Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Клинико-иммунологическая эффективность способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении гнойных ран.

Халилов Максуд Абдуразакович

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

СПОСОБОВ ЛОКАЛЬНОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИЕЛОПИДА И Ш-ТЕРАПИИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ГНОЙНЫХ РАН

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

О ДЕК 2010

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Курск- 2010

004616142

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Орловский Государственный университет»

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Снимщикова Ирина Анатольевна; Затолокин Василий Данилович.

Юдина Светлана Михайловна; Земсков Андрей Михайлович; Винницкий Леонид Ильич.

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава», г. Москва.

Защита диссертации состоится «» ^2010 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д(/208.039.01. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава

Автореферат разослан «2010 г.

л

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Калуцкий П.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гнойно-воспалительные заболевания различной локализации до настоящего времени остаются одной из актуальных проблем современной медицины, что обусловлено их распространённостью, тенденцией к хроническому течению, недостаточной эффективностью традиционных методов лечения (Савельев B.C., Гостищев В.К., 2009; Puigar S., Mechra М., 2008).

В общей структуре хирургических заболеваний хирургическая инфекция наблюдается у 35-45% больных и протекает наиболее часто в виде раневой инфекции, а около 30% летальных исходов после хирургических вмешательств связано с гнойными осложнениями (Федоров В.Д., 2005; Светухин A.M., 2008; Войновский Е.А., 2009; Falanga V., 2010). Эти данные свидетельствуют об актуальности и нерешённости проблемы хирургической инфекции, приобретающей всё большую социально-экономическую значимость.

Результаты лечения гнойных заболеваний мягких тканей и раневой инфекции, несмотря на применение современных методов и достигнутые определенные успехи, не удовлетворяют полностью хирургов (Толстых П.М., 2007; Гостищев В.К., 2009; Coutts P., Sibbald R.G., 2005, 2010). Длительное лечение, значительные материальные затраты, частые осложнения, косметические изъяны - всё это требует изыскания новых путей, совершенствования уже имеющихся способов терапии данной группы больных. И если тактика хирургического лечения гнойных ран в настоящее время определена, то ряд факторов дополнительного воздействия на раневую поверхность постоянно развивается и совершенствуется.

Сложный патогенез раневого процесса обуславливает необходимость комплексного воздействия на различные его фазы (Земляной А.Б., Сажин A.B., 2009; Grundmann Н., 2006). Так как раневая инфекция является одной из основных причин неудовлетворительных исходов ведения открытых повреждений мягких тканей, актуальность оптимизации местной терапии гнойных ран не вызывает сомнений.

В последние годы все большее внимание клиницистов привлекают перспективы использования при лечении воспалительных процессов оксида азота. В эксперименте и клинике доказан ранозаживляющий эффект при обработке гнойных ран газовым потоком, содержащим оксид азота, что заложило основы нового направления в медицине - NO-терапш ран и раневой инфекции. Важным преимуществом NO-терапии, в отличие от большинства физических и медикаментозных факторов, является воздействие полифункционального NO на все фазы раневого процесса (Шехтер А.Б., 2005, 2008; Шулутко A.M., 2006). Вместе с тем недостаточно изучено влияние экзогенного оксида азота на параметры системного и локального противоинфекционного иммунитета, дисбаланс которых при раневой инфекции ограничивает возможности иммунной системы в своевременном распознавании и уничтожении микробных возбудителей, а также способствует хронизации раневого процесса.

Изучению роли нарушений иммунного ответа при гнойных ранах посвящены многочисленные исследования (Ковальчук JI.B, 2004, 2008; Винницкий Л.И., 2005, 2008; Braff М.Н., Bardan, А., 2005; Harder J., 2007, 2010).

Однако закономерности дисрегуляции компонентов врождённого иммунитета при раневой инфекции изучены недостаточно и являются дискутабель-ными, а механизмы формирования иммунодефицита при данной патологии нуждаются в уточнении. До настоящего времени не определены диагностические и прогностические иммунологические критерии неблагоприятного течения гнойных ран, нет единого мнения о значимости показателей локального иммунитета при проведении местного лечения.

Поскольку гнойно-воспалительные заболевания сопровождаются нарушением факторов иммунной защиты (Караулов A.B., Земсков A.M., 2006, 2008; М. Carretero, М. Escamez, 2007), то одним из адекватных способов комплексного лечения представляется иммунотерапия препаратами системного и топического действия. Работами ряда авторов показано, что локальная иммунокор-рекция препаратами иммунорегуляторных пептидов при гнойных заболеваниях мягких тканей и раневой инфекции, способствует снижению продолжительности лечения и частоты рецидивов (Симбирцев A.C., Варюшина Е.А., 2008; Fu-cumoto К., 2005; Jacobsen F., 2007). В литературе встречаются единичные данные о совместном локальном использовании иммуномодуляторов и NO-терапии (Луцевич О.Э., Шехтер А.Б., 2008), однако недостаточно сведений о патогенетическом обосновании их дифференцированного назначения в конкретной клинической ситуации, не изучены эффекты их взаимного влияния при сочетанном применении.

В связи с этим приобретает актуальность оптимизация лечения гнойных ран с включением в программы комплексного ведения больных способов локальной иммунокоррекции с использованием препаратов иммунорегуляторных пептидов и NO-терапии, а также необходимость дальнейшего изучения механизмов их противовоспалительной активности, расширения показаний к назначению и разработки оптимальных схем лечения.

Цель работы. Повышение эффективности лечения больных с гнойными ранами путём разработки и применения способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии.

Задачи исследования.

1. Провести комплексное клинико-иммунологическое обследование больных с гнойными ранами различной этиологии и локализации для выявления маркёров высокого риска реализации затяжного и хронического течения раневой инфекции.

2. Изучить in vitro антимикробную активность препарата миелопид и его влияние на продукцию противомикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), воспалительных и противовоспалительных цитокинов, оксида азота и метаболитов кислорода, экспрессию TOLL2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных с гнойными ранами.

3. Сравнить динамику и особенности заживления экспериментальной гнойной раны при различных вариантах использования NO-терапии и миелопида.

4. Разработать способы локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении больных с гнойными ранами и оценить их клиническую эффективность в сравнении с традиционным лечением.

5. Исследовать влияние вариантов местного применения препарата миелопид, NO-терапии и их комбинации на динамику показателей локального и системного иммунного статуса больных с гнойными ранами.

Научная новизна. Получены данные об изменении при гнойных ранах продукции антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, а-дефенсина, лак-тоферрина, миелопероксидазы, гепсидина), экспрессии ТОЬЬ2-рецепторов фагоцитарными клетками, которые расширяют представления о роли дисфункции компонентов врождённого иммунитета в патогенезе раневого процесса.

Впервые показана диагностическая и прогностическая значимость комплексной оценки в раневой жидкости при гнойных ранах уровней кателицидина LL-37, а-дефенсина, метаболитов NO, матрикс металлопротеиназы - 3 и числа TOLL2+ клеток.

Впервые выявлена прямая антимикробная активность препарата миелопид в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans (Патент № 2333765).

Установлено in vitro иммуномодулирующее влияние препарата миелопид на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактофер-рина, миелопероксидазы), воспалительных и противовоспалительных цитоки-нов, метаболитов кислорода и оксида азота, экспрессию Т01Х2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных гнойными ранами.

Впервые проведена сравнительная оценка изменений патоморфологиче-ских показателей и раневой микрофлоры при заживлении экспериментальной гнойной раны в условиях местного использования вариантов NO-терапии и препарата миелопид.

Впервые разработаны и внедрены в клиническую практику способы локальной иммунокоррекции при гнойных ранах с использованием препарата миелопид и NO-терапии в сочетании с миелопидом (Патент № 2326678), проведена оценка их эффективности в сравнении с традиционным лечением и местным применением NO-содержащего газового потока.

Выявлено положительное влияние способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии на динамику показателей системного и локального иммунитета больных с гнойными ранами.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований экспериментально обосновано локальное применение препарата миелопид и NO-терапии в сочетании с миелопидом в комплексном лечении гнойных ран.

Полученные данные об антимикробной активности препарата миелопид обосновывают возможность его местного использования при гнойных ранах и раневой инфекции, вызванных S. aureus, S. pyogenes, Е. coli, P. vulgaris, К. pneumoniae, С. albicans.

Разработаны критерии балльной оценки тяжести течения гнойных ран с учётом клинико-иммунологических показателей и определены маркёры высокого риска реализации затяжного и хронического течения раневой инфекции.

По результатам сравнительной оценки клинической эффективности местного лечения больных с гнойными ранами показано, что сочетанное применение локальной иммунокоррекции с использованием препарата миелопид и NO-терапии позволяет более быстро купировать воспалительный процесс в тканях раны, ускорить заживление и деконтаминацию, сократить время подготовки ран к хирургическому закрытию, сроки и стоимость лечения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Одним из факторов развития иммунной дисфункции у больных с гнойными ранами является дисбаланс компонентов антиинфекционного иммунитета: продукции антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, дефен-сина а 1-3, лактоферрина, миелопероксидазы, гепсидина) и экспрессии ТОЬЬ2-рецепторов фагоцитарными клетками. Маркёрами неблагоприятного течения гнойных ран являются значительное повышение или снижение в раневой жидкости уровня кателицидина LL-37, повышение концентрации де-фенсина а, матрикс металлопротеиназы-3, снижение числа TOLL2+ клеток и уровня метаболитов оксида азота.

2. Препарат миелопид обладает противомикробной активностью и оказывает иммуномодулирующее влияние на продукцию антимикробных пептидов, цитокинов, метаболитов кислорода и оксида азота, экспрессию TOLL2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных с гнойными ранами.

3. Комбинированное использование при экспериментальных гнойных ранах миелопида и NO-терапии сопровождается более быстрой санацией патологического очага и укорочением сроков заживления, по сравнению с изолированным применением миелопида, антисептика гипохлорита натрия и его сочетания с NO-содержащим газовым потоком.

4. Использование в комплексном лечении гнойных ран локальной иммунокоррекции препаратом миелопид и, особенно, NO-терапии в сочетании с миелопидом, ускоряет купирование воспалительного процесса, сроки заживления и деконтаминации, сокращает продолжительность стационарного лечения.

5. Локальное применение препарата миелопид, NO-терапии, а также их сочетания у больных гнойными ранами приводит к восстановлению исходно нарушенных показателей иммунного статуса.

Внедрения в практику. Способы локальной иммунокоррекции препаратом миелопид, NO-терапии в сочетании с миелопидом; способ определения динамики поверхностных раневых процессов внедрены в практику работы ОГУЗ «Орловская областная клиническая больница», МЛПУЗ «Больница ско-

рой медицинской помощи им. Н.А. Семашко» г. Орла, МЛПУЗ «Больница им. С.П. Боткина» г. Орла, ОГУЗ «Белгородская областная клиническая больница», ГУП НИИ Новых медицинских технологий Тульской области, Тульского отделения академии медико-технических наук РФ. Полученные результаты используются в учебном процессе кафедр иммунологии и специализированных клинических дисциплин; общей хирургии и анестезиологии; анатомии человека, оперативной хирургии с курсом факультетской хирургии медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Связь с планом НИР.

Работа проведена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» (номер госрегистрации комплексной темы 14.00.03).

Апробация работы. Основные положения работы представлены, доложены и обсуждены на II Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орёл, 2001), Межрегиональной конференции и организационном съезде хирургов «Лечение ран и раневой инфекции» (Ярославль, 2003), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы педиатрии и иммунологии» (Санкт-Петербург, 2005), VI Всероссийском научном форуме «Хирургия-2005» (Москва, 2005), Всероссийской конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), VIII и IX Всероссийских научных Форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006, 2007), VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2007), IV Всероссийской конференции общих хирургов с международным участием и Пленуме проблемной комиссии «Инфекция в хирургии» (Ярославль, 2007), I Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орёл, 2008), научно-практической конференции хирургов ЦФО РФ (Орёл, 2009, Белгород, 2010), Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология -практическому здравоохранению» (Москва, 2010), совместном заседании кафедр иммунологии и специализированных клинических дисциплин, анатомии человека, оперативной хирургии с курсом факультетской хирургии, внутренних болезней, общей хирургии и анестезиологии, микробиологии и инфекционных болезней ОГУ (Орёл, 2010).

Работа выполнялась при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» по заявке № 551П/41 «Иммунологический мониторинг адаптации человека и его жизнеобеспечения в условиях действия неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов» (2009-2013 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликована 51 научная работа, в том числе 17 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 монография, 3 пособия для врачей. Получено 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 рисунками, 30 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, за-

ключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 493 источника, в том числе 277 отечественных и 216 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование экспериментальных гнойных ран проводилось на 140 крысах «Вистар» обоего пола в равных количествах весом 170 ± ЗОг по S. Eleck, К. Sommenn (Даценко Б.М., 1995). Все животные до начала эксперимента прошли карантинный режим вивария, содержались в одинаковых условиях в индивидуальных клетках на типовом пищевом рационе. При проведении экспериментальных работ соблюдены принципы Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (2000), требования приказа №267 МЗ РФ от 19.06.2003 «Правила по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных».

Животные в зависимости от серии исследований и применяемого метода лечения были распределены на 5 групп: животные, не получавшие лечения (1 -контрольная группа); животные 2 группы - сравнения (с применением раствора натрия гипохлорита 600 мг/л) и основные группы животных, получавшие оптимизированное лечение с использованием раствора миелопида (3000 мкг/мл) -3 группа, комплекса NO-терапии и раствора натрия гипохлорита (600 мг/л) - 4 группа, а также сочетания NO-терапии и миелопида (3000 мкг/мл) - 5 группа. При моделировании гнойной раны, после предварительной обработки кожи, в асептических условиях, под эфирным масочным наркозом, на выбритом от шерсти участке спины в межлопаточной области у животных иссекалась кожа с подкожной клетчаткой в виде квадрата 2x2 см (400 мм2) по контуру, предварительно нанесенным трафаретом. Края и дно раны раздавливали зажимом Кохе-ра. В рану вносили марлевый тампон весом 0,5 грамм с взвесью суточной культуры золотистого стафилококка (фаготип ЗА/ЗС/55/71) в дозе 1 млрд. микробных тел в 1 мл физиологического раствора. Рану ушивали наглухо. На 5-е сутки на спине в межлопаточной области у животных формировался абсцесс со всеми характерными признаками гнойного воспаления. Отмечался отёк и гиперемия кожи в области нанесения раны, припухлость, у некоторых животных между швами выделялся гной. При пальпации определялась местная гипертермия и флюктуация. После снятия швов и разведения краев раны удалялся марлевый тампон, выделялось большое количество гноя, а сформированная у животных рана имела все основные черты гнойного воспаления, позволяющие считать ее адекватной моделью гнойной раны у человека. Для предупреждения контракции раны за счет эластичности, а также для стандартности условий лечения, к краям раны подшивалась металлическая рамка, соответствующая размерам раны, с «крышкой» для удержания перевязочного материала в ране и предупреждения высыхания раневой поверхности. Лечение начинали с хирургической обработки гнойной раны, включающей эвакуацию гноя, удаление некротической ткани и промыванием ее антисептиком. На раневую поверхность ежедневно во время перевязок при смене марлевых салфеток проводили сеансы NO-терапии,

наносили лекарственные средства согласно делению животных на группы до заживления раны.

Для оценки влияния исследуемых факторов на заживление ран проводились клинические, планиметрические, микробиологические, цитологические и гистологические методы исследований на 1, 3, 5, 7, 10 и 14 сутки от начала лечения. Скорость уменьшения раневой поверхности определяли по методу JI.H. Поповой, для оптимизации которого была использована программа анализа динамики ран (Мошкин A.C., 2008).

В клинической части работы была оценена эффективность лечения 198 больных с гнойными ранами. Все больные по способу лечения были разделены на 4 группы: I - контрольную группу составили 60 пациентов, получавших традиционное лечение; во II группу вошли 39 больных, которым на фоне традиционного лечения проводилась локальная иммунокоррекция препаратом миело-пид; в третью группу были включены 39 пациентов, получавших местную NO-терапию; IV группу составили 60 больных, которые получали локальную им-мунокоррекцию препаратом миелопид в сочетании с NO-терапией. Больные всех групп были сопоставимы по возрасту, полу и характеру патологического процесса в мягких тканях, распределение в них было случайным.

Программа диссертационного исследования утверждена на заседании Этического комитета медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет (протокол № 2 от 16. 03.2005г.) в соответствии с требованиями Основ законодательства РФ «Об охране здоровья граждан». Отчет по проделанной работе заслушан на заседании Этического комитета (протокол № 4 от 21 мая 2009 года).

Местное лечение во всех наблюдаемых группах начинали с проведения хирургической обработки гнойного очага с соблюдением общепринятых принципов: рассечение повреждённых тканей с иссечением девитализированных структур, полная ликвидация гнойных затёков, проведение тщательной ревизии и адекватного дренирования гнойного очага, санация его растворами антисептиков. В группе больных, где применялось традиционное лечение, для закрытия раневой поверхности примененялась многокомпонентная мазь на полиэти-ленгликолевой основе (левомеколь) в первой фазе и метилурациловая мазь во второй фазе раневого процесса.

