Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клинико-генетические ассоциации полиморфизма генов иммунорецепторного аппарата и воспалительных заболеваний кишечника у детей

На правах рукописи

МАЛАХИНОВА НАТАЛИЯ АРДАНОВНА

КЛИНИКО - ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ИММУНОРЕЦЕПТОРНОГО АППАРАТА И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ

14.01.08 - педиатрия

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 1 ОКТ 2010

Москва -2010

004610822

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

кандидат медицинских наук, доцент Шумилов Петр Валентинович доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Делягин Василий Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич

Ведущая организация:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского

совета Д 208.050.01 при Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: 117997, Москва, ГСП-7, Ленинский проспект д. 117, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ ДГОИ и на сайте www.niidg.ru

Защита состоится

.г. в ... часов на заседании диссертационного

2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ЧЕРНОВ В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК) объединяются термином воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). Устойчивая тенденция к увеличению заболеваемости, возрастание частоты поражения лиц молодого возраста, тяжесть течения, наличие опасных для жизни осложнений отмечаются различными исследователями. (Адлер Г., 2001г.; Григорьева Г.А., Мешалкина Н.Ю., 2007г.). Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в последние десятилетия является увеличение распространенности ВЗК среди детей (Malaty,2010). Распространенность БК у детей в Северной Калифорнии в 2006 году составила 12 на 100 тысяч, а НЯК - 19,5 на 100 тысяч населения. Заболеваемость БК у детей в Калифорнии за период времени с 1996 по 2006 годы возросла с 2,2 до 4,3 на 100 тысяч населения, а НЯК - с 1,8 до 4,9 на 100 тысяч (Abramson 0,2010). В результате исследования, проведенного в Англии и Ирландии, установлено, что заболеваемость ВЗК у детей составляет 5,2 на 100 тысяч (Sawczenko А, 2001). По данным Lanfholz Е. (1997) в Дании у 40% манифестация ВЗК наблюдалась у детей до достижения ими 10-летнего возраста. Beattie R.M. (2006) указывает, что 25% случаев ВЗК манифестируют в детском возрасте. Распространенность ВЗК у детей по данным иностранных исследователей составляет 2,2 - 7,0 на 100 тысяч (Sawczenko А., 2001; Buller Н., 2002). В Российской Федерации в 1997 году было проведено единственное эпидемиологическое исследование взрослых пациентов с ВЗК При этом распространённость БК в Московской области составила 3,5 на 100 тысяч населения и заболеваемость БК -0,3 на 100 тысяч населения, а распространённость НЯК была 22,3 на 100 тысяч населения и заболеваемость НЯК 1,7 на 100 тысяч населения (Никулина,1997).

Актуальность изучения обусловлена поиском путей ранней диагностики ВЗК, связанных с тяжёлыми необратимыми нарушениями структуры и функции желудочно-кишечного тракта в зоне поражения, внекишечными поражениями и осложнениями, иногда приводящими к летальному исходу, при увеличении манифестации и роста частоты неспецифического язвенного колита и болезни Крона у детей.

Среди факторов, способствующих развитию хронических ВЗК, генетическую предрасположенность овносят к одним из наиболее установленных факторов риска (Морозова Н.А., 1997; Халиф И.Л., Лоранская И.Д., 2004). В результате трёх различных исследований в 2001 году у больных с БК на длинном плече 16-ой хромосомы в пределах локуса IBD1 был идентифицирован ген NOD2 (Ogura Y., Bonen D.K., Inohara N. et al., 2001; Hugot J.P., Cha-maillard M., Zouali H„ Lesage S., Cezard J.P. et al., 2001; Hampe J., Guthbert F., Croucher P.J., 2001). NOD2 =nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 - нуклеотидсвязываю-

щий олигомерообразующий, включающий два домена, ген. В дальнейшем из-за наличия двух доменов активации каспазы в NOD2 произошло переименование гена с NOD2 в CARD15. CARD 15 =caspase recruitment domain containing protein 15 - кодирует белок 15, содержащий домены активации каспазы. Три наиболее частых ПА 702W, 908R, с3020ш.?С в гене NOD2/CARD15, по данным King Kathy, (2006), повышают риск развития заболевания в гетерозиготном состоянии в 2-4 раза, а в гомозиготном состоянии в 20-40 раз. Генетическую предрасположенность к ВЗК часто связывают с полиморфными вариантами генов NOD2/CARD15, DLG5 и TLR4 (Tomer G., 2003; Ferraris А., 2006; Weersma RX, 2008; Strober W., Kitani A., Fuss I., 2008; Степанова E.B., 2009). Однако степень влияния полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 у населения разных стран на восприимчивость к ВЗК и клинические проявления заболеваний имеют существенные отличия. Различается частота полиморфных вариантов генов NOD2/CARD15, DLG5, TLR4 в разных странах (Inoue N.,2002; Bönen D.K.,2002; Mendoza J.L.,2003; Roussomoustakaki M.,2003; Amott I.D.,2004). В российской популяции у пациентов с манифестацией БК и НЯК в детском возрасте неизвестна частота полиморфных вариантов генов NOD2/CARD15, DLG5 и TLR4, не определен риск развития БК и НЯК при наличии полиморфных вариантов генов NOD2/CARD15, DLG5 и TLR4. Большой интерес представляет исследование особенностей клинической картины и течения БК и НЯК в детском возрасте в зависимости от полиморфных вариантов генов NOD2/CARD15, DLG5hTLR4, выявление генетических критериев, которые позволили бы предупредить о развитии вероятных осложнений у пациентов с ВЗК. Однако до настоящего времени подобное исследование у детей с ВЗК в российской популяции не проводилось.

Всё выше изложенное определяет актуальность изучения ассоциации полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15, DLG5 и TLR4 с БК и НЯК у детей, проживающих па территории Российской Федерации.

Цель исследования: совершенствовать качество диагностики и профилактики воспалитель-пых заболеваний кишечника у детей путем определения полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (702W, 908R, c3020m.sC), DLG5 (30Q) и TLR4 (299G). Задачи исследования:

1. Оценить особенности клинической картины и возраста дебюта заболевания, локализацию воспалительного процесса, наличие внекишечных проявлений и осложнений приБК и НЯК у детей.

2. Выявить ассоциацию полиморфных аллелей генов NOD2/CARD15 (702W, 908R, с3020г'щС), DLG5 (30Q) и TLR4 (299G) с ВЗК у детей в результате сопоставления исследуемых аллельных частот у пациентов и в популяционном контроле.

3. Определить относительный риск развития БК и НЯК в детском возрасте в зависимости от наличия полиморфных аллелей генов >!СЮ2/СА1Ш15 (11702\У, 090811, 3020;/иС) ОЬС5 (Ю0(3) и 1X114 (02990).

4. Изучить влияиие полиморфных вариантов генов М002/САЖ)15, 0Ш5 и ТЪК4 на особенности клинического течения, локализацию воспалительного процесса, наличие внекишечяых проявлений и осложнений при БК у детей.

5. Оценить информативность анализа полиморфных аллелей генов МСЮ2/СА1Ш15 (К702\У, 090811, 3020;>иС) 01Х}5 (1130(2) и Т1Л4 (0299С) для диагностики и профилактики у детей с БК и НЯК.

Научная повизпа:

1. У пациентов с манифестацией БК и НЯК в детском возрасте впервые в России проведено исследование полиморфных вариантов генов ГГОШ/САМ)15 (Т1702Ш, 090811, c3020m.sC), 01X35 (Ю0(}), ТЬЯ4 (02990).

2. Выявлено, что полиморфные аллели 702\У и с3020гтС гена Ж)02/СА1Ш15 у детей достоверно ассоциированы с БК. При этом ассоциации полиморфных аллелей 908Я гена 1ТО02/САЕ1)15,30С> гена 01Л35, 2990гена Т1А4 с БК у детей в России не выявлено.

3. Доказана ассоциация аллелей 702\У и с3020ш.?С гена Ы002/СА1Ш15 с особенностями клинической картины и течения БК у детей в России.

