Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клинико-генетические критерии эффективности ингаляционной глюкокортикоидной терапии у детей с бронхиальной астмой

ЖДАНОВА Марша Владимировна

На правах рукописи

003461870

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНГАЛЯЦИОННОЙ ГЛЮКОКОРТИКОИДНОЙ ТЕРАПИИ У ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14.00.09 - педиатрия 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г«2-Ф:З 2::О

Санкт-Петербург 2009

003461870

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт - Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» на кафедре педиатрии им. профессора И.М.Воронцова ФПК и ПП и в лаборатории молекулярной диагностики с расширенной группой молекулярной кардиологии Научно-исследовательского центра ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Новик Геннадий Айзикович доктор медицинских наук Ларионова Валентина Ильинична

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Сергеева Клара Михайловна

доктор медицинских наук, профессор А санов Алий Юрьевич

Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится « 2 » марта 2009 г. на заседании диссертационного совета Д 208.087.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санюг-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава по адресу: Санкт-Петербург, ул. Кантемировская, 16

Автореферат разослан «. ¿6 » ЯНЪЛРр_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Чухловина М.Л.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

На современном этапе бронхиальная астма (БА) принадлежит к числу наиболее распространенных заболеваний в мире у детей. Бронхиальной астмой страдает от 5 до 10% детского населения [GINA, 2006]. Многочисленные исследования демонстрируют тенденцию к росту заболеваемости БА и утяжелению ее течения [Баранов А.А, Балаболкин И.И, 2006; Коростовцев Д.С. и др., 2002; Федосеев Г.Б и др., 2006; American Academy of Allergy Asthma and Immunology, 2008; Masoli M. et al., 2004].

Надо отметить, что в более ранних изданиях GINA и в созданной на ее основе Национальной программе, стратегия терапии БА основывалась на классификации заболевания по степени тяжести [Национальная программа «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика», 1997, 2006; GINA, 2002]. В новой редакции GINA центральное место для выбора объема терапии отводится не классификации тяжести течения БА, а критериям ее контроля [GINA, 2006]. Однако используемая многоступенчатая система лечения больных и контроля терапии основывается на клинических данных и недостаточно точных одномоментных измерениях показателей форсированного выдоха больных.

Принимая во внимание наличие хронического аллергического воспаления дыхательных путей у всех больных с персистирующей формой БА [Barnes P.J. et al., 1998; GINA, 2006], ингаляционные глкжокортикостероиды (ИГКС) являются препаратами первой линии в лечении данной патологии. ИГКС обладают выраженным противовоспалительным действием на уровне различных звеньев патогенеза [Barnes P.J., 2006; GINA, 2006; Szefler S., 1991]. Существует необходимость выработки объективных точных критериев использования глюкокортикоидов (ГК) и контроля эффективности проводимой терапии, поскольку некоторые пациенты нуждаются в терапии высокими дозами ГК на длительный период, причем снижение дозы приводит к дестабилизации состояния. У части этих пациентов, несмотря на увеличение дозы гормонов, комбинации их с пролонгированными бета2-адреномиметиками, пролонгированными теофиллинами или антагонистами лейкотриенов не удается достигнуть хорошего или полного контроля течения заболевания [Огородова JI.M., 2001; Barnes P.J., 2004; Difficult/therapy-resistant asthma, 1999]. Важно распознать этих пациентов на ранних сроках заболевания, т.к. отсутствие ответа на терапию часто приводит к неоправданно высоким дозам ГК с развитием побочных эффектов проводимой терапии.

Современные методы, применяемые в медицине, позволяют изучать молекулярно-генетические основы чувствительности к стероидам. В ряде ассоциативных исследований выявлены изменения чувствительности к стероидам при некоторых структурных особенностях гена глюкокортикоидного рецептора (GR) [Bray P.J., 2003]. Так предполагают наличие связи Bell полиморфизма гена GR, обусловленного заменой цитозина на гуанин в 647 положении во втором интроне гена, с метаболическими изменениями, гиперчувствительностью гипоталамо-шпофизарно-надпочечниковой системы к

глюкокортикоидам, глюкокортикоид-зависимой вазоковстрикцией [De Iudicibus S. et al., 2007; Panarelli M. et al., 1998; Stevens A et al., 2004; Van Rossum E.F.C. et al., 2004]. Tthllll полиморфизм, образующийся в результате замены цитозина на тимин в -3807 положении от точки старта транскрипции мРНК в промоторном участке гена GR, ассоциирован с повышенным базальным уровнем кортизола и относительной резистентностью к ГК [Rosmond R. et al., 2000; Van Rossum E.F.C. et al., 2004].

В нашем исследовании предметом научного интереса стало изучение связи между структурными особенностями гена GR и клиническим течением БА у детей с формированием различных форм заболевания, имеющих различные уровни контроля при терапии ИГКС, поскольку данный вопрос в доступной литературе освящен недостаточно. Кроме того, особый интерес представляло исследование строения гена GR в группе детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим, неконтролируемым течением БА

Цель исследования. Оптимизация терапии ингаляционными глюкокортикоидами у детей с бронхиальной астмой различной степени тяжести на основе результатов клинико-инструментального и молекулярно-генетического обследования.

Задачи исследования:

1. Сформировать группы детей с различной степенью тяжести БА на основании клинико-инструментального, лабораторного обследования и оценить у них эффективность терапии ИГКС.

2. Провести молекулярно-генетическое тестирование Bell и Tthllll полиморфизма гена GR и изучить распределение аллелей и генотипов.

3. Сопоставить результаты клингасо-анамнестических, инструментальных, лабораторных методов исследования с результатами молекулярно-генетического тестирования у детей, получающих ИГКС, в зависимости от пола и тяжести заболевания.

4. Выделить группу с непрерывно-рецидивирующими, неконтролируемым течением БА и провести анализ нуклеотидной последовательности 2 экзона гена GR методом секвенирования в этой группе детей.

5. Оценить влияние выявленных структурных особенностей гена GR на течение БА у детей.

6. Выявить признаки, позволяющие прогнозировать уровень контроля течения БА и оптимизировать терапию ИГКС у детей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выявлены ассоциации изученных полиморфных маркеров гена GR с особенностями течения заболевания, эффективностью терапии ИГКС и уровнем контроля Б А

2. Полиморфизм гена GR у детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим течением БА является одним из важных компонентов, определяющих

молекулярно-генетическую основу клинических особенностей течения заболевания и недостаточной эффективности терапии ИГКС. 3. Подбор индивидуальной терапии ИГКС и прогнозирование эффекта проводимого лечения у детей с БА целесообразно проводить с использованием комплекса клинико-функциональных и молекулярно-генетических методов обследования.

Научная новизна.

• Настоящая работа является первым в нашей стране комплексным исследованием, учитывающим наряду с клинико-функциональными характеристиками особенности строения гена GR при терапии ИГКС у детей сБА.

• Впервые в нашей стране проведена оценка популяционных частот аллелей и генотипов Bell и Tthl 1II полиморфизма гена GR.

• Впервые изучено влияние Bell и Tthl 1II полиморфизма гена GR на течение и формирование БА у детей, в зависимости от пола и степени тяжести заболевания.