Алгоритм лечения больных четвёртой группы (патент на изобретение №2326678 от 20.06.2008г.) включал хирургическую обработку раны и санацию её растворами антисептиков; воздействие на раневую поверхность воздушно-плазменным потоком, содержащим оксид азота, генерируемым с помощью аппарата «Плазон» (длительность воздействия на одну зону размером 1x1см составляла 8-9 секунд с расстояния 20-25 см от выхода плазмотрона, общее время соответствовало площади раны); локальное применение раствора миелопида (3000 мкг/мл), которым обрабатывали раневую поверхность 1 раз в сутки как в первой, так и во второй фазах раневого процесса. Соответственно, местное лечение пациентов второй и третьей групп включало использование раствора миелопида или оксида азота по выше приведённой схеме.

Критериями исключения пациентов из проводимого исследования служили: возраст пациентов меньше 18 и старше 65 лет, сопутствующие соматические заболевания в стадии обострения или декомпенсации, беременность, тяжёлый сепсис, иммуносупрессия вследствие новообразований или ВИЧ-инфекции, активный вирусный гепатит, индивидуальная непереносимость или аллергическая реакция больного на препараты, используемые для терапии, отказ больного от проводимого исследования.

Эффективность лечения оценивали в баллах по разработанным нами критериям. При этом учитывали: характер и количество раневого отделяемого, наличие инфильтрации и отёка в области гнойного очага, нарушение функции поражённой анатомической зоны, сроки появления грануляций и выполнения ими раны, время начала краевой эпителизации, степень перифокальной гиперемии, клеточный состав мазков-отпечатков с поверхности раны, степень микробной обсеменённости, скорость сокращения площади раны (мм2 в сутки), показатели локального иммунного статуса (табл. 1), которые оценивали на 1, 3, 6, 9 сутки и при выписке больного.

Таблица 1.

Лабораторные показатели оценки выраженности локального воспалительного про-

цесса при раневой иж зскции.

Показатель 0 баллов I балл 2 балла 3 балла

ИЛ-lß 50-100 пг/мл 101-150 пг/мл 151-250 пг/мл >250 пг/мл < 30 пг/мл

ФНО-а 30-50 пг/мл 51-100 пг/мл 101-150 пг/мл >150 пг/мл < 15 пг/мл

ТФР-Р 2000-2500 пг/мл 2501-3000 пг/мл 3001-4000 пг'мл >4000 пг/мл <1000 пг/мл

ИЛ-10 5-10 пг/мл 11-15 пг/мл 16-20 пг/мл >20 пг/мл

а-дефеисин 0,5-0,75 мкг/мл 0,76-1,0 мкг/мл 1,1-1,5 мкг/мл >1,5 мкг/мл

LL-37 1,5-3,0 мкг/мл 3,1-6,0 мкг/мл 6,1-10,0 мкг/мл >10,0 мкг/мл < 0,5 мкг/мл

ММР-3 1,0-5,0 нг/мл 5,1-10,0 нг/мл 10,1-15,0 иг/мл >15 нг/мл

Оксид азота 2,5-3,0 мкмоль/л 3,1-5,0 мкмоль/л 5,1-6,5 мкмоль/л >6,5 мкмоль/л <1,0 мкмоль/л

Для определения исходного состояния иммунного статуса, сравнительной динамики течения раневого процесса у больных с различными причинами возникновения гнойных ран и для выявления маркёров высокого риска реализации затяжного и хронического течения раневой инфекции были дополнительно обследованы 145 больных (средний возраст 42,7±3,5 лет), получавших традиционное лечение: 65 - с ранами после вскрытия абсцессов и флегмон мягких тканей; 20 - с послеоперационными ранами, 30 - с посттравматическими ранами; 30 - с флегмонозно-некротической формой рожи.

Мононуклеары периферической крови (МНК) здоровых лиц и больных с раневой инфекцией выделяли с использованием метода дифференциального центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Фримель Г., 1980). Разделение суммарной фракции мононуклеаров на моноциты и лимфоциты осуществляли посредством избирательной адгезии моноцитов к пластику (Тотолян A.A., 2000).

С целью определения способности клеток к продукции антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), цитокинов, метаболитов оксида азота или кислорода взвесь мононуклеарных фагоцитов (МНФ) в концентрации 2 млн./мл инкубировали в течение 1,5 часов в сывороточной среде RPMI-1640 при 37°С с препаратом миелопид (композит свиных миелопептидов; НПЦ Медицинская иммунология, Россия) в атмосфере 5% С02. В качестве индуктора синтеза цитокинов использовали ФГА (фитогемагг-лютинин, «Difco», США) в концентрации 10 мкг/мл. По окончании инкубации клетки в планшетах трижды отмыв&чи средой 199, ресуспендировали в полной среде RPMI-1640 в объеме 100 мкл и культивировали в стандартных условиях в течение 18 часов (22 часа при определения N0). Для исследования брали су-пернатанты клеток, полученные путем 10-минутного центрифугирования культуральной смеси при 1500 об./мин, которые переносили в лунки 96-луночного планшета.

Интенсивность кислородного метаболизма МНФ крови определяли по восстановлению нитросинего тетразолия в формазан. При оценке индуцированного НСТ-теста в лунки вносили зимозан в концентрации 0,2 мг/мл и инкубировали при 37"С в течение 1 часа. Реакцию учитывали на планшетном фотометре для ИФА при длине волны 540 нм (Тотолян A.A., 2000).

Продукцию миелопероксидазы оценивали по методике Азнабаевой Л.Ф. с соавт. (2002 г.) с расчетом показателя пероксидазной активности исследуемой биологической жидкости (ПОА).

Определение концентрации кателицидина LL-37 и лактоферрина в супер-натантах клеток, сыворотке крови и раневом экссудате проводилось методом твердофазного ИФА с помощью набора реагентов Hbt (Нидерланды), ЗАО "Вектор-Бест" (Россия).

Содержание NO в пробах оценивали спектрофотометрически при длине волны 540 нм с помощью реактива Грисса. Результат рассчитывали по кривой с использованием стандартных растворов нитрита натрия (Голиков П.П., 2004). Уровень цитокинов определяли методом ИФА с помощью набора реагентов ООО "Протеиновый Контур", ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) и DRG (Germany).

Для определения влияния препарата миелопид на экспрессию TOLL-2 рецепторов мононуклеарными фагоцитами крови, МНФ в концентрации 2 млн./мл инкубировали 90 минут в сывороточной среде RPMI-1640 с миелопи-дом (600, 750, 1500, 3000 мкг/мл) в лунках 96-луночных планшетов при 37°С в атмосфере 5% COi. По окончании инкубации клетки в планшетах трижды отмывали от препарата средой 199, ресуспендировали в полной среде RPMI-1640 в объеме 100 мкл и культивировали в стандартных условиях в течение 22 часов, после чего планшет центрифугировали при 2000 об./мин. 3 минуты, удаляли супернатанты и трижды отмывали клетки средой 199. Оценка экспрессии TOLL-2 рецепторов производилась путем подсчёта CD282+ клеток с помощью моноклональных антител Hbt (Нидерланды) непрямым иммунопероксидазным методом.

Оценку уровня дефенсина а и гепсидина в сыворотке крови и раневом экссудате (РЭ) проводили методом ИФА с использованием тест-систем Hbt (Нидерланды) и IBL (Германия).

Для получения РЭ использовали стерильные марлевые тампоны, которые помещали в рану с экспозицией на 20-30 секунд. После аппликации пропитанный тампон вносили в пробирку с 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида на 30 минут с последующим его удалением после центрифугирования в течение 5 минут при 1500 об./мин.

С целью оценки показателей системного иммунитета больных осуществлялся забор периферической крови до лечения, в процессе и после лечения, при этом изучали уровень иммуноглобулинов A, M, G, антимикробных пептидов и цитокинов ИЛ-ip, ИЛ-lRa, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-а, ТФР-р, в сыворотке крови, функциональную активность МНФ.

Фенотип клеток определяли непрямым иммунопероксидазным методом с использованием моноклональных антител (ТОО «Сорбент», г. Москва; Hbt, Нидерланды), согласно прилагаемым инструкциям и рекомендациям. Концентрацию иммуноглобулинов оценивали методом радиальной иммунодиффузии с помощью стандартных планшетов «Реафарм» (Москва). Фагоцитарную активность МНФ определяли с помощью реагентов фирмы «ДиаэМ» (г. Москва).

Для определения иммунологических показателей, принимаемых за физиологическую норму, были обследованы 20 здоровых лиц (средний возраст 45,1±0,5 лет) для выявления у них фоновых показателей иммунного статуса и их сравнения с данными иммунограмм у больных с раневой инфекцией.

Антибактериальное действие миелопида определяли методом диффузии в агар по степени задержки роста микроорганизмов в зоне нанесения препарата. В качестве тест-культур были использованы штаммы микроорганизмов из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также клинические изоляты бактерий (Е. coli, P. vulgaris, К. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus, S. pyogenes, С. albicans).

Иммунологические исследования выполнялись на кафедре иммунологии и специализированных клинических дисциплин медицинского института ОГУ. Бактериологические исследования выполнены на кафедре микробиологии и инфекционных болезней медицинского института ОГУ, в бактериологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Орловской области» и МЛПУЗ «Городская больница им. С.П. Боткина» г. Орла в соответствии с методическими рекомендациями МЗ СССР (1985 г.).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программного комплекса Microsoft Excel ХР на компьютере «Pentium IV». Исследование корреляционной взаимосвязи между показателями выполнялись по Пирсону.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты экспериментальных исследований.

По современным представлениям одним из ключевых звеньев патогенеза гнойных ран является развитие иммунной дисфункции, что приводит к нарушению нормального заживления тканей на одной и более стадиях развития

раневого процесса и замедляет репарацию (Долгушин И.И., 2009; Galkowska, Н., 2005; Steinstraesser L., 2008). Вместе с тем, исследования механизмов формирования иммунной недостаточности у больных гнойными ранами достаточно фрагментарны и посвящены преимущественно изучению состояния Т, В- звеньев иммунитета и фагоцитарной системы (Смирнов B.C., 2004; Сарвин А.Г., 2005; Варганов М.В., 2006). При этом закономерности дисрегуляции системных и локальных компонентов противоинфекционного иммунитета у больных гнойными ранами являются дискутабельными и нуждаются в уточнении для разработки адекватных способов местной иммунокоррекции.

В настоящее время особый интерес вызывает возможность применения для лечения ран препаратов иммунорегуляторных пептидов (цитокинов, факторов роста и др.), которые благодаря широкому спектру биологической активности регулируют все этапы воспалительного процесса (Симбирцев A.C., Ковальчук JI.B., 2008; Юдина С.М., Снимщикова И.А., 2010; Heilborn J. D., 2005; Jacobsen F., 2007). Однако одной из основных проблем, связанных с патогенетическим обоснованием локального применения иммунорегуляторных пептидов, является необходимость изучения их плейотропного действия на различные клетки-мишени и те факторы, которые определяют развитие иммунной дисфункции при гнойных ранах и раневой инфекции.

Учитывая вышеизложенное, представляло интерес изучить у больных с гнойными ранами особенности факторов, обеспечивающих противомикробную защиту при остром, затяжном и хроническом течении раневого процесса и возможности регуляции их продукции препаратом миелопид. Для решения задач исследования нами были обследованы 145 пациентов с гнойными ранами различной этиологии и локализации. При этом на системном и локальном уровне проводилась оценка продукции антимикробных пептидов и белков (АМП), активных метаболитов кислорода и азота, цитокинового статуса, экспрессии TLR2 - рецепторов фагоцитами.

Как известно, особое место среди продуктов активированных фагоцитов занимают АМП, являющиеся, с одной стороны, естественными эндогенными антибиотиками, а с другой - сигнальными молекулами, вовлечёнными в процессы активации клеток иммунной системы и репарации тканей. В настоящее время охарактеризованы сотни эндогенных АМП различных групп, одни из которых имеют большую молекулярную массу и представлены литическими ферментами, белками, содержащими сайты против специфических макромолекул и др., большинство других - являются катионными, гранулы-ассоциированными полипептидами (Кокряков В.Н., 2006; Ковальчук Л.В., 2007; Bowdish DJ., 2005; Braff М.Н., 2004-2006; Hancock R.E., 2006-2008; Harder J., 2007-2010). Предположив, что нарушение синтеза АМП может быть одной из причин иммунной дисфункции при гнойных ранах, были изучены особенности их системной и локальной продукции, а также возможности её регуляции in vitro препаратом имунорегуляторных пептидов миелопид.

На сегодняшний день белок LL37 (hCAPJ8) является единственным идентифицированным человеческим кателицидином, проявляющим иммунорегуля-торное действие и антимикробную активность против грам-отрицательных и

грам-положительных бактерий, а также грибов и вирусов (Ковальчук Л.В., 2007; Barlow P. G., 2006; Zanetti М., 2007; Steinstraesser L., 2008). Как показали результаты исследований, в острую стадию раневого процесса было выявлено повышение содержания LL37 в РЖ (рис.1), по сравнению со стандартными значениями для биологических жидкостей, с пиком продукции на 5-6 сутки, что, по-видимому, имеет срочный компенсаторный характер. Позитивная динамика течения локального патологического процесса сопровождалась последующим снижением уровня LL37 (hCAP18) в раневой жидкости до 1,2-2,5 мкг/мл к 11-14 суткам лечения. Данная иммунологическая картина имела место преимущественно у пациентов с раневыми процессами после вскрытия абсцессов и флегмон мягких тканей (52 пациента - 35,9% из общего числа обследованных больных и 80% из данной категории пациентов). У больных с посттравматическими и послеоперационными ранами аналогичные показатели регистрировались в 4,1% (у 6 больных из 30) и в 7,6% (у 11 пациентов из 20) случаев из общего числа пациентов, соответственно.

2500

/i"

1 сутки 3 сутки 5 сутки 7 сутки

а I D II

Рис. I. Концентрация 1X37 в раневой жидко- Рис. 2. Концентрация дефенсина а (НЫР 1-сти больных с типичным (I) и затяжным (II) 3) в раневой жидкости больных с типичньш течением гнойных ран. (I) и затяжным (II) течением гнойных ран.

Примечание: на рис. 1 и рис. 2, 3, 8 - р<0,05 между показателями в группах на 1, 5; 1 и 7 сутки.

Иная динамика местной продукции 1X37 была характерна для пациентов с неблагоприятным течением и исходом раневой инфекции. Так, затяжной раневой процесс протекал на фоне стабильно высоких концентраций катели-цидина. Начиная с первых дней лечения, в гнойной ране таких больных наблюдалось повышение уровня 1X37 более 10 мкг/мл. Данная динамика выявлялась преимущественно у пациентов с послеоперационными и посттравматическими ранами - 6,2% (у 9 больных из 20) и 4,8% (у 7 больных из 30), соответственно. Кроме того, установлено, что резкое кратковременное повышение исследуемого показателя, как правило, на 7-8 сутки на фоне благоприятного течения раневого процесса сочеталось с развитием инфекционных осложнений и регистрировалось в 7,6% случаев у пациентов с гнойными ранами после вскрытия абсцессов и флегмон мягких тканей. При этом пик содержания 1X37 в РЖ опережал лихорадочную реакцию на 1-2 дня.

Следует отметить, что в раневом экссудате при хронических ранах выявлялось значительное снижение концентрации LL37, который у большинства пациентов определялся в минимальных и «следовых» количествах. Показано, что снижение кателицидина ниже 1,1 - 0,5 мкг/мл в раневой жидкости регистрировалось на всех стадиях раневого процесса у всех больных с флегмонозно-некротической формой рожи и у 17 из 30 пациентов (56,7%) с посттравматическими ранами.

При изучении содержания hCAP18 в сыворотке крови больных была установлена широкая вариабельность значений LL37: от «нулевых» до 5-10 кратного повышения (1,3±0,2 мкг/мл у здоровых лиц). Как правило, динамика этих изменений была аналогична тем, что выявлялись у больных с различным течением гнойной раны в раневой жидкости. Однако пиков продукции исследуемого АМП в течение гнойной раны выявлено не было. Средние концентрации LL37 в сыворотке крови у больных с типичным течением раневого процесса до лечения колебались от 1,7 до 4,7 мкг/мл, составив в среднем 4,1±0,8 мкг/мл. К 11-12 суткам регистрировалось снижение показателя до 3,1 ±0,7 мкг/мл. Как правило, обширные и хронические раны протекали на фоне более низких концентраций LL37 (в среднем 1,1 ±0,4 мкг/мл), которые при этом практически не отличались от показателей здоровых лиц, что может свидетельствовать об угнетении эндогенной продукции АМП и снижении резервных возможностей клеток-продуцентов в ответ на бактериальную стимуляцию.

Как известно, наряду с кателицидином LL37 к катионным АМП относятся дефенсины а и ß (Ковальчук Л.В., 2007; Будихина A.C., Пинегин Б.В., 2008; Bowdish D.J., 2006; Wang G., 2008). В этой связи заслуживают внимания данные об изменении продукции дефенсина a (HNP 1-3) (рис. 2), который являясь уникальным маркёром нейтрофилов (в меньшей концентрации обнаруживаются в Т-, B-лимфоцитах, моноцитах/макрофагах), проявляет микроби-цидное, хемотаксическое действие, а также иммуномодулирующую и цито-токсическую активность (Braff М.Н., 2007; Buck C.B., 2007; Steinstraesser L., 2008). Установлено, что в острую фазу раневого процесса у всех больных гнойными ранами повышено количество HNP 1-3 в раневой жидкости (до 1,8±0,1 мкг/мл) и плазме крови (до 0,95±0,1 мкг/мл). В плазме крови здоровых лиц уровень HNP 1-3 варьировал от 48 до 105 нг/мл. Снижение числа раневых нейтрофилов в РЖ коррелировало с уменьшением уровня дефенсина а (г=0,95; р>95%). Так, при благоприятном течении раневого процесса снижение HNP 1-3 в раневой жидкости отмечалось, как правило, с 5 дня и достигало в среднем уровня 0,625±0,125 мкг/мл к 9-10 суткам. На фоне затяжного, хронического течения раневого процесса и дефицита эпителизации отмечалось сохранение повышенного уровня HNP 1-3 в раневом очаге (более 1,5±0,25 мкг/мл).