4. Рассчитан относительный риск развития БК в детском возрасте в зависимости от наличия полиморфных вариантов генов Ж®2/СА1Ш15 (11702\У, 090811, 3020;>кС), ШХ35 (1130(2), Т1Л14 (0299в) у детей с БК в сравнении с популяциошшм контролем в России.

5. Выявлено отсутствие ассоциации полиморфных аллелей генов Ж)02/СА1Ш15 (702\\^, 90811, с3020тзС), 0Ь05 (300), ТЫ14 (2990) с НЯК у российских детей. Установлено, что относительный риск развития НЯК при наличии у ребёнка полиморфных вариантов генов ЖЮ2/САЫ)15 (Я702\У( 090811, с302ОшС), 01Х}5 (ИЗОС»), ТЬЯ4 (02990) не повышен.

Практическая значимость

Данное исследование создает предпосылки для уточнения роли генетических факторов в развитии воспалительных заболеваний кишечника у детей.

Результаты проведенного исследования позволяют разработать дополнительные генетические критерии для выделения групп детей с повышенным относительным риском развития БК. У пациентов с БК полиморфные аллели c3020hi.sC и 702W гена ЖЮ2/СА1Ш15 могут служить дополнительным критерием в оценке клинического течения заболевания, возможной локализации воспалительного процесса и осложнений.

Полученные в ходе исследования результаты показали, что полиморфные аллели генов ЖЮ2/СА1Ф15 (702\У, 908Я, с3020г>иС), БЬС5 (300), Ш14 (2990) нецелесообразно использовать в качестве диагностического критерия НЯК у детей.

Внедрение результатов работы

Основные результаты исследования внедрены в клиническую практику гастроэнтерологических отделений Российской детской клинической больницы, детской городской клинической больницы № 13 имени Н.Ф. Филатова города Москвы. Основные научные положения и выводы внедрены в педагогический процесс курса гастроэнтерологии и диетологии ФУВ кафедры детских болезней № 2 государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Результаты исследования использованы при подготовке методических рекомендаций «Воспалительные заболевания кишечника у детей: болезнь Крона и иеспецифический язвенный колит», утверждённые Министерством здравоохранения Республики Бурятия. Используются в лекционном курсе кафедры акушерства с курсом педиатрии при обучении студентов медицинского факультета Бурятского государственного университета.

Апробация диссертационной работы состоялась 29 июня 2010 года на научной конференции кафедры детских болезней №2 ГОУ ВПО РГМУ. Диссертация рекомендована к защите.

Основные положения и результаты диссертационной работы доложены па XIV Российской Гастроэнтерологической неделе (г. Москва 6-8 октября 2008г.); VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (г. Москва 21-23 октября 2008г.); 11 международном Славяно-Балтийском паучном форуме «Санкт-Петербург Гастро 2009» (г. Санкт-Петербург, 20-22 мая 2009г.); научно-практической конференции врачей ДГКБ №13 (г. Москва, декабрь 2009г.). По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе в рецензируемых журналах ВАК- 2 работы.

Связь с научными программами, планами, темами Диссертационная работа выполнена в рамках плана научно-исследовательских работ государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Номер государственной регистрации 01200904945.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Полиморфные аллели 702W и с3020/гаС генаЖЮ2/СА1Ф15 достоверно ассоциированы с болезнью Крона в детском возрасте у пациентов, проживающих в России.

2. Относительный риск развития болезни Крона в детском возрасте повышен у носителей полиморфных аллелей 702\\' гена и c3020m.sC ЖЮ2/СА1Ш15.

3. Полиморфный аллель 702V/ генаЖШ2/СА1Ш15 влияет на клинические аспекты болезни Крона:

• локализация болезни Крона в подвздошной кишке и перианальной области достоверно ассоциирована с наличием полиморфного алледя 702W гена М002/САК£)15;

• пенетрирующее течение достоверно ассоциировано с носительством полиморфного аллеля 702W генаЖЮ2/СА1Ш15.

4. Выявлено отсутствие ассоциации полиморфных аллелей с3020ш$С, 908Л, 702W гена ЖШ2/САЫ)15, 30(3 гена 299С гена 7X114 с неспецифическим язвенным колитом и полиморфных аллелей 908Я гена Ш02/САЫ)15, 3(Х} гена 01X55, 299й гена ШМ - с болезнью Крона в детском возрасте.

Объём и структура диссертациовпой работы

Представленная диссертационная работа изложена на /^"/странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав материалов собственного исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 215 источников (33 отечественной и 182 источников зарубежной литературы). Работа проиллюстрирована 38 таблицами и 12 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Данная работа проводилась в период 2007-2010 годов на базе отделений гастроэнтерологии Российской Детской Клинической Больницы, Научного Центра Здоровья Детей РАМН, Государственного Научного Центра Колопрокгологии Росмедтехнологий, ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова г. Москвы и инфекционного отделения №2 (отделение кишечных инфекций) ДГКБ № 9 им. Г.Н. Сперанского г. Москвы.

Всего с ВЗК обследовано 186 человек, из них 101 ребенок с НЯК и 85 детей с БК. Среди больных сВЗК: пациенты мужского пола составили 55,4% (103 пациента), женского пола - 44,6% (83 пациента). Средний возраст больных ВЗК составил 13,2±0,9 лет. Длительность ВЗК в среднем составила 3,96±0,5 года. Диагноз ВЗК основывался на основании оценки жалоб, данных анамнеза заболевания, клинического осмотра и данных проведенных исследований (эндоскопических, морфологических, лабораторных, рентгенологических). Эзофагогасг-родуоденоскопия, ректороманоскопия, илеоколоноскопия с поэтажной биопсией, рентгенография пищевода, желудка и тонкой кишки с барием, ирригография, фистулография, клинические анализы крови и мочи, биохимические и иммунологические анализы крови, ультра-

звуковое исследование печени, желчного пузыря, почек, исследование кала выполнялись по общепринятым методикам. В соответствии с Монреальской классификацией (2005) все пациенты с БК были определены в подгруппы с учетом возраста к моменту установления диагноза, локализации процесса, характера течения заболевания. Для оценки клинической активности при БК использовался педиатрический индекс активности, оценивающий выраженность болей в животе, частоту и консистенцию стула, самочувствие, массу тела и рост, болезненность в животе, лараректальные и внекишечные проявления, лабораторные изменения. У пациентов с неспецифическим язвенным колитом был использован клинический индекс активности Rachmilewitz (Рахмилевич), проводилась оценка общего самочувствия, частоты стула и количества крови, выраженности болевого синдрома, лихорадки, внекишечных проявлений.

Молекулярпо-генетическое исследование проводилось на базе лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН (директор - академик РАМН, д.м.п., профессор Е.К. Гинтер, зав. лабораторией - д.б.н., профессор А.В. Поляков). Образцы ДНК 85 не родственных пациентов сБКи101-с НЯК, а также 106 человек из группы по-пуляционного контроля были исследованы на наличие полиморфных аллелей гена NOD2/CARD15 (702W, 908R, c.3020insC), гена DLG5 (30Q) и гена TLR4 (299G). Популяци-онный контроль был представлен образцами ДНК (п=106) доноров из банка ДНК лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН. В группе популяционного контроля 56,6% составляли доноры мужского пола и 46,4% - женского пола. Образцы ДНК выделены из цельной крови, забор 1 мл крови проводился одновременно с забором крови для планового биохимического исследования из локтевой вены. Генетическое исследование включало следующие этапы: выделение геномной ДНК, мультиплексную лигазную реакцию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ полиморфизма длин рестрикционпых фрагментов (ПДРФ-анализ), анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ-анализ), электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ).

