Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Клинико-генетический анализ болезни Паркинсона и сходных дофа-чувствительных экстрапирамидных синдромов в сербской популяции

На правах рукописи

ДЖУРИЧ

Гордана Михайло

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА И СХОДНЫХ ДОФА-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАПИРАМИДНЫХ СИНДРОМОВ В СЕРБСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

14.00.13 - нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте неврологии Российской академии медицинских наук и Клиническом центре Сербии (г. Белград, Сербия и Черногория)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Иллариошкин С.Н. доктор медицинских наук, профессор Костич B.C.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кадыков A.C. доктор медицинских наук, профессор Федорова Н.В.

Ведущая организация - Московская медицинская академия им. И М Сеченова

Защита состоится «ЯЗ» ноября 2004 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д001.006 01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте неврологии Российской академии медицинских наук по адресу: 125367, Москва, Волоколамское шоссе, 80.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ неврологии РАМН Автореферат разослан чЗЗу> октября 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

С.Н. Иллариошкин

zoos-ч

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Внедрение в практику технологий ДНК-анализа генов наследственных болезней нервной системы и успехи в исследовании молекулярно-биологических основ подержания белкового гомеостаза в клетке существенно изменили представления об этиологии наиболее значимых нейродегенеративных заболеваний человека - болезни Паркинсона (БП), болезни Альцгеймера, полиглутаминовых болезней и др. [Иванова-Смоленская И.А., 1996; Иллариошкин С.Н и др, 2002; Brice А., 1998, Pulst S.M, 2003; Иллариошкин С.Н., 2003]. Непосредственно наследственные формы БП составляют, по данным разных авторов, около 5-10% всех случаев БП [ Wzolek Z. et al., 1995; Golbe L. et al., 1996]. Показана выраженная генетическая гетерогенность и наличие, как минимум, 7 различных генетических локусов аутосомно-доминантной БП - на хромосомах 4q, 2р, 4р, 12q, Ip и 2q; для 2 форм идентифицированы белковые продукты мутантных i енов - а-синуклеин и убиквитин-карбокситерминальная гидролаза-Ll (UCH-L1) [Polimeropoulos M. et al, 1996; Gasser M et al, 1998, Leroy E. etal., 1998, Funayama M. etal., 2002; Hicks A. etal, 2002; Pankratz N. etal., 2003].

Большинство случаев БП являются спорадическими; при спорадической БП этиология болезни рассматривается как результат взаимодействия эндогенных факторов (совокупности генов), определяющих «метаболический фон» конкретного индивида, и факторов окружающей среды [Иллариошкин С.Н., 2003; Spacey S., Wood N., 1999; Mouradian MM., 2002]. Для оценки роли генетики в развитии спорадической БП используется анализ ассоциаций болезни с аллельными вариантами генов, продукты которых принимают участие в метаболизме экзогенных токсинов и ксенобиотиков, функционировании системы антиоксидантной защиты клетки, обмене и транспорте дофамина, окислительном фосфорилировании, процессах репарации нейронов [Иллариошкин С.Н и др, 2002; Nussbaum R., Polymeropoulos M., 1997, Tan E. et al., 2000; Mouradian M, 2002]. С этой цели внимание привлекают аллельные варианты генов цитохромоксидазы (CYP2D6), параоксоназы (PONI), аполипопротеина Е (ароЕ'), а также полиморфизмы генов убиквитин-карбокситерминальной гидролазы (UCH-L1) и паркина Результаты исследований гтеттгс.сжпй гтрядрасцдлрж'енн^с™ к развитию

БП существенно варьируют в тех ил] :ских группах, что

доказывает популяционно-специфичный характер генетических ассоциаций и диктует необходимость сравнительно анализа получаемых данных в разных популяциях мира.

Ювенильный (юношеский) паркинсонизм как особая форма первичного паркинсонизма наследуется, как правило, по аутосомно-рецессивному типу и обусловлен мутациями в 4 самостоятельных генетических локусах, для двух из которых идентифицированы первичные белковые продукты - паркин (хромосома 6q25.2-27) и DJ-1 (хромосома 1р36) [Kitada Т et al, 1998, Valenle М et al, 2001, Van Duijn M et al, 2001, Hampshine J et al, 2001]. Мутации в гене паркина -убиквитин-лигазного фермента, играющего ключевую роль в протеасомной деградации клеточных белков - являются наиболее частой причиной ювенильного паркинсонизма [Загоровская ТБ, 2002; Kitada Т et al., 1998, Lucking С et al, 2000, Maruyama M. etal., 2000].

Дофа-чувствительная дисюния (ДЧД), в большинстве случаев наследуется по ауюсомно-доминантному типу, хотя известны также и значительно более редкие аутосомно-рецессивные случаи болезни. Основной ген ДЧД локализован на хромосоме 14q и кодирует ключевой фермент метаболизма дофамина - ГТФ-циклогидролазу-1 (GCH-Ij [/с hiñóse Н etal, 1994].

Следует отметить, что выявление наследственной предрасположенности к БП и клинико-генетический анализ различных форм дофа-чувстительных экстрапирамидных синдромов могут иметь важное значение с точки зрения разработки новых подходов к эффективной профилактике этих заболеваний в каждой конкретной популяции. До настоящего времени в сербской популяции подобные исследования не проводились.

Таким образом, ЦЕЛЬЮ настоящей работы явился клинико-генетический анализ болезни Паркинсона, ювенильного паркинсонизма и дофа-чувствительной дистонии в сербской популяции на основе исследования мутаций и полиморфизмов в соответствующих генах-кандидатах.

Исходя из поставленной в работе цели, были сформулированы следующие ЗАДАЧИ исследования:

1) Анализ частот полиморфных аллелей генов цитохромоксидазы (CYP2D6), параоксоназы {PONI), аполипопротеина Е (ароЬГ), убиквитин-

карбокситерминальной гидролазы (UCH-L1) и паркипа у пациентов-сербов с БП и в соответствующем этническом контроле.

2) Сопоставление генетического статуса обследованных больных БП с особенностями клинической картины заболевания, а также анализ роли исследованных генов в формировании предрасположенности к БП.

3) Мутационный скрининг генов паркина и GCH-I у больных с наследственными дофа-чувствтельным экстрапирамидными синдромами (ювенильный паркинсонизм, дофа-чувствительная дистония) в сербской популяции.

4) Детальный анализ фенотипических проявлений говенильного паркинсонизма и дофа-чувствительной дистонии в случаях, диагностические подтвержденных на молекулярном уровне.

5) Разработка принципов прямой ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования в сербских семьях, отягощенных ювенильным паркинсонизмом и дофа-чувствительной дистопией.

Научная новизна. Впервые в славянской популяции Сербии проведен анализ молекулярно-генетических факторов, определяющих развитие БП и фенотипически сходных дофа-чувствительных экстрапирамидных синдромов. Установлен вклад А- и М-аллелей генов CYP2D6 и PONI в формирование предрасположенности к БП, а также обосновано протективное значение носительства Y-аллеля гена UCH-L1. Установлено, что гены ароЕ, CYP2D6 и PONI обладают модулирующим эффектом в отношении возраста манифестации БГ1. Полученные данные позволяют выделить ранние случаи БП в особую форму первичного паркинсонизма, в развитии которой наиболее значима роль генетических факторов.

Впервые в сербской популяции при молекулярпо-генетическом анализе дофа-чувствительной дистонии и ювенильного паркинсонизма идентифицированы мутациии в генах GCH-J и паркине, причём мутации 520G—+A и IVSl-85delA гена GCH-I выявлены впервые в мире. Тем самим получено подтверждение, что аутосомно-доминантная дофа-чувствительная дистония и аутосомно-рецессивний ювенильный паркинсонизам являются широко распространенными заболеваниями, встречающимися в различных популяциях мира, в том числе и в Сербии.

