Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Генетические и иммунологические механизмы формирования клинических проявлений целиакии у детей и подростков и их значение в реабилитации

На правах рукописи

0 3 СЕН 2009

ЛОШКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ ЦЕЛИАКИИ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В РЕАБИЛИТАЦИИ

14.00.09 - педиатрия 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ГЬО 18

Томск - 2009

003476018

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава и в Учреждении Российской Академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Кондратьева Е.И.

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Пузырев В.П.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Михалев Е.В.

кандидат медицинских наук Минайчева Л.И.

Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава

Защита состоится «_»_2009 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 208.096.02 при ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава по адресу: 634050, г. Томск, Московский тр., 2

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Тюкалова Л.И.

Актуальность проблемы. Целиакия (Ц) является одной из актуальных медико-социальных проблем современной гастроэнтерологии в связи с высокой частотой осложнений и развитием ассоциированных болезней, ведущих к инвалидизации, что определяет актуальность изучения данной патологии и поиск новейших технологий для выделения групп риска и реабилитации больных [Ревнова М.О., 2004; Бельмер C.B. и соавт., 2004; Maiuru L. et al., 2005; Hoffenberg E.J. et al., 2007].

В настоящее время известно, что заболевание встречается в большинстве стран приблизительно с одинаковой регулярностью (от 1:184 до 1:500) [Murray J.A., 2003, Fasano А., 2003, McManus R. et al., 2003]. Однако, исследования, изучающие распространенность Ц в России, до сих пор не проводились, имеются лишь разрозненные данные по отдельным регионам. Так, например, в Центральном регионе (г. Рязань) по данным сероэпидемиологического исследования, проведенного в 2006 г. в группах риска, распространенность Ц среди детей составила 1:85 (1,56%), среди взрослого населения 1:39 (2,6%) [Стройкова М.В., 2007]. Патогенез развития Ц и ее осложнений является многофакторным и определяется генетически обусловленными особенностями метаболизма, иммунитета, уровнем гиперчувствительности к глютену [Bai J. et al., 2005; Corazza G.R. et al., 2006]. Разработка новых технологий выделения групп риска по развитию целиакии и ее осложнений затруднена в связи с полигенным наследованием и генетической гетерогенностью заболевания. Одним из подходов изучения генетических факторов риска при мультифакториальных заболеваниях, к которым относится и Ц, является концепция молекулярной генетики об ассоциации полиморфных генетических маркеров с предрасположенностью или устойчивостью к развитию патологии [Trevisan R. et.al., 1997]. Эти специфичные для конкретной патологии маркеры могут быть выявлены задолго до ее клинической манифестации, что позволит определить группы риска, организовать их мониторинг, а, в случае необходимости, назначать превентивную терапию [Дедов И.И., 2004; Хаитов P.M. и соавт., 2005]. Современные достижения в области молекулярной генетики открыли новые перспективы в изучении патогенеза Ц: появилась возможность идентифицировать гены, продукты экспрессии которых принимают участие в развитии патологического процесса на слизистой тонкого кишечника [Paradopoulos G.K. et al., 2001]. В связи с этим, изучение вклада генов-кандидатов в развитие заболевания, его клинические проявления, изменчивость количественных признаков иммунитета и метаболизма, участвующих в формировании осложнений, является перспективным и может способствовать поиску критериев риска целиакии.

Цель: изучить генетические и иммунологические механизмы формирования клинических проявлений целиакии у детей и подростков Томской области и определить оптимальные подходы к реабилитации больных и профилактике заболевания.

Задачи:

1. Оценить выявляемость целиакии, соотношение различных форм заболевания, распространенность дефицитных состояний и ассоциированных с целиакией заболеваний в реальных условиях работы педиатрической службы Томской области.

2. Дать характеристику тканеспецифического антителоносительства, цитокинового статуса и гуморального иммунитета у детей с целиакией в зависимости от формы заболевания, состояния морфологической картины слизистой оболочки кишечника, а так же у их родственников.

3. Изучить связь Ж/1-системы (Л()В1 - 12 специфичностей, - 8 специфичностей) и полиморфных вариантов генов интерлейкинов (1Ь1В, ¡ЫЯМ, 1Ь4, 1Ь4ЯА), гена рецептора к витамину Э (V/?/?) с патологическим фенотипом целиакии.

4. Исследовать вовлеченость аллельных вариантов генов цитокинов на клиническое течение целиакии, варьирование патогенетически значимых признаков (тканеспецифические антитела, цитокины, показатели гуморального иммунитета) и на эффективность терапии заболевания.

5. Разработать новые технологии реабилитации детей с целиакией и членов их семей.

Научная новизна работы. Впервые дана оценка взаимосвязи клинических, иммунологических, биохимических и генетических параметров при целиакии на популяционном, семейном и индивидуальном уровнях. Установлены клинические особенности течения Ц в зависимости от возраста, формы заболевания, а также частота дефицитных состояний и осложнений у детей и подростков Томской области. Впервые показано, что дети, рожденные с задержкой внутриутробного развития, составляют группу риска по развитию типичной Ц.

Впервые для большого числа патогенетически значимых количественных признаков (иммунологических), определен вклад наследственной компоненты в их фенотипическую изменчивость, а также представлено описание наследственной компоненты в терминах конкретных генов подверженности Ц и развитию дефицитных состояний.

Новым является подход к исследованию иммунного статуса и тканеспецифического антителоносительства у больных целиакией и их родственников на популяционном уровне, позволивший выявить значительные изменения в данных системах. Впервые получены сведения о том, что изменения иммунитета у всех членов семей пробандов с Ц являются сходными. Получены коэффициенты наследуемости уровней провоспалительных (ИЛ-1Р), и противовоспалительных (ИЛ-4, ИНФ-у) цитокинов. Установлена провоспалительная направленность цитокинового каскада с увеличением содержания ФНО-а, ИЛ-1Р среди пациентов с Ц.

Впервые у больных целиакией Томской области изучены локусы НЬА-системы П()Б1, 0()А1 и показано, что патологические НЬА-маркеры выявлены у всех пациентов. Описана взаимосвязь локусов НЬА-системы с формами

заболевания, развитием осложнений и характером ответа на патогенетическую терапию. Продемонстрирована высокая частота встречаемости патологических НЬА-маркеров среди сибсов больных Ц (92%). Приоритетными являются результаты, показавшие ассоциацию полиморфизмов генов НА,1Ь4ЯЛ, а также генов локуса 1Ь1 и 1Ь1КМ с Ц, ее клиническими формами, развитием дефицитных состояний и ассоциированных заболеваний, а также ответом на патогенетическое лечение.

Практическая значимость работы. Создан регистр больных Ц Томской области. Внедрена 3-х этапная диагностика Ц с активным обследованием пациентов из групп высокого риска (родственники 1 степени родства, гипотрофия, анемия, задержка физического развития), что способствовало улучшению выявляемости заболевания с 19,95 на 100 ООО (2004 г.) до 40,83 на 100 000 детского населения (2008 г.).

Результаты исследования позволили выделить особенности манифестации и течения Ц у детей и подростков Томской области и разработать концепцию индивидуальных профилактических и реабилитационных мероприятий для больного и его родственников. Показано, что дети с задержкой внутриутробного развития являются группой риска по развитию Ц.

Выявленные клинико-генетические и иммунологические маркеры могут служить критериями превентивной диагностики, прогноза течения Ц и развития осложнений. На основе полученных данных показана необходимость организации семейной диспансеризации родственников 1 степени родства пробандов с Ц и предложены алгоритмы диагностики Ц.

Проведена клинико-лабораторная оценка реабилитации с использованием дополнительного энтерального питания (смесь «Нутризон»), препаратов с анаболической активностью (ретаболил), направленные на коррекцию нутритивного статуса пациента. Показана целесообразность и эффективность организации «Школы управления Целиакией», разработаны и адаптированы образовательные программы с учетом индивидуальных особенностей детей с Ц и их родственников.