• Впервые проведено изучение нуклеотидной последовательности 2 экзона гена GR методом прямого секвенирования в группе детей с тяжелым, неконтролируемым течением БА. Выявлены замены во 2 экзоне гена: G198A (22 кодон), G200A (23 кодон), A1220G (363 кодон), описанные в литературе, и замена G633A (167 кодон), ранее не зарегистрированная в базе данных, содержащих информацию о структуре гена GR (GenBank).

Научно-практическая значимость работы.

• Изученные Bell и Tthl III полиморфные маркеры гена GR, ассоциированные с особенностями течения заболевания и эффективностью терапии ИГКС позволяют оптимизировать лечение заболевания у детей с БА.

• Результаты изучения нуклеотидной последовательности 2 экзона у детей с тяжелой, непрерывно-рецидивирующей БА должны рассматриваться как необходимый этап в молекулярно-генетическом алгоритме исследования структуры гена GR.

• На основании полученных результатов разработаны клинико-генетические критерии оценки и прогнозирования эффективности использования ИГКС и уровня контроля БА у детей.

Внедрение результатов в практику.

Результаты исследования применены в учебном процессе на кафедре госпитальной педиатрии, кафедре факультетской педиатрии ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава, внедрены в практику подготовки и усовершенствования специалистов - педиатров кафедры педиатрии им. профессора И.М.Воронцова ФПК и ПП ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава, а также внедрены в клиническую практику детского аллергологического отделения ДГБ №2 им. Св.Марии Магдалины (г.Санкт-Петербург).

Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены на б научно-практических конференциях: X Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2006 г.), на котором постерный доклад получил специальную премию в конкурсе молодых ученых; Научно-практической конференции молодых ученых СПбМАПО (Санкт-Петербург, 2006 г.); XVI Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, П Конгресс Евроазиатского Респираторного Общества (Санкт-Петербург, 2006 г.); III Междисциплинарном конгрессе «Ребенок, врач, лекарство» (Санкт-Петербург, 2008 г.), VII Российскиом конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008 г.), European Human Genetics Conference (Барселона, 2008 г.), XX International Congress of Genetics (Берлин, 2008 г.).

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.

Личный вклад автора в проведенное исследование.

Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, изучение данных клинико-инструментального обследования детей и подростков, наследственного анамнеза и катамнеза, создана формализованная история болезни и база данных результатов обследования детей. Молекулярно-генетическое тестирование выполнено автором лично. Анализ, интерпретация, изложение полученных данных, формулирование выводов и практических рекомендаций в основном выполнены автором лично. Доля участия автора в накоплении информации - до 100%, в математико-статистической обработке - более 80%, в обобщении и анализе материала -100%.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материала и методов, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения. Список литературы включает 25 отечественных и 108 зарубежных источника. Работа изложена на 190 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 таблицами и 30 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования.

Настоящая работа основана на результатах обследования 485 детей (396 мальчиков и 89 девочек) в возрасте 2-17 лет, находившихся на обследовании и лечении на аллергологическом отделении с диагнозом БА в период с 2004 по 2005 гг. Работа выполнена на базе детского аллергологического отделения ДГБ №2 им. Св. Марии Магдалины (Санкт-Петербург) (гл. врач - А.Г.Микава, зав.отд. - О.М. Ащепкова) и лаборатории молекулярной диагностики с расширенной группой молекулярной кардиологии Научно-исследовательского центра СПбГПМА (научный руководитель - д.м.н. В.И. Ларионова).

Аллергологическое обследование включало следующие методы:

1. сбор аллергологического анамнеза (семейного и индивидуального);

2. выявление сопутствующих аллергических заболеваний;

3. постановка кожных аллергических проб скарификационным методом с использованием стандартных бытовых, эпидермальных, пыльцевых и пищевых аллергенов (МРТУ 42-67);

4. проведение ингаляционных провокационных проб (ИПП) с гнетам ином (по Т.М.Голиковой и соавт.,1980) и дистиллированной водой (ингаляция через компрессорный небулайзер «Pari Master» (Германия) в течение 15 минут);

5. проба с дозированной физической нагрузкой (ДФН) на велоэргометре от 0,5 вт/кг до 2 вт/кг веса тела на протяжении 6 минут;

6. определение содержания в сыворотке крови общего IgE и специфических IgE иммуноферментным методом.

Функциональные методы обследования:

1. Оценка функции внешнего дыхания на компьютерном спирографе («Fukuda Denshi Spirosift SP-5000», Япония) с анализом кривой «поток-объем». Оценивались следующие показатели (в процентах от должных величин, заложенных в компьютерную базу спирометра): жизненная емкость легких (VC), форсированная жизненная емкость легких (FVC), форсированная жизненная емкость за 1 сек. (FEV1), индекс Генслера (FEV1/FVC х 100), пиковая скорость форсированного выдоха (PEF), форсированная скорость выдоха в точке 25, 50 и 75% форсированной жизненной емкости легких (FEF 25, FEF50, FEF75). Пробу на обратимость обструкции проводили с использованием бронходилятаторов и считали положительной при повышении FEV1 на 12% и более.

2. Дыхательное мониторирование: исследование циркадианного ритма проходимости бронхов на основании определения пиковой скорости выдоха (ПСВ) с помощью индивидуального пикфлоуметра («Ferraris» или «Clement Clark», Великобритания) и последующей математической обработкой (Новик Г.А., 2005). После ввода данных (3-6 замеров ПСВ на протяжении 2-3 суток) по фактическим измеряемым точкам проводился обсчет результатов на компьютере с построением аппроксимирующей кривой и расчетом ряда вторичных показателей: суточная проходимость бронхов (СПб), СПб%, суточная лабильность бронхов (CJI6), стандартизированный показатель Мст (отношение СПб к максимальной ПСВ, %), максимальная ПСВ, минимальная ПСВ, Т мин (время, соответствующее минимальной ПСВ). При наличии флуктуирующего ритма рассчитывались дополнительные параметры: СПбф, СПбф %, Зр (зона риска), Т-период (наиболее близкая к 24 часам составляющая спектра ПСВ), А (среднее значение данных ПСВ).

Следующий этап исследования включал молекулярно-генетическое тестирование Bell и Tthl 1II полиморфизма гена GR.

Выделение ДНК проводили из лейкоцитов периферической крови. Идентификация аллелей выполнялась с помощью полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом (Fleury I. et.al., 2003; van Rossum EFC. et al., 2004). На данном этапе в исследование в качестве

s

контрольной группы были включены 151 практически здоровых детей 4-17 лет, проходивших клиническое обследование на базе консультативно-диагностического центра СПбГПМА.

В группе детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим, неконтролируемым течением БА (24 человека) дополнительно был произведен анализ нуклеотидной последовательности экзона 2 гена глюкокортикоидного рецептора методов секвенирования фрагментов ДНК, поскольку по данным литературы нуклеотидные замены во 2 экзоне, как и Bell и Tthllll полиморфизм, ассоциированы с изменением чувствительности к ГК.

Полученные результаты обследования детей в виде качественных и количественных клинических и инструментальных признаков (220 показателей) составили компьютерную базу данных, созданную с использованием пакета Microsoft Access (MS Office XP). Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием пакета SPSS версия 13.0.

Для сравнительного анализа данных обследования использовались следующие методы с учетом шкал (количественной, ранговой, номинальной), в которых измерены переменные:

1. Критерий Пирсона (х2) (Pearson Chi-square) для анализа таблиц сопряженности типа NxM и двустороннего критерия Фишера (Fisher Exact Test) для таблиц 2x2.

