Автореферат и диссертация по медицине (14.01.02) на тему:Клинико-генетические аспекты семейных аденом гипофиза

На правах рукописи

Далантаева Надежда Сергеевна

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СЕМЕЙНЫХ АДЕНОМ ГИПОФИЗА

(14.01.02 - эндокринология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 ЯНВ 2014

Москва - 2013

005544227

005544227

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Эндокринологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Директор - академик РАН и РАМН Дедов И.И.)

Научный руководитель

Дедов Иван Иванович

доктор медицинских наук, профессор, академик РАН и РАМН

Официальные оппоненты:

Романцова Татьяна Ивановна

доктор медицинских наук, профессор кафедры эндокринологии ГБОУ В ПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

Ведущая организация

Астафьева Людмила Игоревна

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник 8-го нейрохирургического отделения НИИ нейрохирургии им. акад. H.H. Бурденко РАМН

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного

профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_» _ 2014 года в _ на

заседании диссертационного совета Д.208.126.01 при ФГБУ «Эндокринологический Научный Центр» Минздрава России по адресу: 117036, Москва, ул. Дмитрия Ульянова, 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Эндокринологический Научный Центр» Минздрава России Автореферат разослан 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Суркова Елена Викторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В последнее время все чаще приходит осознание того, что многие болезни имеют в своей основе молекулярно-генетические причины. Генетические мутации могут возникать в одной единственной клетке и приводить к ее моноклональной пролиферации и формированию опухоли. С другой стороны, тот же генетический дефект может возникать при гаметогенезе и на ранних этапах эмбриогенеза, и в этом случае, его будет содержать большинство или каждая клетка организма, приводя к разнообразным патологическим проявлениям на тканевом и органном уровнях. В подавляющем большинстве случаев аденомы гипофиза являются доброкачественными, однако они могут приводить к тяжелым заболеваниям и даже преждевременной смертности из-за масс-эффекта опухоли или дисфункции гормонов (Elston M.S., 2009).

Семейные формы аденом гипофиза, по данным разных авторов, составляют около 3-5% случаев этого заболевания (Chahal H.S., 2010; Vasilev V., 2011). Хотя ряд генетических мутаций был обнаружен в удаленных тканях аденом гипофиза спорадического характера, работ по семейным формам катастрофически мало. В последнее время все больше внимания уделяется именно семейным формам аденом гипофиза, поскольку последние исследования показывают, что их распространенность может быть недооценена. Этот интерес также проистекает из-за различия клинических симптомов и раннего времени манифестации, более агрессивного роста опухоли и нередко резистентности к лечению при наследственных формах аденом гипофиза.

Аденомы гипофиза в семейном формате встречаются при нескольких эндокринных неоплазиях: синдроме МЭН-1, МЭН-4 и Карни-комплексе, которые возникают в результате мутаций в генах MEN1, CDKN1B и PRKAR1A, соответственно. В литературе подробно описаны изолированные семейные соматотропиномы - как клинический синдром у пациентов с акрогигантизмом. Аденомы гипофиза, не только соматотропиномы, могут встречаться в семьях в отсутствии синдромов МЭН 1 и 4 типов, Карни-комплекса; такие аденомы называются изолированными семейными аденомами гипофиза (FIPA). За последнее десятилетие в литературе описано более 200 семей FIPA из разных стран. В семьях могут встречаться как опухоли только одного вида гормональной секреции (гомогенный фенотип), так и сочетание различных видов секреции гормонов (гетерогенный фенотип) (Daly А., 2006).

Важный шаг в исследовании патогенеза семей FIPA был сделан, когда учеными был предложен кандидат локуса на хромосоме 1 lql3 (Yamada S., 1997). Впоследствии были выявлены мутации гена, в регионе кодирования арилуглеводородного рецептора (AHR) - взаимодействующего белка [AIP; также известен как ХАР2 или ARA9], в семьях с соматотропиномами. AIP - молекулярный ко-шаперонный белок, состоящий из 330 аминокислот. Он участвует в функциональном созревании AHR, единственного рецептора, способного связывать токсин окружающей среды -диоксин.

В настоящее время описано множество мутаций AIP: делеции с потерей тетрапептидного домена с последующим нарушением взаимодействия с белком теплового шока и рецептором AIP; миссенс-мутации (например, R271W), которые с помощью аминокислот могут изменить функции AIP другими способами.

В семьях FIPA в 41% случаев встречаются пролактиномы, 30% -соматотропиномы, 13% - неактивные аденомы гипофиза, 7% соматолактотропиномы, 4%- гонадотропиномы и болезнь Иценко-Кушинга и только 1% - тиротропиномы (Daly А., 2009). В целом 15% семей FIPA имеют мутации гена AIP; AIP мутации присутствуют только в половине семей изолированных соматотропином. В семьях с мутациями AIP аденомы гипофиза встречаются в более чем 50% случаев. Высокая частота мутаций гена AIP также обнаружена при спорадических случаях акромегалии, у пациентов с дебютом заболевания до 35 лет.

Таким образом, актуальным представляется изучение клинико-генетических соответствий у пациентов с семейными формами аденом гипофиза, а также в группе пациентов со спорадическими соматотропиномами и дебютом акромегалии до 35 лет.

Большое значение имеет определение семейного риска. Ранее работ на территории Российской Федерации по изучению семейных аденом гипофиза не проводилось.

Цель исследования

Изучить клинико-генетические аспекты семейных аденом гипофиза и спорадических случаев акромегалии с дебютом заболевания до 35 лет.

Задачи исследования

1. Изучение клинической картины семейных опухолей гипофиза и спорадических форм с ранним дебютом заболевания.

2. Исследование частоты и выраженности осложнений заболевания.

3. Определение распространенности и характера мутаций гена AIP.

Научная новизна

В данной работе впервые в России изучались клинико-генетические аспекты семейных аденом гипофиза.