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением программ STATISTICA и SPSS. Достоверность различий частот исследуемых аллелей в группе пациентов с БК в сравнении с контрольной группой и в группе больных с НЯК в сравнении с контрольной группой проводилась с использованием критерия %2 (хи) квадрат (chi-square tests) и критерия Фишера. При вычислении статистически значимыми считались отличия р<0,05 (95%-й уровень значимости). Относительный риск (ОР) был рассчитан с оценкой доверительного интервала и значения р. Степень доказательности данных определялась величиной доверительного интервала (ДИ), вероятность отклонения от нулевой гипотезы ве-

личиной р. Для выявления клинико-генетических ассоциаций между дихотомическими признаками использовался логический ре1рессионный анализ. Анализ клинических особенностей течения заболевания проводился в зависимости от наличия полиморфных аллелей 702\У и с.3020тзС гена N002, которые по данным исследования ассоциированы с БК.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В исследовании участвовали 186 человек с ВЗК, из них 85 (45,7%) пациентов с манифестацией БК в детском возрасте и 101 (54,3%) ребенок с диагнозом - НЯК. Распределение пациентов с ВЗК по возрасту на момент проведения исследования представлено в табл. 1.

Таблица 1

Распределение пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника по возрасту

Возраст в годах

1-3 4-6 7-11 12-17 18-33

БК 1(1,2%) 1 (1,2%) 8 (9,4%) 51(60%) 24 (28,2%)

НЯК 13 (12,9%) 12(11,9%) 13 (12,9%) 63 (62,3%) 0

ВЗК 14(7,6%) 13 (7,1%) 21(11,5%) 114 (60,7%) 24 (13,1%)

Среди больных с ВЗК (п=186) пациенты мужского пола составили 55,4% (103 пациента), женского пола - 44,6% (83 пациента). Средний возраст больных ВЗК составил 13,2 ± 0,9 лет. Длительность ВЗК варьировала от 2 мес. до 16,3 лет и в среднем составила 3,9 ± 0,5 года.

В группе больных с НЯК (а=101) были дети в возрасте от 1,5 лет до 17 лет 10 мес. Средний возраст пациентов с НЯК равен 10,8 ± 0,9, а длительность заболевания в среднем равна 3,5± 0,6 года. Распределение больных с НЯК по полу: мужского пола 51 человек (50,5%) и женского пола 50 человек (49,5%). Средний возраст больных с БК равен 15,9± 0,9 лет. Длительность БК в среднем составила 4,5± 0,8 года. Распределение пациентов с БК по полу: мужского пола 52 (61,2%) и женского пола 33 (38,8%).

Манифестация БК и НЯК происходила во все возрастные периоды от первого года жизни до 18 лет. Распределение больных по возрасту манифестации БК и НЯК представлено в табл. 2.

Таблица 2

Возраст манифестации заболевания при БК и НЯК

Возраст манифестации БК (п=85) НЯК(п=Ю1) Р

0-3 года 7 (8,2%) 32 (31,7%) р<0,05

4-6 лет 6 (7,1%) 14 (13,9%) р>0,05

7-11 лет 25 (29,4%) 30 (29,7%) р>0,05

12-17 лет 47 (55,3%) 25 (24,7%) р<0,05

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что манифестация БК в сравнении с НЯК статистически достоверно чаще происходила в возрастной группе от 12 до 17 лет (р<0,05), а дебют НЯК был статистически достоверно чаще, чем БК, в три первых года жизни ребенка (р<0,05). При этом в возрастных группах 4— 6 лет и 7-11 лет статистически достоверных различий в частоте манифестации БК и НЯК не выявлено (р>0,05).

По локализации заболевания среди пациентов с БК: поражение верхних отделов же-лудочно - кишечного тракта выявлено у 13 человек (15,3%), илсит - у 17 (20,0%), колит- у 16(18,8%), илеоколит - у 39(45,9%) больных. При оценке протяжённости воспалительного процесса у больных с НЯК сочетание поражения тонкой и толстой кишки выявлено в 70,3% случаев (71 ребёнок), частота встречаемости проктита и проктосигмоидита составила 23,8% (24 ребёнка), а левостороннего колита в 5,9% (6 детей).

Воспалительная форма у пациентов с БК выявлена у 41 пациента (48,2%), стриктури-рующая (стенозирующая) форма - у 20 больных (23,5%), пепетрирующая форма - у 14 больных (16,5%), сочетание стриктурирующей и пепетрирующей формы диагностировано у 10 человек (11,8%). При манифестации БК в детском возрасте воспалительная форма диагностировалась чаще в сравнении с пенетрирующей формой БК (р<0,05). У детей с БК не было установлено статистически достоверных различий между частотой встречаемости стриктурирующей формы с пенетрирующей и воспалительной формой БК.

При исследовании особенностей клинической картины у пациентов с БК преобладали следующие симптомы: абдоминальные боли (87%), учащенный стул (64,7%), диарея (55,3%), потеря массы тела (52,3%), повышение температуры тела от 37,5" до 39'- в 50,5% случаев. Для больных с НЯК более характерны были следующие симптомы: примесь крови в стуле (87,1%), учащенный стул (80,2%), абдоминальные боли (73,3%), диарея (67,3%). В таблице 3 представлены данные о частоте встречаемости клинических симптомов, характерных для ВЗК, среди пациентов с БК и НЯК.

Таблица 3

Клинические симптомы в группе пациентов с БК и НЯК

Симптомы Пациенты с БК (п=85) Пациенты с НЯК (п=101) Р

абс. % абс. %

Абдоминальные боли 74 87,0 74 73,3 р>0,05

Повышение температуры 37,5 -39' 43 50,5 27 26,7% р<0,05

Диарея 47 55,3 68 67,3 р>0,05

Учащенный стул 55 64,7 81 80,2 р<0,05

Запоры 5 5,8 11 10,9 р>0,05

Примесь крови в стуле 38 44,7 88 87,1 р<0,05

Потеря массы тела 45 52,9 31 30,7 р<0,05

Наличие свищей 24 28,2 0 0 р<0,05

Наличие стриктур 30 35,3 0 0 р<0,05

Анальные трещины 13 15,3 6 5,9 р<0,05

Тснезмы 8 9,4 7 6,9 р>0,05

При сравнении частоты встречаемости клинических симптомов в группах больных с НЯК и БК было определено, что повышение температуры и потеря массы тела, наличие свищей, стриктур и анальных трещин достоверно чаще встречается при БК, чем при НЯК(р<0,05). У больных с НЯК в сравнении с БК было достоверно чаще выявлепо наличие примеси крови в стуле и учащенный стул (р<0,05).

Определение ассоциации БК и НЯК с полиморфными вариантами (ПВ) с.3020 imC, R702W, G908R гена NOD2/CARD15, R30Q гсиа DLG5, D299G гсиа TLR4

В нашем исследовании проводился анализ частоты встречаемости ПВ генов NOD2/CARD15, DLG5 и TLR4 среда больных БК и НЯК в сравнении с популяционным контролем. В исследуемой группе полиморфные аллели (ПА) имели 69 из 85 больных с БК (81,2%), в том числе гена NOD2/CARD15 41 из 85 с БК (48,2%). Среди больных с НЯК наличие ПА устаповлено у 46 из 101(45,5%), из них ПА гена NOD2/CARD15 - 19 детей (18,8%).

В табл.4 представлен расчет статистических различий между аллельной частотой с.3020 insC, 702W, 908R гена NOD2/CARD15, 30Q гена DLG5, 299G гена TLR4 при БК в сравнении с популяционным контролем.

Таблица 4

Частота ПА гена М(Ж2/САЫЛ5, Ш/55 и Т1А4 у детей с БК

Полиморфные аллели (ПА)

с3020. шС 702\У 90811 30(3 299в

гена КОШ гена N002 гена N002 гена БЬ05 гена Т1Л4

БК ПК БК ПК БК ПК БК ПК БК Ж

85 106 85 106 85 106 77 106 77 106

Всего (п=ПА) 26 12 16 6 5 3 15 16 16 29

Гомозиготы (п) 4 0 2 0 0 0 0 0 3 2

Гетерозиготы (п) 18 12 12 6 5 3 15 16 10 25

Аллельная частота, % 15,3 5,6 9,4 2,8 2,9 1,4 9,7 7,5 10,4 13,7

Р р<0,05 р<0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05

Полиморфный вариант с.3020гтС (вставка С нуклеотида в положении 3020, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп — кодона или р.1007Гз - сдвиг рамки считывания с 1007 аминокислоты) гена >1СШ2/СА1Ш15 выявлен у 22 пациентов с БК (25,9%), в том числе в гомозиготном состоянии у 4 (4,7%) больных, в гетерозиготном состоянии у 18 (21,4%) больных. Аллельная частота с.3020 шбС гена МСЮ2/СА1Ш15 среди больных составила 15,3%. ПВ с.3020 ¡юС генаШ02/СА1Ш15 в гомозиготном состоянии выявлен только среди больных и отсутствуют в контрольной группе. В контрольной выборке ПВ с.3020 шлС выявлен у 12 из 106 человек. Аллельная частота с.3020шзС (р.1007£з) гена ЖЮ2/САЫ)15 в группе популяционного контроля составила 5,6%. При исследовании выявлены статистически значимые отличия в частоте встречаемости ПА с.3020/шС между контрольной и исследуемой выборкой (р<0,05), что свидетельствует об ассоциации с БК.