2. Непараметрический критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney U Test) для сравнения медиан двух выборок, если распределение хотя бы одной из них существенно отличалось от нормального.

3. Т-критерий Стьюдента для сравнения средних (математических ожиданий) двух выборок, если распределение каждой из них было нормальным или несущественно отличалось от нормального.

Проверка гипотезы о нормальности распределения производилась с помощью критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка (в зависимости от объема выборки).

Статистически значимыми приняты различия, по величине уровня значимости р не превышающие 0,05.

Прогностические показатели контроля течения БА рассчитывались по методу Е.В. Гублера (1990). Методом "деревья классификации" был определен доверительный интервал для балльной оценки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клиническая характеристика пациентов.

Основную группу составили 485 детей больных бронхиальной астмой в возрасте 2-17 лет (средний возраст - 12,7 лет): 396 (81,6%) мальчиков и 89 (19,4%) девочек.

Дети в возрасте до 3 лет составили 0,2%, в возрасте с 3 до 7 - 8,9%, с 7 до 11 лет - 18,6%. Преобладали дети старшей возрастной группы (с 11 до 17 лет) (72,4%),

Степень тяжести оценивалась по клиническим признакам, согласно классификации, рекомендованной GINA (2006г.). При этом большая часть

детей имела персистирующую БА средней тяжести - 261 ребенок (53,8%), тяжелая персистирующая БА была диагностирована у 123 (25,4%) детей, легкая БА отмечалась у 101 ребенка (20,8%). Среди детей с тяжелой БА была выделена груша из 24 детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим, неконтролируемым течением бронхиальной астмы.

По данным клинико-функциональных методов обследования детей были выявлены различные стадии заболевания. В стадии ремиссии заболевания находилось 295 детей (60,8%), в стадии обострения - 190 (39,2%).

При выписке из отделения 360 пациентам (74,2%) была рекомендована базисная терапия ИГКС, из них 30 (6,2%) - терапия низкими дозами, 217 (44,7%) - средними дозами, и 113 (23,3%) - высокими.

У большинства детей длительность заболевания БА с момента постановки диагноза БА составила от 3 до 7 лет (34%), у 5,5% длительность заболевания была более 11 лет, у 20,7% - менее 1 года. У 30% детей с момента первого БОС прошло более 11 лет.

При оценке возраста появления первого БОС выявлено, что больше половины детей заболело до 3 лет (54,9%), из которых 18,1% - на первом году жизни. Однако диагноз БА до 3 лет был поставлен всего у 18,2% детей, в большинстве случаев возраст постановки диагноза был с 3 до 7 лет (34,9%) и с 7 до 11 лет (31%).

Наследственная отягощенность по аллергическим заболеваниям выявлена у 76,3% обследованных детей. Аллергические заболевания у матерей отмечались у 33,2% детей с БА. 10,5% детей имели отцов с аллергической патологией. Аллергические заболевания обоих родителей ~ 10,1% детей. 21,9% детей имели сибсов с аллергией, 34,4% - родственников 2 и более степеней родства.

Большинство пациентов (93,6%) имели различные сопутствующие аллергические заболевания. У 13 детей (2,7%) (7 мальчиков и 6 девочек) в анамнезе отмечался астматический статус.

Поливалентная сенсибилизация была выявлена у 70,5% больных, моновалентная сенсибилизация - у 17,3% больных.

В группе из 24 пациентов с тяжелой, непрерывно-рецидивирующей БА с неконтролируемым течением контроль заболевания оценивался согласно критериям, изложенным в GINA (2006г.). В этой группе первый БОС у 15 (62,5%) детей был зафиксирован в возрасте 0-3 года (из них у 3 до 1 года), у 3 (12,5%) в возрасте 3-7 лет, у 3 (12,5%) в возрасте 7-11 лет, у 1 (4,2%) старше 11 лет. У 7 человек (29,2%) диагноз БА был поставлен в возрасте до 3 лет. У 5 человек (20.8%) в анамнезе отмечались астматические статусы.

Наследственная отягощенность по атопическим заболеваниям в семье отмечена у 50% детей этой группы. 9 человек (37.5%) имели отягощенную наследственность по аллергической патологии у обоих родителей. Поливалентная сенсибилизации была выявлена у 21 (87.5%) ребенка. В этой группе 5 детей (20,8%) на момент обследования курили.

Распределение аллелей и генотипов Bell полиморфизма гена GR не отличалось в группах детей с БА различной степени тяжести и контрольной группе, и совпало с соответствующими показателями в популяционных выборках западных стран. Различий в распределении аллелей и генотипов в зависимости от пола также найдено не было (рис. 1).

Рис. 1. Распределение генотипов исследованного Bell полиморфизма гена GR в труппе детей с БА в сравнении с контрольной группой._

:0CC£CGoQe|

Однако при сопоставлении результатов клинико-инструментального

обследования и молекулярно-генетического тестирования получены

следующие результаты.

• У детей с генотипом вв БА формировалась в более раннем возрасте, по сравнению с детьми, носителями других генотипов (р=0,03);

• Гиперреактивность бронхов реже выявлялась у детей, имеющих генотип СС (по ИНН с гистамином, р=0,029) и генотип СО (по пробе с с ДФН, р=0,002), и чаще у носителей генотипа вв (по пробе с ДФН, р=0,01; по частоте встречаемости высокой (выше 15%) СЛб, р=0,028). Полученные данные говорят о более тяжелом течении заболевания, большей выраженности аллергического воспаления бронхов у носителей генотипа ОС, по сравнению с детьми, имеющими генотипы СС и СО;

• Положительные кожные пробы у детей, имеющих генотип Сй, отмечались чаще по сравнению с детьми имеющими другие генотипы (р=0,023);

• Более низкие значения показателей функции внешнего дыхания (по данным спирометрии (БУС) и суточного дыхательного мониторирования (СПб)) отмечены у детей, имеющих аллель в, т.е. генотипы Св и Св. Данные различия были выявлены и в периоде обострения, и в периоде ремиссии заболевания (р<0,05);

• При оценке относительного количества эозинофилов крови как косвенного показателя активности аллергического воспаления отмечено, что в период

обострения заболевания у носителей генотипа (Ю эозинофилия выявлялась чаще, чем у носителей других генотипов (р=0,00б);

• При обострении заболевания необходимость в использовании ИГКС через небулайзер отмечалась чаще у детей, имеющих аллель в как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии, чем у детей с генотипом СС (р=0,038), что может свидетельствовать о большей тяжести обострения и/или недостаточном ответе на проводимую терапию;

• Назначение бета2-адреномиметика через небулайзер при обострении заболевания чаще требовалось носителям генотипа СО (р=0,014). Эти данные свидетельствуют о большей степени тяжести обострения БА у носителей генотипа СО, чем у детей, имеющих генотипы СС и ОЮ, и согласуются с результатами спирографии (более низкие показатели РУС в периоде обострения заболевания);

• У детей, имеющих генотип СС, неконтролируемая БА встречалась реже, по сравнению с носителями других генотипов (р=0,027); у детей, носителей генотипа Св, чаще встречалась контролируемая БА (0,013); в то время как у детей с генотипом ОС чаще встречалась неконтролируемая БА (р=0,013). В пользу недостаточного контроля БА у детей, имеющих генотип вО, относятся и данные о большей частоте высокой (более 15%) СЛб на фоне более низких показателей СПб, по сравнению с аналогичными показателями у детей с другими генотипами в период ремиссии заболевания;

