Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Клинико-генетический и молекулярный анализ миодистрофии Дюшенна в Таджикистане

РГБ ОД 1 5 ДЕК 1996

На правах рукописи

РАХМОНОВ

Рахматулло Азизович

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ МИОДИСТРОФИИ ДЮШЕННА В ТАДЖИКИСТАНЕ

14.00.13 — нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательзком институте профилактической медицины Министерства здравоохранения Республики Таджикистан и Научно-исследовательском институте медицинской генетики Томского научного центра Российской Академии медицинских наук.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук А. А. Ахмедов кандидат биологических наук О. Н. Одинокова

Официальные оппоненты:

Лауреат государственной премии Российской Федерации, доктор медицинских наук( профессор С. А. Лимборская доктор медицинских наук, профессор И. А. Завалишин

Ведущее учреждение — Московская Медицинская Академия им. И. М. Сеченева

Защита состоится « » 1996 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 001.06.01 при Научно-исследовательском институте неврологии Российской Академии медицинских наук по адресу: 123367, Москва) Волоколамское шоссе, 80.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «23» октября 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

С. Н .ИЛЛАРИОШКИН

' Актуальность проблемы, Наследственные болезни составляют существенную долю в общей патологии чело&ека, занимая одно из врущих мест как по многочисленности нозологических форм, так .и 'по многообразию фрнотипических проявлений.

В настоящее время накоплен и систематизирован достаточно обширный материал о распространении наследственных болезней в различных популяциях, проанализированы причины накопления "патологических генов" и факторы популпионной динамики (мутация, миграция. структура браков, изоляция, отбор).

Среди наследственных болезней нервной системы наиболее многочисленную группу состарляют нервно-мышечные заболевания (Emery А.Е.Н.. 19Э1) Одной из наиболее частых и злокачественных Форм нервно-мышечной патологии я&ляется мышечная дистрофия Дюшенна (МДЛ) (Burmelater М. et al., 1987). Заболевание носит отчетливо прогредиентньй характер, приводит к смерти боль пых в пищ? второго - начале третьего десятилетия тщн (Давиденков С.Н., 1934. МаньковскиП Н.В.. 1960 г. Бадалям Л. 0. 1971, 1974). Длительная и тяжегая инвалидизация больных, вынуждающая родственников осуществлять постоянный уход за ними, прлдают этому страданию социальный характер. Для действенной профилактики МДД необходимо знать не только клинико-генетическую характеристику этого тяжелого заболевания, но и популяционно-географические особенности его распространения, а также разработать подхода к наиболее эффективной молекулярной диагностике ВДД.

Цдд)? работы. Изучение клинических проявлений, закономерности распространения.и спектра мутаций гена дистрофкна у больных мж у дистрофией Дюшенна и их родственников в тад-'чкмой популяции.

В конце 80 годов нашего столетия блгодаря значительным успехом молекулярномй генетики был достигнут значительный прогресс е понимании сущности патологического процесса при МДД. Бшю установлено. что о основе болезни лежит дефект гигантского гена, '")-дарующего структурный белок дистрофии, локализующийся на поверхности ме бран мышечных клеток (Hofiam et al. 1987; Ко en Is et. al., 1988). Мутации в гене дистрофина, большинство из которых

составляют деление различной протяженности, приводят к распаду всего дистрофии -гллкопротеинового комплекса и необратимому повреждение мембран ииофибрилл (Eryastl, Campbell, 1991; Wltrovskl, 1998). Указанные открытия позволил^ практически осуществлять сцепления полиморфных генетических маркеров в отягощенных семьях. Было показанс что спектр мутации в гене дистрофика весьма широк (Danlell е" al., 1993: Darras et al. 1988; Davlesetal., 1938; Nitsukletal, 1992; Nalmann-Seyde et al.. 1992; Upadhyaha et fk.,1990), в связи с чем оптимизация ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования требует детального изучения распределения и характера основных типов мутация в различных популяциях

Таким о*оазом, для достлэения цели при проведении исследований поставлены следующие задачи;

- изучить распространенность и клинические проявления МИД в Таджикистане.

- провести мплекулярно-генетический анализ гена дистрсФина у больных с МДД и их ближайших родственников.

- сформулировать основные принципы и подходы к организации помощи семьям с больными ИДИ в Республике Тадасикисган.

Научная новизна исследования. Представлено- первое полное обобщение данных по клиническому полиморфизму миодистрофии Лишений среди населения Таджикистана, имеющего свой исторический путь развития, особенности экологии и традиции в организации социальной c4.jpK жизни. Впервые у вольных МДД данного региона описаны делении гена дистроОина и проведен анализ спектра встречающихся делений в данном регионе. Эта сведения позволяют обосновать принципы диспансеризации сеней с МДД я организации выявления гетерозиготного носительства мутантного гена среди населения- Таджикистана.

