Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Клинико-генетические и иммунологические характеристики различных вариантов течения язвенного колита

На правах рукописи

Харитонов Андрей Геннадьевич

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ТЕЧЕНИЯ ЯЗВЕННОГО КОЛИТА

14.01.04 — внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 1 моя 2013

Санкт-Петербург — 2013

005539021

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Барановский Андрей Юрьевич

Официальные оппоненты:

Гриневич Владимир Борисович - доктор медицинских наук профессор, федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, начальник 2-ой кафедры (терапии усовершенствования врачей)

Белоусова Елена Александровна - доктор медицинских наук профессор, государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского», заведующая кафедрой гастроэнтерологии факультета усовершенствования врачей

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский

государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится М> /я, 2013 г. в « часов на заседании диссертационного совета Д 208.086.04 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., д. 41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (195196, Санкт-Петербург, Заневский

пр.,1/82)

Автореферат разослан

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Захарова Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Язвенный колит (ЯК) — это хроническое заболевание, характеризующееся непрерывным воспалением слизистой оболочки толстой кишки, с обязательным вовлечением прямой кишки и различным по протяженности поражением ободочной кишки (Stange Е., 2008). В последние годы наблюдается рост заболеваемости ЯК по всему миру, в частности в Северной Америке и Европе (Loftus C.G., 2007; Ronnblom А., 2010). Ряд авторов (Kaminaga N., 1999; Михайлова T.J1., 2003; РукшинаО.А., 2005; Морозова H.A., 2007), отмечая безусловный прогресс в диагностике и лечении ЯК, обращают внимание на актуальность исследования часто рецидивирующих, тяжелых и резистентных к лечению форм заболевания. Действительно, на сегодняшний день имеется недостаточно сведений о характере течения и прогнозе этих форм ЯК, относящихся к неблагоприятному варианту заболевания. Следствием этого является нередко встречающаяся недооценка тяжести болезни, влекущая формирование осложнений и увеличение летальности пациентов. Одним из направлений изучения ЯК можно считать поиск предикторов формирования неблагоприятного варианта течения заболевания.

Степень разработанности темы исследования

Принимая во внимание значительную роль наследственной предрасположенности к развитию ЯК, некоторые авторы (BoumaG., 1999; Farrell R.J., 2003; Yamamoto-Furusho J.К., 2009) высказывают предположение о существовании генных мутаций и полиморфизмов, ответственных за развитие тяжелых и резистентных к лечению форм. Другие исследователи (Vergara Т., 2006; Solberg 1.С., 2009; Zhou F.,2010) не исключают возможности влияния иммунных нарушений, ассоциированных с теми или иными особенностями клинической картины заболевания. Однако, имеющиеся данные зачастую противоречивы или недостаточны. Количество работ, посвященных комплексной оценке роли не только клинических, лабораторных, эндоскопических, но также иммунологических и генетических факторов в формировании неблагоприятных форм ЯК крайне мало, а их результаты представляются неоднозначными. В свете вышеизложенного, важным является изучение клинико-лабораторных показателей в сочетании с иммунологическими и генетическими маркерами у пациентов с различными формами ЯК, комплексная оценка этих показателей в качестве факторов риска формирования неблагоприятного варианта течения заболевания.

Цель исследования

Изучить клинико-генетические и иммунологические особенности благоприятного и неблагоприятного вариантов течения язвенного колита в интересах прогноза течения заболевания.

Задачи исследования

1. Сравнить клинические, лабораторные, эндоскопические и морфологические показатели у больных с различными вариантами течения ЯК.

2. Определить частоту полиморфизмов гена TNF-a у больных ЯК и установить их связь с различными вариантами течения заболевания.

3. Уточнить частоту выявления диагностического титра антител к цитоплазме нейтрофилов с перинуклеарным типом свечения (пАНЦА) у пациентов с ЯК и выявить ассоциацию этих антител с клиническими формами заболевания.

4. Оценить значение клинико-лабораторных, эндоскопических, иммунологических и генетических показателей в качестве факторов риска развития неблагоприятного варианта течения ЯК.

Научная новизна исследования

1. Впервые определена роль полиморфизма -308 G/A гена TNF-a в развитии часто рецидивирующей формы ЯК у пациентов, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

2. Обнаружена ассоциация между выявлением антител к цитоплазме нейтрофилов с перинуклеарным типом свечения в диагностическом титре и развитием неблагоприятного варианта течения ЯК.

3. Установлена роль ряда клинико-лабораторных (длительность анамнеза язвенного колита, кровь в стуле, лихорадка и снижение массы тела, абдоминальная боль и общее самочувствие, уровень лейкоцитов в крови в фазу обострения), эндоскопических (распространенность воспаления в толстой кишке), иммунологических (диагностический титр пАНЦА) и генетических (генотип -308 G/A гена TNF-a) маркеров в качестве факторов риска формирования неблагоприятного варианта течения ЯК.

4. Показана необходимость комплексной оценки этих факторов для прогнозирования течения заболевания.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты работы позволили установить клинико-генетические и иммунологические особенности различных вариантов течения ЯК у пациентов, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

Выявлены клинические, иммунологические и генетические факторы риска формирования неблагоприятного варианта течения ЯК.

Была показана целесообразность комплексного обследования пациентов с оценкой анамнеза заболевания, клинической картины, данных лабораторного и эндоскопического обследования в сочетании с определением антител к цитоплазме нейтрофилов с перинуклеарным типом свечения и генетических полиморфизмов, как для установления диагноза заболевания, так и для прогнозирования его течения.