Полиморфный вариант 11702\У (замена аргинина в 702 положении на триптофан или с.2209С>Т - замена нуклеотида С на Т в положении 2209) гена ]М(Ш2/СА1Ш15 обнаружен у 14 (15,3%) больных с БК, при этом у двух больных в гомозиготном состоянии, у 12 - в гетерозиготном. Аллельная частота 702\¥ составила 9,4% у пациентов с БК. Аллель 702W в гомозиготном состоянии выявлен только среди больных с БК. В контрольной выборке аллель 702\У выявлен у 6 из 106 человек, аллельная частота равна 2,8%. По нашим данным выявле-

ны статистически значимые отличия в частоте встречаемости ПА 702Ш в контрольной и исследуемой выборке (р<0,05), что свидетельствует об ассоциации ПА 702\У с БК.

Полиморфный вариант 090811 (замена глицина в 908 положении на аргинин или с.2827С>С - замена нуклеотида О на С в положении 2827) гена 1\Ю02/САМ>15 обнаружен только у 5 (5,9%) больных с БК в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота 90831 (с.2827С) гена ЖЮ2/САКШ5 при БК составила 2,9%. В контрольной группе аллелъная частота равна 1,4%. ПА 908К в гомозиготном состоянии не был определен ни в группе пациентов с БК, ни в популяционном контроле. Аллельная частота 908Я гена К002/САМ>15 в группе пациентов с БК и контрольной группе не имеет статистически значимых отличий (р>0,05), что не подтверждает наличие ассоциации ПА 908Ягена№Ю2/СА1Ш15 сБК.

Полиморфный вариант К.ЗОО гена 01Х}5 выявлен в гетерозиготном состоянии у 15 (17,6%) пациентов с БК. Аллельная частота ЗОС) гена РЬ05 у пациентов с БК составила 9,7%. В контрольной группе ПВ ЫЗОС} обнаружен у 16 из 106 человек. Аллельная частота 30(2 в популяционном контроле равна 7,5%. Аллельная частота ЗОС? в исследуемой и контрольной группе не имеет статистически значимых отличий (р>0,05), что не подтверждает ассоциацию ПВЮ0(2генаМХ>5 сБК.

Полиморфный вариант 02990 гена Т1Л?.4 (То11-подобного рецептора 4) выявлен у 13 (15,3%) пациентов с БК, в том числе в гомозиготном состоянии у трех (3,5%) больных, в гетерозиготном состоянии у 10 (11,7%) больных. Аллельная частота 2990 гена Т[ЛМ среди больных с БК составила 10,4%. В контрольной выборке ПА 2990 выявлен у 25 человек, в двух случаях исследуемый аллель выявлен в гомозиготном состоянии. Аллельная частота 2990 в группе популяционного контроля составила 13,7%. По данным нашего исследования аллельная частота 2990 при БК ниже, чем в контрольной группе, но различия в аллельных частот между исследуемой и контрольной группой статистически незначимы (р>0,05), ассоциация ПВ 02990 гена ТЬМ с БК не доказана.

1*7021« ¡пэС <39081* ЯЗОО 02990

Рис 1. Аллельные частоты с.3020 твС, 702\У, 908Я, ЗОС}, 299в в группе

пациентов с БК и в популяционном контроле. На рис. 1 представлены аллельвые частоты c.3020msC, 702W, 908R гена NOD2/CARD15, 30Q гена DLG5,299G гена TLR4 у пациентов с БК и в груше популяциощшго контроля.

По данным нашего исследования установлено, что только ГГВ c.3020i>uC и R702W гена NOD2 ассоциированы с БК. Ассоциация ПВ G908R гена NOD2, R30Q гена DLG5 и D299G гена TLR4 с БК нами не подтверждена.

При НЯК полиморфный вариант G908R (замена глицина в 908 положении на аргинин или c.2827G>C - замена нукпеотида G на С в положении 2827) обнаружен у б (5,9%) больных в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота 908R гена NOD2/CARD15 составила 2,9%, а в контрольной груше 1,4%. Аллелыше частоты между исследуемой и контрольной выборкой не имеют статистически значимые отличия (р>0,05).

Полиморфный вариант R702W (замена аргшшна в 702 положении на триптофан или С.22090Т - замена нуклеотида С на Т в положении 2209) обнаружен у 8 (7,8%) больных, в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота 702W среди больных с НЯК составила 3,9%. В контрольной группе ПВ выявлен у 6 из 106 человек, аллельная частота равна 2,8%. Значимые отличия частот аллелей в контрольной и исследуемой группе не выявлены (р>0,05).

Полиморфный вариант с.3020 insC выявлен у 6 (5,9%) пациентов с НЯК, в том числе в гомозиготном состоянии у 2 (1,9%) и в гетерозиготном состоянии у 4 (3,9%) больных. Аллельная частота с.3020 insC reHaNOD2/CARD15 среди больных равна 3,9%. В контрольной выборке ПВ с.3020 insC выявлен у 12 человек из 106, причем только в гетерозиготном состоянии. По данным проведенного анализа аллельная частота с.3020 insC в контрольной группе выше (5,6%), чем среди больных, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного ПВ гена NOD2/CARD15 с НЯК.

Полиморфный вариант R30Q гена DLG5 выявлен в гетерозиготном состоянии у 14 (13,7%) больных с НЯК. Аллельная частота 30Q гена DLG5 при НЯК составила 6,9%. В контрольной группе ПВ R30Q обпаружен у 16 из 106 человек и аллельная частота равна 7,5%. Таким образом, аллельная частота 30Q гена DLG5 в исследуемой и контрольной группах не различалась статистически достоверно (р>0,05).

Полиморфный вариант D299G гена TLR4 выявлен у 15 (14,7%) пациентов с НЯК, в том числе в гомозиготном состоянии у 2 (2,0%) больных, в гетерозиготном состоянии у 13 (12,7%) больных. Аллельная частота 299G гена TLR4 составила 8,4% среди больных с НЯК. В контрольной выборке ПВ D299G выявлен у 27 из 106 человек, из них у 2 больных в гомозиготном состоянии, у 25 - в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота 299G гена TLR4

в контрольной группе (13,7%) выше, чем среди пациентов с НЯК, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного ПВ гена К002/САВ.Ш5 с НЯК.

В таблице 5 представлены данные о частоте ПА гена ЖЮ2/СА1Ш15, ВЬ05, Т1Л4 у больных с НЯК и в популяционном контроле.

Таблица 5

Частота полиморфных аллелей гена 1\ЮВ2/САЫ)15, 01X35, ТЬЯ4 у больных с НЯК

Полиморфные аллели (ПА)

c.3020insC 702W 908R 30Q 299G

генаЖЮ2 reHaN0D2 гена КОМ геиа DLG5 гена TLR4

НЯК ПК НЯК ПК НЯК ПК НЯК ПК НЯК ПК

101 106 101 106 101 106 101 106 101 106

Всего (п=ПА) 8 12 8 6 6 3 14 16 17 29

Гомозиготы (п) 2 0 0 0 0 0 0 0 2 2

Гетерозиготы (п) 4 12 8 6 6 3 14 16 13 25

Аллельная час- 3,9 5,6 3,9 2,8 2,9 1,4 6,9 7,5 8,4 13,7

тота, %

Р р>0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05 р>0,05

В результате данного исследования установлено, что частоты встречаемости полиморфных аллелей генов ЖШ2/СА1Ш15, 01X35, Т1Л4 у детей с НЯК и в популяционном контроле не имеют статистически значимых различий, исследуемые ПА с.3020швС, 702Ш, 908К гена ЖШ2/СА1Ф15, 30(} гена 01X35, 299й гена Т1Д14 не ассоциировав с НЯК у детей в России.