Научно-практическая значимость. Дол^. ;ены эпидемологаческие данные по распростр .ценности МДД в Таджикистане, клиническому полиморфизму МДД, что позволило определить оптимальные пути профилактических мероприятий в отношения этой наиболее тяжелой наследственной формы миопатии. Определена диагностическая значимость

* «

исследования отдельных регионов гена дистрофина для диагностик!! МДД в Таджикистане. Осуществленная в работе детекция мутаций з семьях позволила осуществить корректную и точную диагностику в семьях больных с уже детектированными дефектами гена. Полученные результаты создали основу для проведения пренатальной диагностики МДД в отягощенных семьях, и в настоящее время мы уже приступили к этой работе. Республиканский национальный регистр наследственных болезней дополнен новими единицами наблюдения, а у ¡аблюдающихся ранее больных уточнен диагноз с использованием молеку чрно-гене-тических методов.

Основные положения. рыносимые на 'защиту.

1. Значительная распространенность миодистрофии Дюшенна среди других наследственных заболеваний в Таджикистане, высокий ,о~ эФФициент инбридинга в отягощеннгх семьях.

2. Миодистрофии Дюшенна в Таджикской популяции имеет клиш'-.ческие и патогенетические особенности: относительно позднее на«а-ло болезни, ранняя декомпенсация, частое сочетание МДД с врожденными стигмами и аномалиями развития, благоприятное течение у девочек.

3. Спектр делеций гена чистро^ина в популяции Таджикистана имеет свои характерные особенности по сравнению с другими изученными популяциями, что необходимо .учитывать при проведении ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования.

Внедрение результат- мооледования. Материалы исследований используются при чтении лекций л проведении практических занятий для интернов и специализирующихся по неврологии, а также при проведении цикла "Наследственны заболевания нервной системы" для курсантов Таджикского института последипломной подготовки медицинских кадров. Они включены в программу практических занятий и лекций, для студентов IV курса лечебного и педиатрического факультетов субординаторов по неврологии Таджикского государственного "Уилицинского университета им. Абуали ибн Сино. Сведения о наличии в-регионе Оольиьх с НМЗ переданы руководителям лечебных учреждений Е райоьах проведены лекции и беседы, выступления по ради э и 1*лепидеш:ю на темь. "Проблема миодистрс*'"« Дюшечн* в Тад-

жикиотане". "Польза и вред родстпенного брала".

Результаты работы внедрен}' в практическую деятельность 6 неврологических отделений г. Душанбе, областных больниц г.Кур-ган-Тйбе и Куляба, медико-генетического центра, детской консультативное поликлиники РКБ. диагностического цон.ра.

Дгробаш^ работы. Основные положения исследований представ- . лены на: II итоговой конференции НИИ мед. генетики ТНЦ РАМН "Генетике- демографическая характеристика сельской популяции юга Таджикистане (Томск, 1992); IV итоговой конференции НИИ мед. генетик' ТНЦ РАМН "Популяционно-генетичаская характеристика сельской популяции га Таджикистана" (Томск? 1993); 42-ой научной конференция Таджикского гоемедуниверсгГгета им.Абу-али ибн Сино "Изучение генетических факторов в формировании уровня здоровья сельского населения юга Таджикистана" (Душанбе. 1994); научной конференции по проблемам региональной патологии "Генетическое консульта-тирование гена дистрофина" (Душанбе. 1995).

Объем и структура работы,_Работа выполнена на_страницах машинописного текста, состоит из введения, трах глав, заключение. выводов и практических рекомендаций, библиографии, прило-' аекий,' содержит_таблиц и__рисунков.

.. • ' СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ \

зтно-демографическая ситуация ь Республике Таджикистан ' в настоящее время характеризуется стремлением к однонациональным бракам, расширенным воспроизводством населения, возвращением переселенцев на прежнее местожительство, продолжающейся миграцией славянского населения за пределу республики. С генетической точки зрения важно отметить сохранение достаточно высокой доли имбри-диига (кровнородственных браков) в субпопуляциях таджикского на-

- ? -

селения. Следовательно, анализ этно-исторических тенденций.среди таджикского населения позволяет заключить, что настоящее исследование одноА из'форм наследственной патологии, в своей генетической основе, будет с высокой степенью вероятности кас -ься генов идентичных по происхождению. Достаточно большой размер семьи -еще одна из специфических особенкслеП таджикской популяции, нак-ладнвадзющая свой отпечаток на характер проводимого генетического исследования.

В формировании выборки информативных семеЯ с киодистро£ ей Дюшенна для детального исследования использован регистр, составленный на кафедре нервных болезней.Таджикского Государственного медицинского университета им.АОу али ибн Сино и кафедре неришх болезней Таджикского института последипломной подготовки медицинских кадров. В основу настоящего исследования семей с МДД положен метод поэтапного их выявления и обследования (табп. 1)

На первом этапр основным источником информации о наличии семей с МДД служили специализированные неврологические стационары -районные, областные, городские и республиканские, затем экспедиционные поездки в районы респуб'лки, . включая труднодоступные и отдаленные районы республики (Кулябская область). С целью более полного выявления больных с миодистрофией Дюшенна среди населения были привлечены материалы районных, городских и республиканских ВТЭК, архивы клиник города и центральных районных Оочьииц.