В последние годы в патогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний различной локализации активно обсуждается роль гепсидина, который выполняя роль АМП, подобно белкам острой фазы, синтезируется в печени, а также участвует в регуляции транспорта железа в различных компартментах организма, включая клетки эпителия, макрофаги и др. (Nemeth Е., 2003; Dallalio

б., 2003; МеИгиш О.Я., 2007). Установлено, что в РЖ гепсндин определялся лишь в 6,2% случаев и только у больных с обширными (более 100 см2) гнойными ранами. Повышение концентрации гепсидина в сыворотке крови (до 215,3±38,2 нг/мл, по сравнению с показателями здоровых лиц - 87,4±16,8 нг/мл) регистрировалось у 18%, преимущественно у больных с осложнённым течением заболевания на фоне сопутствующей патологии (сахарный диабет, патология желудочно-кишечного тракта).

160 140 120 100 80 60 40 20

1 сутки

3 сутки

5 сутки

7 сутки

-I •

-II

Рис. 3. Концентрация лактоферрина в раневой жидкости больных с типичным (I) и затяжным (II) течением гнойных ран.

Исследование в раневом экссудате уровня железосвязывающего катион-ного пептида - лактоферрина, обладающего антибактериальной, противовирусной и антиоксидантной активностью, а также участвующего в регуляции роста и дифференцировки клеток фагоцитарного ряда (Тотолян A.A., 2003; Orsi N., 2005; Baker Н.М., 2006), выявило повышение его содержания (до 148±12 нг/мл) в РЖ у большинства больных (55,9%) в острую фазу раневого процесса (рис. 3). Последующая динамика лактоферрина зависела как от обширности поражения, так и сопутствующей патологии больных. Так, благоприятное, т.е. типичное течение гнойной раны, протекало на фоне постепенного снижения концентрации лактоферрина (с формированием практически полного «плато» на 3-5 сутки) до уровня 100-110 нг/мл к 7 дню. Затяжное и хроническое течение раневой инфекции сопровождалось более низкой концентрацией лактоферрина (рис. 3). Определение содержания лактоферрина в раневом экссудате больных хроническими ранами выявило максимальное его снижение (до 4,5±1,2 нг/мл) на 18 день лечения. Уровень лактоферрина в сыворотке крови здоровых лиц и больных составил 448±51,4 нг/мл и 936±62,2 нг/мл, соответственно.

Учитывая возможный синергический эффект действия лактоферрина и миелопероксидазы в фагосомной вакуоли в процессе фагоцитоза, а также вне-клеточно в очаге воспаления (Кокряков В.Н., 2008; Klebanoff S.J., 2005; Soehnlein О. А., 2008), представляло интерес оценить продукцию миелопероксидазы на местном и системном уровне.

Анализ результатов показал, что у пациентов в острую фазу заболевания, как при типичном течении раневого процесса, так и при хронической ра-

невой инфекции, уровень миелопероксидазы в раневом экссудате и в сыворотке крови (680±115 у.ед. и 1550±195 у.ед., соответственно) был значительно выше, чем у здоровых лиц (665±105 у.ед. в сыворотке крови), что свидетельствует о компенсаторном характере повышения данного гликопротеина и согласуется с данными литературы (Ashcroft G.S., 2005; Baker Е.А., 2006).

На наш взгляд, заслуживают внимания данные о прогрессивном снижении концентрации миелопероксидазы (до 115±25 у.ед.) в РЖ больных с обширными и хроническими гнойными ранами, которое регистрировалось в период с 5 по 15-е сутки. При этом темп снижения уровня миелопероксидазы в раневом экссудате при благоприятном течении раневого процесса был значительно ниже (максимальное снижение до 378±105 у.ед.), что можно трактовать как реакцию адаптации, направленную на оптимизацию репаративных процессов в зоне повреждения.

Исследование концентраций изучаемых антимикробных пептидов в су-пернатантах МНФ больных, по сравнению со здоровыми лицами, выявило снижение продукции кателицидина LL37, лактоферрина и миелопероксидазы у 51,7%, 47% и 35% пациентов, соответственно. При этом «нулевые» значения уровня LL37 выявлялись в 13,96% случаев, снижение концентрации LL37 и лактоферрина было отмечено у 15,1% пациентов, LL37, лактоферрина и миелопероксидазы регистрировались в 11,63% образцов.

Вероятно, дисбаланс АМП выявляемый, как правило, при хронических ранах или затяжном течении раневой инфекции, свидетельствует, с одной стороны, о повышенной востребованности этих медиаторов для завершения локального воспалительного процесса, а с другой - об истощении их локальной продукции и снижении резервных возможностей фагоцитарных продуцентов АМП. Кроме того, высокий уровень этих медиаторов на ранних стадиях раневого процесса, по всей видимости, необходим для обеспечения определённого уровня защиты от инфекционных агентов в очаге воспаления.

Таким образом, нарушение продукции АМП может рассматриваться как один из механизмов развития иммунной дисфункции у больных гнойными ранами, что является основанием для разработки адекватных способов лечения.

Учитывая вышеизложенное, было изучено влияние миелопида на продукцию АМП мононуклеарными фагоцитами крови здоровых лиц и больных с гнойными ранами. В результате проведенных исследований установлено, что внесение препарата в культуру МНФ крови здоровых лиц сопровождалось усилением продукции изучаемых эндогенных пептидов. Как видно из рис. 4-6, эффект препарата был более выражен при использовании миелопида в дозах 1500 мкг/мл и 3000 мкг/мл (750 и 3000 мкг/мл - для лактоферрина). При сравнительном изучении уровня АМП в супернатантах клеток больных после их инкубации с препаратами (рис. 4-6), было установлено иммуномодулирующее действие миелопида на мононуклеарные фагоциты крови: повышение исходно сниженной продукции и снижение - исходно повышенной, что может иметь важное значение для купирования локального инфекционно-воспалительного процесса при ранах и раневой инфекции. Полученные in vitro данные указывают на воз-

можность направленного изменения синтеза эндогенных противомикробных пептидов под действием миелопида у больных с гнойными ранами.

I 2 3

\ О 1 63 И Э здоровые ■

Рис.4. Влияние препарата миелопид на про- Рис. 5. Влияние препарата миелопид на дукцию LL37 МНФ крови здоровых лиц и продукцию лактоферрина МНФ крови здо-больных с гнойными ранами. ровых лиц и больных с гнойными ранами.

Примечание: на рис. 4-7, 9, 10 - К - контроль (внесены клетки, необработанные препаратом). I - больные с типичным течением раневого процесса; И - больные с хроническими ранами; 1 - миелопид 600 мкг/мл; 2 - миелопид 750 мкг/мл; 3 - миелопид 1500 мкг/мл; 4 -миелопид 3000 мкг/мл; р<0,01 по сравнению с контролем.

В последние годы установлено, что секреция АМП инициируется после связывания патогенов с рецепторами, распознающими «патоген-ассоциированные молекулярные образы» (PRR - pattern-recognition receptors), которые выполняют интегрирующую функцию между врождённой и адаптивной иммунной системой (Хаитов P.M., 2009; Liew F. Y., 2005; Trinchieri G., 2007). Среди PRR То11-подобные рецепторы рассматриваются как ключевые рецепторы, опосредующие реализацию врождённого иммунитета на микробные патогены. Наиболее широким спектром специфичности среди всех идентифицированных TLR обладает TLR2, связывающий липопротеины грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий, пептидогликан и липотейхоевую кислоту грамположительных бактерий, грибковый зимозан (Bellocchio S., 2004, Gantner В. N., 2005; Roeder А., 2005; Takeda К., 2007). В связи с этим представляло интерес изучить уровень экспрессии TLR2 клетками раневого экссудата и МНФ крови здоровых лиц и больных.

Результаты проведенных исследований показали, что у 76% больных с гнойными ранами в течение первых 6 суток, определялся более высокий уровень экспрессии TLR2 клетками раневого экссудата (повышение числа CD282+ клеток до 74,5±1,5%), по сравнению с МНФ крови здоровых лиц и больных (42,5±2,5% и 61,4±4,5%, соответственно), что, вероятно, связано с повышенной концентрацией микробных патогенов в зоне инфекционно-воспалительного процесса. Вероятно, такой высокий уровень экспрессии TLR2 индуцирует выработку антимикробных пептидов, что согласуется с ранее полученными данными. При неосложнённом течении раневого процесса

уровень экспрессии ТЬЯ2 клеточных рецепторов, как правило, снижался к 9 суткам. Вместе с тем, у 24% пациентов регистрировался низкое (ниже 40%) содержание в РЖ СБ282+ клеток, экспрессирующих ТЬЯ2, что может быть связано, с одной стороны, со «сбрасыванием» этих иммунорегуляторных молекул гиперактивированными клетками очага воспаления, а с другой - с генетическими дефектами экспрессии Г1К2 фагоцитами. Данная динамика была характерна лишь для больных с обширными и хроническими гнойными ранами. Наиболее часто из гнойных ран у этих пациентов «высевался» золотистый стафилококк (52% случаев) или его ассоциации (41%). При этом наличие у данной категории больных высоких показателей уровня дефенсина а в раневой жидкости может быть обусловлено другими сигнальными путями активации его продукции (в т.ч. через рецепторы

Рис. 6. Влияние препарата миелопид на про- Рис. 7. Влияние препарата миелопид на экс-дукцию миелопероксидазы МНФ крови здо- прессию С0282+ МНФ крови здоровых лиц ровых лиц и больных с гнойными ранами. и больных с гнойными ранами.

У большинства больных с затяжной и хронической раневой инфекцией (64,5%) число СБ282+МНФ периферической крови соответствовало показателям здоровых лиц, т.е. было снижено по сравнению с количеством С0282+ клеток при благоприятном течении раневого процесса, что, по-видимому, свидетельствует о неполноценности механизмов противомикробной защиты и снижении адаптационных возможностей у данной категории пациентов. При этом повышение числа ТЫ12+клеток периферической крови регистрировалось у 35,5% пациентов с затяжными и хроническими гнойными ранами. Следует отметить, что у здоровых лиц в 10% случаев отмечалось исходное повышение экспрессии С0282+ мононуклеарами крови, по-видимому, связанное с физиологической гетерогенностью в данной группе.

Значительный интерес в этой связи представляют полученные нами данные о влиянии миелопида на экспрессию Т1Л12 МНФ крови. Так, внесение изучаемого препарата в культуру клеток здоровых лиц и больных с «нормальными» показателями приводило к повышению числа СП282+ МНФ и к снижению - исходно повышенной экспрессии ТЫ12. Как видно из рис. 7, наибо-

лее выраженный эффект наблюдался при использовании препарата в дозах 1500 и 3000 мкг/мл.

Известно, что при активации TLR2 запускается сигнальный каскад, приводящий к выработке воспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО-а), хемокинов и др. регуляторных молекул (Ковальчук Л.В., 2008; Baker Н.М., 2006; Barton G. М, 2009). Одной из адапторных молекул, продуцируемых клетками в ответ на активацию TLR2 агонистами, является оксид азота, оказывающий мультимодальное действие на различные клетки-мишени (Ганковская Л.В., 2007; Trinchieri G., 2008). Анализ результатов показал (рис. 8), что при типичном течении раневого процесса пик суммарной продукции нитритов и нитратов в биологических жидкостях приходится на 1-2 сутки со снижением к 5-7 дню.

При проведении клинико-иммунологических параллелей между изменением продукции NO при типичном, затяжном и хроническом течении раневого процесса было показано, что у всех пациентов с вялотекущей и хронической раневой инфекцией оксид азота в экссудате из раны регистрировался в более низких концентрациях (1,1±0,05 мкмоль/л и 0,3±0,03 мкмоль/л, соответственно), что может иметь важное значение в развитии осложнений. Более низкий уровень метаболитов NO был выявлен также при хронических гнойных ранах в сыворотке крови и супернатантах МНФ крови. Следует отметить, что резкое нарастание концентрации NO (более 6,5 мкмоль/л) в РЖ, как правило, на 7-8 сутки на фоне типичного течения раневого процесса сопровождалось последующим развитием инфекционных осложнений.

Обработка клеток in vitro препаратом миелопид оказывала дозозависи-мое действие на продукцию метаболитов NO в культуральной среде, повышая сниженные и снижая повышенные показатели. Как видно из рис. 9, максимальный эффект проявлялся при использовании миелопида в дозе 3000 мкг/мл.

| —•-РЖ —35— сыворотка крови j

Рис. 8. Динамика уровня N0 в раневой жидкости и сыворотке крови больных с типичным течением гнойных ран.

к 1 2 3 4

□ I □ I! 3 здоровые!

Рис. 9. Влияние препарата миелопид на продукцию N0 МНФ крови здоровых лиц и больных с гнойными ранами.

Известно, что в обеспечении противоинфекционной защиты организма, наряду с NO, важное значение имеет продукция АФК (Тотолян A.A., Фрейд-

ЛИН И.С., 2006; Lucas T., 2010). Результаты проведенных исследований показали, что фагоциты большинства больных (92,4%), по сравнению с клетками здоровых лиц, обладают повышенной продукцией АФК, что, вероятно, является результатом избыточного прайминга МНФ под действием медиаторов в зоне воспаления. У 8% пациентов с затяжным течением раневой инфекции регистрировалось снижение показателей спонтанного и стимулированного HCT (до 0,1 и 0,18 ед.опт. плотности, соответственно), что свидетельствует о снижении микробицидного потенциала фагоцитов у данной группы больных и согласуется с данными литературы (Ashcroft G.S., 2005; Falanga V., 2010).

0.8 с 0,6

с

I о,4 S 0,2 0

0,6

0,5

04 с

0,3 Ç о

U,2 Ч"

0,1 ш

спонтанный HCT больные — спонтанный HCT здоровые

стимулированный HCT больные стимулированный HCT здоровые

Рис. 10. Влияние препарата миелопид на показатели спонтанного и стимулированного HCT здоровых лиц и больных с гнойными ранами.

Примечание: по левой оси ординат - показатели больных; по правой - здоровых лиц.

При этом установлено, что внесение препарата миелопид в культуру клеток здоровых лиц приводило к усилению спонтанной и стимулированной продукции АФК. Вместе с тем, у больных с гнойными ранами отмечено дозозави-симое снижение (до показателей здоровых лиц) АФК. Наиболее выраженный эффект наблюдался при использовании дозы миелопида - 1500 и 3000 мкг/мл (рис. 10).

Учитывая то, что цитокинобразуюшая функция макрофагов значительно расширяет их эффекторный потенциал и во многом определяет течение и исход репаративного процесса (Ковальчук JI.B., Ганковская JI.B., 2004-2008; Lucas Т., 2010), нами исследован локальный и системный цигокиновый статус у больных с раневой инфекцией.

Анализ полученных результатов позволил выявить у пациентов три типа реагирования организма на локальный гнойно-воспалительный процесс: первый тип, сопровождающийся увеличением синтеза воспалительных цитокинов и «активным» течением заболевания (при типичном течении раневого процесса), второй - у больных с хронической формой раневой инфекции, сопровождающийся гиперпродукцией воспалительных и противовоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-lRa, ТФР-ßl) цитокинов и третий - со снижением продукции ИЛ-lß, ИЛ-8, ИЛ-6, ФНО-а на фоне затяжного течения патологического процесса в мягких тканях.

Так, исследования концентраций воспалительных цитокинов в РЭ в острую фазу раневого процесса выявили повышение их уровня по сравнению со стандартными значениями для биологических жидкостей в 87% случаев. При этом повышенная продукция ИЛ-1(3, ИЛ-8, ИЛ-6, ФНО-а отмечалась у 42% больных, ИЛ-1 j3 и ИЛ-8 - у 49%, ИЛ-lfi - у 9% больных, соответственно.

В фазу образования грануляционной ткани имело место транзиторное повышение на 25-35% от исходного уровня ИЛ-10 и ИЛ-lRa, а также ТФР-[31 (на 56-147%), который регулирует основные функции фибробластов и эпите-лизацию ран (Симбирцев А.С., 2008; Baker Е. А., 2006; Zhou L.J., 2008).

Как видно из рис. 11, более высокие концентрации в раневой жидкости отмечены для ИЛ-ip и ИЛ-8 при хроническом течении раневой инфекции. Кроме того, в сыворотках крови 66% данных пациентов определялся повышенный уровень ИЛ-1 р, ИЛ-6 и ФНО-а, ay 15% - ИЛ-lfi Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что хронические раны как бы «застревают» в фазе воспаления (Panuncialman .(., Falanga V., 2009-2010). Концентрации ИЛ-10, ИЛ-lRa и ТФР-pi в раневой жидкости, полученной из длительно незаживающих ран, значительно превышали (на 20-45%) уровни данных противовоспалительных цитокинов в заживающих ранах, что свидетельствует о важности баланса между позитивными и негативными цитокиновыми регуляторами в раневом очаге. Следует отметить, что показатели продукции ИЛ-1)3 и ФНО-а в очаге воспаления были выше их концентрации в сыворотке крови, тогда как ИЛ-8 ни в одном из случаев (как у больных, так и у здоровых лиц) в ней не определялся.