На рис. 2 представлены аллельные частоты с.30201>кС, 702\¥, 908К гена >1СШ2/СА1Ш15, ЗОС2 гена Б1Х}5, 2990 гена ТЬЯ4 в группе больных с НЯК и в популяционном контроле.

К702Ю ¡пзС С908Я ЮОО 02996

Рис.2. Аллельная частота в группе больных с НЯК и популяционном контроле

Определение риска развития БК и НЯК в зависимости от наличия двух полиморфных вариантов гена ЖЮ2/САМ)15.

В табл. 6 представлены данные об изменении относительного риска развития БК в зависимости от наличия двух ПВ генаЖЮ2/СА1Ш15.

Таблица 6

Относительный риск развития БК и НЯК при наличии двух ПВ гена Ж)02/САЫ) 15

Название группы Количество людей с 2 ПВ гена N002 ОР да Р

БК (п=85) 8 9,2 2-78 <0,05

ПК(п=106) 0

НЯК(п=101) 1 1,05 0-38,9 >0,05

ПК (п=106) 0

Наличие одновременно двух ПВ гена ЖЮ2/САК015 было определено у 8 человек с БК и 1 - с НЯК. В группе популяционного контроля не было пациентов с двумя НВ гена №®2/САЫ)15. Наличие двух ПА >ТО02/САК015 повышает риск возникновения БК в 9,2 раза (р<0,05), а при НЯК не увеличивает риск развития заболевания. При исследовании не выявлено наличие трех и более ПВ одновременно ни среди больных БК, ни в контрольной группе.

Относительный риск развития БК в зависимости от наличия полиморфных вариантов с.3020 йкС, К702№', С9(Ш{ гена N002, М0<2 гена 01Х?5, Ш99С гена Т1Я4

В табл. 7 представлены данные об изменении относительного риска развития БК в зависимости от наличия ПВ генов ЖЮ2/САМЭ15,ШХ35, ТЬК4.

Таблица 7

Относительный риск развития БК в зависимости от наличия полиморфных вариантов генов МОБ2/СА1Ш15, Т1ЛМ

Прогноз возможности БК

Всего п Пациенты с ПВ п % Пациенты без ПВ п % ОР ДИ Р

с.3020/шС с БК 85 22 25,9 63 74,1 2,3 1,2-4,3 <0,05

с3020гшС в ПК 106 12 11,3 94 88,7

R702W с БК 85 14 16,5 71 83,5 2,9 1,2-7,2 <0,05

R702W в ПК 106 6 5,7 100 94,3

G908R сБК 85 5 5,9 80 94,1 2,1 0,4-11,3 >0,05

G908R в ПК 106 3 2,8 103 97,2

11300 с БК 85 15 17,6 70 82,4 1,2 0,5-2,7 >0,05

ИЗОО в ПК 106 16 15,1 90 84,9

02990 с БК 85 13 15,3 72 84,7 0,6 0,3-1,3 >0,05

Ш99С в ПК 106 27 25,5 79 74,5

Наличие полиморфного варианта с.3020г>цС гена N002/0 АК015 повышает риск БК в 2,3 раза, а полиморфного варианта 11702ЧУ гена К0Б2/САК015 - в 2,9 раза. При наличии полиморфных вариантов 090811 гена ЖЮ2/СА1Ш15, ИЗ ОС) гена 0299С гена ТЪЯ4 относительный риск развития БК не повышен.

Относительный риск развития НЯК в зависимости от наличия полиморфных вариантов в гене ]М002/САШ)15

В табл. 8 представлены данные об изменении относительного риска развития НЯК в зависимости от наличия ПВ с.3020 пкС, Я702\\г, 090815. гена ЖЮ2/СА1Ш15, ИЗОО гена ШЛ35,0299й гена Т1Л14.

Таблица 8

Относительный риск развитая НЯК в зависимости от наличия с.3020 шбС, R702W, 0908Я гена ЖШ2/СА1Ш15, Я30(} гена БЬ05,Ш990 гена ТЬЯ4.

Прогноз возможности НЯК

Всего ц Пациенты с ПВ п % Пациенты без ПВ п % ОР ДИ Р

c3020insC с НЯК 101 5 4,9 96 95,1 0.4 ол- >0,05

c3020insC в ПК 106 12 11,3 94 88,7 ^г

R702W с НЯК 101 8 7,9 93 92,1 1,4 0,5- >0,05

R702W в ПК 106 6 5,7 100 94,3 3,8

G908R с НЯК 101 6 5,9 95 94,1 2,1 0,5- >0,05

G908R в ПК 106 3 2,8 103 97,2 8,2

ЮООсНЯК 101 14 13,9 87 86,1 0,9 0,4- >0,05

R30Q в ПК 106 16 15,1 90 84,9 1,7

D299G с НЯК 101 15 14,9 86 85,1 0.6 0,3- >0,05

D299G в ПК 106 27 25,5 79 74,5 1,1

Относительный риск развития НЯК не повышается в присутствии в генотипе полиморфных аллелей 908R, с.3020 insC, 702W гена NOD2/CARD15 гена, 30Qrena DLG5,299G гена TLR4.

Учитывая, что только аллели с.3020 insC и 702W гена NOD2/CARD15 были ассоциированы с БК, в дальнейшем, проводилось изучение ассоциаций с.3020 insC и 702W гена NOD2/CARD15 с локализацией воспалительного процесса, внекишечными проявлениями, особенностями клинической картины и осложнениями БК у детей.

Анализ зависимости локализации БК от полиморфных вариантов генов NOD2, DLG5, TLR4

У 20 пациентов с БК при наличии полиморфной аллели c3020insC гена NOD2 был обнаружен воспалительный процесс в подвздошной кишке, только у двух пациентов с алле-лем c3020insC подвздошная кишка не была вовлечена в воспалительный процесс, однако статистически достоверных различий не выявлено (р=0,06).

В результате исследования пе получено ассоциации полиморфного адлеля 702W гена NOD2 с локализацией БК в других отделах кишечника, кроме подвздошной кишки.

В табл. 9 представлены результаты логического регрессионного анализа локализации БК в зависимости от наличия ПА 702W гена NOD2.

Таблица 9

Локализация БК в зависимости от наличия 702W гена Î40D2

Локализация БК Количество пациентов, %, с аллелем 702W и 702R renaN0D2

Пациенты, п = 85 702W п= 13 702R п = 72 Р

Без поражения подвздошной кишки 18 6 12 р<0,05

С поражением подвздошной кишки 67 7 60

У пациентов с БК при наличии полиморфного аллеля 702\У гена N002 была выявлена ассоциация с наличием воспалительного процесса в подвздошной кишке (р<0,05).

В таблице 10 представлены данные изучения ассоциации перианального поражение у пациентов с БК в зависимости от наличия 702\У гена N002.

Таблица 10

Перианальное поражение при БК в зависимости от наличия 702W гена N0D2

Локализация БК renNOD2

Перианальное поражение Всего п 702W п % 702R N % Р

отсутствует 55 5 9,1 50 90,9 <0,05

присутствует 30 8 26,7 22 73,3

Перианальное поражение у больных с БК было представлено в виде паралроктитов и параректальных свшцей. У пациентов с БК при наличии полиморфного аллеля 702W гена N0D2 была выявлена ассоциация с перианалышм поражением (р<0,05). У большинства пациентов с БК, имевших ПА c3020insC гена N0D2 не было перианального поражения, но у восьми больных с аллепем c3020insC отмечались паралроктиты и параректальные свищи.

В таблице 11 представлены данные изучения ассоциации перианального поражение у пациентов с БК в зависимости от наличия nAc3020insC генаЖЮ2.