Практическая значимость

Полученные данные послужили основой для выработки алгоритма диагностики больных с семейными аденомами гипофиза. Определены группы пациентов, требующих динамического наблюдения, что позволит улучшить качество жизни больных с указанной патологией и снизить экономические затраты в связи с ранней диагностикой заболевания.

Личное участие автора в получении научных результатов

Автор систематизировала данные историй болезни, освоила принципы и методы молекулярной биологии, самостоятельно выполнила иммуногистохимическое исследование операционного материала, провела статистическую обработку полученных результатов.

Положения, выносимые на защиту

Семейные изолированные аденомы гипофиза отличаются большим объемом опухоли, ранней манифестацией заболевания.

Распространенность мутаций гена AIP в российской популяции больных с семейными аденомами гипофиза составляет 10%, а 90% могут иметь мутации в других генах.

К отличительным особенностям пациентов с мутациями гена AIP относятся наличие акрогигантизма у родственников и/или ранний (до 18 лет) дебют заболевания, агрессивное течение и резистентность к проводимому лечению.

Внедрение полученных результатов

Материалы работы представлены на научном заседании отделения эндокринологии Научно-исследовательского института У. Гарвея Университета Королевы Марии (г. Лондон, Великобритания, 2012), VI Всероссийском конгрессе эндокринологов с международным участием «Современные технологии в эндокринологии» (г. Москва, Россия, 2012), на 15 Европейском конгрессе нейроэндокринологической ассоциации (г. Вена, Австрия, 2012).

Апробация диссертации проведена на межотделенческой научной конференции ФГБУ ЭНЦ Минздрава России 9 декабря 2013 года. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ в отечественных и зарубежных научных изданиях. Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделений нейроэндокринологии и остеопатий и эндокринной хирургии ФГБУ ЭНЦ Минздрава России.

Научное исследование осуществлено при поддержке Королевского общества Великобритании (International Joint Project - 2009/R4 (including CSIR India)).

Руководитель проекта Dr Marta Korbonits, MD, PhD, Professor.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов проведенного исследования (глава 3), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, приложения с подробным описанием применяемых лабораторных методик. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 30 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Согласно дизайну исследования проведено открытое сравнительное исследование пациентов в период с 2009 по 2013 гг.

В исследование включены семьи с наличием двух и более родственников с аденомами гипофиза различного вида секреции и пациенты с дебютом акромегалии до 35 лет. Набор пациентов проводился на базе отделения нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ ЭНЦ Минздрава России, г. Москва (директор - академик РАН и РАМН H.H. Дедов), НИИ нейрохирургии им. акад. H.H. Бурденко РАМН, г. Москва (директор - академик РАН и РАМН А.Н. Коновалов), ГБУЗ Архангельской области «Первая городская клиническая больница им. Е.Е. Волосевич», г. Архангельск (заведующая отделением - проф., д.м.н. Т.А. Зыкова), КГБУЗ «Краевая клиническая больница», г. Красноярск (заведующий эндокринологическим центром - проф., д.м.н. С.А. Догадин), Республиканской больницы №1 г. Кызыла (главный эндокринолог Республики Тыва - Р.В. Чубарова).

Критерием исключения являлось наличие характерных клинических особенностей синдромов МЭН-1, МЭН-4 или Карни-комплекса.

Всего в исследование после подписания информированного согласия включено 20 семей и их родственников с аденомами гипофиза различного вида секреции и 78 пациентов с акромегалией в дебюте заболевания до 35 лет, из них 13 пациентам впервые был поставлен диагноз акромегалии.

Методы анализа медицинских документов

Впервые обратившимся пациентам установление диагноза акромегалии проведено по стандартной методике по месту госпитализации.

При ретроспективном анализе историй болезни получены демографические сведения о больных (пол, возраст), данные анамнеза (длительность заболевания, предшествующее лечение), тщательный семейный анамнез (построение генеалогического дерева), сведения о клинических проявлениях акромегалии, результаты гормонального обследования, представленные в историях болезни: уровень базального СТГ и СТГ70ПТ, ИРФ-1 и пролактина до и после транссфеноидальной аденомэктомии, если пациент подвергался оперативному вмешательству. Эти исследования выполнены в гормональной лаборатории ФГБУ ЭНЦ Минздрава России (заведующий лабораторией - д.м.н. Н.П. Гончаров) или в лаборатории НИИ нейрохирургии им. акад. H.H. Бурденко РАМН (заведующий лабораторией - к.м.н. A.B. Мошкин).

Для оценки размера, характера распространения и структуры аденомы гипофиза изучался протокол МРТ, выполненной в отделении магнитно-резонансной томографии ФГБУ ЭНЦ Минздрава России (заведующий отделением - проф., д.м.н. A.B. Воронцов) или в отделении радиологии и радиохирургии НИИ нейрохирургии им. акад. HR Бурденко РАМН (заведующий отдела тем - проф., дм.н. AJ3. Галанов). Объем опухоли (V) рассчитан способом, предложенным в 1962 году рентгенологами G. Di-Chiro и K.B. Nelson для измерения объема гипофиза: V=0,5xLxWxT, где L- высота аденомы, W- ширина, Т- передне-задний размер (толщина), выраженные в мм. На основании данных МРТ о распространении аденомы все опухоли были разделены на инвазивные и неинвазивные. В основу деления была положена классификация Hardy (1973). Неинвазивным опухолям в нашем исследовании соответствовали Grade I и Grade II А, инвазивным - Grade III-IV (А-Е).

Методы генетического анализа

Пациентам с семейными аденомами гипофиза и 78 пациентам с дебютом акромегалии до 35 лет проводился забор крови из локтевой вены вне зависимости от приема пищи в пробирки «вакутайнер». В качестве консерванта использовали 0.5 М раствор ЭДТА.