Рис. 11. Концентрация цитокинов в раневой жидкости больных с типичным течением раневого процесса (¡), с затяжным течением раневой инфекции (2), хроническими ранами

(3).

Примечание; приведены показатели цитокинового статуса РЭ. полученного на 7 сутки у больных (1) и (2) течением раневого процесса на 14 день - (3); р<0,05 между показателями для 1 и 2; 1 и 3; 2 и 3.

Третий тип реагирования организма на локальный гнойно-воспалительный процесс, сопровождающийся снижением уровня цитокинов ИЛ-1Р (до 16,2512,85 пкг/мл), ИЛ-8 (до 28,55±3,45 пкг/мл), ФНО-а (до 22,15±5,15 пкг/мл), ИЛ-6 (до 10,15+5,15 пкг/мл) в очаге воспаления, наблюдал-

ся в 13% случаев, что у большинства больных сочеталось с угнетением цито-кинпродуцирующей функции МНФ крови. При этом на фоне затяжного течения патологического процесса в мягких тканях снижение концентрации ИЛ-1 в РЭ отмечалось у 72% больных; ИЛ-10 и ИЛ-8 - у 17%; ИЛ-1 р и ФНО-а - у 7%; ИЛ-1 р , ИЛ-8, ФНО-а - у 4% пациентов, соответственно.

Таблица 2.

Влияние препарата мислопнд на спонтанную л ФГА-индуцироваиную продукцию ци-__токннов МНФ крови больных гнойным» ранами.__

Показатель пкг/мл Пациенты с гнойными ранами

К1 К2 I 11 III IY

ИЛ-ф 195,5±10,2 324,5+30,5** 565,5±12,8* 440,5±10,5** 293,3+20,5* 254,5+23,3**

36,4+5,5 49,8110,5* 76,4±6.5** 82,4±5,5** 90,4113,5* 96,6±18,2**

ИЛ-8 177,5±10,5 248,5±14,5** 308,3+9,4** 300,915,6** 199,5±15,1** 175,4±14,2**

45,414,2 54,5±9,8* 86,4±6,2** 104,5113,5** 115,2±15,1** 120,4±15,2**

ФНО-а 89,4+6,6 167,8±16,4** 188,5±13,3* 172,8+13,2** 114,2±12,1* 86,5±13,5**

35,2±4,1 43,5±8,6* 70,4+6,2** 76,814,8** 88,6±5,4** 99,8±8,2"

ИЛ-6 55,8±6,2 94,6±10,2** П6,6±9,4** 105,6+15,8** 77,5112,1* 75,4113,2*

10,15±5,)5 16,515,5 28,7±6,5* 34,5±4,5* 48,5±9,5* 50.5114,5

ИЛ-10 31,3+5,1 54,218,6* 6б,3±5,5** 72,5±3,5** 50,2+11,5* 46,615,2*

9,5+2,5 1S,4±3,5* 24,715,5* 37,8±7,5* 46,5+8,5* 48,8110,4*

ТФР-р 1 7856+75,5 142251129,5* 163451115,5* 15112+89,1 * 8055±78,5* 7985+145,5*

2650+55,8 3231±60,5* 3685152,8* 4055150,8* 4455±80,5* 4512,3140,5*

Примечание: I - миелопид 600 мкг/мл; II - миелопид 750 мкг/мл; III - миелопид 1500 мкг/мл; IV- миелопид 3000 мкг/мл. KI - контроль (клетки, необработанные препаратом, без ФГА; К2 - контроль (клетки, необработанные препаратом с внесением ФГА); * р<0,05 ,** -р<0,01 по сравнению с К2; между К1 и К2. Приведены исходно повышенные (п =15) и сниженные показатели (п =15) уровня цитокинов в супернатантах МНФ.

При сравнительном изучении уровня цитокинов в супернатантах клеток после их инкубации с препаратом (табл. 2), было установлено иммуномодули-рующее действие миелопида на МНФ крови: снижение исходно повышенной продукции и повышение - исходно сниженной, что может иметь важное значение для ускорения процессов миграции, пролиферации и дифференцировки клеток в зоне репарации. При этом более низкие концентрации миелопида (600 и 750 мкг/мл) оказывали преимущественно стимулирующее действие на ФГА-индуцированный синтез цитокинов МНФ крови. Следует отметить, что значимой дозовой зависимости при использовании миелопида в концентрациях 1500 и 3000 мкг/мл установлено не было.

Помимо анализа концентраций цитокинов в биологических жидкостях у больных с исследуемой патологией проводилась оценка частоты выявляемое™ цитокинов, что, согласно данным литературы, служит дополнительным прогностическим критерием цитокинопосредованности патологии и тяжести её течения (Ковальчук Л.И., Ганковская Л.В., 2008). Надо отметить, что в раневой жидкости при хронических ранах наиболее часто выявлялся ИЛ-ip, ИЛ-В и ТФР-Р,, а при типичном течении раневого процесса - ИЛ-1(3, ИЛ-8, ИЛ-6 и ФНО-а, что, как правило, сочеталось с повышением их концентрации. Кроме того, следует отметить, что изменения продукции ряда цитокинов были взаимосвязаны. Наиболее выраженной была зависимость между уровнями ИЛ-ip и ИЛ-10 (г=0,93; р>95%), ИЛ-8 и ТФР-р, (г=0,92; р>95%).

Обобщая полученные нами данные по исследованию противоинфекци-онного иммунитета у больных гнойными ранами, можно сказать, что избыточная или недостаточная продукция антимикробных пептидов и белков, метаболитов кислорода и оксида азота, значительное повышение или снижение воспалительных и противовоспалительных цитокинов, нарушение экспрессии ТЬЯ2 фагоцитами раневой жидкости более чем в 80% случаев приводит к неблагоприятному течению раневой инфекции, проявляющемуся в затяжном и хроническом течении заболевания, развитии инфекционных осложнений.

При этом наиболее значимыми критериями неблагоприятного затяжного и хронического течения раневого процесса было снижение или повышение (менее 0,5 мкг/мл или более 10 мкг/мл) в раневой жидкости уровня 1Х-37, повышение (выше 1,5 мкг/мл) содержания а дефенсина, снижение уровня оксида азота (ниже 1 мкмоль/л) и числа ТЫ12 позитивных фагоцитов (менее 40%).

Таблица 3.

Антибактериальная активность препарата миелопид.______

Доза препарата миелопид Степень задержки роста тест-к Сльтуры (в баллах)

S.aureus S.pyogenes Р. aeruginosa E.coli Р. vulgaris К.pneumoniae С. albicans

3000 мкг/мл 3,04±0,28** 3,11±0,2б** 1,37±0,61 3,29±0,2** 2,8±0,2** 3,3±0,3** 3,6±0,58**

1500 мкг/мл 3,01±0,26** 3,02±0,28** 0 3,43±0,3** 2,75±0,1** 3,2±0,2** 3,64±0,5**

750 мкг/мл 2,98±0,28** 3,01±0,26** 0 3,2440,4** 2,7±0,2** 3,2±0,2** 3,62±0,8"

Контроль 0 0 0 0 0 0

Примечание: контроль - физиологический раствор; **р<0,01 по сравнению с контролем

Известно, что в последние годы отмечается рост устойчивости микроорганизмов-возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний к применяемым в клинической практике антибиотикам и антисептикам (Толстых П.М., 2007; Блатун JI.A., 2009; Deepak V., 2006). Изучение свойств препаратов природных антибиотических пептидов человека и животных и разработка на их основе новых подходов к лечению инфекций - один из перспективных путей преодоления резистентности (Heilborn J. D. 2003-2006; Steinstraesser L., 2008). В связи с этим представляло интерес изучить возможное противомикробное действие препарата свиных миелопептидов - миелопида (табл. 3). Проведенные эксперименты показали, что препарат миелопид активен в отношении всех исследуемых микроорганизмов, кроме Р. aeruginosa. Как видно из представленных результатов, не было выявлено достоверных различий при использовании миелопида в дозах 750,1500 и 3000 мкг/мл.

Таким образом, препарат миелопид обладает не только иммунорегулятор-ным действием, но и противомикробной активностью. Данные литературы и наши наблюдения позволяют предположить, что прямое антимикробное действие миелопида опосредовано входящими в его состав гетерологичными АМП, что позволяет его рассматривать как эндогенный антибиотик животного проис-

хождения и свидетельствует о возможности клинического использования в качестве антимикробного средства (Патент № 2333765).

Как известно, одним из перспективных способов местного лечения гнойных ран является сочетанное использование иммуномодуляторов и физических методов (Луцевич О.Э., Шехтер А.Б., 2008). Исследованиями отечественных авторов показано, что воздушная плазма, обогащенная N0, в отличие от большинства физических факторов, способна оказывать стимулирующее действие на местный иммунный ответ, кровоток и на процесс заживления гнойных ран (Шехтер А.Б., Кабисов Р.К., 2004-2009). Вместе с тем, открытым остается возможность дополнения NO-терапии местным воздействием иммунорегуляторных пептидов для улучшения лечебного эффекта. В доступной литературе также отсутствуют данные о динамике экспериментальной гнойной раны при местном воздействии препарата миелопид. Учитывая это, и полученные in vitro результаты об иммуномодулирующем и антимикробном действии миелопида, представляло интерес провести комплексную оценку динамики течения экспериментальной гнойной раны при различных вариантах локального использования препарата миелопид и NO-терапии. В качестве препарата-контроля из числа традиционных антисептиков был выбран гипохлорит натрия, который, согласно данным литературы, в концентрациях 300-600 мг/л обладает иммунорегуляторным действием (Дол-женко С.Н., 1999).

Эксперименты выполнены на модели гнойной раны на 140 крысах «Вис-тар» на основе модели S. Eleck, К. Sommenn. Все животные были распределены на 5 групп: 1 (контрольная) группа - 20 животных, не получавших лечения; 2 группа (30 крыс) - в которой был использован натрия гипохлорит (600 мг/л) и основные группы животных (по 30 крыс), получавшие оптимизированное лечение с использованием раствора миелопида (3000 мкг/мл) - 3 группа, комплекса NO-терапии и натрия гипохлорита (600 мг/л) - 4 группа, сочетания NO-терапии и миелопида (3000 мкг/мл) - 5 группа.

На 1-е сутки лечения экспериментальные гнойные раны во всех группах выглядели одинаково: отёчные, инфильтрированные края с выраженной гиперемией окружающих тканей, дно покрыто налетом фибрина с участками некроза и умеренно выраженным гнойным отделяемым. У всех животных регистрировался дегенеративно-воспалительный тип цитограмм. На 3-й сутки данный тип цитограмм сохранялся лишь у животных 1 (контрольной) группы, тогда как во 2-4 группах была отмечена его смена на воспалительный тип. При этом, несмотря на то, что в цитограммах преобладали нейтрофилы, их количество снизилось с 92,0±1,3% до 89,35±1,25% при использовании гипохлорита натрия, до 88,2±1,3% - при лечении миелопидом и до 78,4±2,0% - при сочетании воздействия NaOCl и NO-терапии (92,3±1,5% - в контрольной группе). В 5 группе животных уже на 3-сутки определялся воспалительно-регенераторный тип цитограмм со значительным уменьшением числа нейтрофилов (до 51,7±2,5%) и деструктивных форм лейкоцитов (до 1,2±3,3%), повышением количества макрофагов (до 11,8±1,4%) и фибробластов (до 11,3±2,3%). Смена воспалительно-регенераторного типа цитограмм на регенераторно-

воспалительный регистрировалась на 5 сутки при сочетанном использовании миелопида и оксида азота и на 7-е сутки лечения - у животных 2-4 групп. Соотношение клеточных элементов, соответствующее регенераторному типу, наблюдалось в данных группах на 7 и 10 сутки, соответственно. При этом в контрольной группе животных даже на 14 день сохранялся воспалительный тип цитограмм.

По данным планиметрического исследования, самая высокая скорость заживления отмечена в серии животных, пролеченных комбинацией оксида азота и раствора миелопида - 14,110,28 мм/сут. Во 2-4 группах она составила, соответственно, -10,1+0,15; 10,4±0,52 и 12,6±0,72 мм/сут., а в группе контроля

- 6,4±0,34 мм/сут. (р<0,05). При сочетанном использовании ИО-содержащего газового потока и миелопида на 10-14 сутки сокращалось 82-95% раневого дефекта, тогда как у животных 2 группы - 61-82,5%, 3 группы - 59-83%, четвёртой

- 67-85%, а у контрольной - лишь 16,5-31 %.

Комплексный анализ изучения динамики заживления ран, включая гистологическое исследование раневых биоптатов, выявил, что наиболее эффективным явилось применение комплекса МО-терапии и миелопида (табл. 4). При этом на 14-15 сутки отмечено полное заживление ран вторичным натяжением с формированием нежного рубца (средние сроки заживления составили 14,8±1,5 суток). В контрольной группе животных грануляционная ткань даже к 14 суткам полностью не выполняла раневой дефект, а заживление ран длилось 28,4±3,1 дня. Во 2 - 4 основных группах, где изолированно использовался мие-лопид или натрия гипохлорит, а также его сочетание с N0, динамика течения раневого процесса существенно не отличалась: на 7-10 сутки усиливались пролиферация фибробластов и неоангиогенез, что сопровождалось быстрым развитием и созреванием грануляционной ткани. Средние сроки заживления ран в 3 группе составили 18,7±1,28 суток, во 2-й - 19,7±1,6, в четвёртой - 17,4±1,2 (р<0,05 по сравнению с контрольной группой) дней.

Таблица 4.

Динамика течения раневого процесса у экспериментальных животных

Признаки раневого процесса (сутки) Группы животных

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа

Сроки очищения ран 9,17±1,17 4,50±1,22* 4,62±1,34* 3,85±1,47* 2,55±1,60**

Сроки появления грануляций 8,33±1,21 4,33±1,21* 4,17±1,17* 3,97±1,17* 3,12±0,81 *

Сроки выполнения раны грануляциями 13,00±!,27 б,00±1,13* 6,67±1,33* 5,98±1,15* 4,11±0,31**

Начало краевой эпите-лизации 10,67±1,21 6,33±1,21* 6,03±1,21* 5,71±1,21* 4,46±0,84*

Примечание: * р<0,05; ** р<0,01 по сравнению с показателями контрольной группы.

При посеве отделяемого из ран у животных 5 группы, где использовалась комбинация раствора миелопида и оксида азота, бактериальная флора определялась только на 1-3 сутки, у животных 2, 3 и 4 групп - на 1-5 сутки, в контроле - даже на 14 день. При этом установлено, что МО-терапия усиливала бактерицидное действие натрия гипохлорита при их сочетанном применении:

на 5 сутки бактериальная обсеменённость ран снизилась во второй группе до в третьей и четвёртой группах - до 2,2+5-Ю4КОЕ/г и до 2,1 ±5-103 КОЕ/г, соответственно.

Таким образом, анализ данных показал, что эффективность локального действия миелопида при экспериментальных гнойных ранах была аналогична антисептику гипохлориту натрия, бактерицидное действие которого усиливала NO-терапия, а наилучшие результаты были получены при комбинированном использовании миелопида и NO-содержащего газового потока.

Результаты клинических наблюдений.

Для изучения особенностей течения гнойных ран различного генеза нами был проведен клинико-эпидемиологический анализ заболеваемости и лечения пациентов (3475 человек), находившихся в хирургическом отделении МЛПУЗ «Больница скорой медицинской помощи им. H.A. Семашко», МЛПУЗ «Больница им. С.П. Боткина» г. Орла в 2001-2008 годах, который показал, что наибольший удельный вес в структуре гнойных ран занимают процессы, связанные с лечением острых гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей (61,15%) и посттравматические гнойные раны (15,8%), а также раны после хирургического лечения флегмонозно-некротической рожи (12%). При этом в динамике восьмилетнего мониторинга было установлено, что заболеваемость гнойными ранами не имеет тенденции к снижению и характеризуется «омоложением» контингента больных (61,4% пациентов в возрасте 18-35 лет). Кроме того, за период с 2001 по 2008 гг. зарегистрировано увеличение среди пациентов с гнойными ранами числа больных с сахарным диабетом и гипертонической болезнью (на 4,1-5,8%), сокращение количества больных с обширными ранами и пациентов, которым выполнены повторные радикальные хирургические обработки гнойно-некротических очагов (на 5,2-6,2% и 2,8-3,8%, соответственно). В этиологической структуре раневой инфекции за восьмилетний период наблюдения отмечен рост грамотрицательной флоры и микробных ассоциаций, появление С. albicans, сохранение ведущей роли S. aureus.

При этом, как правило, больные поступали в стационар после предшествующего неэффективного амбулаторного лечения. Несвоевременное обращение за медицинской помощью и самолечение имели место в 81,4% и 75,9% случаев, соответственно, 46% больных поступали на лечение в стационар с сомнительным и неблагоприятным прогнозом, 54% - с благоприятным прогнозом течения гнойно-воспалительных заболеваний. Из общего числа пациентов 29,1% имели в анамнезе гнойно-воспалительные заболевания (фурункулы, карбункулы, абсцессы и др.), 62,7% - сопутствующую соматическую патологию (сахарный диабет, гипертоническая болезнь, ИБС, хронические заболевания желудочно-кишечного тракта и гепатобилиарной системы, хронические неспецифические заболевания легких и др.), 34,5% из общего числа больных страдали частыми ОРВИ (до 4-6 раз в год). На основании данных анамнеза, проведённого анализа соматических заболеваний, особенностей течения гнойно-воспалительного процесса в мягких тканях следует, что у 87,3% больных имелись существенные факторы риска для развития иммунной дисфункции. Полученные данные не

противоречат результатам эпидемиологических исследований последних лет и подчёркивают актуальность проблемы гнойной инфекции.