Таблица 11

Перианальное поражение при БК в зависимости от наличия ПА c3020insC гена N0D2

Локализация БК ген NOD2

Перианальное поражение Всего п ins/N п % N/N п % Р

отсутствует 55 14 25,5 41 74,5 >0,05

присутствует 30 8 26,7 22 73,3

Полиморфный аллель c3020insC гена NOD2 не ассоциирован с наличием перианаль-ного поражения при БК (р>0,05).

Внекишечное проявление БК в виде поражения печени обнаружено у 6 больных (12,5%), все они имели ПА гена NOD2, DLG5, TLR4. Артриты отмечались у 13 больных (27%) с ПА гена NOD2, DLG5, TLR4 против 6 больных (16%), пе имевших полиморфных вариантов исследуемых генов. Кожные проявления БК были представлены узловатой эритемой, которая была выявлена у трех человек с ПА гена NOD2, DLG5, TLR4 и у трех человек без полиморфных вариантов исследуемых генов. При анализе внекишечных проявлений БК в зависимости от наличия ПА 702W и c3020insC гена NOD2 не найдено статистически достоверных ассоциаций (р>0,05).

Анализ клинических симптомов БК в зависимости от носительства полиморфных аллелей 702W и c3020insC гена NOD2

Результаты анализа влияния полиморфных аллелей 702W и c3020insC гена NOD2 на особенности клинической картины при БК представлены в таблицах 12,13,14.

Таблица 12

Болевой синдром при БК в зависимости от наличия 702W гена NOD2

Симптом ГенЖЮ2

Боли в животе Всего п 702W п % 702R п % Р

отсутствуют 10 4 40 6 60 <0,05

присутствуют 75 9 12 66 88

У пациентов с БК с ПА 702W гена NOD2 обнаружена ассоциация с наличием абдоминального болевого симптома (р<0,05).

В табл.13 представлены данные о частоте встречаемости болевого симптома у детей с БК в зависимости от наличия аллеля c3020insC гена NOD2.

Таблица 13

Болевой синдром у детей с БК в зависимости от наличия c3020insC геваЖЮ2

Симптом ген NOD2

Боли в животе Всего и ins/N п % N/N п % Р

отсутствуют 10 2 20 8 80 >0,05

присутствуют 75 20 26,7 55 73,3

Не обнаружено достоверной ассоциации ПА c3020insC гена NOD2 с наличием болевого симптома (р>0,05).

Ассоциация пенетрирующей формы БК с полиморфными аллелями 702W и c3020insC гена NOD2

У 25 пациентов с БК были обнаружены межкишечные и параректальные свшци. В таблице 14 представлены данные об ассоциации полиморфного аллеля c3020insC гена NOD2 с пенетрирующей формой БК у детей.

Таблица 14

Ассоциация пенетрирующей формы БК с c3020insC renaNOD2

Локализация БК Полиморфные аллели

свищи Всего п ins/N п % N/N п % Р

отсутствуют 60 16 26,7 44 73,3 >0,05

присутствуют 25 6 24 19 76

У детей с БК не найдена ассоциация полиморфного аллеля c3020insC гена NOD2 с пенетрирующей формой БК (р>0,05).

В таблице 15 представлены данные об ассоциации ПА 702'\У гена N002 с пенетри-рующей формой БК.

Таблица 15

Ассоциация пенетрирующей формы БК сПА702\У гена N002

симптом Полиморфные аллели

свищи Всего 702\У 702Я Р

п п % N %

отсутствуют 60 6 10 54 90 <0,05

присутствуют 25 7 28 18 72

У пациентов с БК при наличии ПА 702Ш гена ЖЮ2 была выявлена ассоциация с пенетрирующей формой БК (р<0,05).

ВЫВОДЫ

1 .Манифестация болезни Крона (БК) в сравнении с неспецифическим язвенным колитом (НЯК) достоверно чаще происходила в возрастной период от 12 до 17 лет. Дебют НЯК в возрасте до трех жизни ребенка был достоверно чаще, чем при БК

2. Выявлено, что достоверно чаще при манифестации БК в детском возрасте встречается воспалительная форма в сравнении с пенетрирующей формой БК. Не определено достоверных различий между частотой встречаемости сгршсгурирующей формы с пенетрирующей и воспалительной формой БК. Потеря веса, повышение температуры, наличие свищей, стриктур, анальных трещин достоверно чаще встречается при БК, чем при НЯК. У детей с НЯК в сравнении с БК было достоверно чаще выявлено наличие примеси крови в стуле и учащенный стул.

3. Болезнь Крона у детей ассоциирована с полиморфными аллелями (ПА) 702и сЗСИОтяС гена N002 и не получено ассоциации дебюта БК в детском возрасте с ПА 908Я гена N002, 30<3 гена 01X35, 2990 гена Т1Л14. Для детей с НЯК не выявлено ассоциаций с ПА 908Я, 702Ш, сЗОгОгаЮ гена N002, 30(} гена 0Ьв5,2990 гена ТШ4. 4.0тносительный риск развития БК в 2,9 раза выше у детей-носителей ПА 702W гена ЖШ2/СА1Ш15 (ОР=2,9, ДИ 1,2-7,2, р<0,05) и в 2,3 раза выше у детей-носителей ПА сЗОгОпкС гена ЖЮ2/САИ515 (ОР-2,3, ДИ 1,2-4,3, р<0,05). При сочетании двух различных ПВ гена Ш02/САК1>15 (11702\У, Ст908К, сЗОгОпвС) риск развития болезни Крона возрастает более чем в 9 раз (ОР-9,2, ДИ 1,3-78, р<0,05).

5. Поражение подвздошной кишки и перианальной области, пенетрирующая форма болезни Крона у детей ассоциировано с ПА 702W гена ЖЮ2/СА1Ш15. В клинической картине БК

при наличии ПА 702W гена NOD2/CARD15 характерно наличие абдоминального болевого синдрома. Ассоциации ПА 702W гена NOD2/CARD15 с другими клиническими симптомами не обнаружено. Не получено ассоциации ПА c3020insC гена NOD2 с локализацией БК, формой заболевания и внекишечными проявлениями, клиническими симптомами заболевания. 6. Генетическое исследование полиморфных аллелей 702W и c3020insC гена NOD2/CARD15 является информативным для определения риска развития и прогноза течения БК у детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование полиморфных аллелей 702W и c3020insC гена NOD2/CARD1S рекомендуется использовать в качестве дополнительного критерия диагностики и прогноза течения болезпи Крона у детей.

2. Носители полиморфных аллелей 702W и c3020insC гена NOD2/CARD15 могут рассматриваться как группа риска по развитию болезпи Крона в детском возрасте и требуют дополнительного диспансерного наблюдения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шумилов П.В., Малахинова H.A., Сапрыкина Е.А., Цимбалова Е.Г., Степанова Е.В., Щапша O.A., Поляков A.B., Потапов A.C. Особенности генотипа при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, ко-лопроктологии. - 2008.- Т. XVIII, №5.- Приложение №32 «Материалы XIV Российской Гастроэнтерологической Недели, 6-8 октября 2008г., Москва. -С.65.

2. Шумилов П.В., Хандамирова О.О., Малахинова H.A., Ипатова М.Г., Румянцев С.А., Потапов A.C. Роль иммунных нарушений и микробного фактора в развитии воспалительных заболеваний кишечника у детей // Вопросы детской диетологии- 2009 - Т.7, №4. -С.20-24.

3. Малахинова H.A., Шумилов П.В., Поляков A.B., Перепанова Т.С., Карпина Л.М. Влияние полиморфизмов гена NOD2 на течение воспалительных заболеваний кишечника у детей // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тезисы докладов. -Москва. - 2009.-С. 168-169.

4. Малахинова H.A., Перепанова Л.С. Клиническая характеристика хронических воспалительных заболеваний кишечника у детей в Республике Бурятия // Бюллетень ВосточноСибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - Иркутск - 2009 - №3 - С. 343-344.

5. Малахинова НА., Перепанова Л.С. Современные подходы к диагностике хронических воспалительных заболеваний кишечника у детей // Сборник статей: «Актуальные проблемы регионального здравоохранения» - Улан-Удэ. - 2009. - С.375-380.