Молекулярно-генетические исследования проводились в двух лабораториях. Всем пациентам выделение ДНК выполнено в лаборатории генетики и клинической иммунологии ФГБУ ЭНЦ Минздрава России (заведующая отделением -к.б.н. О.Н. Иванова). Геномная ДНК выделена из цельной крови с использованием набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) по инструкции производителя.

Выявление генетических мутаций проводилось в лаборатории эндокринологии госпиталя святого Бартоломея Университета Королевы Марии, г. Лондон

Великобритания, (заведующая лабораторией - Dr Marta Korbonits, MD, PhD, Professor). Методом ПЦР и прямого секвенирования исследовались все экзоны и прилегающие участки интронов генов AIP, MEN1, CDKN1B и PRKAR1A. Дополнительно в 1 пробе проводилось исследование на наличие синдрома Мак-Кьюн-Олбрайта - поиск мутации гена GNAS1. Анализ полученных результатов секвенирования выполнен с помощью SeqManv. 7.2 из программного пакета DNASTAR (DNASTAR, Inc., США). Анализ на крупные делеции и инсерции генов AIP и MEN1, CDKN1B и PRKAR1A проводился методом мультиплексной амплификации (MRC-Holland kit Р244-В1, Нидерланды).

Кровь для экстракции РНК взята в специальные пробирки PaxGene Blood RNA, выделение производили с помощью PaxGene Blood extraction kit (Preanalytix, Qiagen, США).

Первым этапом исследовалась нуклеотидная последовательность ДНК методом ПЦР с последующим секвенированием кодирующих экзонов и прилежащих участков интронов генов MEN1, CDKNIB, AIP, PRKAR1A. При выявлении геномной мутации у пробанда у родственников проводилось исследование только участка гена, в котором расположена данная мутация.

Все ПЦР проводились с универсальными pUC-праймерами (М13 прямым TGTAAAACGACGGCCAGT и обратным CAGGAAACAGCTATGACC).

Последовательности всех праймеров приведены в таблицах 1, 2, 3 и 4.

Таблица 1. Последовательности праймеров для амплификации и прямого секвенирования гена MEN1 (NM 130799.2). __

Экзо н ы Прямой праймер Направление от 5' к З'-концу Обратный праймер Направление от 5' к З'-концу ПЦР-проду кт (п.н.)

2А GAAGAGGGTGGGGAAGCA GTGAAGCGGGCATAGAGG 426

2В ATCGACGACGTGGTGCGCCTGTTTG GGGTCATGGATAAGATTCCCACC 473

3 ATCTGAGGTTGGGTCACAGG GCTACTACAGTATGAAGGGGACAAG 395

4 CACCCACATAGGAAGGGAAG GGAAGCTGAAGCTCAGGAAG 354

5 TGGTCCCTGTTGGTTCTGAC CATGGGGTACCTAGGAAAGG 247

6 TGGAAAGGTCAGTAGAGGGAAG GTGAGACTGGATGGGCGATA 332

7 GACTCCCTGGGATCTTCCTG AGGGTGGTTGGAAACTGATG 335

8 TGACCCAGACAGCATCATTT CTCCTGCCATCCCTAATCC 379

9 ATGGTACGTCCTGGCTATGG ACCACCTGTAGTGCCCAGAC 417

10А CACGGGCTTGTCAGACTTTT CAGCGACAGTCCCAGGAG 419

10В AGAAGCCAGCACTGGACAAG GCTCAGAGTTGGGGGACTAA 448

Таблица 2. Последовательности праймеров для амплификации и прямого секвенирования гена CDKNIB (NM 004064.2).__

Экзоны Прямой праймер Направление от 5' к З'-концу Обратный праймер Направление от 5' к З'-концу ПЦР-продукт (H.H.)

1А GTCTTTTGGCTCCGAGGG CACCTTGCAGGCACCTTT 467

1В TTCAGAATCACAAACCCCTAGA GCCAGGTAGCACTGAACACC 468

2 CAGGATTGTGGGTGGAGGTA TTTGACCTCACGAAGTATAAAC 416

Таблица 3. Последовательности праймеров для амплификации и прямого секвенирования гена AIP (NM 003977.2).__

Экзо-п ы Прямой праймер Направление от 5' к З'-концу Обратный праймер Направление от 5' к З'-концу ПЦР-продукт (п.н.)

1 TTCTGCCCTCAACCAAAAT CAATCAGCGTCGAGTTCTG 401

2 TTGTGGCTTTGTTTTCTCACC GAATAGGGCTTGGCTGGAC 436

3 TGTCACTCTCTGGGCCTTG GATGTGAAGGAGGAGGAAAGG 530

4 ATGTGGGTCAGGTCTGCTG GAGCGGGGAGAAGCTGTAG 355

5 CTGCCTCAAGAACCTGC TGCCGAGTAGAGGCATTTAG 448

6 GTGGCATCCTCAGGTCAG GTGGAGCAGCTCAGCAGAC 509

Таблица 4. Последовательности праймеров для амплификации и прямого секвенирования гена PRKAR1A (NG 007093.3).__

Прямой праймер Направление от 5' к З'-концу Обратный праймер Направление от 5' к З'-концу ПЦР- продукт (п.н.)

TAACATTCAAGCGCTGCTCA TTCTCCAAAGCTCCCTCCTT 1273

Таблица 5. Последовательности праймеров для амплификации и прямого секвенирования гена GNASI (NM 016194.2).

Прямой праймер Направление от 5' к З'-концу Обратный праймер Направление от 5' к З'-концу ПЦР-продукт (H.H.)

CAAGCAGGCTGACTATGTGC ACCACGAAGATGATGGCAGT 523

Полимеразную цепную реакцию проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого термоциклера Hybaid Touchdown с использованием термофильной ДНК-полимеразы Thermus aguaticus (Promega, Великобритания). Все протоколы проведения ПЦР доступны по запросу. Очистка ПЦР-продукта производилась при помощи наборов Agencourt AMPure ХР Bead system (Beckman Coulter Genomics, Великобритания) согласно инструкции производителя.