• Уровень 1|>Е в период ремиссии у детей, имеющих генотип СС, более низкий, чем уровень аналогичного показателя у детей с другими генотипами (р=0,047, а в группе девочек р<0,001); также у носителей генотипа СС уровень чаще находился в пределах низких значений (менее 100 ед/мл) (р=0,003);

• У детей, носителей генотипа СС, аллергический конъюнктивит встречался чаще (р=0,011), а малые формы респираторной аллергии реже (р=0,023). У носителей генотипа СО аллергический конъюнктивит и острые аллергические реакции отмечались реже (р=0,009 и р=0,023, соответственно), а малые формы респираторной аллергии и атопический дерматит чаще (р=0,028 и р=0,027, соответственно). У детей, имеющих генотип ОС, малые формы респираторной аллергии отмечались реже (р=0,002), а острые аллергические реакции чаще (р=Ю,00б), чем у носителей других генотипов;

Итак, данные клинико-функционального и лабораторного обследования, а также оценка уровня контроля БА у детей с различными генотипами Вс11 полиморфизма позволяют отметить, что более легкое течение БА, менее тяжелые обострения заболевания, хороший контроль течения заболевания имеют место у детей, имеющих СС генотип, по сравнению с детьми, имеющими аллель в (генотипы Св и СЮ).

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов ОДИН полиморфизма гена ОЯ в группе детей, больных БА разной степени тяжести, и контрольной группе здоровых детей не выявил значимых различий. Однако у

девочек с БА генотип ТТ встречался реже, чем у девочек в группе контроля (р=0.044). Также в группе наблюдения генотип ТТ у девочек встречался реже, чем у мальчиков (р=0.043) (рис. 2).

Рис. 2. Распределение генотипов исследованного ТА11II полиморфизма гена вИ в группе детей с БА в сравнении с контрольной группой.

При оценке данных обследования детей с различными генотипами

Tthl 1II полиморфизма мы получили следующие результаты.

• У детей с генотипом СС БА формировалась в более старшем возрасте, по сравнению с детьми, носителями аллеля Т в гомозиготном и гетерозиготном состоянии (р=0,01);

• Срок, прошедший от первого БОС до постановки диагноза БА, был больше у детей с генотипом СС, чем у детей, имеющих аллель Т в гомозиготном и гетерозиготном состоянии (р=0,011);

• Гиперреактивность бронхов, выявляемая по ИНН с гистамином, встречалась чаще у носителей генотипа СС (р=0,043), чем у носителей других генотипов. Однако, у детей с этим генотипом чаще встречался 3 положительный порог при ИПП с гистамином, и реже 1 и 2, по сравнению с детьми, имеющими аллель Т в гомозиготном и гетерозиготном состоянии (р=0,047). У носителей генотипа СТ высокая (выше 15%) CJ16 встречалась чаще, чем у носителей других генотипов (р=0,029);

» Более низкие значения показателей функции внешнего дыхания (по данным спирометрии и суточного дыхательного мониторирования) отмечены у детей, имеющих аллель Т, и в периоде обострения, и в периоде ремиссии заболевания. У детей носителей генотипа СС в период обострения чаще, чем при других генотипах, отмечалась минимальная степень бронхиальной обструкции;

• У детей, носителей генотипа СС обострение БА протекало легче, с более высокими показателями спирометрии и СПБ, однако с высокой амплитудой колебаний значений РЕБ (р=0,04);

• При оценке относительного количества эозинофилов крови отмечено, что в период ремиссии заболевания у носителей генотипа СС эозинофилия выявлялась реже, чем у носителей других генотипов (р=0,017);

• У детей, имеющих генотип СТ, терапия ИГКС назначалась в более младшем возрасте, по сравнению с детьми, имеющими генотипы СС и ТТ (р=0,048);

• Более низкие значения СПб (р=0,033) и большая частота высокой (более 15%) СЛб отмечались в период ремиссии у детей, имеющих генотип СТ, по сравнению носителями генотипов СС и ТТ;

• Пищевая аллергия чаще отмечалась у детей, имеющих генотипы СС и СТ, по сравнению с носителями генотипа ТТ (р=0,045).

Таким образом, из данных клинико-функционального и лабораторного обследования, можно отметить, что более легкое течение БА, менее тяжелые обострения заболевания зафиксированы у детей, имеющих генотип СС ТШ1111 полиморфизма, по сравнению с детьми, имеющими аллель Т (генотипы СТ и ТТ).

Различные комбинации генотипов двух изученных полиморфизмов формируют 9 вариантов. Распределение комбинаций генотипов гена СЯ не отличалось в группах детей с БА различной степени тяжести и контрольной группе. Различий в распределении в зависимости от пола также не было найдено.

Однако, при совокупной оценке данных клинического и молекулярно-генетического обследования, было выявлено, что носители различных комбинаций генотипов имеют особенности течения БА. Кроме того, при объединении данных комбинаций генотипов в 5 групп в соответствии с количеством аллелей в и Т, выявляется общая тенденция к утяжелению течения при увеличении количества этих аллелей.

Так для детей, в генотипе которых нет аллеля в и Т (комбинация СС/СС), были характерны следующие особенности по сравнению с другими вариантами:

• Формирование БА происходило позднее (р=0,043);

• Показатели функции внешнего дыхания (по данным спирометрии и суточного дыхательного мониторирования) были выше. Данные различия были выявлены и в периоде обострения, и в периоде ремиссии заболевания. Причем более высокие показатели СПб в периоде ремиссии (р=0,014) могут говорить в пользу лучшего контроля БА в этой группе детей, по сравнению с носителями других сочетаний. Наряду с этим, более высокие показатели СПБ в периоде обострения (р=0,045) могут свидетельствовать о большей эффективности проводимой терапии в период обострения БА у носителей комбинации генотипов СС/СС, по сравнению с детьми, имеющими другие комбинации;

• Уровень 1{>Е в период ремиссии был более низким, чем у детей, имеющих другие комбинации генотипов (р<0,001);

• Детям в этой группе реже требовалось назначение ИГКС через небулайзер (пульмикорт) при обострении, чем детям с другими комбинациями генотипов (р=0,012), что может свидетельствовать о более легком обострении БА и/или большей эффективности проводимой терапии ИГКС.

• В данной группе детей неконтролируемое течение БА встречалось реже, чем у детей с другими комбинациями генотипов (р=0,040).

• Малые формы респираторной аллергии встречались реже (р=0,025), а пищевая аллергия чаще (р=0,045).

Для детей, имеющих или аллель в или аллель Т в гетерозиготном состоянии в комбинации генотипов (комбинации СС/СС и СС/СТ) характерными являлись:

• Более низкая выявляемость скрытого бронхоспазма (р=0,036), по сравнению с носителями других комбинаций;

• Более высокие, по сравнению с носителями других комбинаций генотипов, показатели спирометрии, однако у девочек при обострении отмечались более низкие значения БУС (р=0,043).

• Тяжесть обострения и/или недостаточный ответ на проводимую при обострении терапию требовали у этих детей более частого использования бета-2-адреномиметика и ИГКС через небулайзер (р=0,011 и р=0,035, соответственно);

• В данной |руппе детей неконтролируемое течение БА встречалось чаще, чем у детей с другими комбинациями генотипов (р=0,041).