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в соответствии с принципами доказательной медицины, в дизайне когортного проспективного исследования. В исследовании использовались клинические, инструментальные, лабораторные, аналитические, статистические методы исследования. Объект исследования — больные ЯК, находящиеся на амбулаторном и стационарном лечении. Предмет исследования — особенности клинических, иммунологических, генетических характеристик различных вариантов течения заболевания.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Полиморфизм -308 G/A гена TNF-a имеет значение в патогенезе ЯК у пациентов, проживающих на территории Северо-Западного региона, и формировании часто рецидивирующей формы заболевания.

2. Наличие антител к цитоплазме нейтрофилов с перинуклеарным типом свечения в диагностическом титре у больных ЯК ассоциировано с развитием неблагоприятного варианта течения заболевания.

3. Для прогнозирования течения ЯК необходимо проведение комплексной оценки наиболее значимых клинико-лабораторных и эндоскопических признаков, иммунологических и генетических маркеров.

Степень достоверности н апробация результатов

Степень достоверности определяется достаточным количеством пациентов (89 человек) и лиц контрольной группы (117 человек), формированием основных групп и подгрупп наблюдения, адекватными методами исследования и корректными методами статистической обработки. В исследование были включены пациенты с клиническим диагнозом ЯК, поставленного с учетом анамнестических, клинических данных и подтвержденного лабораторно-инструментальными методами. Добровольное участие пациентов в исследовании подтверждалось их письменным согласием.

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на 11-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2009» (Санкт-Петербург, 2009) и 12-ом Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2010» (Санкт-Петербург, 2010), 10-м юбилейный съезд научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2010 г), научно-практической конференции «Трансляционная медицина: от теории к практике» (Санкт-Петербург, 2013).

Результаты исследования внедрены в научно-учебную и лечебно-диагностическую работу на клинической базе кафедры гастроэнтерологии и диетологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова МЗ РФ — СПб ГБУЗ «Городская клиническая больница №31». Результаты научного исследования внедрены в педагогический процесс кафедры гастроэнтерологии и диетологии ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова МЗ РФ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов (в том числе 2 в иностранных журналах).

Личное участие автора в выполнении исследования

Автор лично осуществлял планирование диссертационного исследования и его непосредственное выполнение, статистическую обработку полученных результатов, обсуждение, написание статей, тезисов и докладов, диссертации и автореферата. Личное участие автора в получении научных результатов, излагаемых в диссертации, осуществлялось на всех этапах работы и включало отбор пациентов (проводил анализ амбулаторных карт и историй болезни), их клиническое обследование, первичную обработку полученного материала, его систематизацию, статистическую обработку и анализ полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, состоящей из 7 подразделов, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисунками и 21 таблицей. Библиографический указатель содержит 277 наименований, в том числе 19 отечественных и 258 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В исследование были включены пациенты с ЯК, находящиеся на амбулаторном или стационарном лечении СПб ГБУЗ «Городская клиническая больница №31». Протокол исследования был утвержден на заседании локального этического комитета ГБОУ СЗГМУ им. И.И. Мечникова. Обязательным условием включения в исследование было подписание пациентом информированного согласия.

Обследовано 89 больных с различными вариантами течения язвенного колита, из них 48 женщин (53,9%) и 41 мужчина (46,1%). Возраст пациентов был от 18 до 79 лет, средний возраст составил 42,49±1,61 года. Диагноз заболевания был основан на совокупности данных клинической картины и результатов лабораторных, эндоскопических и гистологических исследований с учетом рекомендаций Европейского Консенсуса по диагностике и лечению ЯК (Stange Е„ 2008).

Все пациенты на момент включения в исследование имели признаки активного ЯК. В зависимости от варианта течения заболевания пациенты были распределены на две основные группы: с благоприятным (группа 1) и неблагоприятным (группа 2) вариантами течения ЯК.

В качестве клинических признаков неблагоприятного течения рассматривались:

- частое рецидивирование (2 и более рецидива ЯК в течение последнего года, как на фоне проводимой поддерживающей терапии, так и без нее);

- гормонозависимость, которая верифицировалась в случае: 1) невозможности уменьшить дозу стероидных гормонов ниже эквивалента преднизолона 10 мг/сутки в течение 3 месяцев после начала стероидной терапии без рецидива активности заболевания; 2) рецидива заболевания в течение 3 месяцев после отмены стероидных гормонов;

- тяжелое обострение (или тяжелая первая атака ЯК) на момент начала исследования. Тяжесть обострения определялась по индексу Тгие1оуе-\Vitts (1954).

Включение пациентов в группу 2 осуществлялось в случае наличия у них, по крайней мере, одного из трех перечисленных клинических признаков неблагоприятного течения ЯК. При этом у 26 больных имелось частое рецидивирование заболевания, у 22 — гормонозависимость, у 22 пациентов — тяжелое обострение (тяжелая первая атака ЯК).

У части больных группы 2 отмечалось сочетание нескольких клинических признаков неблагоприятного течения. Так, из 26 пациентов с частым рецидивированием заболевания 6 человек характеризовались развитием гормонозависимости, двое имели тяжелое обострение (первую атаку) ЯК на момент включения в исследование, у 3 больных были найдены все три клинических признака неблагоприятного течения. Среди пациентов с гормонозависимостью тяжелое обострение (первая атака) заболевания наблюдалось у 7 человек.