Реакцию секвенирования выполняли с использованием набора реагентов BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Разделение синтезированных фрагментов проводили методом автоматического капиллярного электрофореза в анализаторе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Полученные результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения Sequencing Analysis 5.1. В качестве референсных последовательностей использовали данные геномного браузера (http://eenome.ucsc.edu). В качестве референсной последовательности комплементарной ДНК MEN1, CDKN1B, AIP и PRKAR1A использовались ссылки Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez') под номерами NM J 30799.2, NM_004064.2, NM_003977.2 и NG_007093.3, соответственно.

Вторым этапом для всех образцов ДНК, в которых мутаций не выявлено при прямом секвенировании на протяжении всего гена MEN1, AIP, CDKN1B и PRKAR1A, с целью исключения больших делеций/вставок проведен анализ методом MLPA (мультиплексная амплификация с лигированием) SALSA MLPA kit Р244 (MRC-Holland, Нидерланды) по инструкции производителя (информация о праймерах

представлена в диссертации). Продукты ПЦР затем анализировались на ABI3730 DNA sequencer (Applied Biosystems, США), результаты электрофореза визуализировались при помощи программного обеспечения Gene-Marker software версии 1.4 (Softgenetics LLC, США). Количество генетического материала определялось согласно инструкции с использованием Coffalyser version 6.0 (MRC-Holland, Нидерланды). Пробы с количеством меньше 0.65-0.7 (потенциальные делеции) или больше 1.3-1.35 (потенциальные дупликации) подвергались повторному анализу. Также в процессе проведения MLPA в качестве контроля использовались образцы, не содержащие ДНК.

Всем пациентам, с выявленной мутацией, а также их родственникам предложено медико-генетическое консультирование. Информирование родственников о результатах клинического обследования и молекулярно-генетического анализа производилось только с согласия пациента.

Методы морфологического исследования

Архивные парафиновые блоки с аденомами гипофиза взяты у пациентов с FIPA и спорадическими опухолями гипофиза. Все выполнено в согласии с этическим комитетом научной организации.

Морфологическое исследование проведено в отделении патоморфологии ФГБУ ЭНЦ Минздрава России (заведующий отделением - проф., д.м.н. А.Ю. Абросимов). Изготовленные из парафиновых блоков срезы 22 аденом спорадических пациентов и 4 семейных изолированных аденом, толщиной 4-5 мкм были исследованы рутинным гистологическим методом. Материал фиксировали в 10%-ном растворе формалина, забуференном по Лилли при pH 7,4, далее заливали в парафин по стандартной методике.

Иммуногистохимическое исследование было проведено в лаборатории эндокринологии госпиталя святого Бартоломея Университета Королевы Марии, г. Лондон, Великобритания (заведующая лабораторией - Dr Marta Korbonits, MD, PhD, Professor). Изготовленные из парафиновых блоков срезы 26 аденом толщиной 4—5 мкм были исследованы рутинными методами.

Окрашенные гематоксилином и эозином препараты пересмотрены с помощью светового микроскопа для верификации диагноза аденомы гипофиза и уточнения следующих характеристик опухолей: тинкториальных свойств (оксифильная, базофильная, хромофобная, смешанная), структуры (солидная, трабекулярная, смешанная) наличия кровоизлияния, некроза, фигур митоза и апоптозных телец.

Таблица 6. Характеристика использованных первичных антител.

Название Клон Источник Фирма-производитель, страна Разведение

Анти-СТГ Моноклональные Мышиные AbD Serotec, Великобритания 1:50

Анти-ПРЛ Моноклональные Мышиные BioGenex, США 1:1000

Анти-ЛГ С93 Мышиные Dako, Дания 1:50

Анти-ФСГ СЮ Мышиные Dako, Дания 1:50

Анти-АКТГ Моноклональные Мышиные Santa Cruz, США 1:50

Аигги- Моноклональные, Мышиные Becton Dickinson, 1:400

цитокератин клон САМ 5.2 Великобритания

Анти-AIP Поликлональные Кроличьи Novus, США 1:2000

В данном научном исследовании иммуногистохимический анализ проводился с помощью набора Super SensitiveTM Non-Biotin HRP kit (QD420-YIKE, Biogenex, Великобритания), где большое количество фермента пероксидазы хрена полимеризуется, образуя основу, которая конъюгируется с вторичным антителом.

Транссфеноидальная аденомэктомия всем пациентам, чьи блоки были исследованы, проводилась в ФГБУ ЭНЦ Минздрава России (заведующий отделением - проф., д.м.н. А.Ю. Григорьев) или в НИИ им. H.H. Бурденко РАМН (заведующий отделением - проф., д.м.н. Б.А. Кадашев).

Методы статистического анализа

Статистическая обработка данных проводилась с использованием прикладных программ Statistica (StatSoftlnc., США, версия 6.0). Данные представлены в виде медианы (Me) и квартилей [25-й и 75-й процентили, Q25-Q75], Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием непараметрических критериев. Для сравнения двух независимых выборок по количественным признакам использовался критерий Манна-Уитни, по качественным признакам - критерий Фишера. Критический уровень значимости различий принимался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

В группе семейных изолированных аденом гипофиза нами найдено и описано 20 семей с аденомами различного вида секреции. Краткая характеристика всех семей представлена в таблице 7.

Таблица 7. Краткая характеристика семейных изолированных аденом гипофиза.