Практическая значимость. На основании анализа генетических ассоциаций рассчитаны конкретные величины риска БП у носителей

«неблагоприятных» генотипов, а также показан аддитивный (суммирующий) эффект как «неблагоприятных», так и «благоприятных» аллелей в реализации генетического риска. Это позволяет сформировать среди обследованных лиц группы риска в отношении развития БГГ, которые должны становиться объектом целенаправленных профилактических мероприятий. Получен первый опыт прямой ДНК-диагностики дофа-чувствительной дистонии и ювенильного паркинсонизма в семьях сербского этнического происхождения, а также первый опыт медико-генетического консультирования этих форм патологии на основе мутационного скрининга генов GCH-I и паркина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Впервые в сербской популяции проведен комплексный клинико-генетический анализ БП и сходных дофа-чувствительных экстрапирамидных синдромов на основании исследования мутаций и полиморфизмов в генах CYP2D6, PONI, UCH-L1, ароЕ, GCH-J и паркине

2. Генетические факторы играют важную роль в формировании предрасположенности к БП, а также оказывают влияние на особенное!и течения заболевания. Определенные аллели генов CYP2D6, PONI, UCH-L1 приводят к повышению или снижению риска развития БП по сравнению с общей популяцией; помимо этого, носительство «неблагоприятных» аллелей генов CYP2D6, PONI, UCH-L1, ароЕ способствует более ранней манифестации заболевания.

3. Роль изученных генов предрасположенности наиболее значима в развитии ранней формы БП (т.е. в случаях болезни с возрастом манифестации симптомов до 45 лех).

4. В сербской популяции у больных с наследственными дофа чувствительными экстрапирамидными синдромами — дофа-чувствительной дистониой и ювенильным паркинсонизмом — впервые выявлены мутации (в т.ч. не описанные ранее в литературе) в генах GCH-I и паркине Получен первый опыт прямой ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования в отягощенных семьях на территории Сербии.

Апробаиия работы. Материалы диссертации были представлены на 35-м Дунайском Конгрессе по нейронаукам (Белград, 2003 г.), Всероссийской научно-

практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003 г.), X Международном Конгрессе по болезни Паркинсона и расстройствам движений (Рим, 2004 г.), XII конгрессе неврологов Сербии и Черногории с международным участием (Нови-Сад, 2004). Работа апробирована на совместном заседании научных сотрудников I, И, III сосудистых, нейрогенетического, нейроинфекционного и научно-консультативного отделений, лабораторий биохимии и клинической нейрофизиологии ГУ НИИ неврологии РАМН 16 апреля 2004 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 7 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания больных и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, библиографического указателя (включающего 180 источников, в том числе 19 работ российских и 161 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 26 таблицами и 24 рисунками.

Автор выражает искреннюю благодарность руководителю нейрогенетического отделения ГУ НИИ неврологии РАМН профессору И А Ивановой-Смоленской и ведущему науч. сотруднику отделения Е.Д. Марковой - за постоянную помощь и поддержку при планировании и выполнении исследования, научным сотрудникам отделения Т.Б Загоровской и С.А. Клюшникову, а также ведущему науч сотруднику отдела молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН П.А.Сломинскому (руководитель отдела -Лауреат Государственной премии РФ, профессор Лимборская С.А.) - за помощь в выполнении молекулярно-генетической части работы. Автор признателен коллективу сотрудников IV отделения Неврологической клиники Клинического центра Сербии (КЦС) в Белграде (руководитель — профессор Костич С В.) за помощь в выполнении клинической части исследования.

2. ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика больных и обследованных семей. В исследование вошли 106 больных болезнью Паркинсона (БП), 20 пациентов с наследственными дофа-чувствительным экстрапирамидным синдромами - ювенильным

паркинсонизмом (ЮП) и дофа-чувствительной дистопией (ДЧД) и 75 неврологические здоровых лиц в качестве контрольной группы; все обследованные лица - этнические сербы (см. таб. 1). Больные проходили стационарное обследование и лечение в 4-м отделении Неврологической клиники Клинического Центра Сербии в Белграде. Критерием для постановки диагноза БП служило наличие хотя бы 2 из 3 главных двигательных симптомов заболевания (тремор покоя, ригидность, брадикинезия) в сочетании с положительным ответом на прием препаратов леводопы [Calne D et al, 1992, Koler С et ah, 1992] Больным в условиях стационарного наблюдения, помимо детального неврологического осмотра и рутинных общеклинических тестов, был проведен по показаниям ряд современных лабораторных и инструментальных методов исследования с целью исключения дру!их нейродегенеративных состояний. У всех больных БП тяжесть заболевания оценивалась количественно по стандартным шкалам UPDRS, Hoehn&Yarh и Schwabe-England, в том числе в динамике - через год с момента первого обследования.

Клиническая диагностика ЮП и ДЧД основывалась на стандартных критериях данных заболеваний - возраст начала, особенности течения, реакция на прием леводопы и ее дозировки, характер экстрапирамидного синдрома и тд [Segawa М et al, 1976, Маркова ЕД и др., 1975; Ishikava А, Tsuji S, 1996, Иллариошкин С. Н, 2003].

Для более детальной оценки вклада исследуемых полиморфизмов в развитие различных форм БП анализ проводился не только в общей выборке больных, но и в отдельных подфунпах, которые были сформированы следующим образом:

1. Семейные случаи БП - 10 больных из 10 семей. Они выделены в Ol дельную группу, так как в развитии семейной формы заболевания предполагается прямое участие мутаций в конкретных генах. В 8 обследованных семьях можно предположить аутосомно-доминантний тип наследования БП. В 2 семьях болели лица в одном поколении, что не даст возможности четко дифференцировать между аутосомно-рецессивным типом и аутосомно-доминантным наследованием с неполной пенетрантностью мутантного гена.

2. Спорадическая БП - 96 больных. Спорадические случаи БП были нами

поделены на две подгруппы согласно возрасту начала заболевания'

а) больные с ранним началом БП (до 45 лет) - 55 пациентов (36 мужчин и 19 женщин, соотношение полов - 1,9), средний возраст начала заболевания составил 39,5±3,8 лет (от 30 до 45 лет), длительность заболевания - 7,9±2,5 (от 4 до 13 лет).

б) больные с поздним началом БП (после 45 лет) - 41 пациент (22 мужчин и 19 женщин, соотношение полов 1,2), средний возраст начала болезни составил 58,1±6,2 лет (от 45 до 70 лет), длительность заболевания - 6,2±2,9 лет (от 1 до 20 лет).

Средний возраст начала болезни и ее длительность достоверно не различались между семейной и спорадической группами - соответственно, 45,8А9,6 и 47,4±9,1 лет; 7,9±2,5 и 7,1±3,1 лет. Можно отметить преобладание заболеваемости среди мужчин в группе с положительным семейным анамнезом (2,3:1) по сравнению с соотношением мужчин и женщин среди пациентов со спорадической БП (1,2:1). Как при семейной, так и при спорадической БП среди всех фенотипов паркинсонизма преобладала дрожательно-ригидная форма - 70% и 60,4%, соответственно.

Таблица 1. Группы обследованных больных

Болезнь Паркинсона (и = 106) Наследственные дофа-чувствительные синдромы (п = 20) Контроль

Спорадическая форма Семейная форма ЮП ДЧД 75

Раннее начало Позднее начало

55 41 10 15 5

Характеристика молекулярно-генетических методов исследования.

Основанная молекулярно-генетическая часть работы выполнялась нами на базе ДНК-лаборатории нейрогенетического отделения ГУ НИИ неврологии РАМН. Часть исследований (мутационный анализ генов паркина и 6СЯ-7) была выполнена совместно с сотрудниками отдела молекулярных основ генетики человека

Института молекулярной генетики РАН (к.б.н. Сломинский П.А., к б.н. Шадрина M И, руководитель отдела - Лауреат Государственной премии РФ, профессор Лимборская С.А). В совокупности исследован 201 образец ДНК, в том числе 106 образцов ДНК больных БП, 5 образцов ДНК больных ДЧД, 15 образцов ДНК больных ЮП и 75 образцов ДНК лиц контрольной i-руппы.