Внедрение результатов исследования. Стратегия выделения групп риска развития Ц, ее осложнений в виде дефицитных состояний и ассоциированных заболеваний на основании оценки иммунного статуса (определение уровня цитокинов и показателей гуморального звена иммунитета, тканеспецифического антителоносительства), исследования нутритивного статуса, генетического обследования семей внедрена на базе гастроэнтерологического отделения МЛПУ Детской больницы №1, генетической клиники У РАМН НИИ медицинской генетики СО РАМН и детского отделения НИИ курортологии и физиотерапии г. Томска. Результаты исследования используются в лекционном курсе по педиатрии, гастроэнтерологии и нутрициологии на кафедре педиатрии ФПК и ППС и кафедре медицинской генетики СибГМУ.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты

диссертационной работы доложены и обсуждены на VI, VII, VIII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005, 2006, 2007); V, VII Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров «Здоровье детей - наше будущее» (Томск, 2005, 2009); VII и VIII научных конференциях «Генетика человека и патология» (Томск 2004, 2007); межлабораторном научном семинаре У РАМН НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2007); Всероссийской 14-й, 15-й, 16-й научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск 2006, 2007, 2008); XV Международном конгрессе детских гастроэнтерологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей» (Москва, 2007). Работа выполнялась в рамках областной программы «Дети Томской области» (№ 191-06, 2004-2006 годы), подпрограммы «Внедрение новых технологий ранней диагностики и реабилитации детей с синдромом мальабсорбции» и при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-04-00732-а «Генетические и иммунологические механизмы воспалительного процесса при целиакии. Роль HLA и не HLA-зависимых генетических маркеров».

Публикации. Результаты диссертационной работы изложены в 22 публикациях, 3 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 9 статей в региональных сборниках и журналах, 1 статья в зарубежном журнале, 8 тезисов конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 214 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, 6 глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Указатель литературы содержит 258 источников, в том числе, 72 отечественных и 186 иностранных. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 107 таблицами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клиническая картина целиакии у детей Томской области характеризуется выраженным полиморфизмом, высокой частотой развития дефицитных состояний и ассоциированных заболеваний - задержки физического развития (63%), анемии (67%), задержки полового развития (28%), снижения минеральной плотности костной ткани (25%), тиреопатии (17%), рефрактерным ответом на патогенетическое лечение в 40% случаев. Дети, рожденные с задержкой внутриутробного развития, имеют высокий риск реализации типичной формы Ц и составляют группу риска для проведения скрининговых исследований.

2. В семьях пробандов с целиакией у родственников 1 степени родства имеют место сходные с больным ребенком изменения гуморального звена иммунитета, повышение активности провоспалительных цитокинов, высокий уровень тканеспецифического антителоносительства (72% сибсов), реализованные у пробанда в патологический фенотип — целиакия и определяющие форму заболевания, его осложнения и характер ответа на терапию.

3. Патологические HLA-маркеры являются важной компонентой в структуре наследственной подверженности к целиакии среди пробандов и 92% сибсов. Изученные HLA-зависимые и HLA-независимые генетические маркеры определяют форму заболевания, его течение, характер изменчивости патогенетически значимых количественных показателей метаболизма и иммунитета, а также развитие осложнений и дефицитных состояний при глютеновой энтеропатии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объем и методы исследования. Обследовано 88 детей больных целиакией, находившихся на стационарном лечении в гастроэнтерологическом отделении МЛПУ ДБ №1 г. Томска (гл. врач - В.А. Карташов), обратившихся для консультации в генетическую клинику У РАМН НИИ медицинской генетики СО РАМН (зам. Директора по научной и лечебной работе, д-р мед. наук, проф. Л.П. Назаренко) и получавших реабилитацию в детском отделении НИИ курортологии и физиотерапии (директор - заслуженный деятель науки, др мед. наук, проф. Левицкий Е.Ф) в 2003-2008 годах (табл.1).

Таблица 1

Характеристика обследованных детей и подростков, больных целиакией._

Целиакия, п=88

Средний возраст 8,45±0,55 лет

Мальчики; п=44 (50%), Девочки; п=44 (50%)

Средний возраст - 8,55±0, 88 лет; Средний возраст - 6,23±0,83 лет;

Форма заболевания

Типичная; п=52 (60%), | Атипичная; п=36 (40%),

Компенсация заболевания

Рефрактерная; Компенсированная

п=36(41%) п=52 (59%)

Наличие осложнений

Задержка Анемия; Задержка полового Снижение МПКТ; Тиреопатии;

физического п=59 (67%) развития; п=25 (28%) п=22 (25%) п=15 (17%)

развития; п=62

(70%)

В генетической клинике У РАМН НИИ медицинской генетики СО РАМН обследовано 86 семей. Общее количество обследованных - 680 человек, из них родственников 1 поколения - 222, 2-го поколения - 300 человек. Контрольную группу составили 20 практически здоровых детей в возрасте от 6 до 16 лет и 18 семей без отягощенной наследственности по целиакии. Оценка полиморфизма изучаемых генетических маркеров в популяции была проведена у 123 человек, принадлежащих к русскому населению г. Томска и не имеющих по данным клинического, а также инструментального обследования целиакии и признаков аутоиммунных заболеваний.

Методы исследования. Исследование включало следующие блоки: клинический, морфологический, иммунологический, биохимический,

генетический, эпидемиологический. Клинический блок основывался на обследовании пробанда с целиакией и родственников 1 степени родства с использованием скрининговых методов исследования. Морфологические методы исследования включали выполнение фиброгастродуоденоскопии (ФГДС) для получения фрагментов слизистой оболочки из разных участков дистального отдела двенадцатиперстной кишки с последующим проведением морфометрии. Иммунологический блок состоял из методов определения гуморального иммунитета на базе иммунологической лаборатории ЦНИЛ СибГМУ (зав. лабораторией - д.м.н. Петровский Ф.И.) (концентрация сывороточных иммуноглобулинов: IgA, IgG, IgM; [Manchini G., 1965]), а также тканеспецифического иммунитета (антитела к глютену АГА IgA, АГА IgG), показателей цитокинового профиля (ИЛ-ip, ИЛ1РА, ИЛ-10, ИЛ-4, ИНФ-у, ФНО-а) (стандартные наборы «Протеиновый контур», Санкт-Петербург). Биохимический блок включал определение содержания макроэлементов: калий (К), натрий (Na), кальций (Са), кобальт (Со), хром (Сг), железо (Fe), цинк (Zn), селен (Se) (метод нейтронно-активационного анализа, кафедра геоэкологии и геохимии Томского политехнического университета, зав. кафедрой проф., д.г,-м.н. Рихванов Л.П.) и использовался для оценки эффективности реабилитационных мероприятий. Генетический блок исследования был основан на использовании метода родословных; изучении наследуемости количественных признаков на основе внутрисемейного корреляционного анализа; выделении ДНК и амплификации участков генов-модификаторов иммунного ответа IL1B, IL1RN, IL4, IL4RA, VDR и HLA-системы (локусы DQA1, DQBI) с помощью полимеразной цепной реакции. Эпидемиологический блок состоял из базы данных 88 детей, обследованных в результате выполнения исследования и регистра детей с целиакией, проживающих в Томской области в 2006-2008 гг.

Диагноз целиакии устанавливали на основании этапной диагностики (Заключение группы экспертов США, 2004; Бельмер C.B., «Проект стандартов диагностики и лечения целиакии у детей», 2004).

Полученные фактические результаты вносились в компьютерную базу данных, где проводилась их последующая статистическая обработка с применением специальных программ (STATISTICA 6.0, Microsoft Excel-2007). Статистические методы были разделены на методы для описания количественных признаков и специальные методы для проведения генетического анализа.

Специальные методы включали следующие методики статистической обработки генетического материала: показатель наследуемости (h2) получали, как удвоенное значение коэффициента корреляции в парах родитель-ребенок. Для оценки ассоциаций полиморфных вариантов генов с патологическим фенотипом рассчитывали показатель отношение шансов (OR) по формуле: OR=ad/bc, где а - частота анализируемого аллеля у больных; b - частота анализируемого аллеля в контрольной выборке; end- суммарная частота остальных аллелей у больных и в контроле соответственно [Tomson G., 1995].