Но Тип опухоли Количество Мутация AIP Влияние на

ме родственников белок

Р с аденомой гипофиза

1 Акрогигантизм/Пролактинома 2 c.783C>G р.Туг261Х

2 Акромегалия 3 нет

3 Пролактинома 2 нет

4 Соматопролактинома/Акромегалия 2 нет

5 Неактивная аденома гипофиза 2 нет

6 Акромегалия 2 нет

7 Пролактинома 2 нет

8 Акромегалия 7 нет

9 Акромегалия/Неактивная аденома гипофиза 2 нет

10 Акромегалия 2 нет

11 Акромегалия 2 нет

12 Акрогигантизм/Акромегалия 2 нет

13 Акромегалия/Неактивная аденома гипофиза 2 С.4270Т p.Glnl43X

14 Акромегалия/Пролактинома 2 нет

15 Акрогигантизм/Акромегалия 3 нет

16 Акрогигантизм/Акромегалия 3 нет

17 Акрогигантизм/Акромегалия 2 нет

Но 1 МП ОПУХОЛИ Количество Мутация AIP Влияние на

MC р родсгвенников с аденомой белок

гжюфнга

18 Акро1 иганттнм Акромегалия 2 нет

19 Акромегалия 2 нет I

20 Акромегалия 2 нет

Из 20 ссмсй у 48 пациентов наблюдалась аденома гипофиза. Минимальное количество членов семьи с аденомой гииофим составило два, максимальное количество - семь (в данной семье, как минимум, на протяжении четырех поколений присутствуют клинические проявления акромегалии).

Семей с гомогенным типом секреции было 16, с гетерогенным типом - четыре, из них две семьи с акромегалией/неактивной аденомой гипофиза, две с акромегалией/прол&ктиномой.

Распределение но типу секреции аденомы и полу пациентов представлено на рисунке №1 и 2.

Семенные аденомы гипофиза

■ Акромет алия » АхрОГИГ9НТИ|М

■ Сшитолрол JHTHWOMJ

■ Пропак<ино«и

■ Иеим|ив»им ^дсниш

гмлофим

Рисунок I. Распределение по типу секреции аденомы.

Гаспрслинниг по полу

■ Мумгчииы ■ Женщина»

Рисунок 2. Распределение по полу.

Всего в исследование участвовали 23 мужчины и 25 женщин с аденомами гипофиза (48%/52%). Как выно из рисунка I, преобладающими аденомами являлись СТГ-продуцирующие, вторыми по частоте - пролактинсекретирующие. Хотя, по данным мировой литературы (Colao A.M., 2009, Daly А., 2009), среди семейных изолированных аденом наиболее часто встречаются иролактиномы, в нашем исследовании этот тип опухолей гипофиза обнаружен только у шести женщин. Акромегалия чаше выявлялась у мужчин, чем у женщин (17М:13Ж). Гигантизм наблюдался у пяти мужчин и двух женщин. Несмотря на частую совместную секрецию СТГ и пролактина, особенно в случаях макроаденом, в нашем исследовании гистологически только у одной пациентки была подтверждена соматопролактинома. Неактивная аденома гипофюа была обнаружена у одной мужчины и трех женщин.

Дтя выявления особенностей семейных изолированных аденом гипофиза проведен сравнительный анализ. Подобрана контрольная группа из 48 пациентов, сопоставимых по возрасту, полу и типу гормональной секреции аденомы гипофиза. Анализ показал, что семейные изолированные аденомы гипофиза характеризуются ранним дебютом заболевания по сравнению с контрольной группой - 31 год против 37 лет, р=0,03 (рис. 3).

Рисунок 3. Сравнение всзраста лебюта заболевания пациентов с семейными изолированными аденомами гипофиза с контрольной I р> пион.

Семейные изолированные аденомы г ипофиза также характеризуются большим объемом опухоли, 1900 мм* пробив 350 мм\ р=0.005 (рис. 4).

Рисунок 4. Сравнение об|лма опухоли у пациентов с семейными аденомами гипофиза с контрольной группой.

Различий в сскрспин банльных уровней гормонов выявлено не было, также, как и не было различий в возрасте на момент постановки диагноза. У родственников второго поколения заболевание было диагностировано на Ч лет раньше (р=0.01), чем у родственников первого поколения (рис. 5).

Рисунок 5. Сравнение сроков выявления заболевания у родственников первого и второго поколения.

При анализе клинической картины семейных аденом отличий от течения заболевания при спорадических случаях не выявлено. Основные осложнения связаны с метаболическим действием избытка СТГ на сердечно-сосудистую, костно-суставную системы и углеводный обмен (рис. 6).

Основные клинические проявления

100

Рисунок 6. Основные клинические проявления семейных изолированных аденом гипофиза.

Подавляющее большинство семейных изолированных аденом представлено соматотрониномами с преобладанием более частого выявления у мужчин (22М:15Ж) с медианой возраста 46 лет [34-55), самому старшему участнику исследования 73 гола. У 30 пациентов была тиагиостирована акромегалия, у семи - акрогигангизм.

Средний возраст пациентов на момент дебюта заболевания составил 33 года [14-55], на момент постановки диагноза - 35,5 лет [30-45].

Из 37 пациентов с семейными соматогропиномами у шести дебют заболевания пришелся на возраст до 18 лет (четыре мужчины и две женщины). Самый высокий мужчина с ростом 204 см, а рост женщины в настоящее время составляет 206 см. Основными жалобами были изменение внешности, головная боль, нарушение менструального цикла, снижение либидо и потенции, боли в суставах.

Диагноз акромегалии подтвержден данными гормонального обследования (уровень базального СТГ более 2.5 нг/мл или более I иг/мл в ходе пробы СТГ и повышенный уровень ИРФ-1). Максимальный уровень СТГ, зафиксированный на момент дебюта заболевания, составил 80 нг/мл, медиана уровня СТГ- 20,6 нг/мл [12,6-35]. Уровень СТГ/ОГТТ на момент обследования составил 18,15 [4,38-28,25]. Максимум ИРФ-1 составил 5 норм, медиана кратного повышения - 2,72 [1,7-3,7]. Значимая гиперпролактннемия (более 1500 мКд/л) отмечена только у одного пациента, максимум гинерпролактинемии был оценен в 2600 мЕл/л. У женщин нарушения менструальной функции по типу олиго- и аменореи, у мужчин признаки вторичного гипогонализма выявлялись практически в половине случаев.