6. Малахинова H.A., Шумилов П.В., Поляков A.B., Мухина Ю.Г., Щагина O.A., Карпина JI.M., Потапов A.C., Михайлова T.JL, Калинцева В.А., Курохтина И.С. Влияние полиморфных маркеров генов NOD2, DLG5, TLR4 на вероятность развития болезни Крона и неспецифического язвенного колита // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. - Ростов-на-Дону-14-18 мая 2010 - С.109.

7. Малахинова НА., Перепанова JI.C. Воспалительные заболевания кишечника у детей: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит // Методические рекомендации №1-Министерство здравоохранения Республики Бурятия. Республиканский медицинский информационно - аналитический центр. - Улан-Удэ. - 2010. - 40с.

8. Малахинова H.A., Шумилов П.В., Мухина Ю.Г. Роль полиморфных вариантов генов NOD2/CARD 15, DLG5, TLR4 при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите. Обзор литературы // Якутский медицинский журнал.- 2010. — № 2.-С. 50-53.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

БК Болезнь Крона

ВЗК Воспалительные заболевания кишечника

НЯК Неспецифический язвенный колит

ПА Полиморфный аллель

ПВ Полиморфный вариант

ОР Относительный риск

ди Доверительный интервал

Подписано в печать 04.10.2010 г. Объем 1 п.л. Формат 60 х 84/16 Заказ № 164 Тираж 100 экз.

ООО «Фирма Печатный двор» 107076,

г. Москва, Колодезный пер., д. 14 8-(499)-269-80-41; 8-(499)-269-80-42

Актуальность исследования

Болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (ИЯК) объединяются термином воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). Устойчивая тенденция к увеличению заболеваемости, возрастание частоты поражения лиц молодого возраста, тяжесть течения, наличие опасных для жизни осложнений отмечаются различными исследователями (1,8).

Характерной особенностью эпидемиологии ВЗК в последние годы является увеличение распространенности ВЗК среди детей (144). За десятилетний период времени с 1996 по 2006 годы заболеваемость БК у детей в Северной Калифорнии возросла с 2,2 до 4,3 на 100 тысяч, а НЯК - с 1,8 до 4,9 на 100 тысяч. Распространенность БК у детей в 2006 году достигла 12 на 100 тысяч, а НЯК-19,5 (35). В результате исследования, проведенного в Англии и Ирландии, заболеваемость ВЗК 5,2 на 100 тысяч детей (186). В исследовании учёных других стран распространенность ВЗК 2,2 -7,0 на 100 тысяч у детей (60). По данным Ьапйю1г Е. (1997) в Дании у 40% манифестация ВЗК наблюдалась до достижения 10- летнего возраста (136). Веай1е Я.М. (2006) также указывает, что 25% случаев ВЗК манифестировало в детском возрасте (47).

В Российской Федерации в 1997 году было проведено единственное эпидемиологическое исследование взрослых пациентов с ВЗК. При этом распространённость БК в Московской области составила 3,5 на 100 тысяч населения и заболеваемость БК 0,3 на 100 тысяч населения, а распространённость НЯК была 22,3 на 100 тысяч населения и заболеваемость НЯК 1,7 на 100 тысяч населения (18).

Актуальность изучения обусловлена поиском путей ранней диагностики ВЗК, связанных с тяжёлыми необратимыми нарушениями структуры и функции желудочно-кишечного тракта в зоне поражения, внекишечными поражениями и осложнениями, иногда приводящими к летальному исходу, при увеличении манифестации и роста частоты неспецифического язвенного колита и болезни Крона у детей.

Среди факторов, способствующих развитию хронических ВЗК, генетическую предрасположенность относят к одним из наиболее установленных факторов риска (15,28). В результате трёх различных исследований в 2001 году у больных с БК на длинном плече 16-ой хромосомы в пределах локуса IBD1 был идентифицирован ген NOD2 (107,116,157). NOD2 = nucleotide-binding oli-gomerization domain containing 2 - нуклеотид-связывающий олигомерообра-зующий, включающий два домена, ген. В дальнейшем из- за наличия двух доменов активации каспазы в NOD2 произошло переименование гена с NOD2 в С ARDI 5. CARD 15 =caspase recruitment domain containing protein 15 - кодирует белок 15, содержащий домены активации каспазы. Три наиболее частых ПА 702W, 908R, с3020insC в гене NOD2/CARDI5 полиморфных варианта в этом гене, по данным King Kathy (2006), повышают риск развития заболевания в гетерозиготном состоянии в 2-4 раза, а в гомозиготном состоянии в 20-40 раз (126).

Генетическую предрасположенность к ВЗК часто связывают с полиморфными вариантами генов ИОВ2/САВ1)15, ПЮ5 и ТЬЯ4 (24, 86, 193, 198,208). Однако степень влияния полиморфных вариантов гена ЫОВ2/САВ£)15 у населения разных стран на восприимчивость к ВЗК и клинические проявления заболеваний имеют существенные отличия. Различается частота полиморфных вариантов генов МОВ2/СА1Ю15, ОЮ5, ТЬЯ4 в разных странах (40, 53, 119,151, 179).

В российской популяции у пациентов с манифестацией БК и НЯК в детском возрасте неизвестна частота полиморфных вариантов генов И002/САК015, 0Ь05 и ТЫ14, не определен риск развития БК и НЯК при наличии полиморфных вариантов генов ЫОП2/САЮЭ15, ИЬС5 и ТЬВ.4. Требует изучения влияние полиморфных вариантов генов АЮВ2/САШЭ15, ВЬС5, ТЫ14 на особенности течения БК и НЯК в детском возрасте.

Большой интерес представляет исследование особенностей клинической картины и течения БК и НЯК в детском возрасте в зависимости от полиморфных вариантов генов N002/СА1Ю15, ЭЬС5 и ТЬК4, выявление генетических критериев, которые позволили бы предупредить о развитии вероятных осложнений у пациентов с ВЗК. Однако до настоящего времени подобное исследование у детей с ВЗК в российской популяции не проводилось.

Всё выше изложенное определяет актуальность изучения ассоциации полиморфных аллелей генов МОВ2/СА1Ю] 5, ОЮ5 и ТЫ14 с БК и НЯК у детей, проживающих на территории Российской Федерации.

Цель исследования: совершенствовать качество диагностики и профилактики воспалительных заболеваний кишечника у детей путем определения полиморфных аллелей генов МСЮ2/САМ)15 (70290811, с3020шяС), ВШ5 (30<3) и ТЬЯ4 (2990). Задачи исследования:

1. Оценить особенности клинической картины, локализацию воспалительного процесса, наличие внекишечных проявлений и осложнений при БК иНЖ у детей.

2. Выявить ассоциацию полиморфных аллелей генов МОП2/САКЛ15 (702\¥, 90811, c3020m.sC), ПШ5 (ЗОр) и ТЬЯ4 (2990) с ВЗК у детей в результате сопоставления исследуемых аллельных частот у пациентов и в популяци-онном контроле.

3. Определить относительный риск развития БК и НЯК в детском возрасте в зависимости от наличия полиморфных аллелей генов Ы002/СА1Ю15

0908Я, 3020/гаС), 1ЭШ5 (ЯЗОО) и ТЫ14 (Б2990).

4. Изучить влияние полиморфных вариантов генов Ы002/СА1Ю15, ИГМЗ и ТЬЯ4 на особенности клинического течения, локализацию воспалительного процесса, наличие внекишечных проявлений и осложнений при БК у детей.

5. Оценить информативность анализа полиморфных аллелей генов ИСЮ2/САМ)15 (К702\¥, 090811, 3020/гаС), ОШ5 (ЯЗОС}) и ТЬЯ4 (02990) для диагностики и профилактики у детей с БК и НЯК.

Научная новизна:

1. У пациентов с манифестацией БК и НЯК в детском возрасте впервые в России проведено исследование полиморфных вариантов генов ЫОВ2/СА1Ю15 (Ы702\У, С908Я, 3020Ш5С), ИШ5 (ИЗОС)), ТЬЯ4 (Б2990).