Последующий анализ производился отдельно по каждому из трех клинических признаков. В процессе оценки результатов в зависимости от наличия этих признаков отдельно выделялись подгруппы частого рецидивирования (подгруппа 2а), гормонозависимого ЯК (подгруппа 26) и тяжелого обострения заболевания (подгруппа 2в). В дальнейшем производился сравнительный анализ показателей каждой из трех подгрупп с группой 1. Учитывая, что у ряда пациентов имелись несколько клинических признаков неблагоприятного течения ЯК, сравнение между выделяемыми подгруппами не проводилось.

Для стандартизации результатов молекулярно-генетического исследования была сформирована группа контроля, состоящая из 117 практически здоровых лиц (проживающих с рождения на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области), и соответствующая популяционной выборке.

Всем пациентам выполнялось полное клиническое обследование, в том числе лабораторные и инструментальные исследования. В дальнейшем проводилось проспективное наблюдение в течение 2 лет, в ходе которого регистрировались осложнения заболевания, формирование различных клинических форм ЯК.

Молекулярно-генетическое исследование выполнялось в лаборатории пренатальной диагностики НИИ Акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта

РАМН (Санкт-Петербург) и включали в себя анализ частоты аллелей для полиморфных вариантов гена TNF-a (-308G/A и -238G/A) однократно в момент включения пациентов в исследование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с оценкой полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.

После экстракции геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови, выполнялась ПЦР с помощью олигонуклеотидных праймеров с последующей амплификацией на программируемом термоциклере фирмы «ДНК-технология» (Москва).

Продукты рестрикции проверялись методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), визуализировались после окраски этидиум-бромидом в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе «Macrovue» («Pharmacia LKB», Великобритания) и фотографировались в системе видео-гель-документации («Vilber Lourmat»),

Выявление антител пАНЦА и определение их титра проводилось двукратно — в фазу обострения (в момент включения в исследование) и после достижения клинико-лабораторной ремиссии ЯК. Серологическое исследование проводилось с помощью набора для реакции непрямой иммунофлюоресценции CIBD-Profile 1 (производство Euroimmun AG, Германия). Кроме того, использовались стандартные коммерческие наборы для определения антинейтрофильных антител (гранулоциты, фиксированные этанолом, гранулоциты фиксированные формалином, печень обезьяны, клеточная линия НЕр-2000) производства компании Euroimmun AG (Германия). Результаты метода оценивали с помощью люминесцентного микроскопа Euroimmun LED, EUROstar, оснащенного светодиодом (объектив х40). Учитывались типы свечения цитоплазмы клетки (перинуклеарный, цитоплазматический), а также последнее разведение сыворотки, при исследовании которого отмечалась характерная флюоресценция — титр реакции. Иммунологическое исследование проводилось в лаборатории диагностики аутоиммунных заболеваний ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени И.И. Павлова» (заведующий лабораторией к.м.н. Лапин C.B.).

Статистическая обработка результатов выполнялась при помощи пакета программ для статистической обработки данных Statistica for Windows (версия 5.5). Полученные результаты считались статистически значимыми при значении р<0,05. Сопоставление частотных характеристик качественных показателей проводилось с помощью непараметрических методов у2, у2 с поправкой Йетса (для малых групп), критерия Фишера. Сравнение количественных параметров в исследуемых группах осуществлялось с использованием критериев Манна-Уитни, Вальда, медианного хи-квадрат и модуля ANOVA. Оценка изучаемых показателей в разные фазы заболевания (обострение, ремиссия) выполнялась с помощью критерия знаков и критерия Вилкоксона. Для количественных показателей принципиально важные пороговые значения определялись на основе построения классификационных деревьев. По стандартной методике посредством формирования таблиц

сопряженности нами было рассчитано отношение рисков (шансов) (Ж, показывающее во сколько раз риск неблагоприятного течения выше при наличии фактора по сравнению с его отсутствием.

Результаты собственных исследований. Проведенная оценка клинических, лабораторных, эндоскопических, морфологических, иммунологических и молекулярно-генетических показателей выявила ряд особенностей, характерных для неблагоприятного варианта течения ЯК.

На основе комплексной оценки нами было установлено, что клинические проявления ЯК оказались более выражены у больных с неблагоприятным вариантом течения заболевания. Средняя частота стула в сутки у больных с тяжелым обострением и гормонозависимостью была больше по сравнению с благоприятным вариантом течения болезни (9,73+0,74 и 8,0±0,8 раз в сутки против 4,17+0,78, соответственно; р<0,001). Следует отметить, что подобные различия являлись характерными также для часто рецидивирующего ЯК, хотя и с меньшей достоверностью (р<0,01).

У пациентов с тяжелым обострением и гормонозависимым ЯК чаше отмечался умеренно выраженный и выраженный болевой абдоминальный синдром (72,2% и 37,8%; 68,2% и 22,7%, соответственно) по сравнению с группой благоприятного варианта течения (32,5% и 5%, соответственно). Интенсивность абдоминальных болей также была большей у больных с диагностическим титром пАНЦА. По нашим данным, риск развития неблагоприятного варианта течения заболевания увеличивается в 5,1 раза в случае умеренного и выраженного абдоминального болевого синдрома в период обострения заболевания.

Анализ данных субъективной оценки пациентом своего состояния показал, что в подгруппе ЯК с частыми рецидивами достоверно чаще отмечалось плохое общее самочувствие по сравнению с благоприятным вариантом течения (46% против 10%, р<0,01). При сравнении подгрупп тяжелого и гормонозависимого ЯК с благоприятным вариантом течения заболевания это различие было еще более статистически значимым (68,2% и 54,5% против 10%, р<0,001).