Для поиска ассоциации патологии с генетическими маркерами был использован критерий, оценивающий отклонения передачи исследуемого аллеля от гетерозиготных родителей потомкам - Transmission/Diseqilibrium Test (TDT) [Allison D.P., 1997].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клинический блок. Проведенный анализ свидетельствует о поздней диагностике заболевания в общей группе больных целиакией (7,31 ±0,61 лет). Особое внимание обращает на себя запоздалая диагностика глютеновой энтеропатии у больных с атипичной формой (8,29±0,99 лет), диагноз Ц у детей с атипичным течением болезни установлен в среднем на 18 месяцев позже по сравнению с типичной Ц (6,74±0,77 лет). Соотношение мальчики : девочки оказалось одинаковым, несмотря на то, что в развитых странах заболеваемость среди мальчиков выше в 1,5 раза [Murray J.А., 2003, Fasano А., 2003, 2005, Парфенов А.И., 2003, 2007]. Зарегистрирована одинаковая выявляемость типичной и атипичной форм болезни, в то время как в странах Западной Европы соотношение типичная : атипичная целиакия равно 1:7 [Fasano А., 2003, 2005]. Пациенты с типичной Ц отличались осложненным течением перинатального периода (хроническая фетоплацентарная недостаточность (ХФПН) (р=0,001), угроза прерывания беременности на всем протяжении (р=0,007), гестоз (р=0,001), анемия (р=0,020), асфиксия в родах (р=0,001)), что способствовало рождению детей с задержкой внутриутробного развития (ЗВУР). Выявлено, что ЗВУР в 2 раза чаще (67% против 33%) наблюдалась среди пациентов с типичной Ц. Диагноз у всех пациентов с ЗВУР установлен значительно раньше, чем в общей группе детей (3,62 года против 7,62 лет, р=0,0330). Дети с симптомокомплексом ЗВУР имели отличные от общей группы клинические, иммунологические особенности и генетические маркеры

Рис. 1. Характеристика детей с целиакией, имеющих ЗВУР в анамнезе.

Таким образом, данную категорию пациентов можно рассматривать как группу риска по развитию типичной Ц и при наличии энтерального синдрома, либо внекишечной манифестации болезни активно проводить в этой группе специфическую серодиагностику. Среди пациентов с типичным симптомокомплексом Ц сопряженная патология желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) наблюдалась чаще: так хронический гастродуоденит встречался в 86% случаев против 67% при атипичной Ц (р=0,0402), дисфункция билиарного тракта у 63% детей против 44% при атипичной (р=0,0094), лямблиоз в 51% против 26% при атипичной Ц (р=0,0001), описторхоз регистрировался лишь среди пациентов обследуемой группы (14%). Анализ морфометрических критериев СОТК показал, что минимальные патологические изменения, соответствующие 1-И стадии по классификации Марша, характеризуют течение ЦА (63% против 24% при типичной) (р=0,0455, р=0,0001), собственно атрофические изменения в сочетании с гиперплазией криптального отдела (стадии ША-ШВ) зарегистрированы при ЦТ (77% против 38% при атипичной). Отставание в физическом развитии (ФР) отмечено у 63% детей с целиакией, причем чаще среди мальчиков (70% против 56% у девочек). Снижение минеральной плотности костной ткани (МПКТ), нарушение осанки, сколиоз чаще наблюдались среди больных с атипичной Ц (31% против 21%; 78% против 18%; 6% против 2% соответственно). Анемия выявлена у 67% пациентов с Ц. Тиреопатии зарегистрированы у 17% больных, частота этого ассоциированного состояния не зависела от пола ребенка и формы болезни.

Иммунологический блок. Результаты исследования выявили, что иммунный статус детей с Ц характеризуется высоким содержанием как провоспалительных (р<0,001), так и противовоспалительных цитокинов (р<0,001) (табл. 2).

Таблица 2

Содержание цитокинов у детей с целиакией Ме (<31-С>3), пкг/мл

Показат Контроль, Общая Целиакия Целиакия Р

ель (п=20) группа, типичная, атипичная,

(п=76) (п=51) (п=25)

1 2 3 4

ИЛ-1Р 13,09 247,8* 277,7** 233,99*** Р1-2Д4=0,0001

(1,24-15,91) (109,08-391,3) (99,39-409,0) (118,0-311,0) рм=0,0059

ИЛ-1РА 12,72 83,49* 67,51** 142,0*** Рид4=0,0001

(10,85-13,04) (14,06-300,0) (13,54-262,1) (39,7-515,11) рз-4-0,0001

ИЛ-10 10,05 12,09* 10,88** 13,08*** Р1.2.3,4-1,0

(0,01-11,41) (0,58-214,9) (0,58-214,9) (0,98-150,0)

ИЛ-4 5,15 4,08* 2,02** 33,19*** ры=0,0001

(0,11-5,97) (0,23-113,7) (0,18-113,7) (0,35-103,7) Рз-4=0,0001

ИНФ-у 50,87 18,15* 17,7** 14,77*** Р1-2^.4»0,0001

(50,25-52,46) (0,56-50,07) (0,55-50,07) (0,52-49,71)

ФНО-а 35,37 49,03* 49,8** 27,56*** рь2^0,0308

(22,93-50,85) (16,9-139,5) (16,9-272,9) (15,2-109,0) Р:м=0,0007

Примечание: р - достоверность различий при межгрупповом сравнении больных; Р1.2.3.4-достоверность различий между группой контроля с общей группой, ЦТ, ЦА; рз_4 _ достоверность различий между целиакией типичной и атипичной; * - достоверность различий (р=0,0001) в общей группе больных до и после лечения; ** - достоверность различий (р=0,0001) в группе пациентов с типичной целиакией до назначения БГД и в динамике через год; *** - достоверность различий (р=0,0001) в группе больных целиакией атипичной до назначения БГД и в динамике через год.

При типичной форме Ц продемонстрирована максимальная концентрация провоспалительных медиаторов (ФНО-а), в то же время среди пациентов с атипичной Ц, напротив, высока концентрация противовоспалительных (ИЛ-1РА, ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов.Впервые получены данные о том, что цитокиновый дисбаланс определяет форму целиакии, характер ответа на патогенетическую терапию и развитие осложнений Ц (рис. 2, 3).

И 1 1 И ГОНО-

РАР,0001

ИПФ-у - р=0,0001 ИЛ-1РД - р=0,0001 ИЛ-4 - р=0,0001

ИП-1РД-

игм-

Примечание :* - р<0,"01 - Проеослалитегьнье цитокины - Прслмвовоспалшельные цитокины

Рис. 2. Роль цитокинов в формировании фенотипа целиакии.

Рис. 3. Роль цитокинов в формировании осложнений целиакии.

Яркая клиническая картина Ц с манифестным энтеральным синдромом и формированием многочисленных осложнений характерна для пациентов младшего возраста, в то время как в дальнейшем она сглаживается и нивелируется вовсе к подростковому возрасту, когда на первый план выступают изолированные внекишечные манифестации болезни. Такая динамика развития клинических симптомов находит свое патогенетическое

отражение в характере цитокинового каскада: содержание про- (ИЛ-ip, ФНО-а) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИНФ-у) цитокинов, максимальное у пациентов до 6-ти лет, с возрастом нормализуется.

Наибольшая активность тканеспецифического антителоносительства наблюдается при типичной форме заболевания, с удовлетворительной динамикой в процессе терапии, в то же время при атипичной Ц антитела класса G продолжают циркулировать, несмотря на проводимое лечение, это объясняется меньшей приверженностью к терапии пациентов, у которых отсутствуют признаки энтерального синдрома. Высокий уровень носительства антител к глютену выявлен среди родственников 1 степени родства (отцы и матери) пробандов с типичной Ц (р=0,0009), примечательно, что сибсы характеризуются максимальной частотой персистенции антител к глютену (72%), что еще раз доказывает приоритетность проведения серологического скрининга в этой группе, как среди категории лиц с максимальным риском реализации Ц. Таким образом, родственники 1 степени родства, в частности, сибсы формируют группу иммунологического риска по развитию заболевания, причем диагноз среди обследованных сибсов был верифицирован у 18%.