Амплификация 1енов цитохромоксидазы (CYP2D6), параоксоназы (PON1), аполипопротеина Е (ароЕ), убиквитин-карбокситерминальной гидролазы (UCH-Ы), паркина и GCH-I проводилась с использованием полимеразной цепной реакции (ГГЦР) со стандартными парами праймеров \Joost О. et al, 1999, Пчелина С H, 2000, Crook R et al, 1994, Maraganore M et al, 1999, Wang M et al, 1999, GDB PARK2; Ichinose H et al, 1994]. Визуализация продуктов амплификации полиморфных сайтов после их рестрикционного анализа проводилась в агарозном и полиакриламидном гелях с использованием бромистого этидия Прямое секвенирование экзонов и экзон-интронных границ гена GCH-I проводилось ди-деоксинуклеотидным методом Сэнгера; определение дозы i ена паркина осуществлялось с использованием денситометрического протокола и авторадиографии [Sambrook J etal., 1989].

Статистический анализ был проведен с использованием пакетов статистической обработки данных Microsoft Excel и Stalistica 6.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для выяснения профиля генетической предрасположенности к развитию Б11 в сербской популяции на первом этапе исследования мы сопоставляли частоту полиморфных аллелей исследуемых генов в репрезентативной выборке больных БП и в группе контроля популяции Сербии. Сущность такого анализа генетических ассоциаций составляет попытка вычленения из общего «генетического фона» rex ключевых маркерных генов, которые оказывают наиболее значимое влияние на формирование риска БП [Lander Е etal., 1994, SchorkN etal, 1994, Thomson G et al, 1999, Иллариошкин С H и dp, 2002]. С целью более детального анализа роли изучаемых генов-кандидатов в развитии БП на втором этапе исследования нами оценивалась взаимосвязь различных полиморфных аллелей этих генов с

особенностью клинических проявлений БП в сербской популяции, в первую очередь - с возрастом манифестации болезни.

3.1.1. Анализ полиморфизма 2D6*4 в гене CYP2D6

Полиморфизм 2D6*4 гена CYP2D6, являющийся наиболее распространении среди лиц белой расы (75% из известных полиморфизмов в гене CYP2D6), представляет точкову замену G1934A на границе интрон 3/экзон 4 и приводит к нарушению сплайсинга РНК, изменению структуры и потери активности фермента дебризоквин-4-гидроксилазы [Broly F. et al., 1991]. Известно, что дебризоквин-4-гидроксилаза участвует в метаболизме известного нейротоксина МФТП, вызывающего селективную гибель дофаминэргических нейронов мозга [AUard Р et al, 1994, Gilham D et al, 1997] Было показано, что фенотип «слабого метаболизатора» (РМ) является следствием гомозиготного носительства мутации G1934A (генотип А/А) в гене CYP2D6 и наследуется по аутосомно-рецессивному типу [Kimura S et al., 1989].

В нашей выборке при оценке частот отдельных генотипов (таблица 2) показано, что генотип А/А (т.е. фенотип «слабого метаболизатора» РМ) достоверно чаще встречается у больных с БП в общей и спорадической группе по сравнению с контролем (х2=6,4; df=l; р=0,01). Риск развития заболевания для носителей геношна А/А (показатель RR) возрастал в 3,1 раза по сравнению с общей популяцией [95%ДИ — 2,92; 3,20]. Это хорошо согласуется с рядом других исследований в различных популяциях мира, где общий риск развития БП также был ассоциирован с РМ-фенотипом и возрастал в среднем в 2,5 раза [Smith С et al, 1993, Kurth М. et al, ¡993; Lucotte G et al, ¡996; Agundez J et al, 1995]. Распространенность аллеля А гена CYP2D6 у больных БП в нашей выборке составила 22,2% что соответствует полученным данным по распространению данного аллеля у больных белой расы в большом обзорном европейско-американском исследовании — 20,5% [Joest О et al., ¡999].

Анализ полученых данных показывает, что аллель А является «неблагоприятным» и может влиять на темп развития БП, а также способствовать более раннему началу заболевания. Об этом, в частности, свидетельствуют следующие результаты:

Таблица 2. Распределение генотипов G/G, G/A и А/А гена CYP2D6 в различных группах больных БП и в контроле

Группы Генотипы Аллели частота, %

G/G G/A А/А

ш % в % п % аллель G аллель А

Общая группа БП п=106 72 67,9 21 19,8 13 12,3 77,8 22,2

Спорадическая БП п=96 63 65,6 20 20,8 13 13,6 76,1 23,9

Спорадическая БП с ранним началом п=55 36 65,5 10 18,2 9 16,3 74,5 25,5

Спорадическая БП с поздним началом п=45 27 65,8 10 24,4 4 9,8 78,6 21,4

Семейная группа БП п=10 9 90 1 10 0 0 95 5

Контроль п=75 53 70,7 19 25,3 3 4,0 83,4 16,6

Таблица 3. Возраст манифестации БП у носителей разных генотипов по полиморфизму Ю6*4 в гене СУ¥2В6

Генотипы полиморфизма 2D6*4 в гене CYP2D6 Разброс возраста манифестации БП (в годах) Средний возраст манифестации БП (в годах)

Генотип А/А 30-64 44,9±8,3

Генотип G/A 30-68 48,8±8,9

Генотип G/G 30-70 47,3±9,4

Все носители аллеля А 30-68 47,3±8,9

Не-носители аллеля А 30-70 47,3±9,4

• достоверная ассоциация генотипа А/А и БП с ранним началом симптомов Ос2=10,15;сНЧ;р=0,0014);

• отсутствие достоверной связи генотипа А/А и поздней формы БП (Х2=2,17, сЦ-=1;р=0,141);

• у носителей аллеля А в гомозиготном состоянии болезнь начиналась на 2,4 года раньше, чем у гомозигот G/G и на 3,9 года раньше по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа G/Л (таблица 3).

Таким образом, полученные нами результаты позволяют заключить, что носительство генотипа А/А гена CYP2D6, определяющее снижение метаболизма потенциальных нейротоксинов (в том числе и МФТП), является самостоятельным фактором предрасположенности к развитию БП и способствует более ранней манифестации симптомов заболевания.

3.1.2. Анализ полиморфизма L54M в гене PONI

Полиморфные аллели L54M гена PONI, как показали многочисленные исследования, ассоциированы с вариациями концентрации фермента параоксоназы в плазме кровы [Mackness В. et al., 1997]. Установлено, что М-аллель в гомозиготном состоянии приводит к 50%-ному снижению активности фермента параоксоназы относительно субстрата [Mackness В et al, 1997]. Предполагается, что замена лейцина на метионин в положении 54, которая локализована в N-конце белка, приводит к изменению конформации белка, что может нарушать связь параоксоназы с липопротеидами высокой плотности, необходимую для поддержания фермента в активной форме [Mackness В et al, 1997].

Нами выявлены достоверные различия в распределении исследуемых генотипов между общей группой БП, спорадической БП и контролем - таблица 4 (х2=14,24; df=2; р=0,00008). Аллель М, в гомозиготном состоянии ассоциированный со снижением концентрации фермента параоксоназы, встречался в общей и спорадической группе БП достоверно чаще, чем в группе возрастного контроля (х2=4,25; df=l; р=0,039). Риск развития заболевания для носителей генотипа М/М (показатель RR) возрастал в 3,2 раза [95%ДИ —2,65; 3,76] по сравнению с носителями других генотипов, что соответствовало результатам исследований в популяции Швеции и славянской популяции северно-западного региона России [Пчелина С H, 2000, Carmine A. et al, 2002].