• Пищевая аллергия отмечалась чаще (р=0,036);

У детей, имеющих аллель в или аллель Т как в гетерозиготном, так и в гомозиготном состоянии (Св/СТ, СЮ/СС, СС/ТТ комбинации генотипов), отмечались следующие особенности течения заболевания, по сравнению детьми с другими сочетаниями:

• Диагноз БА ставился раньше (р=0,01), в том числе и до 1 года (р=0,038). Известно, что ранний дебют астмы сопряжен с возникновением более тяжелых форм заболевания БА;

• Показатели функции внешнего дыхания (по данным спирометрии и суточного дыхательного мониторировання) были ниже и в периоде обострения, и в периоде ремиссии БА. Причем более низкие показатели СПб в периоде ремиссии (р=0,016) могут говорить в пользу недостаточного контроля БА у детей в этой группе, по сравнению с носителями других комбинаций генотипов;

• В данной группе тяжесть обострения и/или ответ на проводимую терапию требовали более частого включения в терапию ИПСС через небулайзер (у детей, имеющих комбинацию генотипов СС/СС, р=0,038), также чаще отмечалось неконтролируемое течение БА (у детей, имеющих комбинацию генотипов Св/СТ, р=0,05);

• В этой группе лекарственная аллергия и поллиноз у детей встречались чаще (р=0,022 и р=0,017, соответственно), а пищевая аллергия и малые формы респираторной аллергии реже (р=0,03 и р=0,034, соответственно);

Для детей, имеющих аллель О или аллель Т в гомозиготном состоянии в сочетании с гетерозиготным состоянием по второму полиморфизму (СЮ/СТ и СО/ТТ комбинации генотипов), характерным оказались следующие признаки:

• Большая выявляемость гиперреактивности бронхов (по пробе с ДФН (р=0,026). У носителей комбинации генотипов ОЮ/СТ в период ремиссии чаще, чем у носителей других комбинаций, отмечалась высокая (более 15%) СЛб;

• У носителей комбинации генотипов (Хт/СТ и СО/ТТ отмечались более низкие, по сравнению с детьми, имеющими другие варианты, показатели функции внешнего дыхания.

Сравнение данных функционального и лабораторного обследования у детей, имеющих сочетание СО/ТТ (аллели О и Т в гомозиготном состоянии), оказалось невозможным вследствие малого количества детей в группе. Однако было выявлено, что в этой группе чаще, по сравнению с носителями других комбинаций генотипов, встречалось неконтролируемая БА (р=0,046).

Распределение аллелей и генотипов Вс11 и ТШ11II полиморфизма гена вЯ в группе детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим, неконтролируемым течением БА не отличалось в зависимости от пола и сопоставимо с частотами встречаемости в кошрольной группе. Однако, дети с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим течением Б А достоверно чаще имели генотип СТ ТЛИ II полиморфизма гена 011, чем дети с тяжелой БА, имеющие более высокий уровень контроля БА (р=0,032).

Таблица 1.

Нуклеотидные замены во 2 экзоне гена 011, выявленные в группе детей с тяжелой, непрерывно-рецидивирующей, неконтролируемой БА

№ Пол Нуклеотидная Аминокислотная Комбинация генотипов

замена замена ВсИиТЛПП

(N11301 ген) (ABY87547) полиморфизма

1. мужской 0198А Е22Е СС/СС

0200А R23K

2. женский 0198А Е22Е Св/СС

0200А R23K

А12200 N363T

3. мужской А12200 N363T СО/СТ

4. мужской А122(Ю N363T СС/СТ

5. женский А122(Ю N363T СС/СС

6. женский 0633А Q167Q СС/СТ

В результате секвенирования 2 экзона гена GR у 6 детей были выявлены следующие замены в нуклеотидной последовательности (табл. 1). Все выявленные замены находились в гетерозиготном состоянии.

У одной девочки была выявлена нуклеотидная замена G633A (167 кодон). Замена гуанина (G) на аденин (А) в 167 кодоне является синонимичной, не меняет аминокислотный состав белка и кодирует глутамин (Q). Обнаруженная замена не отмечается в базе данных (GenBank), содержащих информацию о структуре гена GR.

У двух пациентов (разного пола) были выявлены замены G198A (22 кодон), G200A (23 кодон). Замена гуанина (G) на аденин (А) в 22 кодоне является синонимичной, не меняет аминокислотный состав белка и кодирует глутаминовую кислоту (Е). Замена гуанина (G) на аденин (А) в 23 кодоне приводит к замене аргинина (R) на лизин (К) в белке. В литературе эти две связанные между собой точечные замены обозначаются как ER22/23EK (rs6189, rs6190) полиморфизм. По данным ряда исследований этот полиморфизм связан с относительной резистентностью к ГК и встречается в изученных популяциях с частотой 9 % [Van Rossum E.F.C. et al., 2002, 2004]. В нашей группе вариант ER22/23EK был выявлен у 8,3% детей, однако сравнение данных невозможно вследствие небольшого объема группы.

У девочки, имеющей аллель ER22/23EK, также была выявлена замена A1220G (363 кодон). Замена аденина (А) на гуанин (G) не является синонимичной и приводит к замене аспарагина (N) на серии (Т). N363T (rs6195) полиморфизм также выявлен еще у 3 человек (2 мальчика и одна девочка). Этот полиморфизм ассоциирован с повышенной чувствительностью к ГК и встречается в изученных популяциях с частотой 6% [Huizenga N.A. et al., 1998; Корег J.W. et al., 1997]. В нашей группе частота составила 16,7%, однако сравнение данных невозможно вследствие небольшого объема группы.

Прогностические показатели контроля течения БА

Для выявления факторов риска, способствующих снижению уровня контроля БА (развитию частично контролируемой или неконтролируемой БА), было определено 153 показателя, отражающих современное представление об этиопатогенетических закономерностях течения БА. На основании частоты встречаемости среди детей с контролируемой БА, частично контролируемой и неконтролируемой БА для каждого признака вычислен прогностический коэффициент в баллах.

В результате удалось выделить 21 наиболее значимый признак по их роли в оценке уровня контроля БА. Доверительный интервал для балльной оценки в определении контроля БА составил 9,85. При этом процент правильно классифицированных случаев составил 84% для состояния "контролируемая БА" и 54% для состояния "частично контролируемая и неконтролируемая БА".

Алгоритм диагностики с использованием прогностической таблицы состоит в следующем. У ребенка последовательно выявляется наличие признаков, занесенных в таблицу (табл. 2), и подсчетывается сумма баллов. При сумме

менее 9,85, у данного ребенка с БА выше вероятность контролируемой БА, при сумме больше 9,85 - частично контролируемой или неконтролируемой.

Таблица 2.