Учитывая это, и в соответствии с поставленными задачами исследования проводилось изучение эффективности лечения 198 больных (мужчин - 127; женщин - 71) с гнойными ранами, которые по способу лечения были разделены на 4 группы: I контрольную группу составили 60 пациентов (38 мужчин, 22 женщины; средний возраст 41,5±3,9 лет), получавших традиционное лечение; II группу - 39 пациентов (25 мужчин, 14 женщин; средний возраст 40,5±3,8 лет), которым проводилась локальная иммунокоррекция препаратом миелопид; в III группу были включены 39 пациентов (24 мужчин, 15 женщин; средний возраст 39,5±3,5 лет), получавших местную NO-терапию; в IV группу - 60 больных (40 мужчин, 20 женщин; средний возраст 42,1±4,5 лет), которые получали локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид в сочетании с NO-терапией.

В структуре гнойных ран доминировали раны после хирургического лечения острых гнойных заболеваний мягких тканей - 108 (54,5%), в т.ч. флегмоны - 86 (43,4%), абсцессы - 22 (11,1%). С флегмонозно-некротической формой рожи было пролечено 30 больных (15,15%), с послеоперационными ранами - 20 (10,1%), с посттравматическими ранами - 40 (20,2%) пациентов. Большинство раневых процессов имели площадь от 31 до 100 см2 (60,6%). Общее состояние средней степени тяжести регистрировалось у 122 больных (61,6%), удовлетворительное - у 54 (27,3%), тяжёлое - у 22 пациентов (11,1%).

i - - II —*- - III —х— IV

Рис. 12. Динамика оценки эффективности лечения больных с типичным течением раневого процесса в баллах.

Примечание: I - контрольная группа; II группа - больные, получавшие локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид; III группа - пациенты, получавшие NO-терапию; IV группа - больные, которые получали локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид в сочетании с NO-терапией; р<0,05 между показателями больных до и после лечения.

Эффективность лечения оценивали в 4-х балльной системе по разработанным нами критериям на 1, 3, 6, 9 сутки и при выписке больного. Совокупная оценка выраженности гнойно-воспалительного процесса в 38 и более баллов соответствовала высокой степени активности; 37,5-20,5 - умеренной; ниже 20,0 - незначительной. По степени выраженности гнойно-воспалительного процесса пациенты во всех группах распределились примерно одинаково: незначительная степень активности гнойно-воспалительного процесса отмечался у 20% па-

циентов группы контроля, у 20,5% больных второй группы и у 17,9% и 20% пациентов третьей и четвёртой групп, соответственно; умеренная степень активности - у 50%; 51,2%; 51,4% и 46,7%; высокая - у 30%; 28,3%; 30,7% и 33,3%, соответственно.

При поступлении выраженность клинических симптомов по сумме баллов у больных контрольной группы составляла 37,3,0±0,5 балла, II группы -36,7±0,8 балла, III и IV групп - 37,8±1,1 и 37,5±0,5 баллов, соответственно (рис. 12). Следует отметить, что локальные объективные признаки гнойно-воспалительного процесса в мягких тканях до лечения определялись у всех пациентов: инфильтрация, отёк в области гнойного очага у 98,5%; гиперемия области поражения у 96,5%; нарушение функции пораженной области у 97,4% больных. В 26,7% случаев выявлялся регионарный лимфаденит, в 16,2% - лим-фангиит, у 8,6% больных - наличие более одного гнойного очага.

Уже на 3 сутки лечения отмечалась существенная разница в течение воспалительного процесса по динамике клинико-лабораторных и инструментальных данных: у больных, получавших локально препарат миелопид, - снижение до 26,9±0,5 баллов; NO - терапию - до 24,5±0,6 баллов; сочетанную локальную иммунокоррекцию миелопидом и NO - до 20,3±0,5 баллов в то время как у пациентов первой группы сумма баллов оставалась на достаточно высоком уровне (28,4±0,7 балла, соответственно). Следует отметить снижение микробной обсеменённости раны и улучшение характера цитологической картины мазков-отпечатков, в основном за счет снижения числа нейтрофилов, увеличения количества макрофагов, появления фибробластов (табл. 5), динамика которых была более значимой на фоне сочетанной локальной иммунокоррекции. При этом на 5-6 сутки у большинства пациентов III и IV групп наблюдалось стихание перифокального воспаления, уменьшение количества раневого отделяемого, и изменение его характера в сторону серозного или серозно-гнойного. Начало появления грануляционной ткани отмечалось лишь у пациентов четвёртой группы. В I контрольной и во II группах динамика показателей была менее выражена, а очищения раневой поверхности зарегистрировано не было.

На девятые сутки у 59% больных второй, 61,5% - третьей и 76,7% - четвёртой групп отмечалось типичное течение раневого процесса и почти полное купирование воспалительного процесса в ране (13,3±0,4 баллов; 9,7±0,8 и 7,45±0,3 баллов, соответственно): очищение от некротических тканей, отсутствие раневого отделяемого, заполнение раневой поверхности грануляционной тканью, уменьшение площади раны, снижение (и отсутствие у больных IV группы) числа микробных колоний в мазках-отпечатках и повышение числа фибробластов (до 44,3±2,3%), свидетельствующих о процессе регенерации тканей (табл. 5). При этом использование миелопида приводило к более быстрому купированию локального воспалительного процесса преимущественно у больных с гнойными ранами размерами до 50 см2. Следует отметить, что сочетанное использование NO-терапии и миелопида в четвёртой группе позволило в 23,3% случаев избежать затяжного течения раневого процесса, а также снизить до 8,3% число больных, получавших повторные курсы антибиотикотерапии.

Таблица 5.

Динамика показателей цитограмм на фоне лечения больных с благоприятным _(типичным) течением раневого процесса.__

Показатель, % 1 сутки 3 сутки 6 сутки 9 сутки

Небтрофилы I группа 53±1,5 49,9±1,2** 45,6±0,9* 35,5±0,9*

II группа 53,5±1,2 49,5±1,2* 45±!,4* 35,1±1,1*

III группа 54,2±1,1 49,4+3,3 • 45,6+2,5 ** 35,6+1,8*

IV группа 53,2+0,4 45+3,4 » 40,8+1,5 * 29,6+1,2**

«Деструктивные» нейтрофилы I группа 18,7+1,2 13,9+0,4* 5,5+0,2 * -

II группа 17,8+1,2 13,7+0,5 ** 5,4+0,3 * -

III группа 17,9+1,2 13,8+0,1 * 5,5+0,4 ** 0,5+0,3**

IV группа 18,5+1,2 11,2+3,3 * - -

Фагоцитоз 1 группа 8,1+2,3 7,3+1,1 * 5,9+0,2 * 2,3+0,5**

II группа 8,0+2,3 6,9+0,1 ** 6,0+0,3 * 2,2+0,2**

III группа 7,9+2,3 7,1+0,2 * 6,1+0,1 ** 2,4+0,5*

IV группа 8,0+2,3 6,2+1,5* 5,4+1,0 * -

Макрофаги I группа 16,8±1,3 20,3+0,9** 20,1±1,5* 18+0,9

II группа 17,2±1,1 21 + 1,1* 20,7+0,8* 19+0,7*

III группа 16,7±1,3 20,7+0,9** 20±0,8* 18,2±0,7*

IV группа 16,9+1,2 24,8+1,4** 21,4+0,6* 13,4±0,8*

Лимфоциты I группа 3,4+0,7 8,6+0,5* 6,6+0,1* 13+0,3**

11 группа 3,5+0,8 8,9+0,3* 6,5+0,7" 13,8+1,3**

III группа 3,3+0,7 8,9+0,1* 6,6+0,4** 12,8+1,3*

IV группа 3,4+0,7 6,5+0,3* 7,8+0,6* 12,7+0,4*

Фибробласты I группа - - 15,4+1,9* 30,7+3,1*

II группа - - 15,6+3,0* 30,4+2,0*

III группа - - 15,7+2,5 * 30,5+3,0**

IV группа - 6,3+2,3 * 24,6+2,5 * 44,3+2,3*

CD95+ клетки I группа 29,5±1,1 31,5,5+1,5* 27,3±1,1* 21,2+0,5*

II группа 28,9±1,4 25,5±1,1* 18,2±0,5* 14,8±0,6*

Ш группа 29,1±0,8 25,8±1,4*- 15,4±0,6* -

IV группа 28,7±1,3 24,9±1,5* 13 ,5±1,2* -

CD282+ клетки I группа 72,9±1,5 69,4+1,2* 62,5±1,5* 57,2±2,7*

II группа 73,4+1,8 64,5±1,5* 53,1+2,5* 44,1±3,5*

II! группа 74,1+1,3 62,4±1,5* 46,4+4,5* -

IV группа 74,5+1,5 63,9±0,5* 43,9+3,8* -

Примечание: I группа - контрольная; II группа - локальная иммунокоррекция с миелопидом; III группа-NO-терапия; IVrpynna-миелопид+ЫО-терапия ; *р<0,05; ** р<0,01 по сравнению с интраоперационными показателями (1 сутки).

У больных первой группы положительная динамика клинических проявлений по сумме баллов на 9 сутки была менее выражена (19,1±0,4 баллов), а типичное течение раневого процесса регистрировалось лишь у 45% пациентов. Купирование воспалительного процесса в мягких тканях у пациентов I группы на фоне традиционного лечения происходило только к 13-14 дню (4,8 ±0,05 баллов). Общая продолжительность стационарного лечения больных с типичным течением раневого процесса при проведении традиционной терапии составила 14,3±2,2 дней. У больных основных групп лечебная тактика с локальным применением N0 и препарата миелопид приводила не только к более быстрой регрессии клинических симптомов, но и позволила снизить среднюю продолжительность пребывания больных в стационаре до 10,8±1,9 койко-дней у больных четвёртой группы, до 13,2±1,8 и 12,7±2,1 дней - пациентов второй и третьей групп, соответственно.

Анализ результатов лечения показал, что затяжное и хроническое течение гнойных ран регистрировалось у 78 (39,4%) человек из общего числа больных (198 пациентов). Необходимо отметить, что динамика гнойных ран у больных с затяжным течением раневого процесса, главным образом у пациентов с флег-монозно-некротической формой рожи, посттравматическими и послеоперационными ранами, отличалась от таковой при типичном течении: очищение раневой поверхности наблюдалось при традиционном лечении не ранее 12-13 дня (на 8-10 сутки у больных IV группы), появление грануляций - не ранее 14-16 суток (на 10-11 день - в IV группе), а начало эпителизации отмечалось лишь к 16-17 дню (на 11-12 сутки - в IV группе). При этом сроки стационарного лечения больных с затяжным течением гнойных ран составили: 23,2±2,4 дней в первой, 21,2±1,9 - во второй, 21,3±1,4 - в третьей группах, соответственно. В четвёртой группе, у пациентов с затяжным течением раневого процесса, использование предложенного сочетания препарата миелопид и NO-терапии позволило сократить сроки стационарного лечения до 17,3±1,7 суток.

Обширность и глубина поражения мягких тканей у больных гнойными ранами определяла необходимость раннего хирургического закрытия раневой поверхности. Восстановительные операции были произведены у 62% больных. При рассмотрении данных времени подготовки ран к хирургическому закрытию по нозологиям, установлено, что при применении комплекса миелопида и NO-терапии выигрыш во времени составил при типичном течении раневого процесса 2,3-3,2 дня, а в случае затяжного течения и более тяжёлых поражений, таких, как флегмонозно-некротическая рожа, от 5,4 до 6,3 суток.

Учитывая полученные данные, представляло интерес изучить возможные экономические преимущества использования в комплексном лечении гнойных ран (при типичном течении) клинически наиболее эффективного способа локальной иммунокоррекции с применением миелопида и NO-терапии в сравнении с традиционной терапией. Стоимость лечения 1 больного в стационаре по данной схеме была ниже на 24,4%, чем при традиционном лечении.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали высокую клиническую эффективность локальной иммунокоррекции у больных с гнойными ранами, приводящую к более быстрому, по сравнению с традиционным лечением, купированию локального воспалительного процесса, а также сокращению сроков и стоимости лечения. Оценка эффективности предложенных способов местного лечения у больных с затяжным и хроническим течением гнойных ран свидетельствует о большей целесообразности сочетанного использования в программах хирургического лечения миелопида и NO-терапии.

Характеристика иммунологических показателей и их оценка в эффективности локальной иммунокоррекции.

Учитывая полученные в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo данные о противовоспалительном и антибактериальном эффектах препарата миелопид и NO-терапии, нами исследована динамика показателей иммунного статуса больных гнойными ранами на фоне локальной иммунокоррекции.

Как известно, заживление ран является динамичным процессом, в который вовлечены клетки крови, соединительной ткани и эпителия, внеклеточный

матрикс, а также различные растворимые медиаторы (Ковальчук J1.B., 2008; Земсков A.M., 2008; Cochrane С., Walker М., 2006). Исследование цитограмм раневой жидкости, взятой интраоперационно, а также в динамике лечения больных с благоприятным (типичным) течением раневого процесса показало, что изменения клеточного состава РЖ имели определённую закономерность (табл. 5). Так, в первые часы после вскрытия и дренирования гнойно-воспалительного очага у всех больных в ране преобладал нейтрофильный цитоз со снижением числа жизнеспособных клеток (до 91,4±1,5% и 21,15±1,75°/о клеток, соответственно). На 3 сутки в цитограммах РЖ больных II-IV групп наблюдалась смена клеточных популяций: снижение числа нейтрофилов, повышение - макрофагов и лимфоцитов, а также количества «живых» клеток. К 6 суткам применения локальной иммунотерапии воспалительно-регенераторный и регенераторный тип цитограмм регистрировался у большинства пациентов. Это сопровождалось значительным снижением количества деструктивных форм нейтрофилов, ростом числа макрофагов и зрелых фибробластов.

При этом использование у больных четвёртой группы комбинированного лечения (миелопид и NO-терапии) позволило получить более выраженный противовоспалительный и прорегенеративный эффекты, чем при изолированном применении обоих способов (табл. 5). После курса локальной терапии с применением миелопида, NO- и их сочетания у всех пациентов отмечались не только статистически достоверные изменения клеточного состава РЖ, но также фенотипа и функциональной активности раневых фагоцитов.

Так, в процессе проведения предложенного лечения, по сравнению с традиционной терапией, наблюдалось улучшение показателей спонтанного и зи-мозан-индуцированного НСТ-теста (табл. 6), снижение исходно повышенной экспрессии CD95+, CDllb+, CD282+ антигенов и повышение пула HLA-DR+, CD16+ клеток (табл. 5, рис. 13). Кроме того, у пациентов второй и третьей групп по данным цитологического исследования к 8-9 суткам зарегистрировано значительное снижение микрофлоры в ране. У больных четвёртой группы на 9 день лечения микрофлора в отпечатках с раневой поверхности не выявлялась.

Таблица 6.

Динамика показателей НСТ-теста раневых фагоцитов на фоне лечения больных с типичным течением раневого процесса. __

Показатель Группа больных До лечения После лечения

Спонтанный HCT (%) 1 группа(п=20) 62,8+6,25 50,2±4,4 *

II группа(п=15) 63,2±6,4 32,б±3,8 **

III группа (п= 15) 65,1±5,5 26,5±3,1*

IV группа (п= 15) 64,1 ±5,1 21,8+3,8 **

Стимулированный НСТ(%) I группа(п=20) 83,3±10,2 53,2±6,3*

II группа (п= 15) 84,5± 11,7 45,7±4,9*

III группа (п=15) 82,5±10,3 42,5+7,6*

IV группа(п=15) 81,9±10,5 44,1 ±5,4*

Примечание: * р<0,05; ** р<0,01 по сравнению с показателями до лечения.

В группе контроля раневой процесс по цитологическим данным характеризовался медленным очищением раны от патогенной микрофлоры (на 11-13

сутки), что приводило к сохранению воспалительных явлений и тормозило наступление пролиферативной фазы раневого процесса.

Рис. 13. Динамика показателей раневой жидкости больных с типичным течением гнойных ран на фоне лечения.

Примечание: 1 - показатели в I группе до лечения; 2 - - показатели в I группе после лечения; 3 - показатели во II группе до лечения; 4 - показатели во II группе после лечения; 5 - показатели в III группе до лечения; 6 - показатели в III группе после лечения; 7 - показатели в IV группе до лечения; 8 - показатели в IV группе после лечения; р<0,01 по сравнению с показателями до лечения у больных II, III и IV групп; р<0,05 - в I группе.

Следует отметить, что при сравнении основных параметров цитограмм больных с затяжным и хроническим течением раневого процесса более неблагоприятные изменения динамики цитологических показателей имели место у больных с флегмонозно-некротической формой рожи. В цитограммах таких пациентов выявлялся высокий процент деструктивных форм нейтрофилов (более 20%) и нежизнеспособных клеток, CD95+ клеток (выше 30%), снижение числа CD282+ (менее 40%), отсутствие в очаге воспаления лимфоцитов на 6 сутки лечения, снижение стимулированного НСТ-теста (до 32,7±3,25%) при сохранении его высокого спонтанного уровня (51,5±4,5%).