Носительство «неблагоприятного» аллеля M способствует более ранней манифестации заболевания, что подтверждается следующими полученными результатами

Таблица 4. Распределение генотипов L/L, L/M и М/М гена PONI в различных группах больных БП и в контроле

Группы Генотипы Аллели частота, %

L/L L/M М/М

п % п % п % аллель L аллель M

Общая группа БП п=106 44 41,5 53 50 9 8,5 66 34

Спорадическая БП п=96 38 39,6 50 52,1 8 8,3 65,7 34,3

Спорадическая БП с ранним началом п=55 19 34,5 30 54,6 6 10,9 61 39

Спорадическая БП с поздним началом п=45 19 46,3 20 48,8 2 4,9 71 29

Семейная группа БП п=10 6 60 3 30 1 10 75 25

Контроль п=75 37 49,3 36 48 2 2,7 73 27

1. Распределение генотипов в подгруппе «раннего начала» и контроле достоверно различалось (х2=16,41; р=0,004) Генотип Т Л. гена PONI достоверно реже встречался у больных с началом заболевания до 45 лез по сравнению с фушгой контроля. Соответственно, генотип М/М наблюдался достоверно чаще в подгруппе «раннею начала», что подтверждено сшшстически ('/2=6,11; ; df=l; р=0,013) 2 R подгруппе больных с началом заболевания позже 45 лет не обнаружено достоверных отличий в распределении генотипов PONI по сравнению с контролем.

3. Носители аллеля M в гомозиготном состоянии заболевали на 4,2 года раньше по сравнению с генотипом L/L, а гетерозиготные носители аллеля M - на 1,7 года раньше по сравнению с носителями генотипа L/L

(таблица 5, различие недостоверно — р=0,38). Таким образом, носители

двойной дозы М-аллеля заболевали на 2,5 года раньше по сравнению с

гетерозиготными носителями аллеля М.

Таблица 5. Возраст манифестации БП у носителей разных генотипов полиморфизма L54M гена PONI

Генотипы LS4M гена PONI Разброс возраста манифестации БП (в годах) Сродный возраст манифестации БП ( в годах)

L/L 31-70 48,5±11,6

L/M 30-69 46,8± 11,0

М/М 30-55 44,3±9,3

Все носители аллеля M 30-69 45,7±9,1

Не-носители аллеля M 31-70 48,5± 11,6

Выявленная нами тенденция повышения частоты генотипа М/М в семейной группе (таблица 4), в силу небольшой численности данной группы, не позволила рассчитывать на получение статистической достоверности. Та же закономерность была ранее выявлена в российской популяции авторами из Санкт-Петербурга, которые показали, что риск развития семейной БП у носителей генотипа М/М возрастает в 7,29 раз [Пчелина СН, 2000] Можно сделать вывод, чго «неблагоприятная» роль М-аллеля гена PONI является универсальной как в отношении спорадической, так и в отношении семейной формы БП.

Проведенное нами исследование позволяет сделать вывод, что генотип М/М гена PONI повышает риск развития БП и способствует раннем началу заболевания, по-видимому, за счет снижения нсйропротективной функции фермента параоксоназы. Носшельство «неблагоприятного» аллеля M характеризуется отчетливом дозо-зависимым эффектом в отношении возраста начала БП, в то время аллель L является «нротективным» и в двойной дозе отсрочивает начало БП.

3,1.3. Анализ полиморфизма в гене ароЕ

Аполипопротеин Е (ароЕ) играет ключевую роль в метаболизме липидов (особенно «строительного» холестерина) и их перераспределении между клетками в процессе репарации [Mahley R, 1988]. Как показали работы ряда авторов, определенные аллельные варианты гена ароЕ могут играть роль фактора риска (аллель е4) или антириска (аллель в2) в механизмах генетической

предрасположенности к развитию ряда нейродегенератив1гых заболеваний

Щербатых Т В, 2000; RubinszteinD etal, Saunders A et al, 1996].

Таблица 6. Распределение генотипов ароЕ и частота аллеля ароЕ-е4 в различных группах больных БП и в контроле

Группы Генотипы (количество, частота %) Аллели частота, %

е2/е2 е2/бЗ еЗ/ЕЗ еЗ/84 e4/s4 s2/e4 еЗ Е4 е2

Общая группа БП п=106 0 13 (12,3) 64 (60,4) 26 (24,5) 1 (0,9) 2 (1,9) 78,8 14,2 7

Спорадическая БП п=96 0 11 (П,5) 58 (60,4) 24 (25) 1 (1Д) 2 (2) 78,6 14,6 6,8

Семейная группа БП 11=10 0 2 (20) 6 (60) 2 (20) 0 0 80 10 10

Спорадическая БП с ранним началом п=55 0 (0,0) 5 (9,1) 29 (52,7) 18 (32,7) 1 (1,8) 2 (3,7) 73,6 20 6,4

Спорадическая БП с поздним началом N=45 0 (0,0) 6 (14,6) 29 (70,8) 6 (14,6) 0 (0,0) 0 (0,0) 85,2 7,4 7,4

Контрольная группа п=75 0 (0,0) 11 (14,7) 45 (60,0) 17 (22,7) 0 (0,0) 2 (2,6) 78,7 12,6 8,7

В нашей выборке нами не выявлено достоверных различий в распределении отдельных аллелей и генотипов гена ароЕ как в общей группе больных БП, так и в различных возрастных подгруппах, по сравнению с контролем (таблица 6). Получение нами данные об 01сутствие значительной 1енетической ассоциации БП с аллельными вариашами 1ена ароЕ соответствую! аналогичными результатам, полученным в некоторых других популяциях мира [Rubinsztein D et al, 1994, Koller W etal., 1995; ZareparsiS etal, 1997].

Следует отдельно отметить, что относительная частота аллеля е4 в подгруппе БП с ранним началом достоверно отличалась от таковой в подгруппе БП позднего начала - 20% и 7.4%, соответственно (х2=5,1; df=1 ; р=0,024). Нами выявлено также достоверное отличие частот генотипа еЗ/еЗ в группе позднего начала по сравнению с группой раннего начала (х2=5,6; df=l; р=0,017) Эти данные свидетельствует в

пользу того, что ароЕ является значимым фактором риска в формировании

генетической предрасположенности к развитию именно ранней формы БП

Таблица 7. Возраст манифестации БП у носителей аллели с4 по сравнению с больными, имеющими другие генотипы ароЕ

Генотипы аполипопротеииа £ Разброс возраста манифестации БП (в годах) Средний возраст манифестации БП (в годах)

Носители аллеля е4 (еЗ/е4, е4/е4, е2/4,) 33-70 45,48 ± 8,32

«Не-носители» аллеля е4 (еЗ/еЗ, е2/еЗ, е2/е2) 30-70 48,04 ± 9,24

Нами также исследовалась взаимосвязь возраста начала заболевания и носительства различных генотипов ароЕ. Результаты этого анализа свидетельствуют в пользу того, что аллель е4 оказывает модулирующее дозо-зависимое влияние на возраст манифестации БП и способствует более раннему появлению симптомов. Сравнение возраста начала болезни у носителей и «неносителей» аллеля е4 показало наличие тенденции к более ранней манифестации заболевания в группе носителей аллеля е4 (таблица 7, соответственно 45,48 ± 8,32 и 48,04 ± 9,24), хотя данная закономерность не достигала уровня статистической значимости (р=0,26). Аллель е4 в хетерозшогпом состоянии способствовал более ранней манифестации БП (таблица 8), а редкий генотип е4/е4 был выявлен только в одном случае, когда заболевание дебютировало в необычно молодом возрасте - в 35 лет, что существенно отличается от среднего возраста начала заболевания во всех обследованных группах больных БП.

Таблица 8. Возраст манифестации БП у носителей разных генотипов ароЕ

Генотипы ароЕ Разброс возраста манифест ации БП (в годах) Средний возраст манифестации БП (в годах)

е2/е2 -0- -0-

е2/еЗ 30-64 45,9±9,6

еЗ/еЗ 30-70 48,4 ± 9,2

еЗ/е4 33-70 46,1 ± 8,9

е2/е4 41 -44 42,5± 1,5

ё4/е4 35 35

3.1.4. Анализ полиморфизма S18Y в гене VCH-L1

В отличие от остальных исследованных в работе полиморфизмов, замена

S18Y в гене UCH-L1 может иметь значение в механизмах нейропротекции, о чем

свидетельствуют недавние результаты исследований в японской, американской и

германской популяции. Показано, в частности, что аллель Y гена UCH-L1

достоверно реже встречается среди пациентов с БП, а в общей популяции снижает

риск развития БП на 50%; гомозиготное носительство Y-аллеля усиливает его

протективную роль [Maraganore D et al, 1999; Satoh J et al, 2001, Momose Y. et

al, 2002]. Результаты наших собственных исследований полиморфизма S18Y в

гене UCH-L1 на примере сербской выборки больных БП представлены в таблице 9.