Показатели, имеющие диагностическое значение для оценки уровня

контроля БА

Признак Балл

Женский пол V

Наличие БА у матери 2?8

Наличие БА у отца 1,1

Тяжелая БА 5,2

Постановка диагноза БА до года 4,2

Отсутствие пшоаллергенного быта 2Д

Ребенок курит 3,6

Первый порог гиперреактивности по ИПП с гистамином 10,4

Положительная проба с ДФН при нагрузке 1 Вт/кг 5,1

Выраженная степень бронхообструкции 11,0

Положительная проба с бронхолитическим препаратом 3,6

Содержание общего IgE в крови выше 500 ед/мл 2,8

FEF 25-75 ниже 60% от должного значения, или от наилучшего для данного пациента показателя 3,5

Индекс Генслера (FEV1/FVC) ниже 80% от должного значения, или от наилучшего для данного пациента показателя 11,0

СПб ниже 60% 11,0

СЛб выше 30% 9,5

Необходимость в ИГКС через небулайзер (пульмикорт) в период обострения 8,6

Необходимость в терапии системными стероидами 11,0

Генотип GG (Bell полиморфизма гена GR) 2,7

Генотип TT (Tthl111 полиморфизма гена GR) 2,6

Комбинация генотипов GG/TT 6,3

Из приведенной таблицы видно, что часть признаков изначально превышают 9,85, т.е. наличия одного из них достаточно, чтобы говорить об отсутствии контроля течения БА. Так, необходимость в терапии системными стероидами или высокая степень гиперреактивности бронхов, свидетельствуют о недостаточном контроле БА уже в текущий момент. Вместе с тем, при отсутствии у больного этих признаков, верифицирующих неконтролируемое течение заболевания, другие показатели, такие как наследственность, условия жизни, генотипы исследованных Bell и Tthllll полиморфизмов гена GR, в совокупности могут говорить о высоком риске развития частично контролируемой или неконтролируемой БА. Например, наследственная

отягощенность по наличию БА у матери (2,8 балла), дебют заболевания на первом году жизни (4,2 балла), отсутствие гипоаллергенных условий быта (2,1 балла) при выявленном высоком уровне общего 1{>Е в крови (2,8 балла) в совокупности дают повышенный риск ухудшения контроля Б А (11,9 баллов). В то же время, у девочки (3,5 балла) с выявленной комбинацией генотипов ОЮ/ТТ гена ¿Я (6,3 балла) и при наличии любого из указанных клинико-анамнестических признаков также высокий риск недостаточного контроля БА.

Таким образом, надо отметить, что определенные генотипы гена 011 и их комбинации, имеют достаточно высокий прогностический коэффициент; и могут наряду с анамнестическими данными, использоваться для оценки риска снижения уровня контроля БА.

ВЫВОДЫ.

1. Распределение аллелей и генотипов Bell полиморфизма гена GR у детей с БА не отличается в зависимости от пола, степени тяжести и сопоставимо с частотами встречаемости в контрольной группе.

2. Распределение аллелей и генотипов Tthllll полиморфизма гена GR у детей с БА не отличается в зависимости от степени тяжести. У детей с БА генотип TT встречается реже у девочек, чем у мальчиков (р=0.043). Девочки с БА реже, чем девочки в группе контроля, имели генотип TT (р=0.044).

3. Более легкое течение бронхиальной астмы отмечается у детей с генотипом СС Bell полиморфизма и генотипом СС Tthllll полиморфизма гена GR, по сравнению с детьми, имеющими аллель G и аллель Т как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Увеличение числа этих аллелей в комбинациях генотипов у детей с БА ассоциировано с более тяжелым течением заболевания и снижением уровня его контроля.

4. У детей, имеющих аллель G Bell полиморфизма гена GR в гомозиготном состоянии, чаще встречается неконтролируемая БА (р=0,013).

5. Дети с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим течением Б А достоверно чаще имеют генотип CT Tthllll полиморфизма гена GR, чем дети с тяжелой БА, имеющие более высокий уровень контроля БА (р=0,032).

6. Анализ нуклеотидной последовательности 2 экзона гена GR у детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим течением БА выявил следующие замены: G198A (22 кодон), G200A (23 кодон), A1220G (363 кодон), описанные в литературе, и замена G633A (167 кодон), ранее не зарегистрированная в базе данных, содержащих информацию о структуре гена GR (GenBank).

7. Генотипирование Bell и Tthl 1II полиморфизма гена GR в совокупности с клиническими, лабораторными и инструментальными методами обследования может быть использовано для оценки особенностей течения заболевания, подбора индивидуальной терапии ИГКС и прогнозирования эффекта проводимого лечения у детей с бронхиальной астмой

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Для оценки особенностей течения заболевания, подбора индивидуальной терапии ИГКС и прогнозирования эффекта проводимого лечения у детей с бронхиальной астмой в совокупности с клиническими, лабораторными и инструментальными методами обследования может быть использовано генотипирование Bell и Tthl 1II полиморфизма гена GR.

2. Разработанная таблица прогноза контроля течения БА у детей может использоваться в практике педиатрами, аллергологами для оценки эффективности терапии и прогнозирования эффекта проводимого лечения наряду с подходом, рекомендованным международными согласительными документами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жданова М.В.Особенности течения бронхиальной астмы у детей с различными генотипами Bell полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора / М.В. Жданова, М.А. Богданова, А.Н. Войтович, О.М. Ащепкова, Е.Э. Журавская, Н.В. Трофимова, Г.А. Новик, В.И. Ларионова // Ж. Педиатрия им. Г.Н.Сперанского. - 200?. - Т. 86 - №4. - стр. 19*24

2. Жданова М.В. Изучение Bell полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора у детей с бронхиальной астмой (специальная премия)/ М.В. Жданова // Педиатрическая фармакология.- 2006,- Т.З, №2. - стр. 61-63

3. Жданова М.В. Изучение Bell полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора у детей с бронхиальной астмой / М.В. Жданова, А.Н. Войтович, O.P. Ромашкина, М.А. Богданова, Г.А. Новик, В.И. Ларионова // Вопросы современной педиатрии: сб. материалов X конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». -Москва, 2006. - Т. 5, №1. - С. 199

4. Жданова М.В. Распределение аллелей и генотипов Bell полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора у здоровых детей и у детей с бронхиальной астмой / М.В. Жданова, М.А. Богданова, А.Н. Войтович, O.P. Ромашкина, Г.А. Новик, В.И. Ларионова // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сб. тезисов к научно-практической конференции молодых ученых СПбМАПО -Санкт-Петербург, 2006. - С.213

5. Жданова М.В. Особенности течения бронхиальной астмы у детей с различными генотипами Bell полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора / М.В. Жданова, М,А. Богданова, А.Н. Войтович, О.М. Ащепкова, Е.Э. Журавская, Н.В. Трофимова, Г.А. Новик, В.И. Ларионова // XVI Национальный конгресс по болезням органов дыхания, П Конгресс Евроазиатского Респираторного Общества: сб. тр. конгресса. - Санкт-Петербург, 2006. - Электрон, опт. диск (CD ROM).-№139

6. Жданова М.В. Способ прогнозирования эффективности терапии ингаляционными глюкокоргикостероидамн у детей с бронхиальной астмой / М.В. Жданова, М.А. Богданова, А.Н. Войтович, О.М. Ащепкова, Е.Э. Журавская, Н.В. Трофимова, Г.А. Новик, В.И. Ларионова Н П Междисциплинарный конгресс «Ребенок, врач, лекарство»: сб. науч. тр. - Санкт-Петербург: СПбГПМА, 2007. - С. 6062

7. Жданова М.В. Исследование гена глюкокортикоидного рецептора у детей с тяжелой неконтролируемой бронхиальной астмой / М.В. Жданова, Г.А. Новик, В.И. Ларионова // II Российский форум «Здоровье детей: профилактика социально-значимых заболеваний»: сб. материалов. - Санкт-Петербург, 2008. - С.135

8. Жданова М.В. Течение бронхиальной астмы у детей с различными генотипами Tthllll полиморфизма гена глюкокортикоидного

рецептора / М.В. Жданова, М.А. Богданова, А.Н. Войтович, О.М. Ащепкова, Е.Э. Журавская, Н.В. Трофимова, Г.А. Новик, В.И. Ларионова // Ш Междисциплинарный конгресс «Ребенок, врач, лекарство»: сб. науч. тр. - Санкт-Петербург, 2008. - Электрон, опт. диск (CD ROM).