При этом в первые двое суток течения раневого процесса (при благоприятном и неблагоприятном течении) существенной разницы в показателях цитограмм, за исключением числа TOLL-2+ клеток (70-75% и 34-38%, соответственно), не отмечалось. Наиболее выраженные отличия в данных цитограмм регистрировались у большинства пациентов с типичным и неблагоприятным течением гнойных ран на 7-12 сутки, а улучшение указанных показателей на фоне традиционного лечения при хроническом и затяжном характере раневого процесса наблюдалось не ранее 18-20 дня. Позитивная динамика цитограмм у этой категории больных при использовании локальной иммунокоррекции имела место уже на 9-12 сутки и была более выражена при сочетанном применении миелопида и NO-терапии. Особо следует отметить на фоне лечения повышение в интервале 9-12 суток в цитограммах раневого экссудата количества клеток, экспрессирующих TOLL-2 рецепторы (до 43,4±2,5% - в I группе; до 46,1+1,5% - во И; до 47,05+1,5% и 58,3±1,5% - в III и IV группах, соответственно). При этом более высокий «темп» прироста CD282+ клеток сочетался с более благоприятной клинической динамикой раневого процесса.

Таблица 7.

Динамика уровней цитокинов раневых экссудатов на фоне лечения у больных с _гнойными ранами при типичном течении раневого процесса._

Уровень цитокина, пкг/мл До лечения После лечения

ИЛ-lß I группа(п=20) 328,63+21,35 118,2110,8«»

II группа (п=20) 345,48133,15 88,5112,7**

III группа (п=20) 335,65+29,15 57,1+3,65**

IV группа(п=20) 350,55±39,5 49,8514,25**

ИЛ-8 I группа (п=20) 357,6125,95 78,55115,45**

II группа (п=20) 361,61135,95 56,8115,12**

III группа (п=20) 360,35125,9 35,2112,5**

IV группа(п=20) 349,55+22,5 39,45116,5**

ФНО-а I группа(п=20) 159,85112,15 59,6+5,45*

II группа (п=20) 157,15110,5 38,1+8,25**

III группа (п=20) 160,85114,05 20,45+6,25**

IV группа(п=20) 168,85113,6 22,5+6,25**

ИЛ-6 1 группа(п=20) 69,85114,15 57,615,45*

II группа(п=20) 66,15110,5 38,1+7,25**

III группа (п=20) 71,85118,05 20,45+5,25**

IV группа(п=20) 72,35+21,6 22,516,25**

ИЛ-10 I ipynna(п=20) 29,85+12,15 9,615,45*

II группа (п=20) 28,15+10,5 38,1+1,25**

Ш группа (п=20) 27,85114,05 20,4515,25**

IV группа(п=20) 29,65113,6 22,5+2.25**

ТФР-р 1 группа(п=20) 3299,85197,5 2759,6+85,5*

II группа (п=20) 3376,151100,5 2338,1190,25**

III группа (п=20) 3401,85+124,5 2108,45+75,25**

IV группа(п=20) 3198,85+123,6 2017,5+82,5**

ИЛ-lRa 1 группа(п=20) 99,85+12,15 47,6115,4*

II группа (п=20) 96,15+10,5 33,1110,5**

III группа (п=20) 101,85114,05 25,517,5**

IV группа(п=20) 98,85+13,6 26,518,25**

Примечание: * р<0,05; ** р<0,01 по сравнению с показателями до лечения.

Оценивая иммунологическую эффективность предложенных способов локальной иммунокоррекции на цитокиновый статус, следует отметить более выраженную положительную динамику при сочетанном использовании NO-терапии и миелопида, как у больных с благоприятным (табл. 7), так и неблагоприятным течением раневого процесса. Так, на фоне локальной иммунотерапии у всех больных после лечения наблюдалось улучшение показателей исходно нарушенного локального и системного цитокинового статуса с нормализацией последних у 66,7% пациентов II группы (у 43,8% - с затяжным течением гнойных ран), 61,5% и 70,1% - III и IVrpynn (53,3% и 71,4% - с затяжным течением раневого процесса), соответственно.

Вместе с тем, после курса традиционной терапии уровни ИЛ-lß, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-lRa, ИЛ-10 и ТФР-ßl достоверно изменялись (в зависимости от исходного содержания), однако, значений нормы в раневом экссудате и сыворотке крови достигали лишь у 25% и 35% больных, соответственно. Позитивная динамика уровня цитокинов в РЖ при затяжном течении гнойных ран имела место лишь к 14-16 суткам лечения. У 92% больных было установлено сочетание положительной клинической динамики течения раневого процесса и

улучшения до нормальных значений показателей локального цитокинового статуса.

Как уже отмечалось, развитие гнойных ран сопровождается значительными нарушениями локальной антимикробной защиты поврежденных тканей. В процессе проведения предложенного комплексного лечения у 94,2% больных с типичным течением гнойных ран к 9-12 суткам отмечалось значительное улучшение показателей продукции антимикробных белков и пептидов в целом более выраженное у пациентов второй и четвёртой групп (рис. 14, 15, 17). У больных первой группы положительная динамика регистрировалась только к 14-16 дню в 45% случаев.

При затяжном и хроническом течении гнойных ран более позитивные изменения выявлялись при сочетанном использовании NO-терапии и миело-пида. Так, уровень LL-37 в раневой жидкости у больных I, II, III и IV групп после лечения составил, соответственно, 3,45±0,75 мкг/мл, 2,38±0,35 мкг/мл, 2,27±0,25 мкг/мл и 1,45±0,15 мкг/мл. Снижение концентрации дефенсина а в раневой жидкости регистрировалось к окончанию лечения при затяжном течении процесса у пациентов всех групп: до 1,15±0,02 мкг/мл в I группе, до 0,98±0,01 мкг/мл - во второй, до 0,85±0,02 и 0,26±0,01 мкг/мл в третьей и четвёртой группах, соответственно. Положительная динамика на фоне лечения была характерна и для продукции лактоферрина: повышение в раневой жидкости его уровня до 22,6±5,5 нг/мл, 34,5±6,45 нг/мл, 36,5±6,5 нг/мл и 48,6±5,5 нг/мл у больных I - IV групп, соответственно.

I группа II группа III группа IY группа

31 ffl 2 Q 3 О 4 I

Рис. 14. Динамика уровня дефенсина а в ра- Рис. 15. Динамика уровня 1Х-37 в раневой невой жидкости и плазме крови больных с жидкости и сыворотке крови больных с ти-типичным течением гнойных ран. пичным течением гнойных ран.

Примечание: р<0,01 между показателями больных до и после лечения; р<0,05 -1 и И групп после лечения; здесь и на рис. 16-18: 1 - показатели сыворотки (плазмы) крови до лечения; 2 - после лечения; 3 - показатели РЖ до лечения; 4 - показатели РЖ после лечения.

Аналогичная закономерность наблюдалась в отношении уровня миелопе-роксидазы с повышением его концентрации от исходно сниженной (до 115±25 у.ед.) на 26%, 27,5%, 34% и 54%, в исследуемых группах, соответственно. При этом у больных с типичным течением раневого процесса регистрировалось снижение исходно повышенного уровня миелопероксидазы. Однако, статисти-

чески значимых различий, как в её системной, так и в локальной продукции на фоне различных способов лечения установлено не было.

При затяжном течении гнойных ран в сыворотке крови большинства больных (71%) II - IV групп нормализация уровней АМП наблюдалась к 14-16 суткам, при использовании традиционного лечения - лишь к 20-21 суткам у 36,4% пациентов.

Следует отметить, что на фоне лечения происходило «выравнивание» в раневом экссудате и сыворотке крови концентрации метаболитов оксида азота: снижение исходно повышенных показателей и повышение исходно сниженных (рис. 16). При этом динамика указанных параметров у больных третьей и четвёртой групп была более выражена при исходно сниженных показателях, что, очевидно, связано с введением экзогенного оксида азота в раневой очаг. Нормализации уровня N0 у пациентов, получавших традиционное лечение, зарегистрировано не было.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению матриксных металлопротеиназ как белков тканевого ремоделирования s развитии ряда патологических состояний (Ковальчук JI.B., 2007; Levy М.М., 2005). Однако их роль в регуляции процессов репаративной регенерации тканей изучена недостаточно и остается дискутабельной. Известно, что матрикс металлопротеина-за-3 (ММР-3) катализирует деградацию многих компонентов соединительной ткани, включая протеогликаны, коллаген типов II, IV, IX, XI, Э ламинин и фибронектин, а также оказывает опосредованное действие на деградацию экс-трацеллюлярного матрикса через активациию проколлагеназы-1 (Соболева Г.М., Сухих Г.Т., 2007; Antiopi V., Allison J., 2006; Liew F.Y., Brint E.K., 2005).

а (группа □ II группа и 1Н группа ш Г* группа !

Рис. 16. Динамика уровня N0 в раневой жидкости и сыворотке крови больных с гнойными ранами.

Примечание: А - пациенты с исходно высокими показателями; В - пациенты с исходно низкими показателями; р<0,05 между показателями сыворотки крови до и после лечения, р<0,01- раневой жидкости до и после лечения.

При анализе показателей ММР-3 до лечения в сыворотке крови и РЖ больных (рис. 18) было выявлено повышение ее концентрации (до 28,4±7,8 нг/мл в РЖ и до 16,7±2,5 нг/мл - в сыворотке крови). Вероятно, данные изме-

В 1 □ 2 В 3 Ш 4

нения носят адаптивный характер и направлены на ликвидацию последствий повреждения и стабилизацию репарации. У здоровых лиц уровень ММР-3 составил 0,8±0,5 нг/мл.

I группа II группа III группа IV группа

Рис. 17. Динамика уровня лактоферрина в Рис. 18. Динамика уровня ММР-3 в раневой раневой жидкости и сыворотке крови боль- жидкости и сыворотке крови больных с ти-ных с типичным течением гнойных ран. личным течением гнойных ран.

Примечание: на рис. 17 по левой оси ординат - уровень лактоферрина (нг/мл) в сыворотке крови, по правой - в раневой жидкости; на рис. 17, 18 - р<0,01 между показателями больных до и после лечения.

При этом существенная разница в концентрации ММР-3 в РЖ больных с различными вариантами течения гнойных ран фиксировалось, как правило, между 5-ми и 7-ми сутками, а уровень ММР-3 в раневой жидкости выше 15 нг/мл после 7 дня был характерен лишь для пациентов с затяжным и хроническим течением раневого процесса. Анализ динамики ММР-3 у больных гнойными ранами в процессе лечения показал, что восстановление показателя мат-рикс металлопротеиназы-3 при неосложнённом течении раневого процесса начинается с 5-7 суток и завершается к 10-13 суткам лишь у 52% больных при традиционном лечении гнойных ран.

После применения оптимизированного комплексного лечения значимое снижение концентрации ММР-3 отмечалось уже к 8-9 суткам у больных с типичным течением раневого процесса и не ранее 12-14 дня - при затяжном и хроническом течении. Так, после традиционного лечения флегмонозно-некротической формы рожи и посттравматических ран концентрация ММР-3 ниже 5 нг/мл в сыворотке крови и менее 10 нг/мл в РЖ регистрировались в среднем на 21,5±2,4 день лишь у 21,2% и 15,2% больных, соответственно. Тогда как в группах сравнения показатели ММР-3 на фоне лечения изменялись статистически более значимо уже на 10-11 сутки, а в концентрациях ниже 5 нг/мл, как в раневой жидкости, так и в сыворотке крови после лечения (на 1719 сутки) определялись у 63,3% пациентов II - IV групп.

Полученные результаты позволили нам рассматривать показатель ММР-3 более 15 нг/мл в качестве одного из важных критериев развития затяжного и хронического течения раневого процесса при гнойных ранах. Как показали ре-

зультаты, комбинация из трёх и более приведенных лабораторных показателей (табл. 8) с высокой долей вероятности (92,6%) свидетельствовала о развитии у больных затяжного и/или хронического течения гнойной раны.

Таблица 8.

Показатели прогноза затяжного и/или хронического течения раневой инфекции

у больных гнойными ранами различного генеза.

№п/п Показатель Значения показателя

1. Кателицидин LL-37 < 0,5 мкг/мл или >10 мкг/мл

2. а дефенсин > 1,5 мкг/мл

3. N0 < 1 мкмоль/л

4. TLR2+ клетки <40%

5. ММР-3 >15 нг/мл

Оценка исходного состояния системного иммунитета показала наличие у 77,8% больных гнойными ранами после вскрытия абсцессов и флегмон мягких тканей признаков иммунной дисфункции. При этом выявлено достоверное снижение числа CD4 (29,9±1,6%), CD8 (17,1+1,2%), CD19 (9,1 ±1,2%) - позитивных клеток, а также нарушение функциональной активности Т- лимфоцитов в виде снижения экспрессии ранних (CD25 - до 2,6±0,3%; CD71 - до 24,9±1,1%) и поздних (HLA-DR - до 20,9±1,15%) индуцибельных маркеров. При этом у больных, раневой процесс которых характеризовался неблагоприятным течением, было отмечено более выраженное снижение содержания CD4+ и CD25+ субпопуляций на 42% и 38% от вышеприведенных данных. В целом признаки иммунной дисфункции, по экспрессии иммунорегуляторных молекул, у данной категории пациентов регистрировались в 88,5% случаев. Кроме того, иммунные нарушения у 68,3% больных с благоприятным течением раневой инфекции проявлялись повышением фагоцитарной активности (ФА) МНФ крови (до 88,7+1,7%), гиперэкспрессией CD95 рецепторов, отражающих процесс негативной активации клеток. Снижение ФА (до 30,5±1,5%) было выявлено у 22% пациентов лишь с неблагоприятным течением раневой инфекции. При этом следует отметить, что разброс данных системного иммунитета при послеоперационных ранах был достаточно широк, поскольку чаще всего они являются следствием какого-либо заболевания, требующего хирургического лечения, в связи с чем наибольшую значимость имело определение показателей локального иммунного статуса.

На фоне лечения у больных всех групп наблюдалось достоверное повышение числа лимфоцитов, экспрессирующих стабильные (CD4+, CD8+) и ак-тивационные маркеры (CD25+, CD71+, HLA-DR+). При благоприятном течении раневого процесса регулирующее влияние NO-терапии и её сочетанного использования с миелопидом было более выраженным и имело место у всех больных (более чем у 90% - II и III групп, соответственно). При затяжном течении гнойных ран восстановление показателей Т-системы иммунитета регистрировалось к окончанию лечения в 68,8% случаев при использовании мие-лопида, в 73,3% - NO-терапии и в 85,7% - при сочетанном применении миело-пида и экзогенного оксида азота. В контрольной группе изменения показате-

лей Т- звена иммунитета были менее выражены, а полная нормализация числа СБ25+, СР71 +, С095+, НЬА-Б11+ - клеток наблюдалось у 59% больных с типичным течением раневой инфекции и лишь у 45,5% - с затяжными и хроническими гнойными ранами. Аналогичная закономерность отмечалась и в отношении ФА МНФ периферической крови, восстановление которой (снижение показателей до 57,8±7,8%) регистрировалось к 9-10 суткам у всех больных Н-1У групп при благоприятном течении гнойных ран и только у 67% I группы. При осложнённом течении раневого процесса нормализация исходно сниженной ФА (повышение до 51,7+4,2%) имела место лишь при местном применении сочетания миелопида и экзогенного N0.

Кроме того, у больных с типичным течением раневого процесса отмечалось снижение на фоне лечения исходно повышенного числа СБ95+ и СЭ282+ клеток. При неблагоприятном течении гнойных ран восстановление числа С095+ клеток периферической крови наблюдалось у всех больных четвёртой группы и у большинства пациентов второй (68,8%) и третьей (80%) групп. Следует отметить, что уменьшение числа МНФ, экспрессирующих ТЬЯ2-рецепторы, в среднем с 70,5±7,4% до 48,3±3,5% регистрировалось у всех пациентов с затяжным течением гнойных ран при их исходном повышении, однако достоверных различий по группам установлено не было.

Достоверная положительная динамика после предложенного лечения отмечалась также в отношении В-лимфоцитов (СБ 19+ клеток) и сочеталась с восстановлением исходно нарушенной продукции которая регистрировалась на протяжении всего раневого процесса у больных постгравматическими ранами (повышение от +53% до +78%) и при флегмонозно-некротической форме рожи (снижение на 44% - 52%). При этом значительных различий по сравнению с традиционным лечением установлено не было. На фоне лечения происходило восстановление в РЖ концентрации (повышенной до 1,15±0,33 г/л при типичном течении ран, сниженной до «следовых» значений - при неблагоприятном). Указанная динамика была более значима на фоне комбинированного лечения препаратом миелопид и N0 (восстановление уровня в I группе до 0,7±0,03 г/л; во II - до 0,55±0,05 г/л; в III и IV группах до 0^510,09 и 0,45±0,05 г/л, соответственно; р< 0,05).

Полученные данные показали выраженное положительное влияние локального применения препарата миелопид, МО-терапии, а также их комбинации на восстановление иммунологической реактивности больных с гнойными ранами, приводящее к значительному улучшению, а в ряде случаев к нормализации показателей иммунитета. При этом достоверно лучший клинический эффект, подтверждённый лабораторными данными, был получен при сочетанном применении препарата миелопид и МО-терапии: восстановлению показателей локального и системного иммунитета на 9-12 день при типичном и на 14-16 сутки - при затяжном течении гнойных ран.