Второй этап исследования шшзчал у эчнение кликико-генеало-гических данных в семьях- больных с МДД и окончз ельную верификацию диагноза с использованием дополнительных методов исследования. Для изучения клинического полиморфизма В' обследование Ошг в к» мело ' человек из 127 семей, среди "оторых было выявлено 170 Зольных МДД. Бее больные и члены их семе!? клинически осмотрены мично. На все семьи заполнялась стандартная медицинская каэта. При оостйР.лен1Щ родословных использована общепринятая оиь^опикд (Н. II. Бочков, 1982). Наряду с !-»незлогическ.им анализом в семьях проведено детальное исследование неврологического статуса. Из лабораторных и инструмент;здьных методов исследования использовались: электрешография, электрокардиография, эхокардиографпя.

Таблица 1

Объем материала и его характеристика.__'

Характер обе здовапия (исследования) Общее число оследованных

мужчин женщин всего

Эттде^лологетеекий 1.173.000 1.126.000 2.299.000

Клетгшекий 132' 93 225

Молекулярно— генетический больные в здоровые родствешга ки больных) больные здоровые родствен НИКИ больных) больные здоровые родствен НИКИ больных)

25 34 - 47 25 81

исследование сывороточной активности креатннкиназы (КК). фосфата-зы, определение креатина и креатинина в крови и моче, мочевой кислоты, кальция, фосфора.

Для точной постановки диагноза МИД особое зна.ание ииеет проведение тщательной дифференциальной диагностики с различными фенокопиями, и в первую очередь с "двшенноиодобной" мкодисг^офи-ей, или так называемой "тяжелой аутосомно-рецессивной миодистро-Фией детского возраста" (Ben U'mlda et ai.. 1992). С этой цзлыо особое внимание при диагностике МДД чами уделялось следующим критериям: а) наличию типичной генеалогии, свидетельствующей об Х-сцепленном характере наследования болезни; б) наличию типичной карлиомиопатиг, «реззнчайно характерной для МДД (по данным клинического обследования, ЭКГ, ЭхоКГ, ФКГ); в) наличие у обследуемого лица больных сибсов с подтвержденным дефектом дистрофина.

Молекулярно-генетическне исследования гена МДД бы i проведены у 25 больных и 81 родственников {р&дители и сибсы пробандов) из 23 семей. ДНК-исследования включали делеционный анализ гена дистрофина и анализ ДНК-полиморфных локусов в семьях больных. ДНК-диагностика осуществлялась на«й на базе НИИ медицинской генетики Томского Научного Центра РАМН (директор, член-корр. РАМН профессор Пузырев В.П.) в лаборатории молекулярной генетики совместно с канд. биол.наук 0. Н.Оданоковой. /енетико-эшдемиологичес-кое исследование семей с ИДД проведено на всей reppt: .-ории Таджикистана в соответстгчи с современным административно-территор-/-альннм делением республик^ (А. Кахаров, 1990). Распространение МДД по регионам республики представлено в табл. 2. Всего ло республике было выявлено- 170 больных МДД в 12? семьях или 3,4 на '00 тыс. населения.

Анализ показал, что в семьях, отягощекьых МДД, Ы? составили смешанные браки (таджики и узбеки),а в 89% случаев были осечены браки между супругами одной национальности (66%' - таджики'," li% -узбеки. .1055 - русские, казахи, киргизы, или туркмены).

Указание на кровное родство родителей бкло в 26 семьях из 127. В 9.1 семьях имелось по одному больному реб.лку, в 26 по дзэ больных, в' 8 - трое детей больных МДД и в двух семьях - четверо

Таблица 2

Количество больных МДД различных стадий заболевания в зависимост и от териториальногс распределени

Регионы (области, города) Стадии заболевания

I 1 И! Всего

ГЪАО 2 1 2 5

Кулябская Ю 6 6 44

Курган — Тюбинская - 16 13 -3 * 38

Ленинабадсяая 8 10 5 23

г.Душанбе 13 12 6 31

Районы республиканского подчинение 17 19 13 49

ИТОГО 66 63 41 170

больных. Следует особо отметить, что нами были выявлены 6 случаев ИДЯ у девочек, что по данным литературы предстазляет собой Иск tjo-чнтельную редкость (Emery, АЕН 1993); во всех случаях диагноз МЯД у девочек подтверждался обнаружением у больных сиб ^в мужского пола делеций в гене дистрофина. Клиническая картина миопагии Дю-шенна укладывалась в рамки классических списаний.

Средний возраст начала болезни у обследованных больных составил 6-7 лет. В многодетных семьях было трудно точно установить начало заболевания, так как его "замечали" окружающие лишь ис ле того, как наступала значительная декомпенсация двигательной Функции. Однако при детальном опросе удалось выявить, что большинство (72%) больных детей ходить начали поздно - к трем годе . часто падали, что расценивалось родителями как общая слабость.