2. Выявлено, что полиморфные аллели 702\\^ и с3020ш5С гена И002/СА1Ю15 у детей достоверно ассоциированы с БК. При этом ассоциации полиморфного аллеля 908Я гена АЮИ2/СА1Ю15, 300 гена 2990 гена ТЬЯ4 с БК у детей в России не выявлено.

3. Доказана ассоциация аллелей 702\¥ и с3020/гаС гена ЫОй2/СА1Ю15 с особенностями клинической картины и течения БК у российских детей.

4. Рассчитан относительный риск развития БК в детском возрасте в зависимости от наличия полиморфных вариантов генов ИОВ2/САВ£)15 (К.702^¥, 090811, 3020/гаС), ВЮ5 (1130(2), ТЬЯ4 (02990) у детей с БК в сравнении с популяционным контролем.

5.Выявлено отсутствие ассоциации полиморфных аллелей генов И002/СА1Ю15 (702W, 90811, сЗОгОтэС), ШвЗ (30(2), ТЬЯ4 (2996) с НЯК у российских детей. Установлено, что относительный риск развития НЯК при наличии у ребёнка полиморфных вариантов генов МОВ2/СА1Ю15 (R702W, 090811, с3020ш$С), (1130(3), ТШ4 (Б2990) не повышен. Практическая значимость

Данное исследование создает предпосылки для уточнения роли генетических факторов в развитии воспалительных заболеваний кишечника у детей. и

Результаты проведенного исследования позволяют разработать дополнительные генетические критерии для выделения групп детей с повышенным относительным риском развития БК. У пациентов с БК полиморфные аллели c3020insC и 702W гена NOD2/CARD15 могут служить дополнительным критерием в оценке клинического течения заболевания, возможной локализации воспалительного процесса и осложнений. Полученные в ходе исследования результаты показали, что полиморфные аллели генов NOD2/CARD15 (702W, 908R, c3020insC), DLG5 (30Q), TLR4 (299G) нецелесообразно использовать в качестве диагностического критерия НЯК у детей. Основные положения, выносимые на защиту

1. Полиморфные аллели 702W и с3020/ш-С гена NOD2/CARD15 достоверно ассоциированы с болезнью Крона в детском возрасте у пациентов, проживающих в России.

2. Относительный риск развития болезни Крона в детском возрасте повышен у носителей полиморфных аллелей 702W гена и с3020ш^С гена NOD2/CARD15.

3. Полиморфный аллель 702W гена NOD2/CARD15 влияет на клинические аспекты болезни Крона:

• локализация болезни Крона в подвздошной кишке и перианальной области достоверно ассоциирована с наличием полиморфного аллеля 702W гена NOD2/CARD] 5;

• пенетрирующее течение достоверно ассоциировано с наличием полиморфного аллеля 702W гена NOD2/CARD15.

4. Выявлено отсутствие ассоциации полиморфных аллелей c.3020zraC, 908R, 702W гена NOD2/CARD15, 30Q гена DLG5, 299G гена TLR4 с неспецифическим язвенным колитом и полиморфных аллелей 908R гена NOD2/CARD15, 30Q гена DLG5, 299G гена - с болезнью Крона в детском возрасте. Внедрение результатов работы

Основные результаты исследования внедрены в клиническую практику гастроэнтерологических отделений Российской Детской Клинической Больницы, детской городской клинической больницы № 13 имени Н.Ф. Филатова города Москвы.

Основные научные положения и выводы внедрены в педагогический процесс курса гастроэнтерологии и диетологии ФУВ кафедры детских болезней № 2 государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Результаты исследования использованы при подготовке методических рекомендаций «Воспалительные заболевания кишечника у детей: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит», утверждённые Министерством здравоохранения Республики Бурятия. Используются в лекционном курсе по педиатрии кафедры акушерства с курсом педиатрии при обучении студентов медицинского факультета Бурятского государственного университета.

Апробация диссертационной работы состоялась 29 июня 2010 года на научной конференции кафедры детских болезней №2 ГОУ ВПО РГМУ. Диссертация рекомендована к защите.

Основные положения и результаты диссертационной работы доложены на XIV Российской Гастроэнтерологической неделе (г. Москва 6-8 октября 2008г.); VII Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (г. Москва 21-23 октября 2008г.); XI международном Славяне - Балтийском научном форуме «Санкт - Петербург- Гастро 2009» (г. Санкт-Петербург, 20-22 мая 2009г.); научно-практической конференции врачей ДГКБ №13 (г. Москва, декабрь 2009г.). Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, из них в 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов исследований. Изданы методические рекомендации «Воспалительные заболевания кишечника: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит», утверждённые министерством здравоохранения Республики Бурятия. Связь с научными программами, планами, темами

Диссертационная работа выполнена в рамках плана научно- исследовательских работ государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Номер государственной регистрации 01200904945.

Структура и объём диссертации

Представленная диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав материалов собственного исследования с обсуждением полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 215 источников, из них 33 отечественной и 182 источников зарубежной литературы.

ВЫВОДЫ

Манифестация болезни Крона (БК) в сравнении с неспецифическим язвенным колитом (НЯК) достоверно чаще происходила в возрастной период от 12 до 17 лет. Дебют НЯК в возрасте до трех жизни ребенка был достоверно чаще, чем при БК.

2. Выявлено, что достоверно чаще при манифестации БК в детском возрасте встречается воспалительная форма в сравнении с пенетрирующей формой БК. Не определено достоверных различий между частотой встречаемости стрикту-рирующей формы с пенетрирующей и воспалительной формой БК. Потеря веса, повышение температуры, наличие свищей, стриктур, анальных трещин достоверно чаще встречается при БК, чем при НЯК. У детей с НЯК в сравнении с БК было достоверно чаще выявлено наличие примеси крови в стуле и учащенный стул.

3. Болезнь Крона у детей ассоциирована с полиморфными аллелями (ПА) 702и с3020тзС гена N002 и не получено ассоциации дебюта БК в детском возрасте с ПА 90811 гена ШБ2, 30(2 гена ОЬС5, 299С гена ТШ4. Для детей с НЯК не выявлено ассоциаций с ПА 90811, 702XV, сЗОгОпгеС гена МЮ2, 30<3 гена 299в гена Т1Л14.

4.0тносительный риск развития БК в 2,9 раза выше у детей-носителей ПА ^02W гена ЖЮ2/САБШ15 (ОР=2,9, ДИ 1,2-7,2, р<0,05) и в 2,3 раза выше у детей-носителей ПА с3020тБС гена ЖЖ2/САБШ15 (ОР=2,3, ДИ 1,2-4,3, р<0,05). При сочетании двух различных ПВ гена ЖЮ2/САБШ15 (Я702Ч/, 0908Я, с3020тзС) риск развития болезни Крона возрастает более чем в 9 раз (ОР=9,2, ДИ 1,3-78, р<0,05).

5. Поражение подвздошной кишки и перианальной области, пенетрирующая форма болезни Крона у детей ассоциировано с ПА 702XV гена N002/0АКТ) 15. В клинической картине БК при наличии ПА 702XV гена ЖЮ2/САШЭ15 характерно наличие абдоминального болевого синдрома. Ассоциации ПА 702\^ гена ЖЮ2/САШЭ15 с другими клиническими симптомами не обнаружено. Не получено ассоциации ПА с3020тзС гена N002 с локализацией БК, формой заболевания и внекишечными проявлениями, клиническими симптомами заболевания.

6. Генетическое исследование полиморфных аллелей 702\\^ и с3020тзС гена ЖЮ2/САШ)15 является информативным для определения риска развития и прогноза течения БК у детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование полиморфных аллелей 702\\^ и с3020тзС гена N002/0АЯЕ) 15 рекомендуется использовать в качестве дополнительного критерия диагностики и прогноза течения болезни Крона у детей.

2. Носители полиморфных аллелей 702и с3020тзС гена МЖ2/САШ)15 могут рассматриваться как группа риска по развитию болезни Крона в детском возрасте и требуют дополнительного диспансерного наблюдения.