Гипергаммаглобулинемия характерна для всех членов семьи пробанда с Ц. Для родственников 1 степени родства пробандов с Ц характерно увеличение продукции провоспалительных - ИЛ-ip и ФНО-а (последний повышен только у сибсов) и противовоспалительных цитокинов - ИНФ-у (только для матерей и сибсов), ИЛ-4 (оказался высоким лишь среди сибсов), ИЛ-10 (повышен у всех членов семьи пробанда с типичной Ц), кроме того, концентрация ИЛ-1Ра была максимальной в семьях детей больных атипичной Ц.

Генетический блок. В результате проведенной работы наличие патологических HLA-маркеров выявлено у всех больных целиакией. Наиболее часто у детей с целиакией Томской области регистрировались специфичности: DQA 1*501 (45%), DQA1*102 (31%), DQB1*201 (25%). Примечателен тот факт, что в популяции больных целиакией Томской области имеются значительные отличия в распространенности аллелей DQ2 от данных ряда европейских стран, так 80% детей являлись носителями как DQA1, так и DQB1, комбинация DQA1*0501B1*0201 выявлена у 29,7%, что отличается от стран Северной Европы [Kagnoff M.F., 2000; Louka A.S., 2003; Kim C.Y., 2004; Margaritte-Jeannin P., 2004], но сопоставимо с результатами, полученными в казахской и узбекской популяциях [Камилова А.Т., 2008; Исабекова Т.К., 2008] (рис. 4).

Пациенты с генотипом DQA1*501*501 имели типичную форму заболевания, рефрактерный ответ на БГД (71%), осложнения, такие как снижение МПКТ (64%), анемия (71%), ЗФР (86%), дефицит IgA (79%). Атипичная форма Ц чаще встречалась у пациентов с гетерозиготным генотипом DQA1 и DQB1. Снижение антител к глютену отмечалось во всех группах, однако, значимое уменьшение циркуляции антител зарегистрировано у гомо- и гетерозигот DQB 1*201 (табл. 3).

Рис. 4. Частота встречаемости НЬА-аллелей А1*501, В1*201 в мире при целиакии.

Таблица з

Динамика антител к глкугену в зависимости от сочетания НЬА-аллелей на фоне лечения

НЬА -аллели АГА ^А до лечения АГА ^А после лечения АГА ДО до лечения АГА ДО после лечения

1 2 3 4

0(2А1*501*501 17,92±5,02 8,85±7,51 р 1.2=0,3454 261,82 ±106,06 30,18±26,70 Рз.4=0,1159

0(2А1*501*102 82,18±40,06 36,74±20,37 р 1.2=0,1441 201,96±64,58 85,24±50,86 Рз-4=0,1380

одв 1*201*201 63,87±26,02 12,67±5,81 Р1_2 =0,0409 447,59±131,55 33,99±13,41 рз-1=0,0033

ОСЗВ 1*201 17,77±6,045 4,48±1,99 р 1.2=0,0431 163,58±65,72 33,32±18,59 р3^=0,0431

Примечание: р - достоверность различий до и после назначения БГД.

Результаты исследования показали, что диагностику Ц у родственников пробанда следует проводить в три последовательных этапа. Проведение НЬА-типирования должно являться первым этапом в формировании групп риска среди родственников больных целиакией (группа генетического риска), в нашем исследовании патологические маркеры целиакии обнаружены у 92 % сибсов. Серологические маркеры заболевания (антиглиадиновые антитела) обнаружены у 75% сибсов, что позволило серологический этап (второй этап) диагностики использовать для выявления лиц с иммунологическими отклонениями (группа иммунологического риска). В результате морфологического исследования слизистой оболочки тонкого кишечника (третий - основной этап диагностики) Ц была диагностирована у 18% сибсов. При отрицательных результатах детям рекомендовано дальнейшее динамическое наблюдение.

Следующим этапом явилось исследование вклада генов-модификаторов иммунного ответа в развитие Ц. Сравнение частот аллелей изученных полиморфизмов между контрольной группой и выборкой больных Ц не выявило ассоциаций ни для одного из полиморфных маркеров генов УОК, 1Ь1В, 1Ь1КЫ, 1Ь4, 1Ь4ЯЛ. В дальнейшем выполнялся поиск ассоциации полиморфных маркеров с Ц, вариантами клинического течения и осложнениями методом случай-контроль. При сравнении частот аллелей исследуемых маркеров генов-модификаторов иммунного ответа в зависимости

от формы Ц была выявлена связь полиморфизма I50Vгена IL4RA с атипичной Ц (OR=5,63, р=0,017). Показана позитивная роль аллеля f полиморфного варианта F/f гена VDR в отношении снижения МПКТ (СЖ=0,27, р=0,034). Обнаружена ассоциация аллеля А2 VNTR полиморфизма гена IL1RN (OR=3,73, р=0,000) с развитием тиреопатии у детей с Ц. Анализируя семейный материал удалось выявить ассоциацию Ц, ЗФР с аллелем Al полиморфизма (+3953) А1/А2 гена IL1B и аллелем G полиморфизма З'-UTR G/C гена IL4, а также ассоциацию последнего с типичной Ц (табл. 4).

Таблица 4

Ген Полиморфизм Аллели Количество перенесенных аллелей TDT Р (d.f.=l)

Число аллелей, унаследованных больными целиакией от гетерозиготных родителей

IL4 З'-UTR G/C G 53 12,000 0,001

С 22

IL1B (+3953) А1/А2 Al 41 5,823 0,016

А2 21

Число аллелей, унаследованных больными типичной целиакией от гетерозиготных родителей

IL4 З'-UTR G/C G 33 7,848 0,005

С 13

Число аллелей, унаследованных больными целиакией с задержкой физического развития от гетерозиготных родителей

IL1B (+3953) А1/А2 Al 29 3,841 0,050

А2 15

IL4 З'-UTR G/C G 40 8,491 0,004

С 17

Число аллелей, унаследованных больными целиакией с анемией от гетерозиготных родителей

IL1RN VNTR Al 36 6,113 0,013

А2 17

IL4 З'-UTR G/C G 42 11,860 0,001

С 15

IL4RA 150 V А 51 7,841 0,006

G 26

Число аллелей, унаследованных больными целиакией с нарушением минеральной плотности костной ткани от гетерозиготных родителей

IL1RN VNTR Al 27 4,225 0,040

А2 13

IL4 З'-UTR G/C G 34 12,023 0,001

С 10

Выявлена ассоциация аллеля А1 УЫТЯ полиморфизма гена 1Ь1ЯИ, аллеля / полиморфизма 150У гена 1Ь4ЯА и аллеля (7 полиморфизма З'-ШП в/С гена 1Ь4 с развитием анемии на фоне Ц. Показана связь аллеля А1 УИТЯ полиморфизма гена 1Ь1ЯN и аллеля в полиморфизма З'-ШП О/С гена 1Ь4 со снижением МПКТ. Установлена ассоциация аллеля Vполиморфизма 150У гена 1Ь4ЯА с атипичной Ц. Для аллеля <5 полиморфизма З'-ШИ С/С гена 1Ь4

найдена связь с Ц, ее типичной формой и осложнениями. Аллель AI VNTR полиморфизма гена IL1RN связан с развитием анемии и снижением МПКТ у пациентов. Для полиморфного варианта (+3953) А1/А2 гена [LIB обнаружена ассоциация как с заболеванием, так и с ЗФР, осложняющей течение Ц.

В целом, в ходе проведенного исследования, наибольшая связь с целиакией выявлена для изученных полиморфизмов генов IL4, IL4RA, а также генов локуса IL1 и IL1RN. Показано, что гены модификаторы иммунного ответа определяют тип целиакии, а также развитие осложнений и ассоциированных с целиакией заболеваний.