Таким образом, анализ результатов проведенных исследований позволяет сделать заключение о перспективности применения в программах хирургиче-

ского лечения гнойных ран локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии.

ВЫВОДЫ

1. Развитие гнойных ран сопровождается значительными нарушениями компонентов врождённого противоинфекционного иммунитета: дисбалансом продукции антимикробных пептидов (LL-37, дефенсина а 1-3, лактоферрина, миелопероксидазы, гепсидина) и экспрессии TLR2 фагоцитами крови и раневой жидкости.

2. Критериями неблагоприятного течения гнойных ран являются значительное повышение или снижение в раневой жидкости уровня кателицидина LL-37, повышение концентрации дефенсина а, матрикс металлопротеиназы-3, снижение числа TOLL2+ клеток и уровня метаболитов оксида азота.

3. Препарат миелопид обладает прямой антибактериальной и антикандидоз-ной активностью и оказывает in vitro иммуномодулирующее влияние на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), воспалительных и противовоспалительных цитокинов, оксида азота и метаболитов кислорода, экспрессию ТОЬЬ2-рецепторов мононукле-арными фагоцитами периферической крови больных с гнойными ранами.

4. Экспериментальное исследование на модели гнойных ран у крыс показало, что эффективность локального действия миелопида по срокам заживления ран и снижению бактериальной обсеменённости аналогична антисептику гипо-хлориту натрия, а NO-терапия усиливает бактерицидное действие натрия гипо-хлорита при их сочетанном применении. Наилучшие результаты получены при комбинированном локальном использовании миелопида и NO-терапии, что сопровождалось дополнительным ускорением в 1,5-2 раза санации патологического очага и сроков заживления гнойных ран.

5. Установлена более высокая клиническая эффективность способа локальной иммунокоррекции с сочетанным использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении больных с гнойными ранами в сравнении с традиционным лечением, местным применением NO-содержащего газового потока, препарата миелопид.

6. Комбинированное локальное применение в комплексном лечении гнойных ран препарата миелопид и NO-содержащего газового потока ускоряет купирование воспалительного процесса в тканях раны, сроки заживления и деконта-минации, уменьшает время подготовки ран к хирургическому закрытию (на 2,3-3,2 дня при типичном и на 5,4-6,3 - при затяжном и хроническом течении), что позволяет сократить на 3-4 дня (на 5-6 дней при затяжном и хроническом течении) продолжительность и на 24,4% стоимость стационарного лечения.

7. Применение в комплексном лечении гнойных ран комбинации локальной иммунокоррекции препаратом миелопид и NO-терапии, по сравнению с другими предложенными вариантами лечения, приводит у большинства больных на 9-12 сутки (на 14-16 сутки при затяжных и хронических гнойных ранах) к восстановлению в периферической крови числа CD4+, CD8+, CD 19+, CD25+, HLA-DR+, CD71+, CD95+, С0282+клеток, улучшению показателей системно-

го и локального днтокинового статуса, уровня оксида азота, антимикробных пептидов, ^ в (в раневой жидкости), матриксной металлопротеиназы-3, а также функциональной активности мононуклеарных фагоцитов крови и раневой жидкости.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выбора тактики лечения и дифференцированного применения способов локальной иммунокоррекции у больных с гнойными ранами рекомендуется использовать разработанную шкалу балльной оценки и прогностические маркёры высокого риска развития затяжного и хронического течения раневой инфекции.

2. С целью ускорения купирования воспалительного процесса в очаге поражения и сокращения сроков заживления при лечении гнойных ран (размерами до 50 см2), как в первую, так и во вторую фазу раневого процесса, рекомендуется использовать локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид (3000 мкг/мл) с первого дня лечения 1 раз в сутки до полной эпителизации раневой поверхности.

3. Оптимальным вариантом локальной иммунокоррекции в комплексном лечении гнойных ран (как при типичном, так и при неблагоприятном течении) является разработанная комбинация местного использования миелопида и N0-терапии, которую проводят с первого дня лечения 1 раз в день, во время перевязки. Сочетанное воздействие целесообразно прекратить после хирургического закрытия раневого дефекта или заживления раны.

4. Методика локальной иммунокоррекции с сочетанным использованием миелопида и МО-терапии должна включать воздействие на раневую поверхность (в первую и вторую фазы раневого процесса) воздушно-плазменным потоком, содержащим оксид азота, генерируемым с помощью аппарата «Плазон» (длительность воздействия на одну зону размером 1x1 см составляет 8-9 секунд с расстояния 20-25 см от выхода плазмотрона, общее время соответствует площади раны) и местное применение раствора миелопида (3000 мкг/мл).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Халилов, М.А. Гнойная рана: особенности течения в зависимости от генеза: пособие для врачей / М.А. Халилов. - Орёл, 2001. - 44 С.

2. Халилов, М.А. Оценка антибиотикотерапии в комплексном лечении больных с гнойными заболеваниями / М.А. Халилов, А.С. Муковников, Л.Н. Долинская // Материалы науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы научно-практической медицины». - Орёл, 2002. - С. 300-303.

3. Новые подходы к комплексному лечению больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей / И.А. Снимщикова, А.И. Медведев, М.А. Халилов и др. // Материалы II Рос. конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». -М., 2003. - С. 516-517.

4. Эффективность локальной иммунокоррекции в сочетании с ультразвуковой кавитацией при гнойно-воспалительных заболеваниях / И.А. Снимщико-

ва, А.И. Медведев, М.А. Халилов и др. // Тезисы V Рос. конф. «Современные проблемы антимикробной химиотерапии». - М., 2003. - С. 64.

5. Снимщикова, И.А. Некоторые аспекты локальной иммунокоррекции при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, А.И. Медведев // Вклад земляков - орловцев в развитие и становление российской науки, культуры и образования: Материалы науч. конф. -Орёл, 2003. - С. 66-67.

6. Комплексный метод лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей. / И.А. Снимщикова, В.И. Круглый, М.А. Халилов и др. // Материалы 68-й межвузовской науч. конф. - Курск, 2003. часть 1. - С. 59.

7. Халилов, М.А. Локальная иммунокоррекция в лечении экспериментальных гнойных ран / М.А. Халилов, И.А. Снимщикова // Актуальные вопросы медицины и образования. Учёные записки, том 3. - Орёл, 2004. - С. 16-21.

8. Халилов, М.А. Некоторые вопросы профилактики и лечения гнойных осложнений в амбулаторной хирургии / М.А. Халилов, В.Д. Затолокин, М.С. Новиков // Материалы VI Всерос. науч. форума «Хирургия - 2005». - М. 2005. -С. 54.

9. Халилов, М.А. Экспериментальное обоснование топического применения иммунорегуляторных пептидов при гнойно-воспалительных процессах / М.А. Халилов, И.А. Снимщикова, И.А. Молдованов // Сб. статей, посвященный 85-летию Орловской городской больницы скорой медицинской помощи им. Н.А.Семашко. - Орёл, 2006. - С. 198-202.

10. Затолокин, В.Д. Воздействие оксида азота и локальной цитокинотера-пии в лечении раневых осложнений экспериментального перитонита / В.Д. Затолокин, М.А. Халилов, С.И. Долгов // Актуальные вопросы хирургии. Сб. на-уч.-практ. работ, посвященный 90-летию кафедры общей хирургии РостГМУ. -Ростов-на-Дону, 2006. - С. 186-187.

11. Новые подходы к локальному применению препаратов иммунорегуляторных пептидов / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, Е.И. Лялюхина и др. // Russian Journal of Immunologi. - 2006. - V.9, S.3. - С. 152.

12. Халилов, М.А. Использование миелопида в локальной иммунокоррекции экспериментальных гнойных ран / М.А. Халилов // Материалы VII международной науч.-практ. конф. «Здоровье и образование в XXI веке. - М., 23-25 ноября 2006 г. - С. 528-529.

13. Новые подходы к локальному применению препаратов иммунорегуляторных пептидов в педиатрической практике / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, Е.И. Лялюхина и др. II Медицинская иммунология. - 2006. -Т. 8, № 2-3. - С. 464.

14. Халилов, М.А. Экзогенный оксид азота в комплексном лечении гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей / М.А. Халилов, А.С. Мошкин // Вестник развития науки и образования. - 2007. - №1. - С. 20-21.

15. Халилов, М.А. Обоснование эффективности и сроков воздействия экзогенного оксида азота в лечении гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей / М.А. Халилов, А.С. Мошкин // Научная жизнь. - 2007. - №1. - С. 22-23.

16. Халнлов, М.А. Влияние внутрнбольничной инфекции на динамику гнойного процесса при использовании NO-терапии / М.А. Халилов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - №4. -С. 112.

17. Халилов, М.А. Иммунологические и микробиологические изменения в гнойно-воспалительных ранах при локальном воздействии миелопида / М.А. Халилов // Сб. материалов VI Всерос. университетской науч.-практ. конф. молодых учёных по медицине. - Тула, 2007. - С. 251-252.

18. Халилов, М.А. Эффективность топической терапии при инфекционно-воспалительных процессах / М.А. Халилов, И.А. Снимщикова, И.А. Молдова-нов // Сб. материалов VI Всерос. университетской науч.-практ. конф. молодых учёных по медицине. - Тула, 2007. - С. 252-253.

19. Халилов, М.А. Локальное воздействие иммунорегуляторных пептидов в лечении гнойных ран / М.А. Халилов // Материалы IV Всерос. конф. общих хирургов РФ с международным участием и Пленума проблемной комиссии «Инфекция в хирургии». - М.-Ярославль, 2007. - С. 207-209.

20. Затолокин, В.Д. Некоторые аспекты заживления гнойных ран в эксперименте / В.Д. Затолокин, М.А. Халилов, А.С. Мошкин // Материалы IV Всерос. конф. общих хирургов РФ с международным участием и Пленума проблемной комиссии «Инфекция в хирургии». - Ярославль, 2007. - С. 115-116.

21. Экспериментальное обоснование применения иммунорегуляторных пептидов при гнойно-воспалительных процессах / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, И.А. Шманева и др. // Материалы IV Всерос. конф. общих хирургов РФ с международным участием и Пленума проблемной комиссии «Инфекция в хирургии». - М.-Ярославль, 2007.-С. 185-188.

22. Возможности и перспективы локального применения препаратов иммунорегуляторных пептидов / И.А. Снимщикова, B.C. Анцупова, М.А. Халилов и др. // Материалы межрегиональной конф., посвящённой юбилею Орловского областного родильного дома. - Орёл, 2007. - С. 286-289.

23. Эффективность локальной иммунокоррекции в комплексном лечении спаечных процессов органов малого таза / И.А. Снимщикова, B.C. Анцупова, М.А. Халилов и др. // Russian Journal of Immunologi. - 2007. - V.9, S.4. - С. 63-70.

24. Экспериментальное обоснование применения препарата миелопид при иммунодефицитах / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, В.В. Красников и др. // Russian Journal of Immunologi. - 2007. - V.9, S.4. - С. 149-150.

25. Экспериментально - морфологическое обоснование применения различных лекарственных форм миелопида при бактериальных инфекциях / М.А. Халилов, В.В. Красников, О.В. Ильина, и др. // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, JV» 2-3. - С. 169.

26. Перспективные направления лечения инфекционно-воспалительных процессов кожи и слизистых / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, И.А. Молдоваиов и др. // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, JVa 2-3. - С. 355.

27. Халилов, М.А. Применение различных лекарственных форм миелопида при бактериальных инфекциях / М.А. Халилов, В.В. Красников, И.А. Мол-

дованов // Сб. науч.-практ. статей по санитарно-эпидемиологическим вопросам. - Орёл, 2007. - С. 382-384.

28. Участие эндогенных антимикробных пептидов в регуляции ин-фекционно-воспалительных процессов / И.А. Снимщикова, И.А. Шманева, М.А. Халилов и др. // Вестник Российского Государственного медицинского университета. - 2008. - №4 (63). - С. 50.

29. Перспективы топической иммунокоррекции при кандидозных поражениях кожи и слизистых / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, B.C. Анцупова и др. // Вестник Российского Государственного медицинского университета. - 2008. - №4 (63). - С. 50.

30. Современные подходы к диагностике и лечению гнойно-воспалительных заболеваний и раневой инфекции / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, А.И. Медведев и др. // Вестник Российского Государственного медицинского университета. - 2008. - №4 (63). - С. 95-98.

31. Роль эндогенных антимикробных пептидов в регуляции воспалительных процессов / И.А. Снимщикова, И.А. Шманева, М.А. Халилов и др. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11), №2-3. - С. 187.

32. Халилов, М.А. Опыт применения программного метода анализа ран в эксперименте / М.А. Халилов, A.C. Мошкин // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия. - Вып. 8,2008. - С. 290-291.

33. Затолокин, В.Д. Водные дисперсии оксидных наноструктур металлов при местном лечении раневых процессов / В.Д. Затолокин, М.А. Халилов, A.C. Мошкин // Учёные записки Орловского Государственного Университета. -2008. - №4. - С. 50-54.

34. Халилов, М.А. Клинические и экспериментальные аспекты локальной иммунокоррекции в лечении гнойных ран / М.А. Халилов // Актуальные вопросы хирургии: материалы науч.-практ. конф. хирургов ЦФО РФ. - Орёл, 2009. -С. 193-194.

35. Течение раневого процесса при воздействии оксида азота / В.Д. Затолокин, М.А. Халилов, В.Ф. Мурадян и др. // Актуальные вопросы хирургии: материалы науч.-практ. конф. хирургов ЦФО РФ. - Орёл, 2009. - С. 62-63.

36. Новая методика в лечении хирургической инфекции / В.Д. Затолокин, М.А. Халилов, В.Ф. Мурадян и др. // Актуальные вопросы хирургии: материалы науч.-практ. конф. хирургов ЦФО РФ. - Орёл, 2009. - С. 64-65.

37. Товаченков, В.И. Хирургическая тактика при гнойно-некротических поражениях стоп у больных сахарным диабетом / В.И. Товаченков, М.А. Халилов // Актуальные вопросы хирургии: материалы науч.-практ. конф. хирургов ЦФО РФ. - Орёл, 2009. - С. 188-189.

38. Халилов, М.А. Эффективность использования экзогенного оксида азота в лечении раневой инфекции / М.А. Халилов, Д.Б. Марков // Материалы науч.-практ. работ, посвященных 40-летию городской больницы им. С.П. Боткина». -Орёл, 2009. - С. 188-192.

39. Халилов, М.А. Вопросы оптимизации местного лечения гнойных ран / М.А. Халилов // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2009. - №3. - С. 31-37.

40. Халилов, М.А. Использование топической иммунокоррекции в лечении гнойных ран / М.А. Халилов // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. XVI, №4. - С. 165-168.

41. Халилов, М.А. Роль факторов врождённого иммунитета в патогенезе и диагностике воспалительных заболеваний кожи / М.А. Халилов, И.А. Снимщикова, Е.И. Лялюхина // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. XVI, №4. - С. 174-176.

42. Халилов, М.А. Коррекция нарушений иммунного статуса в лечении гнойных ран: пособие для врачей / М.А. Халилов. - Орёл: ГОУ ВПО ОГУ, 2009. - 68 С.

43. Халилов, М.А. Лечение и профилактика иммунных нарушений осложнённого раневого процесса: методические рекомендации для врачей - хирургов / М.А. Халилов. - Орёл: ГОУ ВПО ОГУ, 2009. - 32 С.

44. Снимщикова, И.А. Теория и практика иммунокоррекции при гнойно -воспалительных процессах мягких тканей: монография / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов. - Орёл: ГОУ ВПО ОГУ, 2009. - 108 С.

45. Нарушение баланса цитокинов при ранах и раневой инфекции / М.А. Халилов, И.А. Снимщикова, Е.В. Митяева и др. // Российский аллер-гологический журнал. - 2010. - №1, вып. 1. - С. 184-185.

46. Лечение экспериментальных гнойных ран с использованием топической иммунокоррекции / М.А. Халилов, И.А. Снимщикова, A.B. Молчанова и др. // Российский аллергологический журнал. - 2010. - №1, вып. 1. -С. 185-186.

47. Халилов, М.А. Изучение иммунного статуса больных гнойными ранами на фоне локальной иммунокоррекции / М.А. Халилов, И.А. Снимщикова // Вестник новых медицинских технологий. - 2010. - Т. XVII, №1. -С. 101-104.

48. Халилов, М.А. Опыт использования локальной иммунокоррекции в лечении гнойных ран / М.А. Халилов, И.А. Снимщикова // Медицинская иммунология. - 2010. - Т. 12, №3. - С. 227-234.

49. Характеристика течения раневого процесса при воздействии экзогенного оксида азота / В.Д. Затолокин, М.А. Халилов, В.Ф. Мурадян и др. // Актуальные вопросы хирургии: материалы науч.-практ. конф. хирургов ЦФО РФ. -Белгород, 2010. - С. 63-64.

50. Снимщикова, И.А. Сравнительная характеристика способов топической иммунокоррекции в комплексном лечении гнойных ран / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов // Учёные записки Орловского Государственного Университета. - 2010. - №2(36). - С. 201-207.

51. Халилов, М.А. Особенности течения гнойной раны в условиях локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и оксида азота / М.А. Халилов // Учёные записки Орловского Государственного Университета. - 2010. - №2 (36). - С. 217-222.