Частота снижения массы тела среди всех пациентов с ЯК составила 36%. Дефицит массы тела чаще наблюдался у больных с тяжелым обострением и гормонозависимостью (63,6% в обеих подгруппах) и повышал риск развития неблагоприятного варианта течения ЯК в 3,1 раза.

Было обнаружено достоверное различие в частоте возникновения лихорадки у пациентов групп сравнения. Так, повышение температуры тела от 37°С до 38°С в фазу обострения было более характерно для больных с частыми рецидивами (50%), гормонозависимостью (54,5%) и тяжелым обострением (86,4%) по сравнению с пациентами с благоприятным вариантом течения ЯК (20%) (р<0,05). Лихорадка выше 38°С наблюдалась у 27,4% больных с тяжелым обострением и 18,1% больных с гормонозависимостью, в то время как в группе благоприятного варианта течения столь значимое повышение температуры тела отмечалось лишь в 5% случаев (р<0,05).

Была установлена достоверно большая частота суставных болей как внекншечных проявлений ЯК в подгруппах больных с частыми рецидивами и гормонозависимым ЯК по сравнению с группой благоприятного варианта течения заболевания (30,8% и 31,8% против 10%, соответственно). При этом не было найдено ассоциации между локализацией воспалительного процесса и частотой суставных поражений. По всей видимости, эта частота определяется в большей степени длительностью течения заболевания, а в случае гормонозависимости поражение суставов может быть связано с влиянием некоторых генов (в том числе, TNF-a). В подтверждение этого предположения была найдена большая частота артралгий у больных с генотипами -308 G/A и -308 А/А (обозначенными как генотип -308 А/-) по сравнению с генотипом -308 G/G гена TNF-a (18,8% и 1,5%, соответственно; р<0,05). Таким образом, генотип -308 А/- ассоциирован с большей выраженностью системного воспаления при ЯК.

Изучение лабораторных показателей крови для определения активности ЯК позволило выявить ряд особенностей, присущих трем рассматриваемым формам неблагоприятного варианта течения заболевания.

Сравнительный анализ содержания гемоглобина в крови пациентов в фазу обострения ЯК показал, что статистически значимое его снижение наблюдалось в подгруппах неблагоприятного варианта течения с тяжелым обострением и гормонозависимостью по сравнению с группой благоприятного варианта течения заболевания (113,8±4,79 г/л и 111,14±5,13 г/л против 129,7+3,0 г/л, соответственно; р<0,01). У больных с частым рецидивированием ЯК отмечалась тенденция к более низкому содержанию гемоглобина в крови по сравнению с благоприятным вариантом течения (р=0,06).

Содержание гематокрита в клиническом анализе крови также было достоверно ниже у пациентов с тяжелым обострением (32,8+1,68%) и гормонозависимостью (34,81+1,36%) по сравнению с группой благоприятного варианта течения ЯК (38,4±0,95%) (р<0,05).

Было выявлено статистически значимое увеличение содержания лейкоцитов крови в фазу обострения у пациентов с частым рецидивированием ЯК по сравнению с благоприятным вариантом течения заболевания (8,62±0,5 х109/л и 7,2±0,35 х109/л; р<0,05). Еще более высокий уровень лейкоцитов отмечался в подгруппах тяжелого и гормонозависимого ЯК (р<0,001).

Кроме того, обнаружены достоверные различия в уровне палочкоядерных лейкоцитов в крови у пациентов с тяжелым обострением ЯК и гормонозависимостью по сравнению с больными группы благоприятного варианта течения заболевания (0,70±0,15 х109/л и 0,64±0,16 х109/л против 0,23±0,03 х109/л, соответственно) (р<0,01).

Снижение альбумина в крови отмечалось во всех исследуемых подгруппах, причем для пациентов с тяжелым обострением ЯК и гормонозависимостью были характерны достоверно более низкие значения этого биохимического показателя, чем для больных с благоприятным

вариантом течения заболевания (31,9+0,8 г/л и 34,49+1,12 г/л против 37,4±0,51 г/л, соответственно) (р<0,01). В подгруппе пациентов с частыми рецидивами уровень альбумина в фазу обострения составил 37,4+0,52 г/л.

Для тяжелого обострения и гормонозависимого ЯК в фазу активного заболевания было характерны увеличение количества тромбоцитов, лейкоцитов, СРВ и ускорение СОЭ по сравнению с группой благоприятного варианта (таблица 1).

Таблица 1 — Некоторые показатели клинического анализа крови у пациентов с различными вариантами течения язвенного колита в фазу обострения заболевания

Показатель Благоприятный вариант течения ЯК (группа 1) Клинический признак неблагоприятного варианта течения ЯК Р

Частое рецидиви-рование (подгруппа 2а) Гормоноза- ВИСИМОСТЬ (подгруппа 26) Тяжелое обострение (подгруппа 2в)

N=40 (М±ш) N=26 (М+т) N=22 (М±ш) N=22 (М±ш)

Тромбоциты (х109/л) 311,4+17,4 372,48±24,8 427,6+36,08 438,63±30,77 <0,05' <0,0123

СОЭ (мм/ч) 15,0±1,37 20,64±2,79 22,81+3,18 24,4±2,74 <0,0512 <0,013

СРБ (мг/л) 6,2±1,52 13,15+2,64 24,14±4,36 26,2±3,61 <0,01' <0,0012,3

Примечание: достоверные различия: 1 — между группами 1 и 2а; 2 — между группами 1 и 26; 3 — между 1 и 2в.