Выявлена связь аллеля А2 гена IL1RN, генотипа А1А2 гена IL1B, аплеля С в гомозиготном состоянии гена IL4, аллеля / в гомозиготном состоянии гена VDR с высокими показателями провоспалительного цитокина ФНО-а. Напротив, носители аллеля G в гомозиготном состоянии гена IL4, аллеля F в гомозиготном состоянии гена VDR имеют максимальное содержание противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-1РА, ИНФ-у). Ассоциация

признаками.

Таким образом, продемонстрирована последовательность процессов вовлечения иммунной системы и органов-мишеней как единого патофизиологического механизма, определяющего фенотип заболевания не только у пробандов, но также у родственников 1 степени родства, в первую очередь сибсов.

В семьях больных Ц вклад наследственных факторов в изменчивость исследованных иммунологических показателей оказался различен. Оценки коэффициентов наследуемости (И2) иммунологических показателей в семьях больных целиакией варьировали в широких пределах от 38,6% до 87,8%. Наиболее высокие значения коэффициента наследуемости были зарегистрированы для противовоспалительных цитокинов: ИЛ-4 - 87,8%

(р=0,001); ИНФ-у - 81,8% (р=0,001) и менее значимые для провоспалительных цитокинов: ИЛ-lß - 52,0% (р=0,004) и ФНО-а - 43,4% (р=0,01б).

В последние годы особое внимание уделяется изучению рефрактерной Ц, в связи с возникающими трудностями в терапевтической тактике ведения таких пациентов [Mulder C.J., 2000; Holmes G.К., 2002; Meijer J.W., 2004; Daum S., 2005; Brousse N., 2005; Krauss N., 2006; Smedby K.E., 2006 Bernardo D., 2007; Al-Toma A., 2007]. В ходе выполнения работы было выявлено 28% больных с рефрактерной Ц (80% с типичной и 20% пробандов с атипичной Ц), которые характеризовались наличием сохраняющейся задержки физического развития (100%), сочетанным поражением желудка и двенадцатиперстной кишки (100%), а также отсутствием иммунологической (100%) (АГА А 82,58±46,62 ед/мл, АГА G 156, 34±45,89 ед/мл) и морфологической компенсации (100%) (Ша стадия выявлена у 76% Illb -у 24% детей) на фоне БГД в течение 2-х лет. На рис. 6 представлены иммунофенотипические и генетические маркеры развития рефрактерной Ц.

Фенотип

Рис. 6. Характеристика рефрактерной целиакии.

Программа реабилитации. В последние годы многие авторы [Парфенов А.И. 1997; Feighery С., 1999; Ревякина, A.B., 2001; Farell R.J., 2002] считают необходимым включение в комплекс реабилитации пациентов с хроническими заболеваниями обучения в «Школе управления заболеванием» и психологическую поддержку больного и членов его семьи. Критериями медицинской оценки эффективности влияния программы на течение заболевания явились: повышение уровня знаний о причине заболевания, его терапии, а также проблеме «скрытого глютена» в 4 раза, методах диагностики Ц - в 3 раза, причине развития осложнений Ц в 5 раз; снижение интенсивности тканеспецифического антителоносительства (р=0,000) по сравнению с пациентами, непосещавшими занятия, а также восстановление СОТК в группе больных, посещавших занятия, по сравнению с пациентами, не прошедшими данный этап реабилитации у которых сохранялись признаки гиперрегенераторной атрофии СОТК (р=0,000).

В нашей работе впервые было показано, что применение в терапии детей с Ц, осложненной задержкой физического развития, препарата ретаболил и смеси для дополнительного энтерапьного питания «Нутризон» (Nutricia, Голландия) приводит к улучшению нутритивного статуса пациента, а в случае использования Нутризона, еще и к снижению активности провоспалительной компоненты цитокинового каскада, коррекции микроэлементного состава крови.

Таким образом, в результате комплексного исследования состояния здоровья пробанда с целиакией и его родственников 1 степени родства представлена концепция о важной роли наследственной компоненты в развитии заболевания, проявляющейся в клинических особенностях целиакии, в характере нарушений иммунного статуса у всех членов семьи. Установлена роль полиморфных вариантов генов-модификаторов иммунного ответа IL4, IL4RA, а также генов локуса IL1 и IL1RN в развитии болезни, ее течении, формировании осложнений и характере ответа на патогенетическую терапию, которая была подтверждена несколькими тестами (OR, TDT, коэффициент наследуемости - h2). Впервые представлены особенности течения воспалительного процесса у больных Ц. Проведен анализ эпидемиологической ситуации в Томской области, выявлена частота встречаемости Ц, а так же ее осложнений. Представлены особенности клинического течения Ц у детей и подростков Томской области и предложена программа их реабилитации на этапе диспансерного наблюдения.

Выводы:

1. Выявляемость заболевания у детей Томской области в 2008 г. составила 40,83 на 100 000 детского населения. К особенностям клинических проявлений целиакии относятся: одинаковая частота встречаемости типичной и атипичной формы, отсутствие различий в заболеваемости между мальчиками и девочками, высокая частота развития дефицитных состояний (задержка физического развития (63%), анемия (67%), задержка полового развития (28%), снижение минеральной плотности костной ткани (25%)) и ассоциированных заболеваний (тиреопатии (17%)), более ранняя манифестация энтерального синдрома и сочетанное поражение слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Для типичной целиакии свойственна максимальная концентрация тканеспецифических антител класса G и выраженные морфологические нарушения цитоархитектоники слизистой оболочки тонкого кишечника в виде гиперрегенераторной атрофии.

2. Дети, рожденные с симптомокомплексом задержки внутриутробного развития, при наличии у них патологических HLA-маркеров (DQA1*0501B1*0201) предрасположены к реализации типичной целиакии с яркой манифестацией и развитием многочисленных дефицитных состояний, а также демонстрируют провоспалительную направленность цитокинового каскада (повышение уровня ФНО-а, HJI-ip), снижение активности

гуморального звена иммунитета (IgA), максимальную выраженность тканеспецифического антителоносительства и рефрактерность к лечению.

3. Пробанды с целиакией и родственники первой степени родства характеризуются однонаправленными изменениями со стороны гуморального звена иммунитета (гипергаммаглобулинемиия, тканеспецифическое антителоносительство), цитокинового статуса — в виде повышение уровня про-(ФНО-а, ИЛ-lp) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-1Ра, ИНФ-у) цитокинов, которые определяют тип Ц, развитие осложнений и характер ответа на патогенетическую терапию. Установлены высокие коэффициенты наследуемости для ИЛ-4 (88%), ИНФ-у, (82%), ИЛ-1Р (52%).

4. Маркеры целиакии по HLA-системе выявлены у всех больных целиакией Томской области и 92% сибсов. Патологический гаплотип DQA1*501*501 ассоциировался с типичной формой заболевания (100%), развитием осложнений (анемия (71%), снижение минеральной плотности костной ткани (64%), задержка физического развития (86%), селективный дефицит IgA (79%)) и рефрактерным течением целиакии (71%).

5. Полиморфный вариант (+3953)А1/А2 гена IL1 ассоциирован с целиакией (TDT=5,823; р=0,016). Установлена ассоциация гена IL4 с типичной формой заболевания (TDT=12,00; р=0,001), задержкой физического развития (TDT=8,491; р=0,004), снижением минеральной плотности костной ткани (TDT=12,023; р=0,001). Обнаружена ассоциация гена IL1RN со снижением минеральной плотности костной ткани (TDT=4,225; р=0,040), IL1B с задержкой физического развития (TDT=3,841; р=0,050).

6. Использование обучающих программ в «Школе управления целиакией» приводит к увеличению в 4 раза информированности пациентов и количества детей с компенсированным течением заболевания. Использование дополнительного энтерального питания улучшает нутритивный статус пациентов, уменьшает содержание провоспалительных медиаторов (ИЛ-ip и ФНО-а), оптимизирует содержание гуморальных факторов, нивелирует дисбаланс микроэлементов.