По данным МРТ головного мозга, в подавляющем большинстве случаев визуализировались макроаденомы гипофиза, то есть опухоли с максимальным диаметром >10 мм. В двух случаях описана диффузная неоднородность гипофиза. Медиана объема опухоли составила 2520 мм* [1481-4282], минимальный объем - 250 мм\ максимальный - 12474 мм1. Локализованных энлоселлярных аденом гипофиза отмечено не было, опухоли распространялись экстрассллярно. Аденомы, растущие в направлении перекреста зрительных нервов (супраселлярно), выявлены у 30 пациентов (86%); опухоли, распространяющиеся в кавернозный синус (латероселлярно) отмечены у 29 пациентов (83%); аденомы, проникающие в пазуху основной кости (инфраселлярно), были обнаружены в 23 наблюдениях (66%); в направлении решетчатого лабиринта (антсселдярно) - у двух пациентов (6%); опухоли с экстрадуральным распространением из полости турецкого седла под твердую мозговую оболочку ската (ретроссллярно)- также у двух пациентов (6%). У большинства пациентов аденомы распространялись более чем в двух направлениях. На основании данных МРТ все опухоли были разделены на две группы: инвазивные и неинвазивные аденомы. Нсинвазивныс соматотропиномы включали в себя опухоли с супраселлярным распространением без зрительных нарушений. Инвазивные опухоли, то есть новообразования с супраселлярным ростом и ограничением полей зрения или другим направлением экстраселлярного роста были выявлены у семи пациентов. Местные или системные метастазы не были обнаружены ни в одном из наблюдений.

Семейные соматотропиномы трудно поддаются лечению, зачастую используются комбинированные методы терапии. 16 пациентов подвергнуты первичному оперативному вмешательству, двум пациентам проведена повторная операция. Методы лучевой терапии использовались в 8 наблюдениях, медикаментозное лечение после оперативного вмешательства применено в 14 случаях. Комбинированные методы лечения использовались в 13 наблюдениях. Достижение «безопасного» уровня СТГ (<2,5 нг/мл) и нормальною уровня ИРФ-1 отмечено у двух пациентов (5%); Снижение уровней СТГ и ИРФ-1 более чем на 30% от исходных показателей обнаружено у 17 пациентов (45%), у 19 пациентов имелись отклонения в анализах крови.

Нам удалось исследовать четыре семейные соматотропиномы: одну с изолированной секрецией СТГ, три - со смешанной. При окраске на цитокератин САМ5.2 половина соматотропином представлена редкогранулированными аденомами, которые известны инвазивным росгом и резистентностью к терапии. Иммунотистохимия удаленных образцов опухоли показала низкую специфичность и чувствительность при окраске на AIP. таким образом, ланный метол не является целесообразным для прескрининга мутаций AIP. (рис. 7).

Рисунок 7. Окраска на AIP.

Метолом ПНР и прямого секвенирования исследовались все »зоны и прилегающие участки нитронов генов MENI. CDKNIB. AIP и PRKARIA. Анализ на кру пные делении и инсерции генов проводился методом MLPA. В группе семейных аденом типофиза было обнаружено лва варианта нонсенс-мутации AIP в двух гетерогенных семьях: акромегалии с неактивной аленомой (C.4270T в 3 жзонс) и в другом случае - акрогигаита и пролактиномой гипофиза (C.7830G в 5 зкзоне). Интерес представляет пациент, который в 14 л ei стал отмечать быстрое увеличение роста, при обследовании выявлена макроаленома гипофиза. Несмотря на проводимую терапию, уровень И РФ-1 за все время заболевания нормализован не был (рис. 8).

АД 4 ♦ t

МГТ годе—а гв >ЦД>Я1»* [МПрМЦ •опечки. ^апс1иит»пи1Я тклмь юммиши 1 сЛожх * 1Щ1ИОШЫ1 пщ

СТГаг/м «г» 1.«Г/*1

СвЯГКПТМЯИ*

>50

г «г»

ИМ 1> 70 I«.« 4 М I»

Я» ««в «50 »1» ЯЛЖ.Ш 20 И

иЬтмчш ж I 1,5

\ Н М

1Т»1>

24.» Гр

и »рмоа 100 150 200 175 мят "_.__10«

Рисунок 8. Клиническое течение заболевания пациента.

Молекулярно-генетическими методами выявлена мутация, при скрининге родственников носителями оказались отец, тетя и родная сестра пациента.

У сестры в возрасте 18 лет диагностирована пролакгинома, но новолу чет она получала .течение агонистами дофамина.

У дочери наниента. которая также скринирована. мутации не обнаружено, но в 5 -летнем возрасте она умерла в результате глиобласгомы (рис. 9).

/ И ® 0 И □ • «сап«,.

¡, • нсиосшсль

я

о □ о о

о ■ • □

® о

ГЛЦО&МСТОАМ

I

- иртпишшн • цкишшими

сГМС'О (р¥»1Х) ■мжеяе'иуташк

Рисунок 9. Генеалогическое дерево Л//'-положительного пациента.

Л/Р-мутация встречается и у пациентов со спорадическими аденомами гипофиза без выявленной семейной истории.

Мы проанализировали также когорту пациентов с дебютом заболевания до 35

лет.

Соотношение мужчин и женщин составило 41М:37Ж с медианой возраста 34 года [26-40], самому младшему участнику исследования 12 лет. 60 пациентам была диагностирована акромегалия, 18 - акрогигантизм. Средний возраст пациента на момент дебюта заболевания составил 24,5 года [20-30], на момент постановки диагноза - 28,5 лет [24-35]. Самый высокий мужчина с ростом 223 см. Основными жалобами были изменение внешности, головная боль, нарушение менструального цикла, снижение либидо и потенции, боли в суставах.