9. Жданова М.В. Новые возможности прогнозирования эффективности терапии ингаляционными глюкокортикостероидами у детей с бронхиальной астмой / М.В. Жданова, М.А. Богданова, А.Н. Войтович, Г.А. Новик, В.И. Ларионова// VII Российский конгресс «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии»: сб. материалов. - Москва: Изд-во «Оверлей», 2008. - С.272

10.Zhdanova М. V. Glucocorticoid receptor Bell variant in children with bronchial asthma. / M. V. Zhdanova, A. N. Voitovich, M. A. Bogdanova, 0. R. Romashkina, G. A. Novik, V.I. Larionova // European Human Genetics Conference, Amsterdam, The Netherlands, May 6 - 9, 2006. European Journal of Human Genetics. - 2006. - Vol.14. - Sup.l. - P0048

11. Zhdanova M. V. Glucocorticoid receptor Bell variant in children with different levels of bronchial asthma severity / M. V. Zhdanova, A. N. Voitovich, M. A. Bogdanova, O. R. Romashkina, G. A. Novik, V.I. Larionova // 11th International Congress of Human Genetics, Brisbane, Australia, August 6-10, 2006. - Book of Abst. - 2006. - Reference Number: 1298.

12.Zhdanova M. V. Polymorphisms in the glucocorticoid receptor in children with difficult bronchial asthma. / M. V. Zhdanova, V. S. Tikhoniva, A. N. Voitovich, M. A. Bogdanova, G. A. Novik, D. S. Korostovcev, V. I. Larionova // European Human Genetics Conference, Barcelona, Spain, May 31 - June 3, 2008. European Journal of Human Genetics. - 2008. - Vol.16. - Sup.2. - p.99.

13.Zhdanova M.V. Polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and their relationships with different levels of bronchial asthma severity in children / M.V. Zhdanova, M.A Bogdanova, AN. Voitovich, G.A. Novik, V.I. Larionova // XX International Congress of Genetics, Berlin, Germany, July 12-17,2008. - Book of Abst. - 2008. - p.147

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БА- бронхиальная астма

БОС - бронхообструктивный синдром

ГК- глюкокортикоидный гормон

ДНК- дезоксирибонуклеиноваякислота

ДФН - дозированная физическая нагрузка

ИГКС - ингаляционный глюкокортикостероид

ИПП - ингаляционная провокационная проба

ПСВ - пиковая скорость выдоха

CJI6 - среднесуточная лабильность бронхов

СПб - среднесуточная проходимость бронхов

FEF 25-75 — forced expiratory flow - форсированная скорость выдоха или средняя объемная скорость на участке от 25 до 75% выдыхаемой форсированной жизненной емкости легких

FEF 25, FEF 50, FEF 75 — forced expiratory flow — форсированная скорость выдоха в точке 25,50 и 75% форсированной жизненной емкости легких FEV1 - forced expiratory volume per 1 second — форсированная жизненная емкость за 1 сек. или объём форсированного выдоха за 1 сек. F VC - forced vital capacity - форсированная жизненная емкость легких GINA - Global Initiative For Asthma - Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы GR - глюкокортикоидный рецептор Ig Е - иммуноглобулин Е

PEF - peak expiratory flow - пиковая или максимальная скорость

форсированного выдоха (ПСВ)

VC - vital capacity - жизненная емкость легких

Лицензия № 020383 от 14 апреля 1998 г.

Подписано в печать 12.01.2009. Ф-т 60x84'/,Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Зак. № 2.

Отпечатано в ЦМТ СПбГПМА. 194100, Санкт-Петербург, Литовская ул., д. 2.

Актуальность темы.

На современном этапе бронхиальная астма (БА) принадлежит к числу наиболее распространенных заболеваний у детей в мире. Бронхиальной астмой страдает от 5 до 10% детского населения [4]. Многочисленные исследования демонстрируют тенденцию к росту заболеваемости бронхиальной астмой и утяжелению ее течения [6, 7, 9,22, 30, 92].

Надо отметить, что в более ранних изданиях GINA и созданной на ее основе Национальной программе, на первый план выдвигалась классификация БА по степени тяжести, что и определяло стратегию ее терапии [3, 12, 13]. В новой редакции GINA центральное место для выбора объема терапии отводится не классификации тяжести течения БА, а критериям ее контроля [1, 4]. Однако нельзя не отметить, что используемая многоступенчатая система лечения больных и контроля терапии основывается на клинических данных и недостаточно точных одномоментных измерениях показателей форсированного выдоха больных.

Принимая во внимание наличие хронического аллергического воспаления дыхательных путей у всех больных с персистирующей формой БА [4, 37], ингаляционные гшококортикостероиды (ИГКС) являются препаратами первой линии в лечении данной патологии. ИГКС обладают выраженным противовоспалительным действием на уровне различных звеньев патогенеза [4, 36, 115]. Существует необходимость выработки объективных точных критериев использования глюкокортикоидов (ПС) и контроля эффективности проводимой терапии, поскольку некоторые пациенты нуждаются в терапии высокими дозами ГК на длительный период, причем снижение дозы приводит к дестабилизации состояния. У части этих пациентов, несмотря на увеличение дозы гормонов, комбинации их с пролонгированными бета2-адреномиметиками, пролонгированными теофиллинами или антагонистами лейкотриенов не удается достигнуть хорошего или полного контроля течения заболевания [17, 40, 64]. Важно распознать этих пациентов на ранних сроках, т.к. отсутствие ответа на терапию часто приводит к неоправданно высоким дозам ГК с развитием побочных эффектов проводимой терапии.

Современные методы, применяемые в медицине, позволяют изучать молекулярно-генетические основы чувствительности к стероидам. В ряде ассоциативных исследований, выявлены изменения чувствительности к стероидам при некоторых структурных особенностях гена глюкокортикоидного рецептора (GR) [43]. Так, например, предполагают наличие связи Bell полиморфизма гена GR, обусловленного заменой цитозина на гуанин в 647 положении во втором интроне гена, с метаболическими изменениями, гиперчувствительностыо гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы к глюкокортикоидам, глюкокортикоид-зависимой вазоконстрикцией [100, 110, 125, 132]. Tthllll полиморфизм, образующийся в результате замены цитозина на тимин в -3807 положении от точки старта транскрипции мРНК в промоторном участке гена, ассоциирован с повышенным базальным уровнем кортизола и относительной резистентностью к ГК [109, 127].

Значительный интерес представляет исследование полиморфизма гена GR, их связи с клиническим течением БА у детей, влиянием на эффективность проводимой терапии ИГКС, поскольку данный вопрос в доступной литературе освящен недостаточно. Все это послужило основанием для выполнения настоящей работы.

Цель исследования. Оптимизация терапии ингаляционными глюкокортикоидами у детей с бронхиальной астмой различной степени тяжести на основе результатов клинико-инструментального и молекулярно-генетического обследования. Задачи исследования.