Содержание лимфоцитов в крови больных в фазу ремиссии ЯК было достоверно ниже в подгруппах гормонозависимого ЯК (1,39±0,05 х109/л) и тяжелого обострения (1,91±0,1б х109/л) по сравнению с группой благоприятного варианта течения заболевания — 2,05±0,11 х109/л (р<0,05 и р<0,01, соответственно). Остальные показатели клинического анализа крови, а

также значения СРБ и альбумина в фазу ремиссии в исследуемых группах достоверно не различались.

Признаки, используемые для расчета индекса эндоскопической активности Рахмилевича (D. Rachmilewitz, 1989), такие как зернистость слизистой оболочки толстой кишки (СОТК) и изменения сосудистого рисунка, встречались у больных с ЯК с общей частотой 70,7% и 97,2%, соответственно. Мы обнаружили, что подгруппы гормонозависимого ЯК и тяжелого обострения заболевания характеризовались достоверно более выраженной кровоточивостью и повреждениями СОТК по сравнению с группой благоприятного варианта течения (р<0,05 и р<0,01, соответственно).

Отдельно рассматривалась частота встречаемости эрозивно-язвенных изменений СОТК. Отмечено, что эти признаки эндоскопической активности ЯК достоверно чаще встречались у больных с гормонозависимостъю (суммарно в 86,4% случаев) и тяжелым обострением заболевания (86,4%), и были менее характерны для благоприятного варианта течения заболевания (37,5%; р<0,05).

Кроме того, у больных с гормонозависимостью и тяжелым обострением ЯК значение индекса Рахмилевича было выше, чем в группе благоприятного варианта течения (5,9±0,2 балла и 6,41+0,3 балла против 4,25+0,32 балла, соответственно) (р<0,001). Нами также выявлено более высокое значение этого индекса у пациентов с частым рецидивированием, по сравнению с больными с благоприятным вариантом течения, хотя различие не достигало статистической значимости (р=0,05).

Была также выявлена тенденция к большей активности кишечного воспаления, характеризуемого индексом Рахмилевича, у носителей генотипа -308 А/- (то есть -308 G/A или -308 А/А) гена TNF-a (р=0,08). Кроме того, была отмечена большая частота эрозивно-язвенных поражений толстой кишки в группе больных с диагностическим титром пАНЦА по сравнению с пАНЦА-негативными пациентами (60,3% против 27,5%, р<0,05). Можно предположить, что более высокая степень выраженности воспалительного процесса в СОТК наблюдается у больных со всеми формами неблагоприятного варианта течения ЯК, ассоциирована с аутоиммунными нарушениями (в частности, продукцией пАНЦА) и, вероятно, предопределяется генетически.

Сравнение результатов морфологического исследования биоптатов у пациентов исследуемых групп показало, что среди больных с гормонозависимостью и тяжелым обострением ЯК чаще, чем в группе благоприятного варианта течения заболевания встречается трансмуральная инфильтрация СОТК (57% и 57% против 20%, соответственно; р<0,05).

Нарушение архитектоники крипт и базальный плазмоцитоз (наиболее патогномоничные признаки ЯК) были выявлены у всех обследованных пациентов. Частоты встречаемости криптитов и крипт-абсцессов, диффузной инфильтрации собственной пластинки СОТК и снижения плотности крипт достоверно не отличались в исследуемых подгруппах.

Проведенное иммунологическое исследование показало, что диагностически значимый титр пАНЦА в крови был выявлен у 58 из 87

обследованных больных (66,6%), из них у 42 обнаружены иАНЦА а у 27 пациентов — пАНЦА 1»Л. У 11 исследуемых наблюдалось сочетание иАНЦА ДО и иАНЦА ^А.

В зависимости от наличия диагностически значимого титра пАНЦА (^О и/или 1§А) все пациенты были разделены на две группы исследования: пАНЦА -негативные (или группа А), и пАНЦА-позитивные больные (группа Б), в которых и проводилось дальнейшее сравнение.

Средний возраст больных с диагностически значимым титром пАНЦА на момент обследования был достоверно больше, чем у пАНЦА-негативных пациентов (44,91 ±1,97 года против 37,66±2,75 лет). Нами также был отмечен больший возраст пАНЦА-позитивных пациентов на момент установления диагноза (40,31+1,90 лет против 34,55±2,72 года в группе пАНЦА-негативных больных), хотя это различие и не достигало статистической значимости (р=0,08). Оценка анамнеза заболевания показала, что длительность ЯК также достоверно различалась в исследуемых группах, составив 7,16 ± 0,89 лет у пациентов группы Б против 4,54 ± 0,92 года у больных группы А (р<0,05). Больные, включенные в группу Б, имели большее количество рецидивов по сравнению с пАНЦА-негативными пациентами (3,1+0,23 и 2,6+0,24, соответственно, р<0,05).

Было установлено, что длительность анамнеза заболевания более 6 лет увеличивает риск развития любой формы неблагоприятного варианта течения в 13,17 раз. По всей видимости, большая длительность заболевания характеризуется продолжительным контактом иммунной системы организма с еще не установленным антигеном, что проявляется в более выраженной продукции антител (в том числе пАНЦА).