Основная масса выявленных нами больных детей - это лица коренной национальности из многодетных сеней, где степень внимания к детям снижена. Возможно, поэтому наши данные отличаются от литературных (Т.А.Дроздина, 1970; Л.Г.Калмыкова, 1976; Н.А.Ильина, 1982), где фиксируется более раннее начало заболевания, "Утиная" походка отмечена у 100% больных ' обусловлена слабостью мьиц тазового пояса. Дета часто спотыкалась, падали и получали переломы - лобной, лучевых костей в типичном месте, малоберцовой кости (8%). иногда повторно, гипертрофия мышг была заметна у 9% детей. В остальных случаях она была "компенсирована" гипррстенической конституцией и хорошо развитой подкога--жировой клетчаткой или ожирением. Проявление гиперлордоза в поясничном отделе выявили у 95% детей. Он сочетался с отвислым животом у 68% больных и "лягушачьим" животом у 13% больных ШЩ. Особенно отчетливо у 87% больны). слабость мышц тазового пояса и бедер прочилась к 6-7 годам. Нами было отмечено, что несмотря на гипотрофию, гипотоник и снижете силы мышц склонность к образованию грыж у детей с МДД минимальная. Из всех больных только у одного отмечена пупочная .рыка. Сила мышц снижалась к 6-7 годам до 3-4 баллов, портфель первоклассника и ступеньки лестницы в школе становились большим препятствием чдя посещения школы. В этом возрасте сча мышц плечевого пояса еще отчетливо сохранялась на уровне 4 баллов, но уже ка-

мечались "крыловидные" лопатки, отставание лопаток от грудной клетки, симптомы свободных наДплечий. При падении дети вставали с ' пола без посторонней помощи по "лестничному" типу. Псевдогипертрофия икроножных мышц отмечены в 87% случаев, мышц предплечий -52%, половых оранов - 25?, губ - 11%. дельтовидной мышцы - 1%, языка - 9%. "чла дистальных отделов ног и рук сохранялась относительно доиго от 3 до 8 лет (7395 больных). По мере прогрессирова-лия процесса к 8-9 годам у 38% детей выявлена тугоподвижность и в локтевых суставах. Ахиллов рефлекс не удавалось вызвать к 4 годам у 88% детей, потеря коленного рефлекса отмечена с 7-летнего возраста у 67% больных. Сухожильные рефлексы с рук начинали снижаться и исчезать к 9-10 годам в 73%' случаев. Психические нарушения, выявлены у детей (43.ЗД. Наши наблюдения показывают.' что чем раньше начались проявления МДД, тем тяжелее протекали нарушения психики.

Многие авторы (Н.Л.Ильина, 1982; К.И.Теблоев, 1994) отмечают при НДС поражение мышцы сердца, .желудка, кишечника. Всем больным при нашем наблюдении проведено ЭКГ, 6 больных Эхо КГ и ФКГ исследование в динамике. У 28% больных найдено изменение на ЭКГ: у 22 детей частичная блокада яожек пучка Гисса. в 10 случаях нарушение внутрипредсердной проводимости, у 6 детей обнаружены изменения в виде нарушения ритма (аритшя, тахикардия, брадикардия), у 4-х зарегистрирована атриовентрикулярная блокада I степени (Рй -0,19" к 0,18"), -в случаях отмечались изменения в виде узлового ptm.• а у 3 больных выявлена сглаженность зубца Т и удлинение электрической систолы желудочков. Данные изменения на ЭКГ свидетельствуют л вовлечении в патологический процесс при МДД миокарда. Эхо КГ и ФКГ свидетельствует о Гй^ртрэфии миокарда у 18% б_льных.

Одной из наиболее характерных особенностей кашей выборки больных явилось большое•количество бол них (68%), имевших те или иные дизрафическк проявления. Эта признаки вклачага в себя следующие изменения: гипертелоризм, зпикант, макро - или микроотии, прогнатизм, деформации ушных раковин - приплюснутость, неправильный завиток, противозавнток. деформации черепа (башенный, высокое

небо, брахидакглдая), изменения поэзоиочнчка и грудной клетки, наблюдаемые у больных МДД. Нами у каждого третьего больного отмечена деформация зубов.

По нашему мнению, сто."ь высокая частота дизрафических стигм и аномалий развития в исследованной популяции может быть объяснена, во всяком случае частично, высоким коэффициентом инбридинга и, следовательно, неблагоприятным генетическим фоном, на котором происходила манифестация заболевания. Рентгенологическое исследование у 32 больных МИД-выявило атрофию бедренных и боль^еберцовых костей, сужение циафиз'ов трубчатых костей, = обусловленные рассасыванием коркового слоя и сужением костно-мозгового канала, замедление оссификации, симптом "пера".