Практические рекомендации

1. Разработан алгоритм диагностики целиакии у пациентов с наличием энтерального синдрома в особых случаях (рис. 7) и в группах высокого риска (рис. 8). Генетический этап диагностики у лиц с энтеральным синдромом показан в случаях: а) необоснованного назначения патогенетической терапии до проведения морфологического исследования; б) затруднении интерпретации данных морфологического исследования при наличии пре- и инфильтративных изменений слизистой оболочки тонкого кишечника, соответствующих I и II стадии (M.N. Marsh, 1992).

Отологическое исследонмнне uiTHTfJia к глютепу А ГА А, АГЛ О; «тела к ткянгвой ípaiicriKiTUMHiu te)

Морфологическое исследование ■ с проведением морфоиетрии %'■>, (обм1Я1елыю!) ¿J

II------,---Ш

*11арушекне

|| - Затруднение

иигериретвцки

ре

! результате!

(нс»11р1м*нно / Генетическое исследование V морфолшнч»с1

Ш.А-спснифнчносгсИ*

Рис. 7. Алгоритм диагностики целиакии у пациентов с энтеральным синдромом.

Генетическое исследование ИЬЛ-спеиифнчиостей*

Гру ппа генетического риска

Серологическое исследование (антитела к гл»отеку АГЛ А, АГА G; антитела к тканевой трансглютаминам)

-1 Г

Морфологическое исследование с проведением морфометрии (оЛи.нтс.ьноГ)

Цел и а кия ]

Группа иммунологическо го риска

Диспансерное наблюдение

Рис. 8. Алгоритм диагностики целиакии в группах риска.

2. Результаты исследования позволили выделить дополнительную группу риска - дети, рожденные с задержкой внутриутробного развития, по реализации типичной целиакии.

3. Показана целесообразность назначения пробандам с целиакией, осложненной нарушениями нутритивного статуса, курсов дополнительного энтерального питания смесью «Нутризон» (Nutricia, Голландия). В составе комплексной терапии для пациентов с целиакией, осложненной задержкой физического развития, целесообразно использование коротких курсов ретаболила.

• Коррекции нутритивной недостаточности смесью «Нутризон» детям 25 лет 100,0 мл в сутки, пациентам старше 5-ти летнего возраста 200,0 мл в сутки, продолжительностью курса 1 месяц показана в ситуации: а) рост и масса тела ниже 3 перцентиля; б) гипотрофия 1-2 степени (отсутствие прибавок массы тела в течение последних 6 месяцев).

• Назначение ретаболила по схеме - 0,1 мл на год жизни, 1 инъекция в месяц, № 3 показано в случае: а) рост и масса тела ниже 3 перцентиля; б) недостаточное влияние диеты на нутритивный статус (отсутствие прибавок массы тела в течение последних 6 месяцев и скорость роста менее 2,5-3 см в год); в) задержка костного возраста более 2-х лет.

4. Выявлены критерии риска развития рефрактерной целиакии (рис. 9).

IILA-MapKtpbii DQA1* SO 1*501 DQyVl * 102 DQBfZOl DQB1*302

~—j:c-

Отсутствие серологической и морфологической компенсации целиакии —---более года __— -

Рефрактерное течение целиакии

Рис. 9. Критерии диагностики рефрактерной целиакии.

5. Все родственники пробанда с целиакией нуждаются в определении тканеспецифического антителоносительства.

6. Исследование полиморфизма генов цитокинов (IL4, IL4RA, IL1 и IL1RN) рекомендовано в превентивной диагностике целиакии и ее осложнений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Лошкова Е.В. Состояние здоровья и гуморального иммунитета у родственников пробанда с целиакией [текст] / Лошкова Е.В., Будкин A.B. // Сборник статей Всероссийской 63-й итоговой студенческой конференции им. И.П. Пирогова. - 2004. -С. 54-56.

2. Лошкова Е.В. Клинико - генеалогические и иммунологические особенности целиакии у детей г. Томска [текст] / Лошкова Е.В., Будкин A.B. // Сборник статей IV межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров «Здоровье детей - наше будущее!» - 2004. - С. 146-148.

3. Лошкова Е.В. Клинико - генеалогические и иммунологические особенности целиакии у детей г. Томска [текст] / Лошкова Е.В., Будкин A.B. // Сборник статей Всероссийской 63-й итоговой студенческой конференции им. И.П. Пирогова. - 2004. -С. 72-73.

4. Кондратьева Е.И. Эффективность безглютеновой диеты у больных целиакией [текст] / Кондратьева Е.И., Янкина Г.Н., Лошкова Е.В. // Тезисы Всероссийского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - 2004. - С. 144-146.

5. Роль антиглиадиновых антител в диагностике целиакии [текст] / Г.Н. Янкина, Л.П. Назаренко, Е.В. Лошкова и др. // Сборник научных статей, посвященный 60-летию педиатрического факультета СибГМУ. - 2004. - С. 187-190.

6. К вопросу диагностики целиакии в группах риска [текст] / Е.И. Кондратьева, Л.П. Назаренко, Е.В. Лошкова и др. // Материалы Российского Конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - 2004. - С. 147-148.

7. Клинико-генеалогическая и иммунологическая характеристика у детей г. Томска [текст] / Е.И. Кондратьева, Г.Н. Янкина, Е.В. Лошкова и др. // 25 лет факультету повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов. - 2004. -С. 103-106.

8. Состояние здоровья детей с целиакией и их родственников [текст] / Е.И. Кондратьева, Г.Н. Янкина, Л.П. Назаренко, Е.В. Лошкова // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 2004. - №18. - С. 99-100.

9. Иммунологические методы диагностики целиакии [текст] / Е.И. Кондратьева, Г.Н. Янкина, Л.П. Назаренко, Е.В. Лошкова и др. // Сборник научных трудов «Генетика человека и патология». - 2004. - Вып. 7. - С. 291-294.

Ю.Клинико - генеалогическая и иммунологическая характеристика целиакии у детей г. Томска [текст] / Е.И. Кондратьева, Г.Н. Янкина, Л.П. Назаренко, Е.В. Лошкова и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2005. - №4. - Приложение №2. - С. 17-22.

11.Влияние полиморфизма генов IL1B, IL1RN, IL4, ILRA на развитие синтропных аутоиммунных заболеваний у детей: сахарного диабета 1 типа, аутоиммунного тиреоидита, целиакии [текст] / Е.И. Кондратьева, В.П. Пузырев, A.A. Рудко, Е.В. Лошкова и др. // Медицинская иммунология. -2006. - Т.8. - № 2. - С. 226-227.

12.Поиск ассоциации полиморфных вариантов генов - модификаторов иммунного ответа с целиакий у детей и подростков Томской области [текст] / Е. И. Кондратьева, В. П. Пузырев, А. А. Рудко, Лошкова Е.В. и др. // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии: научно-практический журнал Сибирского отделения Российской академии медицинских наук . — 2006. — № 20. — С. 68-72.

13. Распространенность HLA-аллелей у больных целиакией г. Томска [текст] / Е. И. Кондратьева, Л. П. Назаренко, A.A. Рудко, Лошкова Е.В. и др. // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии: научно-практический журнал Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. — 2006. — № 20. — С. 72-73.

14.Генетические и иммунологические параллели при сахарном диабете 1-ого типа, аутоиммунном тиреоидите и целиакии [текст] / Е. И. Кондратьева, В.П. Пузырев, A.A. Рудко, Е.В. Лошкова и др. // Вопросы современной педиатрии. - 2006. - Т. 5. - №1. -С. 732-733.

15.Кондратьева Е.И., Янкина Г.Н., Лошкова Е.В. Клинические и иммунологические особенности целиакии у детей г. Томска [текст] // Вопросы детской диетологии. -2007.-Т. 5. -№1. - С. 66.

16.Лошкова Е.В. Клинико-иммунологические особенности целиакии у детей г. Томска [текст] // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. - 2007. - №21. - С. 66.

17.Клинико - генетические параллели при целиакии у детей Томска [текст] / Е.И. Кондратьева, В.П. Пузырев, A.A. Рудко, Е.В. Лошкова и др. // Педиатрическая фармакология. - 2007. - Т. 4. - №5. - С. 25 - 32.