У пациентов с диагностически значимым титром пАНЦА количество тромбоцитов в крови в фазу обострения было достоверно большим, чем в группе пАНЦА-негативных больных (384,11+18,72х109/л против 307,75+18,72х109/л, р<0,01). Статистически значимое различие в количестве тромбоцитов сохранялось и в фазу ремиссии (308,68±16,22х109/л против 249,85±19,39х109/л; р<0,05). Не было выявлено ассоциации между наличием пАНЦА в крови и такими маркерами лабораторной активности заболевания, как уровень лейкоцитов, СОЭ и СРБ.

У больных с диагностически значимым титром пАНЦА достоверно чаще, чем в группе пАНЦА-негативных больных, выявлялась тяжелая степень заболевания (32,7% против 10,3%; р<0,05).

Эндоскопическое исследование толстой кишки показало, что значение индекса эндоскопической активности Рахмилевича было различным в группах А и Б, составив, соответственно, 4,45±0,40 и 5,33±0,25 (р=0,06). Распространенность воспалительного процесса в толстой кишке не зависела от наличия пАНЦА.

В настоящем исследовании проводилась оценка частоты выявления диагностического титра пАНЦА среди пациентов с различными вариантами течения ЯК. В группе благоприятного варианта течения заболевания

диагностический титр пАНЦА встречается у 20 больных (51%). В то же время в подгруппах часто рецидивирующего, гормонозависимого ЯК и тяжелого обострения заболевания эти антитела обнаруживались с частотой 76%, 77% и 86,3%, соответственно (р<0,05).

Современные теории этиопатогенеза ЯК в качестве одного из значимых аспектов рассматривают влияние генетического фактора на развитие заболевания. Одним из наиболее изучаемых генов, который, как предполагается, участвует в патогенезе заболевания, является ген TNF-a и его полиморфные варианты (-308 G/A и -238 G/A). По данным Bouma G. и соавт. (1998) носительство аллеля -308 А должно приводить к увеличению синтеза цитокина ФНО-а.

В работе проведен анализ частоты носительства полиморфных вариантов гена TNF-a -308 G/A и -238 G/A у пациентов с ЯК, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области (таблица 2).

Таблица 2 — Частоты носительства аллелей и генотипов полиморфных вариантов гена TNF-a -308 G/A и -238 G/A в группе пациентов с ЯК и контрольной выборки

Полиморфные варианты Генотипы Аллели Пациенты с ЯК (п=83) Популяционная выборка (п=117) Р

п частота (%) п частота (%)

-308 G/A G/G 67 80,7 108 92,3 <0,05

G/A 14 16,9 8 6,8 <0,05

А/А 2 2,4 1 0,9 >0,05

G 148 89,2 224 95,7 <0,05

А 18 10,8 10 4,3 <0,05

-238 G/A G/G 78 93,6 103 87,9 >0,05

G/A 5 6,4 14 12,1 >0,05

А/А 0 0 0 0 >0,05

G 161 97,0 220 94,0 >0,05

А 5 3,0 14 6,0 >0,05

Было выявлено достоверное различие в частоте носительства генотипа -308 G/A гена TNF-a среди больных ЯК по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Кроме того, частоты аллелей -308 G и -308 А у пациентов с ЯК составили 89,2% и 10,8%, а в контрольной группе — 95,7% и 4,3%, соответственно (р<0,05).

Анализ частот генотипов и аллелей полиморфного варианта гена TNF-a -238 G/A не выявило достоверных различий между пациентами с ЯК и популяционной выборкой. Генотип -238 G/A был обнаружен у 6,4% больных ЯК и 12,1% — контрольных индивидуумов. Аллели -238 G и -238 А встречались в исследуемой группе с частотами 97% и 3%, в контрольной группе — 94% и 6% соответственно. Согласно рассчитанному коэффициенту отношения шансов (Odds ratio, OR) носительство аллеля -308 А в 2,5 раза увеличивало риск развития ЯК, генотипа -308 G/A гена TNF-a — в 2,76 раза.

Была проанализирована частота носительства полиморфных вариантов гена TNF-a у пациентов с различными вариантами течения ЯК. Выявлены достоверные различия частот генотипов -308 G/A или -308А/А (обозначенных как генотип -308 А/-) между группой пациентов с часто рецидивирующей формой ЯК и благоприятным вариантом течения заболевания (38,4% против 12,5%, соответственно, р<0,05). По всей видимости, отмеченная исследователями большая активность аллеля -308 А гена TNF-a в отношении продукции цитокина, оказывает влияние и на течение заболевания у пациентов с ЯК, способствуя длительному поддержанию кишечного воспаления, склонности к частым обострениям.

Аллель -238 А встречался реже у пациентов с гормонозависимым ЯК по сравнению с контрольной группой (0% и 12,5%, соответственно; р=0,05).

В настоящем исследовании не удалось обнаружить статистически значимых различий между частотами исследованного полиморфизма промоторной области гена TNF-a и полом, возрастом пациентов, возрастом дебюта заболевания, наличием наследственной предрасположенности или аппендэктомии в анамнезе у больных ЯК

Были проанализированы данные клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования у больных ЯК с целью выявить ассоциации с носительством одного или нескольких полиморфных вариантов гена TNF-a. Исследование основных лабораторных маркеров воспаления (СОЭ, СРБ, уровень лейкоцитов) не выявило достоверных различий в показателях у больных с наличием или отсутствием полиморфизма гена TNF-a. Однако пациенты с генотипами -308 G/A или -308 А/А имели достоверно более высокий уровень у-глобулинов крови в фазу обострения ЯК по сравнению с больными-носителями полиморфного варианта -308 G/G (20,1+1,7 г/л против 15,9±0,64 г/л, р<0,05).