У рсех больных имелся высокий- риск развития лекаритвеный аллергии, т?к как они многократно.В течение ряда лет получали медикаментозную терапию, включающую в себя комплекс витаминов, био генные стимуляторы, . гормоны, антвхолинэстерааные препараты и дробное переливание крови. Исходя' из этого. , в процессе сбора анамнеза мы особое внимание придавали учету индивидуальных аллергических реакций.. Выяснилось наличие рзчее перенесенных и широко распространенных заболеваний«типа нейродермита, поллиноза. аллергического ринита, сезонного' коньюктнвита." поствакцинальной аллергии, бронхиальной астмы, астматического бронхита, пищевой и лекарственной аллергия,» крапивницы, отека Квинке и. токсикосллерги-ческих осложнений, детских инфекций. Все вышеперечисленное в сочетании с катамнестмческш наблюдением в течений многих лет, динамическим контролем у 124 больных с МДД (определение содеряания разных популяций лимфоцитов в периферической.крови, абсолютное и отнсси"ельное содержание Т- и В-лимфоцитов,- уровень иммуноглбули-нов класса А, М. -С, белка и белковых-Фракций а сыворотке.крови) указывают на снижение аллерголопнеской реактивности больных мио-патией^Люиенна. Следует отметить, однако, что за весь период наблюдения зэ указанными больяыми на'« не удалось выяйить ни одного случая аллергических-реакций. Это'может,указывать на то. что измененная мышечная - ткань теряет, по видимому, способность матрицы, ка которой происходит сЬединение антигена с е:.г;;телом. Либо в

процессе формирования аллергических реакций у больных МДД уменьшение количества реагентов снижает ьероягность возникновения аллергии.. У 12-ти больных (8%) отмечены эндокринологические изменения - общее ожирение, синцом Иценко-Кушнга и flpvrue. По способности обслуживать себя выделены три группы больных. Больных с I стадией - 69 чел., II ста, лей - 64, III стадией - 42 человека.

Таким образом, проведеннор клиническое исследование больных в семьях с МДД позволило нам выявить некоторые особенности клинического проявления и течения заболевания в популяции Таджикистана. К ним относятся: позднее начало болезни в 6-7 лет; ранняя декомпенсация с ранним развитие^, контрактур в : эленщх суставах, затем голеностопных суставах (указанная особенность в значительной степени может быть обусловлена традицией сидеть на полу); грубые деформации грудной клетки; достаточно высокая частота встречаемости малых аномалий; благоприятное медленное течение заболевания у девочек, выявленных в семьях, больных МДД.

Молекулярно-генетнческий анализ

Молекулярио-генетическое исследование больных с МДД и членов их семе?1 проведено у. 25 пробандов из 23 семей. Исследован делеций в гене дистрофина методом множественной полимеразной реакции амплификации промоторной области гена и отдельных зкзонов гена дистрофина: 3.6,8,13,17,19,32,43,44,45 47,48,50,52 и 60 ЗКЗОНОВ.

Делеция исследуемого .региона гена определялась по отсутствию соответств'ущего продукта амплификации на электрофг.реграм-ме. Например, на представленном рисунке (рис. 1) видно отсутствие фрагментов ДНК. соответствующих экзонам 17 и 19 (дорожка 4), эк-зону 45 (дорожки 2 и 5) экзшу 44 (дорожки 3 и 6). Делеция какого-либо из исследуемых регионов гена были определены нами у 13 больных из 13 семей, что составляет 4ВЯГ исследованных семей. Как видно из таблицы 3, делении определялись в различных участках и быси достаточно полиморфными. *

Анализ частоты встречаемости делеций отдельных участков гена не выявило делеций промоторной области 3,6,52 и 60 экзонов.

1,1 * г ,

й

эктоь45Ц , ^ г 1 ,

экзон 19 V „ ^ экзон 17^» 1,- т

^ л

л *

'Ь

... . экзон 44!

г

» 1

«й л I

ГЛ », |416 п.н.

547 п.н. 159 п.н.

7! *

<

I ;

а в 1 2 3 4 5 6 7 89 в

>68 п.н.

Рис. I ДеяециоииыП анализ у больных МДЦ: амплификация 17,19,44, 45эхзонов гена дистрофика методом множественной ПЦР. а-рис 18/Мзр1, в рЖП2ГГщ1, дорожки I - 9 - ДНК больных МДД:

1 - ДНК больного 11-1,

2 • ДНК больного 7-1: отсутствует экзон 45,

3 - ДНК больного 10-1; отсутствуя экзон 44,

4 - ДНК больного2-2: делмда экзонов ¡7 и 19,

5 - ДНК больного 22-1: деления эхзона 45,

6 - ДНК больного 27-1: делеция эхзона 44, 7,8,9 - ДНК больных 3-3,6-5,9-1.