Диагноз акромегалии подтвержден данными гормонального обследования, (уровень базального СТГ более 2,5 нг/мл или более 1 нг/мл в ходе пробы СТГ и повышенный уровень ИРФ-1). Максимальный уровень, зафиксированный на момент дебюта заболевания составил 989 нг/мл, медиана уровня СТГ 33,45 нг/мл [15-60,7]. Уровень СТГ/ОГТТ на момент обследования составил 33,44 [10,88-79,2]. Максимум ИРФ-1 составил 9,75 норм, медиана кратного повышения - 2,74 [2,07-4]. Медиана уровня пролактина - 343,5 мЕд/л, минимум -25,9 мЕд/л, максимум - 7000 мЕд/л. У женщин нарушения менструальной функции по типу олиго- и аменореи, у мужчин признаки вторичного гипогонадизма выявлялись практически в половине случаев. В нашем исследовании нарушения функций половых желез встречались с одинаковой частотой у больных с повышенным и нормальным уровнем пролактина крови (по двустороннему критерию Фишера, р=0,35).

По данным МРТ головного мозга в подавляющем большинстве случаев (72 наблюдения) визуализировались макроаденомы гипофиза, то есть опухоли с максимальным диаметром >10 мм. У трех пациентов отмечена микроаденома гипофиза, диффузная неоднородность гипофиза описана в трех случаях. 12 наблюдений представлены и кистозным компонентом. Медиана объема опухоли составила 2820 мм3 [1397-6562], минимальный объем - 21 мм3, максимальный -45325 мм3. Локализованные эндоселлярные аденомы гипофиза отмечены в трех наблюдениях (4%), опухоли, распространяющиеся экстраселлярно, - в 76 случаях (96%). Аденомы, растущие в направлении перекреста зрительных нервов (супраселлярно), выявлены у 47 пациентов (65%); опухоли, распространяющиеся в кавернозный синус (латероселлярно) отмечены у 24 пациентов (33%); аденомы, проникающие в пазуху основной кости (инфраселлярно) были обнаружены в 34 наблюдениях (47%); в направлении решетчатого лабиринта (антеселлярно) - у двух пациентов (3%); опухоли с экстрадуральным распространением из полости турецкого седла под твердую мозговую оболочку ската (ретроселлярно)- также у двух пациентов (3%). У большинства пациентов аденомы распространялись более чем в двух направлениях. На основании данных МРТ все опухоли были разделены на две группы: инвазивные и неинвазивные аденомы. Инвазивные опухоли были выявлены у 63 пациентов. Местные или системные метастазы не были обнаружены ни в одном из наблюдений.

Акромегалия плохо поддавалась лечению, нередко использовались комбинированные методы терапии. 50 пациентов подвергнуты первичному оперативному вмешательству, 24 пациентам проведена повторная операция. Методы лучевой терапии использовались в 12 наблюдениях, из них одному пациенту

проведено два сеанса терапии. 17 пациентов получали лечение атомистами соматостатина, четыре - агонисгами дофамина. Комбинированные методы лечения использовались в 15 наблюдениях. Достижение «безопасного» уровня СТГ (<2,5 нг/мл) и нормального уровня ИРФ-1 отмечено у 8 пациентов (11%); Снижение уровней СТГ и ИРФ-1 более чем на 30% от исходных показателей имели 12 пациентов (15%), 41 пациент имел повышенные уровни СТГ или ИРФ-1.

Учитывая молодой возраст пациентов, включенных в исследование, многие осложнения, характерные для акромегалии, не выявлены. Обнаружено достоверное различие во встречаемости артериальной гипертонии между мужчинами и женщинами. Вероятно, что объясняется тенденцией к более высокой частоте развития сердечно-сосудистых заболеваний у мужчин в популяции.

Нам удалось исследовать 23 образца удаленной ткани гипофиза пациентов с дебютом заболевания до 35 лет. Изолированная секреция СТГ встречалась в 8 случаях, смешанная (СТГ+ПРЛ, СТГ+АКТГ) - в 14 наблюдениях. Достоверных отличий по пату, возрасту дебюта заболевания, уровню секреции гормонов, характеру роста и объема опухши выявлено не было. При окраске на цитокератин САМ5.2 преобладали густограиулированные аденомы (6 из 8 изолированных соматотроиииом и 9 из 14 аденом смешанной секреции).

В ipynne 78 пациентов со спорадическими опухолями обнаружено три изменения в последовательности гена AIP Две мутации являются патогенными (c.47G>A в I экзоне, c.978dupG в 6 экэоне), третья не описана ранее (N/N с.787+9С>Т). Данная интронная мутация обнаружена у молодою пациента с макроаденомой гипофиза с инвазией и а1рессивным ростом опухоли. Он дважды оперирован. Иммуннотистохимически опухать экспрсссировала СТГ и ПРЛ, также отмечена высокая экспрессия фиброзных телец, что является признаком редкофанулированной аденомы гипофиза. Для проверки пато(енности указанною нарушения последовательности проведен эксперимент. Данное изменение (замена нескольких иуклеотилов) находится в 5 нитроне без результатов и сообщений в известных базах данных последовательностей. ')то изменение находится в конце 5 и начале 6 экэона. При патогснности данного изменения продукт 111 IP будет отличным но молекулярной массе от предполагаемого продукта. Для этого собрана кровь пациента в пробирку со специальным реагентом, экстрагирована РНК, синтезирована комплементарная ДНК (то есть только кодиру ющая последовательность без ин гронов и нетранскрибирусмых областей), проведена ПНР и секвенированы продукты реакции (рис. 10).

Рису нок 10.11ЦР и анализ проду ктов секвснировапия пациента.

При анализе продуктов выявлено изменение последовательности, которое в результате вырожденности генетического кода является полиморфизмом аллеля дикого типа. Так. подтверждена непатогенность данного изменения последовательности гена.

Таким образом, данная научная работа послужила платформой для изучения семейных аденом гипофиза в России. Полученные результаты явились основой для выработки алгоритма диагностики больных с семейными аденомами гипофиза, определены группы пациентов, требующие динамического наблюдения. Алгоритм скрининга представлен в приложении I.