Не установлена ассоциация между локализацией воспалительного процесса в толстой кишке и носительством полиморфных вариантов исследуемого гена

Активность воспаления в СОТК была более выраженной у больных с генотипом -308 А/-. Так, у этих пациентов значения индекса Рахмилевича оказались выше, чем в группе больных с отсутствием указанного полиморфного варианта гена TNF-cx (5,08+0,22 балла и 4,89+0,23 балла, соответственно), хотя различие и не достигало статистической значимости (р=0,08). При носительстве хотя бы одного из генотипов (-308 A/G или -308 А/А) отмечалось достоверное увеличение частоты суставного синдрома, поражений глаз (р<0,05) и кожи (р<0,01) как внекишечных проявлений ЯК.

Частоты обнаружения АНЦА достоверно не различалась у пациентов с генотипами -308 G/G, -308 A/G и -308 А/А. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности исследования полиморфного варианта -308 G/A гена TNF-a у больных ЯК как одного из критериев диагноза, а также в качестве одного из маркеров, позволяющих клиницисту предвидеть развитие неблагоприятного варианта течения заболевания до его формирования.

Помимо клинических, лабораторных и эндоскопических признаков (длительность анамнеза заболевания, интенсивность абдоминального болевого синдрома, количество крови в стуле, выраженность общей слабости, уровень лейкоцитов в крови, распространенность воспалительного процесса в толстой кишке) нами были установлены иммунологический и генетический факторы риска развития неблагоприятного течения ЯК. Выявление пАНЦА в крови повышало риск формирования неблагоприятного варианта течения заболевания в 3,61 раза, а наличие генотипа -308 G/A — в 2,74 раза.

В работе показано, что наиболее достоверные данные, касающиеся расчета отношения шансов, были получены при рассмотрении 10 факторов риска, включающих клинические, лабораторные, эндоскопические показатели, а также иммунологические и молекулярно-генетические маркеры для прогнозирования течения ЯК (таблица 3, рисунок 1).

Таблица 3 — Факторы риска развития неблагоприятного варианта течения язвенного колита

Признак OR

Умеренная и значительная примесь крови в стуле в фазу обострения 16,8

Длительность анамнеза язвенного колита более 6 лет 13,17

Плохое общее самочувствие в фазу обострения 9,3

Температура тела выше 37, 2°С в фазу обострения 6,3

Умеренная и выраженная абдоминальная боль в фазу обострения 5,1

Количество лейкоцитов в крови более 8 тыс/мкл в фазу обострения 4,28

Выявление диагностического титра пАНЦА 3,61

Снижение массы тела 3,1

Генотип -308 G/A гена TNF-a 2,74

Распространенный колит 2,32

100 90 80 70 60

% 50 40 30 20 10 0

Нет 1-2 3-4 5-7 8-10

фактора фактора факторов факторов

Рисунок I. Частоты риска формирования неблагоприятного варианта течения язвенного колита при различных уровнях суммарного количества факторов риска

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании была проведена оценка клинико-лабораторных, эндоскопических, морфологических, иммунологических, генетических признаков у больных с благоприятным и неблагоприятным (часто рецидивирующим, гормонозависимым, тяжелым) вариантами течения ЯК. Работа продемонстрировала, что все три формы неблагоприятного течения характеризуются не только более выраженным кишечным, но и системным воспалением при сравнении с благоприятным вариантом течения заболевания.

Было показано, что почти у 2/3 пациентов с ЯК выявляются пАНЦА классов IgG и/или IgA, а их наличие ассоциировано с неблагоприятным вариантом течения ЯК. Пациенты с диагностическим титром этих антител характеризовались более выраженной клинико-лабораторной и эндоскопической активностью заболевания. Таким образом, пАНЦА являются не только важным диагностическим, но и прогностическим маркером ЯК.

Проведенный анализ частоты встречаемости полиморфных вариантов гена TNF-a -308 G/A и -238 G/A как среди пациентов с ЯК, так и в группе контроля, позволил установить большую частоту выявления генотипа -308 G/A у больных ЯК, а также ассоциацию генотипа -308 А/- с формированием часто рецидивирующей формы заболевания. Полученные результаты свидетельствуют о несомненном участии генетических факторов в развитии неблагоприятного варианта течения ЯК.

В заключительной части настоящего исследования проводилась оценка роли некоторых клинико-лабораторных, эндоскопических, иммунологических и генетических маркеров в формировании неблагоприятного варианта течения

ЯК. Была показана важность комплексной оценки факторов риска в

формировании неблагоприятных форм заболевания.

Таким образом, в результате работы достигнута поставленная цель и

решены основные задачи исследования.

ВЫВОДЫ

1. Предикторами неблагоприятного варианта течения язвенного колита являются выраженные изменения клинико-лабораторных и эндоскопических показателей, отражающих активность не только местного (кишечного), но и системного воспаления.

2. У больных язвенным колитом, проживающих на территории Санкт-Петербурга и Ленинградской области, достоверно чаще, чем в популяции выявляется полиморфизм -308G/A гена TNF-a. Наличие аллеля -308 А гена TNF-a в 2,5 раза повышает риск развития язвенного колита, а генотип -308А/- ассоциирован с частыми рецидивами заболевания.

3. Антитела к цитоплазме нейтрофилов с перинуклеарным типом свечения в диагностическом титре ассоциируются с неблагоприятным вариантом течения заболевания.