Таблица 3

Результаты определения методом ГЩР делений промоторной области и отдельных экзонов гена дистрофика у больных МДД

Г' -.............1 1 Пробаяды 1 " 1 1 I 1 Зкзоны гена ■" -1

1 1 1 г Рго 1 1 — 3 ...... ■ "1 6 1 8 г I I |13|17| 1 1 1 1111111111 19|32|43|44|45|47148(501521601 1111111111

1 ..... I 2-4 , 1 + + + - - - - 4 4 4 4 4 4 4 4

I 6-3 4 + + 4 л 4 4 4 4 4 - - - 4 4|

1 7-1 + + + + + •«'.+ Ч- 4 4 + - - 4 4|

1 10-1 4 + + + 4 4 4 - - - 4 + 4 4 4 4 |

1 12-1 4 + + + ' 4 4 4 4 4 4 4 4 4 - " " 1

1 22-1 4 + + + 4 4 4 + 4 4 4 - - + + I

| 23-3 + + 4 4 ' 4 4 4 4 4 4 4 - - - 4 4 |

I 24-3 + + + 4 4 -4 4 4 4 4 4 4 4 - 4 4 |

1 26-1,26-2 4 + + 4 4 4 + 4 4 4 4 4 4 - 4 41

1 27-1 4 + + д. 4 1- 4 4 4 - 4 4 4 4 4 >-|

1 29-1 + + + 4 . 4 4 4 4 4 4 4 - - - 4 41

I % (Ш))* - - 4 4 4 '4 4 9 9 22 22 35 - -1

1............ - - - 9 9, 9 9 9 9 18 18 45 45 73 1

Примечание:

+ - наличие исследуемогр фрагмента гена дистрофина: - - делеция фрагмента ДНК;

♦ - % выявление делеций Фрагмента у обследованных больных МДД

(25 больных из 23 семей); ** - встречаемость делеций фрагмента среди•больных с вдавленными делециями гена.

Делеции экзонов 8,13,17.19,32,43 выявлены.у больных, делении экзонов 44,45 - у 9% больных. Наиболее часто определг 'ись делеции 47.48 экзонов - в 22% случаев МДД, а деления экзсна §0 -в 35% случаев болезни. Изучение размера и расположена ДНК-нарушений у таджикских больных показывает преобладание делеций в дис-тальной области дистрофина. Отсу-твие ядра экзоноз в проксимальной части гена зафиксировано только у двух пробандов из одной семьи: у обеих определена достаточно протяженная делеция, охватывающая не менее 12 гкзонов гена. У одного больного выявлен крупный дефект гена затрагивающий не менее и экзонов гена. Остальные выявленные делеции (82%) были кеньше по размерам - от одного до нескольких экзонов. Делеции всего гена или большей ег части не были выявлены ни в одном случае.

В таджикской популяции кокно предположить некоторые особенности молекулярных нарушений структуры гена дистрофина при МДД. Так, при определений границ молекулярного дефекта были обнаружена "горячая точка" гена дистрофина: в случаев всех выявленных делеций одна из границ разрыва ДНК (дистальная) находилась между 50 и 52 экзонами гена, что видимо, отражает некоторые популяцион-ные отличия таджикской популяциц от описанных в литературе. В Таджикистане не наблюдается характерное для многих популяций одного из максимумов делеций с 3 регионе гена дистрофина (в перзкх двадцати зкзонах гена). Для 91 неродственных пробандов с определяемыми делениями кодирующей часта "ена дефекты ДНК обнаружены нами в районе экзоноь 44,-50.

В Таджикистане дефекты в гене дистрофина при мышечной дистрофии Дюшенна выявлены в 52% обследованных семей. Такая эффекта3^ нс^.ть установления молекулярного дефекта считается довольно высокой в мировой практике, что позволяет осуществлять достаточно крпректлую и точную диагностику, в том числе пренатальную в семье больных с уже детектированными дефектами гень. Прямые ме\ ды детекции мутаций оказались неинформатовныш в 48% семей.

Таким образом, высокий процент дефектов включающих 50 эк2ой, не встретившийся з литературе для других популяций позволяет предположить носительство данного варианта патологического гена у

большей доли женщин родственных больным МДД в Таджикистане (в 35% семей путем прямой детекции наличия -или отсутствие данного фрагмента гена в хромосомах).

Следующий этап молекулярных исследований - это поиск информативных ДНК мар! ров в семье. Мы исследовали в работе полиморфизм'по двум "окусам системы рЕНТ: 87-8Л^ и рЕСТ-87-15/Ват Н1.

Амплификацией фрагментов ДНК из региона 87-8/Тае1 гена диет-рофина с последующей рестрикцией ферментом Тац I выявляются два варианта ДНК-Фрагментов - 145 п.н. или 74 п. и. +71 п.н., в зависимости от отсутствия или наличия в ДНК сайта для рестриктазы Тад I. Амплификацией ДНК из региона рЕИТ 87-15/Ваи Н1 с последующей рестрикцией ферментом Ваш Н1 выявляются также два варианта , ДНК-фрагментов-216 п.н. -или 166 п.н. +50 п.н. в зависимости от отсутствия или наличия в ДНК сайта для рестриктазы Ваш Н1.