Изобретения

1. Патент 2326678 РФ, МПК А61К 33/08, 35/28, 9/06, А61Р 17/02. Способ лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей / Халилов М.А.,

Снимщикова И.А., Лялюхина Е.И. - № 2006141806/14; заявл. 28.11.06; опубл. 20.06.08, Бюл. № 17.-4 с.

2. Патент 2333765 РФ, МПК А61К 38/08. Средство, обладающее антикан-дидозной активностью / Снимщикова И.А., Халилов М.А., Лялюхина Е.И.. - № 2006141805/15; заявл. 28.11.06: опубл. 20.09.08, Бюл. № 26. - 3 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМП Антимикробные пептиды

АФК Активные формы кислорода

ИЛ Интерлейкин

ИЛ-1 Яа Рецепторный антагонист ИЛ-1

ИФА Иммуноферментный анализ

ЛФ Лактоферрин

ММР-3 Металлопротеиназа-3

МНС Главный комплекс гистосовместимости

МНФ Мононуклеарные фагоциты

НСТ Нитросиний тетразолий

ПОА Пероксидазная активность

РЖ Раневая жидкость

РЭ Раневой экссудат

ТФР Трансформирующий фактор роста

ФГА Фитогемагглютинин

ФНО Фактор некроза опухолей

СР Кластер дифференцировки

НЬА Человеческий лейкоцитарный антиген

НИР 1-3 Дефенсин а (1-3) Иммуноглобулин ЬЬ37( ЬСАР18) Кателицидин ЬЬЗ 7

N0 Оксид азота

ТЬ Т-хелперы

ТЬЛ Толл-лайк рецепторы

Сдано в набор 08.11.2010 г. Подписано в печать 09.11.2010 г. Формат 60х84'/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 502 Полиграфический центр ИП Киселёв 302026, г. Орел, ул. Московская, 65.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Гнойно-воспалительные заболевания различной локализации до настоящего времени остаются одной из актуальных проблем современной медицины, что обусловлено их распространённостью, тенденцией к хроническому течению, недостаточной эффективностью традиционных методов лечения [8, 57, 58, 257, 272, 333, 424].

В общей структуре хирургических заболеваний хирургическая инфекция наблюдается у 35-45% больных и протекает наиболее часто в виде раневой инфекции. Наряду с этим, около 30% летальных исходов после хирургических вмешательств связано-с гнойными осложнениями [56, 206, 207, 244, 322, 462]. Эти данные свидетельствуют об актуальности и нерешённости проблемы хирургической инфекции, приобретающей все большую социально-экономическую значимость.

Результаты лечения гнойных ран и раневой инфекции, несмотря на применение современных методов и достигнутые определённые успехи, не удовлетворяют полностью хирургов- [47, 48, 134, 233, 256, 257, 333, 446, 461]. Длительное лечение, значительные материальные затраты, частые, осложнения, косметические изъяны - всё это требует изыскания новых путей, совершенствования уже имеющихся способов терапии данной группы больных. И если тактика хирургического лечения гнойных ран в настоящее время определена, то ряд факторов дополнительного воздействия на раневую поверхность постоянно развивается и совершенствуется.

Сложный патогенез раневого процесса обуславливает необходимость комплексного воздействия на различные его фазы. Так как раневая инфекция является одной из основных причин неудовлетворительных исходов ведения открытых повреждений мягких тканей, актуальность оптимизации местной терапии гнойных ран не вызывает сомнений.

В последние годы все большее внимание клиницистов привлекают перспективы использования при лечении воспалительных процессов оксида азота. В эксперименте и клинике доказан ранозаживляющий эффект при обработке гнойных ран охлаждённым газовым потоком, содержащим оксид азота, что заложило основы нового направления в медицине - 1чЮ-терапии ран и-раневой инфекции [68, 93, 94■ 140, 271, 273, 274]. Вместе с тем' недостаточно изучено влияние экзогенного оксида азота на параметры системного и локального противоинфекционного иммунитета, дисбаланс которых при раневой инфекции ограничивает возможности иммунной системы в своевременном распознавании и уничтожении микробных возбудителей, а также способствует хронизации раневого процесса.

Изучению роли нарушений иммунного ответа при гнойных ранах посвящены многочисленные исследования [36, 43, 86, 106, 108, 110, 220, 253, 317, 326, 354, 355, 356, 469]. Однако закономерности дисрегуляции компонентов врождённого иммунитета при раневой инфекции изучены недостаточно и являются дискутабельными, а. механизмы формирования иммунодефицита при данной патологии нуждаются в уточнении. До настоящего времени не определены диагностические и прогностические иммунологические критерии неблагоприятного течения гнойных ран, нет единого мнения о значимости- показателей локального иммунитета при проведении местного лечения.

Поскольку гнойно-воспалительные заболевания сопровождаются нарушением факторов иммунной защиты, то одним из адекватных способов комплексного- лечения представляется иммунотерапия препаратами системного и; локального: действия. Работами ряда авторов-показано, что местная иммунокоррекция препаратами иммунорегуляторных пептидов при гнойных заболеваниях мягких тканей и раневой инфекции, способствует снижению продолжительности лечения и частоты рецидивов [213, 275,.311, 317, 341]. В литературе встречаются единичные данные о совместном использовании иммуномодуляторов и ИО-терапии [144], однако недостаточно сведений о патогенетическом обосновании их дифференцированного назначения в конкретной клинической ситуации, не изучены эффекты их взаимного влияния при сочетанном применении.

В связи с этим приобретает актуальность оптимизация лечения гнойных ран и раневой инфекции с включением в программы комплексного ведения больных способов локальной иммунокоррекции с использованием препаратов иммунорегуляторных пептидов и NO-терапии, а также необходимость дальнейшего изучения механизмов их противовоспалительной активности, расширения показаний к назначению и разработки оптимальных схем лечения.

ЦЕЛЬЮ настоящего исследования является повышение эффективности лечения больных с гнойными ранами путём разработки и применения способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести комплексное клинико-иммунологическое обследование больных с гнойными ранами различной этиологии и локализации для выявления маркёров высокого риска реализации затяжного и хронического течения раневой инфекции.

2. Изучить in vitro антимикробную активность препарата миелопид и его влияние на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), воспалительных и противовоспалительных цитокинов, оксида азота и метаболитов кислорода, экспрессию Т01Х2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных с гнойными ранами.

3. Сравнить динамику и особенности заживления экспериментальной гнойной раны при различных вариантах использования NO-терапии и миелопида.

4. Разработать способы локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении больных с гнойными ранами и оценить их клиническую эффективность в сравнении с традиционным лечением.

5. Исследовать влияние вариантов местного' применения препарата миелопид, NO-терапии и их комбинации на динамику показателей локального и системного иммунного статуса больных с гнойными ранами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Получены данные об изменении при гнойных ранах продукции антимикробных белков и пептидов (кателицидина LL-37, а-дефенсина, лактоферрина, миелопероксидазы, гепсидина), экспрессии ТОЬЬ2-рецепторов фагоцитарными клетками, которые расширяют представления о роли дисфункции компонентов врождённого иммунитета в патогенезе раневого процесса.

Впервые установлена диагностическая и прогностическая значимость комплексной оценки в раневой жидкости при гнойных ранах уровней кателицидина LL-37, а-дефенсина, метаболитов N0, матрикс металлопротеиназы - 3 и числа TOLL2+ клеток.

Впервые установлена прямая антибактериальная активность препарата миелопид в отношении' Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans (Патент № 2333765).

Установлено in vitro иммуномодулирующее влияние препарата миелопид на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), воспалительных и противовоспалительных цитокинов, метаболитов кислорода5 и оксида азота, экспрессию Т01Х2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных гнойными ранами.

Впервые проведена сравнительная оценка изменений патоморфологических показателей и раневой микрофлоры при заживлении экспериментальной гнойной раны в условиях местного использования вариантов NO-терапии и препарата миелопид.

Впервые разработаны и внедрены в клиническую практику способы локальной иммунокоррекции при гнойных ранах с использованием препарата миелопид и NO-терапии-в сочетании с миелопидом (Патент № 2326678), проведена оценка их эффективности в сравнении с традиционным лечением и местным применением NO-содержащего газового потока.

Выявлено положительное влияние способов локальной иммунокоррекции с использованием миелопида и NO-терапии на динамику показателей врождённого и адаптивного иммунитета больных с гнойными ранами и раневой инфекцией.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В результате проведенных исследований экспериментально обосновано локальное применение препарата миелопид и NO-терапии в сочетании с миелопидом в комплексном лечении гнойных ран.

Полученные данные об антибактериальной активности препарата миелопид обосновывают возможность его локального использования при гнойных ранах и раневой инфекции, вызванных S. aureus, S. pyogenes, Е. coli, P. vulgaris, К. pneumoniae, С. albicans.

Разработаны критерии балльной оценки тяжести течения гнойных ран с учетом клинико-иммунологических показателей и определены маркёры высокого риска реализации затяжного и хронического течения раневой инфекции.

По результатам сравнительной оценки клинической эффективности местного лечения больных с гнойными ранами установлено, что сочетанное применение локальной иммунокоррекции с использованием препарата миелопид и NO-терапии позволяет более быстро купировать воспалительный процесс в тканях раны, ускорить заживление и деконтаминацию, сократить время подготовки ран к хирургическому закрытию, сроки и стоимость лечения.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Одним из факторов развития иммунной дисфункции у больных с гнойными ранами является дисбаланс компонентов антиинфекционного иммунитета (продукции антимикробных пептидов кателицидина LL-37, дефенсина а 1-3, лактоферрина, миелопероксидазы, гепсидина и экспрессии Т01Х2-рецепторов фагоцитарными клетками). Маркёрами неблагоприятного течения гнойных ран являются значительное повышение или снижение в раневой жидкости уровня кателицидина LL-37, повышение концентрации дефенсина а, матрикс металлопротеиназы-3, снижение числа TOLL2+ клеток и уровня метаболитов оксида азота.

2. Препарат миелопид обладает противомикробной активностью и оказывает in vitro иммуномодулирующее влияние на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), метаболитов кислорода и оксида азота, воспалительных и противовоспалительных цитокинов, экспрессию ТОЬЬ2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической^крови больных с гнойными ранами.

3. Комбинированное использование при экспериментальных гнойных ранах миелопида и NO-терапии сопровождается более быстрой санацией патологического очага и укорочением сроков заживления, по сравнению с изолированным применением миелопида, антисептика гипохлорита натрия и его сочетания с NO-содержащим газовым потоком.

4. Использование в комплексном лечении гнойных ран локальной иммунокоррекции препаратом миелопид и, особенно, NO-терапии в сочетании с миелопидом, ускоряет купирование воспалительного процесса, сроки заживления и деконтаминации, сокращает продолжительность стационарного лечения.

5. Локальное применение препарата миелопид, NO-терапии, а также их сочетания- у больных гнойными ранами приводит к восстановлению исходно нарушенных показателей иммунного статуса.

ВНЕДРЕНИЯ. Способы локальной иммунокоррекции препаратом миелопид, NO-терапии в сочетании с миелопидом; способ определения динамики поверхностных раневых процессов внедрены в практику работы ОГУЗ «Орловская областная клиническая больница», МЛПУЗ «Больница скорой медицинской помощи им. Н.А. Семашко» г. Орла, МЛПУЗ «Больница им. С.П. Боткина» г. Орла, ОГУЗ «Белгородская областная клиническая больница», ГУП НИИ Новых медицинских технологий Тульской области, Тульского отделения академии медико-технических наук РФ. Полученные результаты используются в учебном процессе кафедр иммунологии и специализированных клинических дисциплин; общей хирургии и анестезиологии; анатомии человека, оперативной хирургии с курсом факультетской хирургии медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Связь с планом НИР.

Работа проведена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» (номер госрегистрации комплексной темы 14.00.03).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы представлены, доложены и обсуждены на II Российской научно-практической конференции- «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орёл, 2001), Межрегиональной конференции и организационном съезде хирургов «Лечение ран и раневой инфекции (Ярославль, 2003), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы педиатрии и иммунологии» (Санкт-Петербург, 2005), VI Всероссийском научном форуме «Хирургия-2005» (Москва, 2005), Всероссийской конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), VIII и IX Всероссийских научных Форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2006, 2007), VI Российском конгрессе

Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2007), IV Всероссийской конференции общих хирургов с международным участием и Пленуме проблемной комиссии «Инфекция в хирургии» (Ярославль. 2007), I Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орёл, 2008), научно-практической конференции хирургов ЦФО РФ, (Орёл, 2009, Белгород, 2010), Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (Москва, 2010), совместном заседании кафедр иммунологии и специализированных клинических дисциплин, анатомии человека, оперативной хирургии с курсом факультетской хирургии, внутренних болезней, общей хирургии и анестезиологии, микробиологии и инфекционных болезней МИ ОГУ (Орёл, 2010).

Работа выполнялась при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» по заявке № 551П/41 «Иммунологический мониторинг адаптации человека и его жизнеобеспечения в условиях действия неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов» (2009-2013 гг.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликована 51 научная работа, в. том числе 17 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 монография, 3 пособия для врачей. Получено 2 патента на изобретение.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация «изложена на 257 страницах машинописного текста; иллюстрирована 37 рисунками, 30 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 493 источника, в том числе 277 отечественных и 216 зарубежных авторов.

202 ВЫВОДЫ

1. Развитие гнойных ран сопровождается значительными нарушениями компонентов врождённого противоинфекционного иммунитета: дисбалансом продукции антимикробных пептидов (LL-37, дефенсина а 1-3, лактоферрина, миелопероксидазы и гепсидина) и экспрессии TLR2 фагоцитами крови и раневой жидкости.

2. Критериями неблагоприятного течения гнойных ран являются значительное повышение или снижение в раневой жидкости уровня кателицидина LL-37, повышение концентрации дефенсина а, матрикс металлопротеиназы-3, снижение числа TOLL2+ клеток и уровня метаболитов оксида азота.

3. Препарат миелопид обладает прямой антибактериальной и антикандидозной активностью и оказывает in vitro иммуномодулирующее. влияние на продукцию антимикробных пептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина, миелопероксидазы), воспалительных и противовоспалительных цитокинов, оксида азота и метаболитов кислорода, экспрессию Т01Х2-рецепторов мононуклеарными фагоцитами периферической крови больных с гнойными ранами.

4. Экспериментальное исследование на модели гнойных ран у крыс показало, что эффективность локального действия миелопида по срокам заживления ран и снижению бактериальной обсеменённости аналогична антисептику гипохлориту натрия. Наилучшие результаты получены при комбинированном локальном использовании миелопида и NO-терапии, что сопровождалось дополнительным ускорением в 1,5-2 раза санации патологического очага и сроков заживления гнойных ран.

5. Установлена более высокая клиническая эффективность способа локальной иммунокоррекции с сочетанным использованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечении больных с гнойными ранами в сравнении с традиционным лечением, местным применением NO-содержащего газового потока, препарата миелопид.

6. Комбинированное локальное использование в комплексном лечении гнойных ран препарата миелопид и ЫО-содержащего газового потока ускоряет купирование воспалительного процесса в тканях раны, сроки заживления и деконтаминации, уменьшает время подготовки ран к хирургическому закрытию (на 2,3-3,2 дня при типичном и на 5,4-6,3 - при затяжном и хроническом течении), что позволяет сократить на 3-4 дня (на 56 дней при затяжном и хроническом течении) продолжительность и на 24,4% стоимость стационарного лечения.

7. Применение в комплексном лечении гнойных ран комбинации локальной иммунокоррекции препаратом миелопид и МО-терапии, по сравнению с другими предложенными вариантами лечения, приводит у большинства больных на 9-12 сутки (на 14-16 сутки при затяжных и хронических гнойных ранах) к восстановлению в периферической крови числа СБ4+, С08+, СБ 19+, СВ25+, НЬА-ОЫ+, СБ71+, СБ95+, СБ282+клеток, улучшению показателей системного и локального цитокинового статуса, оксида азота, уровня антимикробных пептидов, ^ О, матриксной металлопротеиназы-3, а также функциональной активности мононуклеарных фагоцитов крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выбора тактики лечения и дифференцированного применения способов локальной иммунокоррекции у больных с гнойными ранами рекомендуется использовать разработанную шкалу балльной оценки и-прогностические маркёры высокого риска развития затяжного и хронического течения раневой инфекции.

2. С целью ускорения купирования воспалительного процесса в очаге поражения и сокращения сроков заживления при лечении гнойных ран о размерами до 50 см ), как в первую, так и во вторую фазу раневого процесса, рекомендуется использовать локальную иммунокоррекцию препаратом миелопид (3000 мкг/мл) с первого дня лечения 1 раз в сутки до полной эпителизации раневойповерхности.

3. .Оптимальным вариантом локальной иммунокоррекции в комплексном лечении гнойных ран (как при типичном, так и при неблагоприятном течении) является разработанная комбинация местного использования миелопида и КЮ-терапии, которую проводят с первого дня лечения 1 раз в день, во время перевязки. Сочетанное воздействие целесообразно прекратить после хирургического закрытия раневого дефекта или заживления раны.

4. Методика локальной иммунокоррекции с сочетанным использованием миелопида и ЫО-терапии включает воздействие на раневую поверхность (в первую и вторую фазы раневого процесса) воздушно-плазменным потоком, содержащим оксид азота, генерируемым с помощью аппарата «Плазон» (длительность воздействия на одну зону размером 1x1см составляет 8-9 секунд с расстояния 20-25 см от выхода плазмотрона, общее время соответствует площади раны) и местное применение раствора миелопида (3000 мкг/мл).

205