1. Сформировать группы детей с различной степенью тяжести Б А на основании клинико-инструментального, лабораторного обследования и оценить у них эффективность терапии ИГКС.

2. Провести молекулярно-генетическое тестирование Bell и Tthl 111 полиморфизма гена GR и изучить распределение аллелей и генотипов.

3. Сопоставить результаты клинико-анамнестических, инструментальных, лабораторных методов исследования с результатами молекулярно-генетического тестирования у детей, получающих ИГКС, в зависимости от пола и тяжести заболевания.

4. Выделить группу с непрерывно-рецидивирующими, неконтролируемым течением БА и провести анализ нуклеотидной последовательности 2 экзона гена GR методом секвенирования в этой группе детей.

5. Оценить влияние выявленных структурных особенностей гена GR на течение БА у детей.

6. Выявить признаки, позволяющие прогнозировать уровень контроля течения БА и оптимизировать терапию ИГКС у детей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выявлены ассоциации изученных полиморфных маркеров гена GR с особенностями течения заболевания, эффективностью терапии ИГКС и уровнем контроля БА.

2. Полиморфизм гена GR у детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим течением БА является одним из важных компонентов, определяющих молекулярно-генетическую основу клинических особенностей течения заболевания и недостаточной эффективности терапии ИГКС.

3. Подбор индивидуальной терапии ИГКС и прогнозирование эффекта проводимого лечения у детей с БА целесообразно проводить с использованием комплекса клинико-функциональных и молекулярно-генетических методов обследования.

Научная новизна исследования. Настоящая работа является первым в нашей стране комплексным исследованием, учитывающим наряду с клинико-функциональными характеристиками особенности строения гена GR при терапии ИГКС у детей с БА.

• Впервые в нашей стране проведена оценка популяционных частот аллелей и генотипов Bell и Tthl111 полиморфизма гена GR.

• Впервые изучено влияние Bell и Tthl 111 полиморфизма гена GR на течение и формирование БА у детей, в зависимости от пола и степени тяжести заболевания.

• Впервые проведено изучение нуклеотидной последовательности 2 экзона гена GR методом прямого секвенирования в группе детей с тяжелым, неконтролируемым течением БА. Выявлены замены во 2 экзоне гена: G198A (22 кодон), G200A (23 кодон), A1220G (363 кодон), описанные в литературе, и замена G633A (167 кодон), ранее не зарегистрированная в базе данных, содержащих информацию о структуре гена GR (GenBank).

Научно-практическая значимость работы.

• Изученные Bell и Tthl 111 полиморфные маркеры гена GR, ассоциированные с особенностями течения заболевания и эффективностью терапии ИГКС позволяют оптимизировать лечение заболевания у детей с БА.

• Результаты изучения нуклеотидной последовательности 2 экзона у детей с тяжелой, непрерывно-рецидивирующей Б А должны рассматриваться как необходимый этап в молекулярно-генетическом алгоритме исследования структуры гена GR. На основании полученных результатов разработаны клинико-генетические критерии оценки и прогнозирования эффективности использования ИГКС и уровня контроля БА у детей. Апробация работы.

Результаты исследования применены в учебном процессе на кафедре госпитальной педиатрии, кафедре факультетской педиатрии ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава, внедрены в практику подготовки и усовершенствования специалистов - педиатров кафедры педиатрии им. профессора И.М.Воронцова ФПК и НИ ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава, а также внедрены в клиническую практику детского аллергологического отделения ДГБ №2 им. Св. Марии Магдалины (г.Санкт-Петербург).

Основные положения диссертации представлены на 6 научно-практических конференциях: X Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2006 г.), на котором постерный доклад получил специальную премию в конкурсе молодых ученых; Научно-практической конференции молодых ученых СПбМАПО (Санкт-Петербург, 2006 г.); XVI Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, П Конгресс Евроазиатского Респираторного Общества (Санкт-Петербург, 2006 г.); III Междисциплинарном конгрессе «Ребенок, врач, лекарство» (Санкт-Петербург, 2008 г.), VII Российскиом конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2008 г.), European Human Genetics Conference (Барселона, 2008 г.), XX International Congress of Genetics (Берлин, 2008 г.).

Проведенная работа является разделом НИР кафедры педиатрии им. профессора И.М.Воронцова ФПК и ПП ГОУ ВТО СПбГПМА Росздрава.

По проблемам диссертации опубликовано 13 печатных работ (11 тезисов и 2 статьи), из них 4 в зарубежных изданиях.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, изучение данных клинико-инструментального обследования детей и подростков, наследственного анамнеза и катамнеза, создана формализованная история болезни и база данных результатов обследования детей. Молекулярно-генетическое тестирование выполнено автором лично. Анализ, интерпретация, изложение полученных данных, формулирование выводов и практических рекомендаций в основном выполнены автором лично. Доля участия автора в накоплении информации - до 100%, в математико-статистической обработке - более 80%, в обобщении и анализе материала — 100%.

ВЫВОДЫ

1. Распределение аллелей и генотипов Bell полиморфизма гена GR у детей с БА не отличается в зависимости от пола, степени тяжести и сопоставимо с частотами встречаемости в контрольной группе.

2. Распределение аллелей и генотипов Tthllll полиморфизма гена GR у детей с БА не отличается в зависимости от степени тяжести. У детей с БА генотип ТТ встречается реже у девочек, чем у мальчиков (р=0.043). Девочки с БА реже, чем девочки в группе контроля, имели генотип ТТ (р=0.044).

3. Более легкое течение бронхиальной астмы отмечается у детей с генотипом СС Bell полиморфизма и генотипом СС Tthllll полиморфизма гена GR, по сравнению с детьми, имеющими аллель G и аллель Т как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Увеличение числа этих аллелей в комбинациях генотипов у детей с Б А ассоциировано с более тяжелым течением заболевания и снижением уровня его контроля.

4. У детей, имеющих аллель G Bell полиморфизма гена GR в гомозиготном состоянии, чаще встречается неконтролируемая БА (р=0,013).

5. Дети с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим течением Б А достоверно чаще имеют генотип СТ Tthllll полиморфизма гена GR, чем дети с тяжелой БА, имеющие более высокий уровень контроля БА (р=0,032).

6. Анализ нуклеотидной последовательности 2 экзона гена GR у детей с тяжелым, непрерывно-рецидивирующим течением БА выявил следующие замены: G198A (22 кодон), G200A (23 кодон), A1220G (363 кодон), описанные в литературе, и замена G633A (167 кодон), ранее не зарегистрированная в базе данных, содержащих информацию о структуре гена GR (GenBank).

7. Генотипирование Bell и Tthllll полиморфизма гена GR в совокупности с клиническими, лабораторными и инструментальными методами обследования может быть использовано для оценки особенностей течения заболевания, подбора индивидуальной терапии ИГКС и прогнозирования эффекта проводимого лечения у детей с бронхиальной астмой

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки особенностей течения заболевания, подбора индивидуальной терапии ИГКС и прогнозирования эффекта проводимого лечения у детей с бронхиальной астмой в совокупности с клиническими, лабораторными и инструментальными методами обследования может быть использовано генотипирование Bell и Tthl 111 полиморфизма гена GR.

2. Разработанная таблица прогноза контроля течения БА у детей может использоваться в практике педиатрами, аллергологами для оценки эффективности терапии и прогнозирования эффекта проводимого лечения наряду с подходом, рекомендованным международными согласительными документами.