Нами был проведен анализ ПДРФ по полиморфным системам рЕИТ 87 в 23 семьях, имеющих больных МДД детей. При этом 16 семей оказались информативными (матери пробандов были гетерозиготны) хотя бы по одному локусу, 5 семей - неинформативными; обнаружены 2 случая рекомбинаций в гене дистрофинг. Дополнительно к этому в двух семьях у больных выявлена делеция данной области гена, о чем было уже упомянуто выше. Пример такой косвенной ДНК-диагностики в семье с МДД представлен на рис. 2.

Непосредственное определение нарушений в гене может расширить возможности и тбчнооть медико-генетического консультирования семеГ. таджикских больных. Этот путь имеет ряд преимуществ по сравнению с анализом сцепления с внутригенними и фланирующими ДНК-маркерам": 1) становится возможной диагностика (в том числе и пренатальная) при спорадических случаях: тч для пренатальной диагностики достаточно применения только 1 маркера (делеткрованного у больных в семье), причем риском рекомбинации можно пренебречь; 3) не нужно привлекать трудоемкий анализ цепления.

Что касается ренатальной диагностики, то она возможна во всех семьях с делециями и связана с детекцией у плода тех же фрагментов ДНК, которые отсутствовали у больного. С развитием и усовершенствованием методов молекулярно-генетического анализа

а.

0

9-5

уШб.ш!

^9-1/ 9-3

6

О

9-2

0

ой

9.4 9-6 9-7 9-8 9-9

13546 7 8 92

21'п. 166 п.

50 п. I

Рнс. 1, Анализ ПДРФ в лоху« рЕЕ/Ш-15/Ваш Н1 в семье с двумя больными МДД.

а - родословная семьи;

б - схема злектрофореграммы анализа ПДРФ.

возможности пренатальной диагностики- в системе мер профилактики . будут увеличиваться. При этом повышение значимости профилактических медико-генетических мероприятий зависит и от уровня информированности врачей существуювдх служб здравоохранения и населения о наследственных болезнях и возможностях их предотвращения. Следует .отметичь, что выше олисанный метод ДНК-диагностики в силу своей трудоемкости, многоэтапное™ процесса, использования дорогих химических реактивов, изотопов и ферментов диктует необходимость создания специального, хорошо оснащенного центра молекулярной диагностики наследственных болезней. Учитывая высокую экономическую и социальную эффективн :сть молекулярно-генетических ме-: .дов диагностики и профилактики этой патологии, следует по-види-' мому, стаь-.ть вопрос о создании такого центра з Таджикистане в системе специализированной медикогенетической службы республики. (Рис. 3).

Она создается Минздравом республики Таджикистан. Основным видом деятельности учреждений медико-генетического центра (МГС) является профилактика врожденной и наследственной патологии путем организации и проведения ретро- и проспективного медико-генетического консультирования, пренатальной диагностики, преклиничес-кой диагностики и новорожденных наследственных болезней, направление больных на лечение и диспансерное наблюдение семей о наследственной патологией.

Структура и задачи медико-генетической службы

В задал районного (городского) уровня входит выявление семей, отягощеняп наследственно/ и другой патологией, их учет и направление в региональное (областное) медико-генетическоэ учреждение, диспансерное наблюдение за лицами с выявленной патологией, распространение медико-генетических знаний среди врачей, среднего медперсонала и населения района. Совместно с Таджикским медицински« университетом им. Абу али ибн Сино о использованием республиканских специализированных клиник организация республиканского медико-генетического центра (МГЦ). МГЦ в задачи которого входит:

EäSoK

иезропатодог воач-гертшс

Обярстз. неггропато-пог врач-геястих

Гсшл

нгвршатолог ерач-гсяетшс

НецаонглъпыЗ

регистр мвсдкстрсфпя

/Ч

Республиканский

центр медпхо-

генеткчгсхого консультирования

г—————-

4 Республиканская ,ч] нгг.рояогпчесгсав

КЯЛИИК2

/\

Рис. 3.

Схема взакмоденстея пгчебно-даагнссгкческиг учр^дяшй республики с меЕгаго-генегачеааш центром и национальным регистром миояистрофяЯ.

консультирование сложных случаев патологии, подтверждающая цито генетическая, биохимическая и ыолекулярно-генетическая диагностика сложных и редких случаев наследственных болезней; разработка, апробация и внедрение новых методов диагностики, лечения и реабилитации. подготовка и повешение квалификации специалистов меди-ко-генетичесг 'х учреждений путем организации стажировки на рабочем месте- ведение национального регистра семей с наследственной патологией.

МГС функционирует как составная часть системы лечебно-профилактических учреждений практического здравоохранения, осуществляет свои мероприятия в координации с акушерской, педиатрической, неврологической и другими службами. Принцип инфраструктуры МГС -территориально основанный на создании и развитии материальных, кадровых и финансовых ресурсов здравоохранения для обеспечения гарантируемых видов медико-генетической помощи семьям, отягощенным наследственной и врожденной патологией: медико-генетическое консультирование пренатальная диагностика, скрининг новорожденных ка поддающиеся коррекции наследственные болезни, социально-медицинская реабилитация наследственных больных. МГС охватывает районный, городской, региональный (областной и др.) и республиканский центр, обеспечивая максимальное приближение к месту жительства обслуживаемых контингентов населения, оказание специализированной помощи.