4. Наибольший риск развития неблагоприятного варианта течения язвенного колита отмечается при одновременном выявлении прогностически наиболее значимых клинико-лабораторных показателей (длительность анамнеза заболевания, кровь в стуле, лихорадка и снижение массы тела, абдоминальная боль и общее самочувствие, уровень лейкоцитов в крови в фазу обострения), эндоскопических признаков распространенного колита, иммунологических и генетических маркеров (диагностический титр пАНЦА и генотип -308 G/A гена TNF-a).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациентам с язвенным колитом показано определение полиморфного варианта -308G/A гена TNF-a в качестве предиктора развития неблагоприятного варианта течения заболевания.

2. Для прогнозирования течения язвенного колита в комплекс диагностических мероприятий целесообразно включать определение антител к цитоплазме нейтрофилов с перинуклеарным типом свечения.

3. Для определения риска развития неблагоприятного варианта течения язвенного колита необходима комплексная оценка совокупности клинико-лабораторных, эндоскопических, иммунологических и генетических показателей.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективы дальнейшей разработки темы заключаются в уточнении патогенетических механизмов формирования гормонозависимости и гормонорезистентности у больных ЯК, в том числе более широкое молекулярно-генетическое исследование, определение иммунологического, цитокинового профиля, и составления на их основе прогностической модели формирования резистентных форм заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Харитонов, А.Г. Особенности клинических проявлений язвенного колита у пациентов с повышенным титром р-АНЦА / А.Г. Харитонов, Э.А. Кондрашина, C.B. Лапин, A.C. Герасимова // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 10-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2008». - 2008. - № 2-3 -С. M122.

2. Харитонов, А.Г. Полиморфные варианты гена TNF-a у пациентов с язвенным колитом / А.Г. Харитонов, Э.А. Кондрашина, Т.Э.Иващенко, Ю.А.Насыхова // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 11-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2009». -2009.-№2-3.-С. М83.

3. Харитонов, А.Г. Клинические особенности язвенного колита у p-ANCA позитивных пациентов / А.Г. Харитонов, Э.А. Кондрашина, С.В.Лапин, A.C. Герасимова//Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 11-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2009». - 2009. - №2-3. - С. М83.

4. Baranovsky, A.Y. Clinical features of ulcerative colitis in pANCA-positive patients in Russian Federation / A.Y. Baranovsky, A.G. Kharitonov, E.A. Kondrashina, S.V. Lapin // J. Crohns Colitis. - 2009. - Vol. 3, N.l. - P. 120.

5. Baranovsky, A.Y. Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphism in Russian patients with ulcerative colitis / A.Y. Baranovsky, A.G. Kharitonov, E.A. Kondrashina, Y.A. Nasykhova, V.S. Baranov // J. Crohns Colitis. - 2009. -Vol. 3, N.l. - P.129.

6. Харитонов, А.Г. Особенности клинической картины и течения язвенного колита у пациентов с различным р-АНЦА статусом / А.Г. Харитонов, Э.А. Кондрашина, C.B. Лапин, Т.В. Булгакова // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 12-го международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2010». - 2010. - № 2-3 -С. М91.

7. Насыхова, Ю.А. Анализ полиморфизма генов NOD2/CARD15 и TN Fa у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями желудочно-кишечного тракта / Ю.А. Насыхова, Н.В. Семенов,

A.Г. Харитонов, Т.Э. Иващенко, О.Б. Щукина, А.Ю. Барановский,

B.C. Баранов // Молекулярная медицина. - 2010. - №3. - С.32-37.

8. Харитонов, А.Г. Антитела к цитоплазме нейтрофилов как маркер неблагоприятного варианта течения неспецифического язвенного колита / А.Г. Харитонов, Э.А. Кондрашина, А.Ю. Барановский, Т.В. Булгакова, С.В. Лапин, A.A. Тотолян // Медицинская иммунология.

- 2010. - Т.12, № 6. - С. 537-546.

9. Барановский, А.Ю. Полиморфизм гена TNF-a у пациентов с язвенным колитом / А.Ю. Барановский, Э.А. Кондрашина, А.Г. Харитонов, Ю.А. Насыхова, Т.Э. Иващенко // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии последипломного образования.

- 2011. - Т. 3, №3. - С. 41-45.

10. Барановский, А.Ю. Можно ли предвидеть неблагоприятное течение язвенного колита? / А.Ю. Барановский, Э.А. Кондрашина, А.Г. Харитонов // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета имени И.И.Мечникова. - 2012. - Т. 4, №1. -С. 41-47.

П.Харитонов, А.Г. Клинико-иммунологические особенности различных вариантов течения язвенного колита / А.Г. Харитонов, Э.А. Кондрашина, А.Ю. Барановский, Т.В. Булгакова, С.В. Лапин, A.A. Тотолян// Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - №3. -С. 22-26.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника Ген ТЖ-а - ген фактора некроза опухоли а

пАНЦА - перинуклеарные антинейтрофильные цитоплазматические антитела

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

СОТК - слизистая оболочка толстой кишки

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СРБ - С-реактивный белок

ЯК — язвенный колит

Харитонов Андрей Геннадьевич

Клинико-генетические и иммунологические характеристики различных вариантов течения язвенного колита

Подписано в печать 08.11.2013. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Усл. печ. листов 1,63. Тираж 100 экз. Заказ № 2187/2013.

Отпечатано в типографии ООО «Пркфикс Принт» 191014, Санкт-Петербург, Виленский пер., д. 8, лит. А Тел. (812) 272-24-71, 273-22-27