Таблица 9. Распределение генотипов S/S, S/Y и Y/Y гена VCH-L1 в различных группах больных БП и контроле

Группы Генотипы Аллели частота, %

S/S S/Y Y/Y

и % п % п % аллель S аллель Y

Общая группа БП п=10б 66 62,3 38 35,8 2 1,9 81,2 19,8

Спорадическая БП п=96 58 60,4 36 37,5 2 2,1 81,2 19,8

Спорадическая БП с ранним началом п=55 36 65,5 18 32,7 1 1,8 81,2 18,2

Спорадическая БП с поздним началом п=41 22 53,7 18 43,9 1 2,4 75,6 24,4

Семейная группа БП п=10 8 80 2 20 0 0 90 10

Контроль п=75 52 69,4 19 25,3 4 5,3 82 18

При сравнительном анализе полученных результатов нами было выявлено достоверное различие по распределению генотипов в общей группе, при спорадической БП и БП с поздним началом по сравнению с группой контроля -

таблица 9 (х2=7,95; df=2; р=0,0187). Частота генотипа Y/Y гена UCH-L1 была достоверно (в 2,7 раза) выше в группе контроля, чго хорошо согласуется с аналогичными данными других авторов и может косвенно свидетельствовать о протективной роли Y аллеля в отношении риска развития БП [Elbaz A et al, 2003]. Генотип S/Y чаще встречался в группе больных БП. чем в группе контроля, а самая высокая частота генотипа S/Y была отмечена у больных БП с поздним началом симптомов Эти данные позволяют предположить, что аллель Y (хогя бы в одной копии), обладает свойством отсрочивать начало БП

Таблица 10. Возраст манифестации БП у носителей разных генотипов полиморфизма S18Y гена VCH-L1

Генотипы S18Y гена UCH-L1 Разброс возраста манифестации БП (в годах) Средний возраст манифестации БП (в годах)

S/S 30-70 47,2±9,9

S/Y 30-67 47,3 ±8,2

Y/Y 42-64 53±11

Все носители аллеля Y 30-67 47,6±8,4

Не-носители аллеля Y 30-70 47,2±9,9

Для наиболее часто встречающихся генотипов S/S и S/Y достоверных различий в возрасте начала болезни между соответствующими группами больных получено не было (таблица 10).

3.1.5. Анализ полиморфизма V380L в гене паркинг

Проведенные исследования в ряде европейских стран показали связь спорадической БП, в том числе ранней формы болезни, с гомозиготным носительством аллеля V гена паркина [Klein С et al, 2000, Lucking С et al, 2003] Результаты наших исследований данного полиморфизма при БП представлены в таблице 11.

Нами не было выявлено достоверных различий в распределении генотипов и отдельных аллелей между больными БП и контролем (х2=0,63; df=2, р=0,729) Проведенный анализ взаимосвязи генотипов и возраста манифестации симптомов БП выявил тенденцию более раннего начала болезни у носителей «неблагоприятного» аллеля V но сравнению с носителями «благоприятного» аллеля L (46,5±8,8 лет и 50,5-t9,9 лет) Указанный эффект был дозо-зависимым' хотя

Таблица 11. Распределение генотипов У/У, У/Ь и Ь/Ь гена паркина в различных группах больных БП и в контроле.

Группы Генотипы Аллели частота, %

У/У V/L L/L

п % п % п % аллель V аллель L

Общая группа БП п=106 84 79,3 21 19,8 1 0,9 89,2 10,8

Спорадическая БП п=96 75 78,1 20 20,8 1 1,1 88,5 11,5

Спорадическая БП с ранним началом п=55 44 80 10 18,2 1 1,8 89,1 10,9

Спорадическая БП с поздним началом п=41 31 75,6 10 24,4 0 0 87,8 12,2

Семейная группа БП п=10 9 90 1 10 0 0 95 5

Контроль п=75 57 76 17 22,7 1 1,3 87,3 12.7

Таблица 12. Возраст манифестации БП у носителей разных генотипов полиморфизма У380Ь гена паркина.

Геиотипы V380L гена паркина Разброс возраста манифестации БП (в годах) Средний возраст манифестации БП (в годах)

V/V 19-70 46,5±8,8

V/L 39-69 51,19±9,72

L/L 35 35±0

Все носители аллеля L 35-67 50,5±9,9

Не-носители аллеля L 30-70 46,5±8,8

генотип Ы, наблюдался только у одного пациента, заболевание у него проявилось в возрасте 35 лет (таблица 12). Эти данные позволять заключить, что полиморфизм У380Ь в гене паркинг не является самостоятельным фактором риска развития БП в сербской популяции, но при этом носительство аллеля V способствует более

раннему началу БП. Можно предположить, что аллель L является протективним фактором, отсрочивающим манифестацию БП, но эта гипотеза нуждается в дальнейшем изучении [Lucking С. et al., 2003]

3.1.6. Анализ комбинированных полиморфизмов в генах-кандидатах

С целью исследования возможного взаимодействия генов в формировании предрасположенности к БП нами в различных клинических группах был проведен анализ комбинированных генотипов, сгруппированных следующим образом:

• комбинированный генотип I - носители, как минимум двух «неблагоприятных» аллелей в гомозиготном состоянии и еще одного «неблагоприятного» аллеля в гетерозиготном состоянии;

• комбинированный генотип II - носители трех «неблагоприятных» аллелей в гомозиготном состоянии;

• комбинированный генотип III - носительство «благоприятных» аллелей Y и L генов паркина и гена UCH-L

Проведенный анализ показал, что комбинированный генотип I в большинстве случаев встречался у пациентов со спорадической БП раннего начала (рисунок 1). Эта тенденция была еще более выражена у пациентов с комбинированным генотипом II: такой наиболее неблагоприятный генотип выявлен у 12,7% лиц в группе БП раннего начала (7 случаев) по сравнению с 2,4% в группе с поздним началом болезни (только один случай с дебютом заболевания в 54 года) Кроме этого, больные с комбинированным генотипом II заболевали на 6,8 лет раньше по сравнению с общей группой спорадической БП (рисунок 2)

Интересные данные были получены ткже при анализе благоприятного комбинированного генотипа III. Такой редкий протективный генотип в нашей выборке почти 3 раза чаще встречался в подгруппе спорадической БП позднего начала (14,6%) по сравнению с БП раннего начала (5,5%) — см рисунок 1 Соответственно, носители данного генотипа заболевали на 4,5 лет позже по сравнению с общей группой БП и lpyimoft спорадической БП (рисунок 2).

Таким образом, полученные нами результаты показали, что носительство нескольких «неблагоприятных» или, напротив «благоприятных» аллелей характеризуется отчётливым аддитивным эффектом в отношении риска или

антириска развития БП. Такое суммированные генетических эффекюв позволяет

значительно повысить расчёты риска и, на основании типирования большого числа

ключевых генов, составлять детальный «профиль» наследственной

предрасположенности у конкретного индивида. По-видимому, именно в таких

тщательно сформированных генетических группах риска можно ставить вопрос о

проведении комплекса профилактических мероприятий в отношении БП.