18.К вопросу о рефрактерном течении целиакии у детей г. Томска [текст] / Е.И. Кондратьева, A.A. Рудко, Г.Н. Янкина, Е.В. Лошкова // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. - 2008 - №22 - С. 55-58.

19. Association of Polymorphisms of Immune Response Modifier Genes with Celiac Disease and Its Clinical Forms in the Tomsk Population [текст] / Rudko A.A. , Kondratieva E.I., Loshkova E.V. et al. // Molecular. Biology. - 2008. - Vol. 2. - № 1. - P. 42-49.

20. Частота тканеспецифического антителоносительства к глютену у детей г. Томска [текст] / Е.В. Лошкова, Г.Н. Янкина, Н.Г. Мухина, Л.М. Исакова // Сборник статей VII межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров «Здоровье детей - наше будущее!» г. Томск, 2009. - С. 74-77.

21.Особенности течения целиакии у больных с задержкой внутриутробного развития / Е.И. Кондратьева, Г.Н. Янкина, Е.В. Лошкова [текст] // Материалы XVI Конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей», Москва, 2009. - С. 336-338.

22.Случай сочетанного течения целиакии и алопеции [текст] / Кондратьева Е.И., Янкина Г.Н., Лошкова Е.В., Сиротина С.А. // Вопросы детской диетологии. - 2009. - Т. 7. -№2.-С. 73-75.

Список сокращений

АГА - антиглиадиновые антитела

АИТ - аутоиммунный тиреоидит

АЭА - антиэндомизиальные антитела

БГД - безглютеновая диета

ГАГ - гликозаминогликаны

ЖДА - железодефицитная анемия ЗВУР -

задержка внутриутробного развития

ИЛ - интерлейкин

ИНФ - интерферон

ИЭЛ - интраэпителиапьные лимфоциты МПКТ - минеральная плотность костной ткани

МФЗ - многофакторные заболевания

РЦ - рефрактерная целиакия

РХВ - равновесие Харди-Вайнберга

СД 1 типа-сахарный диабет 1 типа

СМА - синдром мальабсорбции

СНВ - синдром нарушенного всасывания

СОТК - слизистая облочка тонкого

кишечника

ФНО - фактор некроза опухоли ФР - физическое развитие Ц - целиакия ЦТ - целиакия типичная ЦА - целиакия атипичная НЬА - главный комплекс гистосовместимости - иммуноглобулин

МЭЛ - межъэпителиальные лимфоциты ОРВИ - острые респираторные заболевания

CD (cluster of differentiation) - классификация, основанная на реактивности с различными

моноклональными антителами, распознающими поверхностные молекулы

TDT - критерий оценки отклонения передачи исследуемого аллеля от гетерозиготных

родителей потомкам (Transmission/Diseqilibrium Test)

tTT - тканевая транглютаминаза

VNTR- полиморфизм по числу тандемных повторов (variable number of tandem repeats)

Целиакия (Ц) является одной из актуальных медико-социальных проблем современной гастроэнтерологии. Целиакия (coeliakia; греч.: koilikos — кишечный, страдающий расстройством кишечника; синонимы: глютеновая болезнь, глютеновая энтеропатия, нетропическая спру, болезнь Ги-Гертера-Гейбнера, англ.: - coeliac disease; шифр по МКБ X - К 90.0) - хроническое генетически детерминированное заболевание, характеризующееся стойкой непереносимостью глютена (злаковый белок) с развитием гиперрегенераторной атрофии слизистой оболочки тонкой кишки и связанного с ней синдрома мальабсорбции. Прошло 120 лет с тех пор, как S.J. Gee в 1888 г. описал типичные симптомы целиакии: хроническую диарею, истощение, отставание в физическом развитии и анемию [Парфенов А.И., 2007]. Немногим более 50 лет назад G. Vclver и J. French, воспользовавшись предположением W. Dicke о возможной связи Ц с употреблением в пищу хлеба, исключили из пищевого рациона детей хлебные злаки и убедились в терапевтическом эффекте такой диеты- [Парфенов А.И., 2007]. Однако, и в настоящее время, Ц остается наименее изученным аутоиммунным заболеванием, основным проявлением которого является синдром мальабсорбции, что приводит к формированию нарушений во всех видах обмена, клиническому полиморфизму, затрудняет диагностику, ведет к развитию множества дефицитных состояний, сопровождается сложностями адаптации ребенка в обществе, ведет к инвалидности [Ревнова М.О., 2004; Бельмер С.В. и соавт., 2004; Maiuru L. et al., 2005; Hoffenberg E.J. et al., 2007]. Несмотря на то, что заболевание впервые было описано в 1888 году (Gee S.J.), на сегодняшний день отношение диагностированных к не диагностированным случаям целиакии в Европе находится на уровне от 1:5 до 1:13 [Bai J. et al., 2005]. Клиническая картина заболевания настолько полиморфна, что лишь 20-30% пациентов имеют классические симптомы болезни, в то время, как почти 70-80% случаев Ц остаются не диагностированными [Hill I. et.al., 2006]. Одним из подходов изучения генетических факторов риска при мультифакториальных заболеваниях, к которым относится и Ц, является концепция молекулярной генетики об 5 ассоциации полиморфных генетических маркеров с предрасположенностью или устойчивостью к развитию патологии [Эммануэль B.JI. и соавт., 2000; Sollid L.M. et.al., 2007]. Эти специфичные для конкретной патологии маркеры могут быть выявлены задолго до ее клинической манифестации, что позволит определить группы риска, организовать их мониторинг, а в случае необходимости, назначить превентивную терапию [Sturges R.P. et al., 2001; Srinivasan U. et al., 2008]. Особый интерес представляет изучение генов-кандидатов, если продукт их экспрессии (фермент, гормон, рецептор) прямо или косвенно участвует в развитии патологического процесса [Kim C.Y. et al., 2004]. Следует отметить, что исследования подобного типа мало представлены семейным материалом, что значительно снижает их научную значимость.

В связи с этим, изучение вклада кандидатных генов в развитие заболевания, его клинические проявления и• в изменчивость количественных признаков иммунитета, в т.ч. тканеспецифического антителоносительства, участвующих в формировании проявлений заболевания и его осложнений, является перспективным. Кроме того, исследование количественных патогенетически значимых параметров иммунного ответа на популяционном и семейном уровнях могут способствовать поиску критериев риска Ц и ее осложнений, а так же служить основой для разработки индивидуальных программ профилактики и реабилитации. В последние годы активно изучается роль цитокинов в развитии Ц и ее осложнений [Mention J.J. et al., 2003; Anderson R.P. et al., 2005]. В литературе идет накопление информации, посвященной изучению цитокинового профиля при осложнениях Ц [Maiuri L. et al., 2000; Murray J.A. et al., 2005; Di Sabatino A. et al., 2006].

Цель:

Изучить генетические и иммунологические механизмы формирования клинических проявлений целиакии у детей и подростков Томской области и определить оптимальные подходы к реабилитации больных и профилактике заболевания.

Задачи:

1. Оценить выявляемость целиакии, соотношение различных форм заболевания, распространенность дефицитных состояний и ассоциированных с целиакией заболеваний в реальных условиях работы педиатрической службы Томской области.

2. Дать характеристику тканеспецифического антителоносительства, цитокинового статуса и гуморального иммунитета у детей с целиакией в зависимости от формы заболевания, состояния морфологической картины слизистой оболочки кишечника, а так же у их родственников.

3. Изучить связь НЬА-сштемы (DQB1 - 12 специфичностей, DQA1 - 8 специфичностей) и полиморфных вариантов генов интерлейкинов (IL1B, IL1RN, IL4, IL4RA), гена рецептора к витамину D (VDR) с патологическим фенотипом целиакии.

4. Исследовать вовлеченость аллельных вариантов генов цитокинов на клиническое течение целиакии, варьирование патогенетически значимых признаков (тканеспецифические ■ антитела, цитокины,, показатели гуморального иммунитета) и на эффективность терапии заболевания.

5. Разработать новые технологии реабилитации детей с целиакией и членов их семей.

