбор доноров на основании количества генов, по которым донор может иммунизировать реципиента. 1

Подтверждена эффективность применения лимфоцитоиммунотерапии в I программах экстракорпорального оплодотворения 'в парах с бесплодием аллоиммунного генеза. I

Впервые разработаны рекомендации для перехода к донорским программам ВРТ на основании анализа генотипа НЬА пары, особенностей ответа женщины на стимуляцию суперовуляции и результатов протоколов ЭКО. I

Теоретическая и практическая значимость.

Расширены представления о роли 1 главного комплекса гистосовместимости в процессах репродукции. Определена группа пациентов повышенного риска репродуктивных неудач, у которых необходимо проведение иммуногенетического обследования. Выделена группа пациентов, у которых лимфоцитоиммунотерапия может быть единственным эффективным методом лечения бесплодия. Выделена группа пациентов с высоким риском репродуктивных неудач.

На основании результатов обследования оптимизирована тактика включения или исключения супруга из донорства лимфоцитов. При отсутствии антигенов во II классе или наличию всего 2х антигенов, по которым муж может I иммунизировать супругу, рекомендуется исключать' мужа из числа доноров лимфоцитов.

Впервые разработан алгоритм определения прогноза исхода лечения бесплодия, в том числе процедуры экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в зависимости от генотипа НЬА пары. 1

Разработан алгоритм включения пары с аллоиммунным генезом бесплодия в программы экстракорпорального оплодотворения и программы ЭКО с применением донорских гамет.

Положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Носительство аллелей I и II класса А*33,А*03, В* 15, В*35, В* 13, В*38, В*41, ВЯВ1*05 , ЭС>А1*05:01, ЭС)А1*01:03, 0(^1*02:01 и ЭС)В 1*03:01 в генотипе НЬА супругов снижает вероятность наступления беременности. |

2. Такие факторы, как: совпадение супругов по аллели ЭС>А1*01:03, сочетание аллели ОС) А 1*01:03 с гаплотипами 07\02:01 \03:03, 07\02:01\03:01, 08\03:01\03:02 и 09\03:01\03:03, гомозиготность I супругов по вышеперечисленным аллелям, наличие более одного I совпадения в I классе главного комплекса гистосовместимости по аллелям А*33,А*03, В* 15, В*35, В* 13, В*38, В*41 являются основой для формирования группы риска по отрицательным исходам в программах экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.

3. Учет особенностей генотипа НЬА пар определяет дифференцированный подход к ЛИТ в лечении бесплодия. 4. Использование алгоритма ведения пар с бесплодием с учетом особенностей их НЬА-генотипов, применение прогностического индекса, применение территориальных карт и определение прогноза повышает эффективность преодоления бесплодия.

Внедрение результатов исслеледования в практику.

Результаты исследования внедрены в практическую работу женской консультации Клиники ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России и отделения вспомогательных репродуктивных технологий ЗАО «Жемчужина», г.Челябинск.

Основные положения диссертационной работы используются в педагогическом процессе на кафедре Акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития I

России. ; I

Апробация работы. '

Основные положения работы доложены на научной конференции кафедры Акушерства и гинекологии № 1 «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской

Федерации (2010), на междисциплинарной конференции ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови» (2011 г).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, включая 34 таблицы, 18 диаграмм, 4 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 175 литературных источников, из них 69 отечественных и 106 зарубежных. 1 I

I I

I I

выводы.

1. В генотипе пар русской национальности, проживающих на Южном Урале, с аллоиммунным фактором бесплодия достоверно чаще, чем в популяции встречаются аллели А*33, В*35, НЬА ОКВ1*05, НЬА ЭОА 1*05:01 и НЬАЭС>В 1*03:01 и гаплотип 05/05:01/03:01. Достоверно реже встречаются аллели В*15иВКЫ*0.

2. Наличие в генотипе НЬА пары аллелей А*01, А*25, В*49.В*50, В*52, ЭС)А1*01:02 ассоциировано с положительным результатом лечения аллоиммунного бесплодия как при естественном зачатии, так и в процедурах экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Данные аллели можно отнести к аллелям -протекторам. Аллели В* 15, В*35, ЭЯВ1*05, ЭОА1*01:03, гаплотипы НЬА 05/05:01/03:01 и 13/01:03/06:00 ассоциированы с репродуктивными неудачами и снижением эффективности программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и являются аллелями - маркерами репродуктивных неудач.

3. Применение лимфоцитоиммунотерапии в качестве монотерапии бесплодия эффективно у пар, в генотипе главного комплекса гистосовместимости которых присутствуют ал л ел и-протекторы. Применение лимфоцитоиммунотерапии в качестве способа подготовки к программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов пар с аллоиммунным бесплодием и совпадениями по 2 и более генам в системе главного комплекса гистосовместимости позволяет повысить эффективность программы экстракорпорального оплодотворения.

4. Алгоритм ведения пациенток на основе прогностического индекса позволяет формировать группы риска по неблагоприятному исходу программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и производить отбор пациентов, потенциально перспективных для преодоления бесплодия методами вспомогательной репродукции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Показаниями для определения генотипа главного комплекса гистосовместимости в паре с бесплодием являются: диагноз «бесплодие неясного генеза», отрицательный результат процедуры экстракорпорального оплодотворения, репродуктивные потери после процедуры экстракорпорального оплодотворения при нормальном кариотипе эмбриона.

2. При наличии совпадений в системе главного комплекса гистосовместимости, наличии в генотипе аллелей маркеров репродуктивных неудач целесообразно определять прогностический индекс и группу риска по территориальной карте.

3. Прогностический индекс и определение варианта исхода лечения бесплодия по предложенной территориальной карте в парах с совпадениями в системе главного комплекса гистосовместимости и бесплодием использовать для формирования группы высокого риска по неблагоприятному исходу программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов и отбора пациентов, перспективных для преодоления бесплодия методами вспомогательной репродукции.

4. В случае перехода к донорским программам - донорство яйцеклеток, спермы, определять генотип главного комплекса гистосовместимости донора.