Рисунок 1. Анализ распределения комбинированных генотипов в подгруппах больных БП

Общая БП Спорад БП Ранняя БП Поздняя БП >мейная БП

генотип I | 47,2 50 56,4 | 39,1 30 генотип II I 7^6 8,3 12,7 | 2,4 0

генотип III) 8,5 9,4 5,5 [ 14,6 0

Выявленные в настоящей работе генетические ассоциации оказались наиболее значимыми в подгруппе пациентов с ранним началом (до 40—45 лет), что показывает важную роль генетических механизмов предрасположенности в развитии именно ранней формы БП, а также обосновывает выделение этой формы в отдельную этио-патогенетическую группу. Эта точка зрения, высказывавшаяся ранее Mouradian М (2002) и Tuner С, et al (1999), на примере сербской популяции находит свое четкое статистическое подтверждение. Напротив, при позднем начале заболевания факторы внешней среды является ведущими в формировании предрасположенности к БП по сравнению с генетической составляющей

Рисунок 2. Анализ комбинированных генотипов с точки зрения возраста манифестации БП

Семейная БП

Поздняя БП

Ранняя БП

Спорадическая БП

Общая БП

20 40 60

возраст (в годах)

□ генотип III ■ генотип II агенотип I

□ средний возраст

4.2. Молекулярный анализ наследственных дофа-чувствительных экстрапирамидных синдромов

Нами впервые в сербской популяции проведена молекулярная идентификация ряда наследственных дофа-чувствительных экстрапирамидных синдромов, имеющих фенотипическое сходство с БП - аутосомно-рецессивного ювенильн01 о паркинсонизма (одной из форм первичного паркинсонизма) и аутосомно-доминантной дофа-чувствительной дистопии Мутационный скрининг соответствующих генов - паркина и СтСН-1 - был проведен у 20 больных с дистонико-паркинсоническими фенотипами, дебютировавшими в возрасте до 30 лет и характеризовавшимися высокой чувствительностью к препаратам леводопы В 4 сербских семьях нами были выявлены 4 мутации в изучаемых генах - 2 мутации в гене ОСН-1 и 2 мутации в гене паркине.

В семье ДЧД-1 (см. рисунок 3) нами была обнаружена новая, не описанная в литературе точковая 1егерозиготная мутация в 4-м экзоне гена ОСН-1 • выявленная мутация 5200—>А приводит к замена глутаминовой кислоты на лизин в 173-м

положении белка GCH-I (рисунок 4). Вторая мутация — гомозиготная делеция в 1-м интроне гена GCH-I (IVSl-85del А) - была выявлена нами в семье ДЧД-2. Эта мутация находится в некодирующей области гена, что является чрезвычайной редкостью и свидетельствует о нарушении экспрессии GCH-I В обследованных семьях клинико-генетический анализ позволяет установить аутосомно-доминантный тип наследования, причем в семье ДЧД-1 отмечается пропуск поколения (мать нробанда клинически здорова), что свидетельствует о неполной пенетрантности мутантного гена (см. рисунок 3). Неполная пенетрантносгь гена GCH-I описана также рядом авторов в семьях с ДЧД различного этнического происхождения [.Eldrige et al, J989] Среди обследованных нами пациентов с мутацией в гене GCH-I наблюдается практически равное соотношение лиц женского и мужского пола (2:2). Эти данные не согласуются с описанным в литературе преобладанием лиц женского пола среди больных ДЧД; вероятно, полученное расхождение может быть артефактом, связанным с относительно небольшим числом больных в обследованных нами родословных.

В семье ДЧД-1 наблюдался «классический» фенотип ДЧД: начало заболевания на первом десятилетии жизни; генерализованая ригидная форма дистонии со статокинетическим тремором; наличие дневных флюктуаций моторики — ухудшение состояния к вечеру и улучшение утром или после дневного сна; «драматический» эффект малых доз препарата леводопы (125-250 мг), который сохраняется на протяжении многих лет, без побочных эффектов. Во второй семье (ДЧД-2) клиническая картина также характеризовалась классическим генерализованым фенотипом ДЧД доброкачественного течения, хорошо купирующимся приемом 250 мг мадопара в сутки.

Выявленные у 2 больных мутации в гене паркине представлены гетерозиготными делециями 4-го и 6-го экзонов (рисунок 5). В обоих случаях «ядро» клинического фенотипа составлял типичный паркинсоновский синдром, чувствительный к препаратм леводопы. Относительно поздняя манифестация симптомов паркинсонизма у этих больных - в 44 и 37 лет - не является типичным признаком «паркинопатии», но соответствует описанному в литературе достаточно широкому разбросу возрастов начала заболевания. Известно, что примерно у 25% больных с мутациями в гене паркине заболевание не является «ювенильным» и

начинается в возрасте от 30 до 68 лет \Lucking С et а1, 2000]. У больного с делецней 6-го экзона гена паркина следует отметить размашистые баллистические движения по гемшипу в качестве первоначальных симптомов заболевания, чш является большой редкостью и расширяет существующие представления о фенотипическом спектре паркин-ассоциированного паркинсонизма. В настоящей работе нами получен первый опыт прямой ДНК-диагностики ДЧД и ЮП в сербской популяции, а также опыт медико-генетического консультирования отягощёкных семей на основе современных молекулярных технологии. Полученные нами результаты подтверждают, что ДЧД и ЮП, связанные с мутациями в генах ССН-1 и паркине, являются широко распространёнными формам наследственных экстрапирамидных дофа-чувствительных заболеваний и выявляются, в том числе, и у больных в популяции Сербии. Рисунок 3. Генеалогические схемы обследованных семей.

ДЧД-1

ДЧД-2

III

II

дчд-з

ч

РИСУНОК 4. Мутация 52(Ю—»А в 4-м экзоие гена йСН-Т (в гетерозиготном состоянии).

Т ШЗ- "Х~ -А. О- Ль А А. ТГ С ~Г А

Рисунок 5. Идентификация мутаций в гене паркине.

А. - Гетерозиготная делеция 4-го экзопа (стрелка указывает на область

уменьшения «дозы гена» у больного по сравнению с контролем).

Б. - Гетерозиготная делеция 6-го экзона гена паркина (стрелка указывает на

область уменьшения «дозы гена» у больного по сравнению с контролем).

На А и Б цифры по краям электрофореграмм означают номера экзонов гена

паркипа, амплифицированных в мультиплексных реакциях.

Б

ю

■а^уг«. . -1)- }

больной контроль контроль больной

ВЫВОДЫ

1. В сербской популяции впервые установлен вклад ряда генов в формирование предрасположенности к развитию БП:

• гомозиготное носительство аллелей — А (ген цитохромоксидазы) и М (ген параоксоназы 1) повышает риск развития БП в 3,1 и 3.2 раза, соответственно;

• в сербской популяции аллель Y гена убиквитин-карбокситерминальной гидролазы является фактором антириска в отношении БП.

2. Установлено модулирующее влияние генов CYP2D6, PONI и ароЕ на возраст манифестации БП: носительство аллелей А, М и g4 этих генов способствует более раннему началу заболевания, причем для алделя ароЕ-е4 этот эффект носит дозо-зависимый характер.

3. Неблагоприятный прогностический эффект носительсиа указанных полиморфных аллелей «генов риска» может суммироваться и ноешь, таким образом, аддитивный характер; это позволяет на основании результатов ДНК-анализа устанавливать генетический профиль консультируемых лиц и формировать генетические группы риска в отношении БП.

4. В подгруппе БП с ранним началом симптомов частота встречаемости «неблагоприятных» аллелей генов CYP2D6, PONI и ароЕ достоверно выше по сравнению с контролем. Это позволяет считать раннюю форму БП особым вариантом первичного паркинсонизма, в развитии которого вклад генетических факторов наиболее значим. Напротив, при поздней БП роль генетической составляющей менее значима по сравнению со средовым и другим факторами.

5. В сербской популяции у больных с наследственными дофа-чувствительными экстрапирамидными синдромами — дофа-чувствительной дистонией и ювенильным паркинсонизмом — впервые выявлены мутации в генах GCH-1 и паркине\ мутации 520G—>А и IVSl-85delA в гене GCH-I являются новыми и не описаны ранее в литературе. Полученные результаты подтверждают широкую распространенность аутосомно-доминантной ДЧД и аутосомно-рецессивного ЮП в различных популяциях мира, в том числе и в Сербии

6. В работе получен первый опыт прямой ДНК-диагностики в отягощенных указанными заболеваниями семьях на территории Сербии, а также первый опыт медико-генетического консультирования этих форм патологии на основе современных технологий ДНК-анализа.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ

1 Дофа-чувствительная дисгония в сербской популяции. Всероссийская научно-практическая конференция «Современные достижения клинической генетики» Тез докл опубликованы в журнале Мед. генетика 2003; 10: 413 (соавт.: Светел М., Маркова Е Д, Сломинский П.А , Иллариошкин С Н и др.).