Научная новизна работы. Впервые дана оценка взаимосвязи клинических, иммунологических, биохимических и генетических параметров при целиакии на популяционном, семейном и индивидуальном уровнях. Установлены клинические особенности течения Ц в зависимости от возраста, формы заболевания, а также частота дефицитных состояний и осложнений у детей и подростков Томской области. Впервые показано, что дети, рожденные с задержкой внутриутробного развития, составляют группу риска по развитию типичной Ц.

Впервые для большого числа патогенетически значимых количественных признаков (иммунологических), определен вклад наследственной компоненты в их фенотипическую изменчивость, а также представлено описание наследственной компоненты в терминах конкретных генов подверженности Ц и развитию дефицитных состояний.

Новым является подход к исследованию иммунного статуса и тканеспецифического антителоносительства у больных целиакией и их родственников на популяционном уровне, позволивший выявить значительные изменения в данных системах. Впервые получены сведения о том, что изменения иммунитета у всех членов семей пробандов с Ц являются сходными. Получены коэффициенты наследуемости уровней провоспалительных (ИЛ-ip), и противовоспалительных (ИЛ-4, ИНФ-у) цитокинов. Установлена провоспалительная' направленность цитокинового каскада с увеличением содержания ФНО-а, ИЛ-lp среди пациентов с Ц.

Впервые-у больных целиакией Томской области изучены локусы HLA— системы DOB1, DOA1 и показано, что патологические HLA-маркеры выявлены у всех пациентов. Описана взаимосвязь локусов HLA—системы с формами заболевания,, развитием осложнений' и характером ответа на патогенетическую терапию. Продемонстрирована высокая частота встречаемости* HLA-маркеров Ц (92%) среди сибсов. Приоритетными являются результаты, показавшие ассоциацию полиморфизмов генов IL4, IL4RA, а также генов локуса IL1 и IL1RN с Ц, ее клиническими формами, развитием дефицитных состояний и ассоциированных заболеваний, а также ответом на патогенетическое лечение.

Практическая значимость работы. Создан регистр больных Ц города Томска. Внедрена 3-х этапная диагностика Ц с активным- обследованием пациентов из групп высокого риска (родственники 1 степени родства, гипотрофия, анемия, задержка физического развития), что способствовало улучшению выявляемости Ц с 19,951 на 100 000 (2004 г.) до 40;83 на 100 000 детского населения (2008 г.).

Результаты исследования» позволили выделить особенности манифестации и течения целиакии у детей и подростков Томской области и разработать концепцию индивидуальных профилактических и реабилитационных мероприятий для больного и его родственников. Показано, что дети с задержкой внутриутробного развития являются группой риска по развитию Ц.

Выявленные клинико-генетические, иммунологические маркеры могут служить критериями превентивной диагностики, развития осложнений и прогноза заболевания. На основе полученных данных показана необходимость организации семейной диспансеризации родственников 1 степени родства пробандов с Ц. и предложены алгоритмы диагностики глютеновой энтеропатии.

Проведена, клинико-лабораторная оценка реабилитации^ с использованием дополнительного энтерального питания (смесь «Нутризон»), препаратов с анаболической активностью (ретаболил), направленные на коррекцию нутритивного статуса пациента. Показана целесообразность и эффективность организации; «Школы управления Целиакией»,. разработаны и адаптированы образовательные программы с учетом индивидуальных особенностей; детей с Ц и их родственников.

Внедрение-результатов исследования;. Стратегия выделения групп риска развития-Ц; ее осложнений и ассоциированных заболеваний на.основании оценки иммунного статуса (определение уровня цитокинов и показателей гуморального звена иммунитета, тканеспецифического антителоносительства), исследования нутритивного статуса, генетического обследования семей внедрена на базе гастроэнтерологического отделения МЛПУ Детской больницы №1, генетической клиники У РАМН НИИ медицинской? генетики СО РАМН и детского отделения НИИ курортологии и физиотерапии г. Томска. Результаты исследования используются в, лекционном курсе по гастроэнтерологии: и нутрициологии на кафедре педиатрии ФПК и ППС и кафедре медицинской генетики СибГМУ.

Апробация» материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на VI, VII, VIII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005, 2006, 2007);.V, VII Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых-педиатров «Здоровье детей - наше будущее» (Томск, 2005, 2009); VII и VIII научных конференциях «Генетика человека, и патология» (Томск 2004, 2007); межлабораторном научном семинаре ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2007); Всероссийской 14-й, 15-й, 16-й научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск 2006, 2007, 2008); XV Международном конгрессе детских гастроэнтерологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы абдоминальной патологии у детей» (Москва, 2007). Работа выполнялась в рамках областной программы «Дети Томской области» (№ 191-06, 2004-2006 годы), подпрограммы «Внедрение новых технологий ранней диагностики и реабилитации детей с синдромом мальабсорбции» и при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-04-00732-а «Генетические и иммунологические механизмы воспалительного процесса при целиакии. Роль HLA и не HLA-зависимых генетических маркеров».

Публикации. Результаты диссертационной работы изложены в 22 публикациях, 3 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК, 9 статей в региональных сборниках и журналах, 1 статья в зарубежном журнале, 8 тезисов конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 194 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, 6 глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические рекомендации. Указатель литературы содержит 258 источников, в том числе, 72 отечественных и 186 иностранных. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 107 таблицами.

2. Результаты исследования позволили выделить дополнительную группу риска - дети, рожденные с задержкой внутриутробного развития, по реализации типичной целиакии.

3. Показана целесообразность назначения пробандам с целиакией, осложненной нарушениями нутритивного статуса, курсов дополнительного энтерального питания смесью «Нутризон». В составе комплексной терапии для пациентов с целиакией, осложненной задержкой физического развития, целесообразно использование коротких курсов ретаболила.

• Коррекции нутритивной недостаточности смесью «Нутризон» детям 25 лет 100,0 мл в сутки, пациентам старше 5-ти летнего возраста 200,0 мл в сутки, продолжительностью курса 1 месяц показана в ситуации: а) рост и масса тела ниже 3 перцентиля; б) гипотрофия 1-2 степени (отсутствие прибавок массы тела в течение последних 6 месяцев).

• Назначение ретаболила по схеме - 0,1 мл на год жизни, 1 инъекция в месяц, № 3 показано в случае: а) рост и масса тела ниже 3 перцентиля; б) недостаточное влияние диеты на нутритивный статус (отсутствие прибавок массы тела в течение последних 6 месяцев и скорость роста менее 2,5-3 см в год); в) задержка костного возраста более 2-х лет.

4. Выявлены критерии риска развития рефрактерной целиакии (рис. 25).

Отсутствие серологической и морфологической компенсации целиакии -—. более года

Рефрактерпое течение целиакии

HLA-маркеры: DQA1 *501 *501 DQAH102 DQBl *20t DQB1 -302

Рисунок 25. Критерии диагностики рефрактерной целиакии.

5. Все родственники пробанда с целиакией нуждаются в определении тканеспецифического антителоносительства.

6. Исследование полиморфизма генов цитокинов (IL4, IL4RA, IL1 и IL1RN) рекомендовано в превентивной диагностике целиакии и ее осложнений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Серологическое исследование (антитела к глютену АГА А, АГА G; антитела к тканевой трансглютамниазе)

- • ~ '

Морфологическое исследование с проведение (обод

Нарушение напностн N

Генетическое исследование HL А-спецнфнчностей * X

Целиакия

Рис. 23. Алгоритм диагностики целиакии у пациентов с энтеральным синдромом.

Генетическое исслгдотинш

Ш^Л-сисцифн'Июстсй*

Серологическое исследование (янтнтелп к" глвдтсну АГА А, АГА G; шгппслп к ткяиевой ТрЛНСГЛЮТ11М1ШЯ'}е)

Морфолотическое нсслсдовшше с проведеннеш пюрфометрнн (обя'игте.1ьно!)

Целнакпп

Группа генетического рнскл

Диспансерное ма&поденне

Рис. 24. Алгоритм диагностики целиакии в группах риска.