выводы"'

1. Впервые плучены оценки распространенности ММ в Республике Таджикистан. Рассчитанная срёдняя частса ИДЯ составила 3,4 на

, 100 тыс. населения.

2. Клиническое исследование в семьях бс ¡ьних с МДД позволило уточнить у бо. Л1ЫХ некоторые особенности клинического течения заболевания, характерные для исследованной популяции: позднее начало заболевания в 6-7 лет; ранняя декомпенсация с развитием контрактур в крупных суставах; высокая частота дипрафкческих

стигм и аномалий развития: высокий риск лекарственной аллергии, благоприятное течение заболевания у девочек.

3. В результате молекулярт-генетического анализа в выборке больных с МДД из популяции Таджикистана делеции гена дистрофина установлены в 52% семей больных с использованием мультиплексной ДНК-амплификации промоторной области отдельных экзонов гена дистрофина (3, 6, £>,' 13.1?. 19,43.44,45,47,48.50,52 60 экзонов) и локусов рЕРТ-87-15^ва Н1.

'4. Исследование спектра делеций гена у больных МДД выявило значительный полиморфизм нутаций, о преобладанием дефектов в дис-тальной области гена (8355). Часто определялись делеоди экз -нов 47,48 - в 22% случаев, детсция экзона 50 - в 35% случаев болезни (или у 7338 больных с идентифицированными делециями) Таким образом, наиболее диагностически значимой яьляьгея пара олигонуклеотидных праймеров для определения экзона 50 гена дистрофина. Это обосновывает первоочередную целесообразность и важность анализа данного региона гена при- дальнейшей диагностике МДД в таджикском регионе. •

5., На основании полученных нами результатов предложена модель оказания медико-генетической помощи населению Таджикистана.

По теме диссертации' опубликованы следующие работы:

1. Генетики-демографичес- Генетика человека и Соавторы:

кая характеристика патология, материа- Дьясенко Е.П.,

сельелой популяции лы 2 итог, конферв- Раджабалиев Ш.-.

юга Таджикистана ренции НИИ мед. Иванова 0.Ф.,

генетики ТНЦ РАЧН, Кучер А.Н. Томск. ТГУ. 1992. -С. 6-8.

Медико-генетическая характеристика , * наследственных Солез-наР Куля'бской области Таджикистана

Генетика человека и Соавторы: пая».'логин. Материалы Салюкова O.A.,

2 итог. конф. НИИ Пузырева О. А.,

мед. генетики ТНЦ Назаренко Л.П..

РАМН. Томск. ТГУ, Раджабалиев Ш.Ф.

¡1992. - С. 37-38. Хакназаров А. X..

Пузырев В.П.

3. Популяционно-генети-ческая характеристика сельский популяции юга Таджикистана

4. Генетический полиморфизм биохимических и иммунологических маркеров генов в сельской популяции ¡ora Таджикистана

Генетика, 1993 т. 2.9,, К В. -С. 1375-1381.

Здравоохранение Таджикистана, 1993, N 2. - С. 22.

Соавторы: Дьяченко Е.П.. Пузцрев В. П., Кучер А. Н., Иванова о.Ф.. Радяабалиев Ш. Соавторы: Радаабалиев Ш.Ф. Дьяченко Е.П.. Пузырев В.П.. Кучер А.Н., Иванова О.Ф.

5. Изучение генетических факторов в формировании уровня здоровья сельского населения юга Таджикистана'

Материалы годичной' 42-й научн. конференции Госмедуни-верситета ин.Абуали' ибн Сино "Актуальные вопросы профилактики болезней человека". Душанбе, 1994. - С. 139-140.

Соавторы: Кучер А. Н., Пузырев В. П.

6. Наследственная патология' в Кулябской области Таджикистана

Материалы годичной •12-й научи, конфе ренвди Госмедуни-BtpcHTt-ла им. Абуали

Соавторы: Пузырев В.П., Пуаырева O.A., Назаренко Л. П.

ибн Сино "Актуальные Ахмедов A.A.

вопросы профилактики

болезней человека".

Дуианбе, 1994. - С.

147-148.

7. Эпидемиология наследственных болезней в Кулябской области Таджикистана (предварительное сообщение)

Здравоохранение Тагики стана. 1993, Н 6. - С. 42-44

Соавторы: Радабалиее Ш.Ф. Салюкова о. к.. Назаренко Л.П.. Лузирева O.A.

8. Эледимисуюгия мио-дистрафий Зрба-Рота в Таджикистане

Здравоохранение Таджикистана, 1993ЧМ 4. -С. 33-37.

Соавторы: . Раджабалиев Ш.<!\ Хаму-танов М.М.

9. Генетическое консультирование на основе исследования гена дистрофина.

Актуальные вопросы региональной патологии и оптимизации учебного процесса. Душанбе, 19С- С. 72.

Соавторы: Пузырев S.П.. Раджабалиев Ш. Ф.