2 Clinical and molecular genetic analysis of hereditary dopa-responsive syndromes in Serbian population. In: 35th International Danube Symposium for neurological science's & continuing education Book of abstracts Belgrade, 2003: 125 (соавт.- Slominsky P A , Svetel M , Markova E.D , Illarioshkin S.N. et al.).

3. Parkinson's disease in Serbian population: genetic association studies In- 35th International Danube Symposium for neurological sciences & continuing education Book of abstracts Belgrade, 2003: 126 (соавт.. Illarioshkin S N., Kostid V S., Svetel M et al.).

4. Дофа-чувствительная дистония и сходные наследственные экстрапирамидные синдромы в сербской популяции. Мед генетика 2003, 12: 533-536 (соавт Сломинский П А , Светел М , Шадрина М И , Иллариошкин С.Н. и др ).

5. Clinical and molecular genetic analysis of hereditary dopa-responsive syndromes in Serbian population. Mov Disord. 2004, 19 (Suppl 9)- S356 (соавт. Slominsky PA, Svetel M., Illarioshkin S.N., Kostic V S., Markova E.D.).

6 Klim£ko-gencti6ka analiza Parkinsonove bolesti XII kongres neurologa Srbije i Crne Gore sa medunarodnim ucesce: Zbornik sazetaka Novi Sad, 2004: 45-46 (соавт.: Kostid V.S , Illarioshkin S.N., Svetel M.).

7. Khnicka l genetiika analiza pacjijenata sa Parkinsonovom boleScu ranog poietka. XII kongres neurologa Srbije i Crne Gore sa medunarodnim uie$6em' Zbornik sazetaka Novi Sad, 2004: 23-24 (соавт. Gavrilovid J., Kostic V.S., Kleine C., Illarioshkin S.N.)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БП болезнь Паркинсона

ДИ - доверительный интервал

ДЧД - дофа-чувствительная дистония

юп - ювенильный паркинсонизм

ароЕ аполипопротеин Е

CYP2D6 ген семейства цитохромоксидазы

GCH-I ген ГТФ-циклогидролазы-1

PON1 ген параоксоназы 1

RR - относительный риск

UCH-L1 - ген убиквшшмарбокаперминащюй гидролазы

519 9 9 5

РНБ Русский фонд

2005-4 15964

Актуальность работы. Достижения молекулярной генетики последнего десятилетия привели к идентификации человеческого генома, а также выяснению роли нескольких тысяч генов в этиологии наследственных заболеваний человека Это позволяет уже в настоящее время проводить молекулярную диагностику и специфическую профилактику многих моногенных заболеваний, а также определять генетические факторы риска развития наиболее распространенных мультифакториальных форм патологии [Горбунова ВН, Баранов ВС, 1997, Киселев JIJI, 2000, Evans G, 1998] Появился принципиально новый раздел медицины - молекулярная медицина (а также ее подразделы - молекулярная неврология, молекулярная кардиология и т д), они основаны на точном знании молекулярной природы первичных генетических и белковых дефектов при изучаемых заболеваниях [Горбунова В Н идр, 2000, Beaudet А , 1999]

Прогресс в области изучения медицинской геномики в полной мере затронул и неврологию [Иванова-Смоленская ИА, 1996, Иллариошкин СН и др, 2002, Brice А, 1998, Pulst S, 2003] Помимо внедрения в практику технологий ДНК-анализа генов наследственных болезней нервной системы, все шире исследуются молекулярно-биологические основы поддержания белкового гомеостаза в клетке с целью установления механизмов развития наиболее значимых нейродегенеративных заболеваний человека - болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, полиглутаминовых болезней и др [Иллариошкин С Н, 2003]

Болезнь Паркинсона (БП) представляет одно из наиболее распространенных возраст-зависимых нейродегенеративных заболеваний человека, в механизмах развития которой большое значение в последние годы придается генетическим факторам Непосредственно наследственные формы составляют, по данным разных авторов, около 5-10% всех случаев БП [ WzolekZ et al, 1995, Golbe L et al, 1996], причем показана выраженная генетическая гетерогенность и наличие, как минимум, 8 различных генетических локусов аутосомно-доминантной БП - на хромосомах 4q, 2р, 4р, 12q, lp, 2q и 5q [Pohmeropoulos М et al, 1996, Gasser T et al, 1998, FarrerM et al 1999 Leroy E et al, 1998, Funayama M et al, 2002, Hicks A etal, 2002, PankratzN et al, 2003, Marx P et al ,2003]

Этиология спорадических случаев БП рассматривается как результат взаимодействия эндогенных факторов (совокупности генов, определяющих «метаболический фон» конкретного индивида) и факторов окружающей среды [Иллариошкин СН, 2003, Spacey S, Wood N, 1999, Mouradian M, 2002] Для оценки роли генетики в развитии подобных мультифакториальных заболеваний используется анализ ассоциаций болезни с аллельными вариантами генов, имеющих отношение к ключевым звеньям патогенеза болезни Применительно к БП, были получены определенные ассоциации болезни с генами, продукты которых принимают участие в метаболизме экзогенных токсинов и ксенобиотиков, функционировании системы антиоксидантной защиты клетки, обмене и транспорте дофамина, окислительном фосфорилировании, процессах репарации нейронов [Иллариошкин С Н и др 2002, Nussbaum R, Polymeropoulos М, 1997, Tan Е etal, 2000, Mouradian М, 2002] Результаты исследований генетической предрасположенности к развитию БП существенно варьируют в тех или иных странах и этнических группах, что доказывает популяционно-специфичный характер генетических ассоциаций и диктует необходимость сравнительно анализа получаемых данных в разных популяциях мира

Особой формой первичного паркинсонизма, имеющей значительную генетическую компоненту, является ювенильный (юношеский) паркинсонизм Это заболевание обычно наследуется по аутосомно-рецессивному типу и может быть связано с мутациями в 4 самостоятельных генетических локусах [Kitada Т et al, 1998 Valente М et al 2001 Van Duijn M et al, 2001, Hampshine J et al, 2001], для трех из которых идентифицированы первичные белковые продукты - паркин (хромосома 6q25 2-27), PINK1 (хромосома 1р35-р36) и DJ-1 (хромосома 1р36) Мутации в гене паркина - убиквитин-лигазного фермента, играющего ключевую роль в протеасомной деградации клеточных белков - являются наиболее частой причиной ювенильного паркинсонизма [Загоровская ТБ, 2002, Kitada Т et al, 1998, Lucking С et al 2000, Maruyama M et al, 2000] Характерными фенотипическими особенностями паркинопатий являются раннее начало, сочетание паркинсоновского синдрома с дистонией, быстрое развитие леводопа-индуцированных дискинезий, дневные флюктуации симптомов, относительно благоприятное течение Однако, в последние годы было показано, что иногда мутации в паркине могут приводить к клинической картине «классической» поздней БП, дофа-чувствительной дистонии, паркинсонизма с атаксией и др [.Иллариошкин СН и др 2002] Таким образом, выяснение истинного фенотипического спектра паркинопатий и частоты мутаций в гене паркина у больных в различных популяциях являются весьма актуальными задачами современной клинической неврологии и нейрогенетики

Еще одним наследственным дофа-чувствительным экстрапирамидным заболеванием является дофа-чувствительная дистония (ДЧД) Она наследуется по аутосомно-доминантному и (гораздо реже) по аутосомно-рецессивному типу, клинически характеризуясь дистоний с повышением мышечного тонуса, формированием патологических поз, дневными флюктуациями симптомов и «драматическим эффектом» малых доз леводопы [Nygaard Т et al, 1993, Маркова ЕД, 1975, 2002] Основной ген ДЧД локализован на хромосоме 14q и кодирует ключевой фермент метаболизма дофамина - ГТФ-циклогидролазу-I (GCH-I) [Ichinose Н et al, 1994] Значительное фенотипическое сходство ДЧД и ювенильного паркинсонизма диктует необходимость разработки методов их четкой дифференцировки, в том числе и использованием молекулярно-генетических подходов -те с помощью комбинированного мутационного скрининга генов паркина и GCH-I

Следует отметить, что до настоящего времени в сербской популяции клинико-генетический анализ различных форм дофа-чувстительных экстрапирамидных синдромов не проводился

Цель работы: клинико-генетический анализ болезни Паркинсона, ювенильного паркинсонизма и дофа-чувствительной дистонии в сербской популяции на основе исследования мутаций и полиморфизмов в соответствующих генах-кандидатах

Исходя из поставленной в работе цели, были сформулированы следующие задачи исследования

1) Анализ частот полиморфных аллелей генов цитохромоксидазы (CYP2D6), параоксоназы (PON1), аполипопротеина Е (ароЕ), убиквитин-карбокситарминалъной гидролазы (UCH-L1) и паркина у пациентов-сербов с БП и в соответствующем этническом контроле

2) Сопоставление генетического статуса обследованных больных БП с особенностями клинической картины заболевания, а также анализ роли исследованных генов в формировании предрасположенности к БП.

3) Мутационный скрининг генов паркина и GCH-I у больных с наследственными дофа-чувствительным экстрапирамидными синдромами (ювенильный паркинсонизм, дофа-чувствительная дистония) в сербской популяции.

4) Детальный анализ фенотипических проявлений ювенильного паркинсонизма и дофа-чувствительной дистонии в случаях, диагностически подтвержденных на молекулярном уровне.

5) Разработка принципов прямой ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования в сербских семьях, отягощенных ювенильным паркинсонизмом и дофа-чувствительной дистонией.

Научная новизна

Впервые в славянской популяции Сербии проведен анализ молекулярно-генетических факторов, определяющих развитие БП и фенотипически сходных дофа-чувствительных экстрапирамидных синдромов. Установлен вклад А и М-аллелей генов CYP2D6 и PON1 в формировании предрасположенности к БП, а также обосновано протективное значение носительства Y-аллеля гена UCH-L1. Установлено что гены ароЕ, CYP2D6 и PON1 обладают модулирующим эффектом в отношении возраста манифестации БП. Полученные данные позволяют выделить ранние случаи БП в особую форму первичного паркинсонизма, в развитии которой наиболее значима роль генетических факторов.

Впервые в сербской популяции при молекулярно-генетическом анализе дофа-чувствительной дистонии и ювенильного паркинсонизма идентифицированы мутациии в генах GCH-I и паркине, причём мутации 520G—>А и IVSl-85delA гена

GCH-I выявлены впервые в мире. Тем самим получено подтверждение, что аутосомно-доминантная дофа-чувствительная дистония и аутосомно-рецессивний ювенильный паркинсонизам являются широко распространенными заболеваниями встречающимися в различных популяциях мира, в том числе и в Сербии.

Практическая значимость. На основании анализа генетических ассоциаций рассчитаны конкретные величины риска БП у носителей «неблагоприятных» генотипов, а также показан аддитивный (суммирующий) эффект как «неблагоприятных», так и «благоприятных» аллелей в реализации генетического риска. Это позволяет сформировать среди обследованных лиц группы риска в отношении развития БП, которые должны становится объектом целенаправленных профилактических мероприятий. Получен первый опыт прямой ДНК-диагностики дофа-чувствительной дистонии и ювенильного паркинсонизма в семьях сербского этнического происхождения, а также первый опыт медико-генетического консультирования этих форм патологии на основе мутационного скрининга генов GCH-I и паркина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Впервые в сербской популяции проведен комплексный клинико-генетический анализ БП и сходных дофа-чувствительных экстрапирамдных синдромов на основании исследования мутаций и полиморфизмов в генах CYP2D6, PON1, UCH-L1, ароЕ, GCH-1 и паркинг.

2. Генетические факторы играют важную роль в формировании предрасположенности к БП, а также оказывают влияние на особенности течения заболевания. Определенные аллели генов CYP2D6, PON1, UCH-L1 приводят к повышению или снижению риска развития БП по сравнению с общей популяцией; помимо этого, носительство «неблагоприятных» аллелей генов CYP2D6, PON1, UCH-L1, ароЕ способствует более ранней манифестации заболевания.

3. Роль изученных генов предрасположенности наиболее значима в развитии ранней формы БП (т.е. в случае с возрастом манифестации симптомов до 45 лет).

4. В сербской популяции у больных с наследственными дофа чувствительными экстрапирамидными синдромами — дофа-чувствительной дистониой и ювенильным паркинсонизмом — впервые выявлены мутации (в т.ч. не описанные ранее в литературе) в генах GCH-I и паркинг Получен первый опыт прямой ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования в отягощенных семьях на территории Сербии.

Автор выражает искреннюю благодарность руководителю нейрогенетического отделения ГУ НИИ неврологии РАМН профессору И.А. Ивановой-Смоленской и ведущему научному сотруднику отделения Е.Д. Марковой за постоянную помощь и поддержку при планировании и выполнении исследования, научным сотрудникам отделения Т.Б.Загоровской и С.А.Клюшникову, а также ведущему науч. сотруднику отдела молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН П.А.Сломинскому (руководитель отдела - Лауреат Государственной премии РФ, профессор С.А.Лим-борская) за помощь в выполнении молекулярно-генетической части работы. Автор признателен коллективу сотрудников IV отделения Неврологической клиники Клинического центра Сербии (КЦС) в Белграде (руководитель — профессор В.С.Костич) за помощь в выполнении клинической части исследования.

ВЫВОДЫ

1. В сербской популяции впервые установлен вклад ряда генов в формирование предрасположенности к развитию БП:

• носительство аллелей — А (ген цитохромоксидазы) и М (ген параоксоназы 1) повышает риск развития БП в 3,1 и 3,2 раза, соответственно;

• в сербской популяции аллель Y гена убиквитин-карбокситерминальной гидролазы является фактором антириска в отношении БП.

2. Установлено модулирующее влияние генов CYP2D6, PON1 и ароЕ на возраст манифестации БП: носительство аллелей А, М и е4 этих генов способствует более раннему началу заболевания, причем для аллеля ароЕ-£4 этот эффект носит дозо-зависимый характер.

3. Неблагоприятный прогностический эффект носительства указанных полиморфных аллелей «генов риска» может суммироваться и носить, таким образом, аддитивный характер; это позволяет на основании результатов ДНК-анализа устанавливать генетический профиль консультируемых лиц и формировать генетические группы риска в отношении БП.

4. В подгруппе БП с ранним началом симптомов частота встречаемости «неблагоприятных» аллелей генов CYP2D6, PON1 и ароЕ достоверно выше по сравнению с контролем. Это позволяет считать раннюю форму БП особым вариантом первичного паркинсонизма, в развитии которого вклад генетических факторов наиболее значим. Напротив, при поздней БП роль генетической составляющей менее значима по сравнению со средовым и другим факторами.

5. В сербской популяции у больных с наследственными дофа-чувствительными экстрапирамидными синдромами — дофа-чувствительной дистониой и ювенильным паркинсонизмом — впервые выявлены мутации в генах GCH-I и паркине\ мутации 520G—>А и IVSl-85delA в гене GCH-I являются новыми и не описаны ранее в литературе. Полученные результаты подтверждают широкую распространенность аутосомно-доминантной ДЧД и аутосомно-рецессивного ЮП в различных популяциях мира, в том числе и в Сербии.

6. В работе получен первый опыт прямой ДНК-диагностики в отягощенных указанными заболеваниями семьях на территории Сербии, а также первый опыт медико-генетического консультирования этих форм патологии на основе современных технологий ДНК-анализа.