Выводы

1) Среди 48 пациентов с семейными аденомами гипофиза из 20 семей у 62% наблюдалась акромегалия. 15% - акрогигантизм, 13% - пролактинома, 2% -соматопродакгинома, 8% • неактивная аденома гипофиза, с одинаковой частотой выявления у мужчин и женщин. Характерной особенностью семейных изолированных аденом, в отличие от спорадических, является ранний дебют заболевания, больший объем опухали. Выявление заболевания у родственников второго поколения происходило раньше, чем у первого.

2) В клинической картине семейных соматотропино.м, проявляющихся акромегалией, отличий в течении заболевания от спорадических случаев акромегалии не выявлено.

3) Среди 48 пациентов с семейными аденомами гипофиза обнаружено два варианта нонсенс-мутации. Среди 78 пациентов с дебютом заболевания до 35 лет выявлено три изменения последовательности гена AIP (одна мутация сдвига рамки считывания, 1 миссенс-мутания, I иитронная мутация).

4) При обследовании родственников в Л/Р-положителыiых семьях у четырех из семи пациентов подтверждено наличие мутации гена AIP и только два случая сопровождались развитием аденом гипофиза.

5) Ни у одного из пациентов с семейными изолированными аденомами гипофиза изменений генон MENI. CDKNIB и PRKARIA выявлено не было.

6) У пациентов с мутациями гена AIP наблюдалось агрессивное течение заболевания и резистентность к проводимому комплексному лечению.

Ирак-тичсские рекомендации

1. Все пациенты с аденомами гипофиза должны быть опрошены на предмет наличия семейной истории. Пациентам с семейными аденомами гипофиза при отсутствии других синдромов, ассоциированных с опухолями (МЭН-1, МЭН-4, Карни-комплекс), показано проведение скрининга мутаций гена AIP

2. Пациентам с аденомами гипофиза с дебютом до 18 лет и пациентам с акромегалией с дебютом заболевания до 35 лет и наличием макроаденомы гипофиза рекомендовано направление на скрининг мутаций гена AIP.

3. ^//'-положительные пробанды должны находиться под диспансерным наблюдением эндокринолога.

Приложение 1,

Пашки: с адсиомол гипофиза СемсАма* история

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дзеранова Л.К., Гиниятуллина Е.Н., Пигарова Е.А., Рожинская Л.Я., Далантаева Н.С. Аутожель в контроле биохимических маркеров активности акромегалии: представление клинического случая // Ожирение и метаболизм. -2010. -№4.-С. 44-47.

2. Далантаева Н.С., Дзеранова Л.К., Пигарова Е.А., Пржиялковская Е.Г., Рожинская Л.Я., Дедов И.И., Корбонитс М. Клинико-генетические аспекты семейных аденом гипофиза и спорадических форм с ранним дебютом заболевания // VI Всероссийский конгресс эндокринологов с международным участием «Современные технологии в эндокринологии» 27-31 мая 2012 г. Сборник тезисов.

3. Alexandraki K.I., Munayem Khan М., Chahal H.S., Dalantaeva N.S., Trivellin G., Berney D.M., Caron P., Popovic V., Pfeifer M., Jordan S., Korbonits M., Grossman A.B. Oncogene-induced senescence in pituitary adenomas and carcinomas // Hormones (Athens). - 2012 Jul-Sep. - 11(3). - PP. 297-307.

4. Далантаева H.C., Пигарова E.A., Дзеранова Л.К., Рожинская Л.Я., Дедов И.И. Новые возможности в лечении и ведении акромегалии // Ожирение и метаболизм. - 2012. - №3. - С. 29-32.

5. F. Martucci, G. Trivellin, Е. Garcia, N. Dalantaeva, P. Chappie, F. P. Giraldi, A. Grossman, M. Korbonits. Can the stability of variant aryl hydrocarbon receptor interacting protein (AIP) be a marker for pathogenicity in FIPA (familial isolated pituitary adenoma)? // Endocrine Abstracts. - 2012. - V. 28. - P. 241.

6. F.Guaraldi, V.Corazzini, G.L.Gallia, S.Grottoli, K.Stals, N.Dalantaeva, L.A.Frohman, M.Korbonits, R.Salvatori. Genetic analysis in a patient presenting with meningioma and familial isolated pituitary adenoma (FIPA) reveals selective involvement of the R81X mutation of the AIP gene in the pathogenesis of the pituitary tumor // Pituitary. - 2012. Dec. - 15 Suppl 1. - S61-7. - doi: 10.1007/sl 1102-012-0391-y.

7. Далантаева H.C., Дедов И.И. Генетические и обменные особенности семейных изолированных аденом гипофиза // Ожирение и метаболизм. - 2013. - №2. - С. 3-10.

8. N. Dalantaeva, L. Dzeranova, Е. Pigarova, М. Korbonits, S.A. Prokofiev, I. Dedov. Gigantism and prolactinoma in an AIP Mutation Positive FIPA Family 11 Congress of the European Neuroendocrine Association, 12-15 September, Vienna, Austria. -Abstract identification number P097.

9. J. Denes, F. Swords, E. Rattenberry, P. Xekouki, A. Kumar, C. Wassif, N. Fersht, S. Baldeweg, D. Morris, S. Lightman, C. J Thompson, A. Agha, A. Rees, M. Druce, J. Grieve, M. Powell, C. L. Boguszewski, C. Higham, J. Davis, C. Preda, J. Trouillas, N. Dalantaeva, A. Ribeiro-Oliveira, P. Dutta, F. Roncaroli, R. V Thakker, M. Stevenson, B. O'Sullivan, P. Taniere, K. Skordilis, P. Gabrovska, A. Barlier, S. Ellard, K. Stals, C. A. Stratakis, A. B. Grossman, E. Maher, M. Korbonits. Pituitary adenoma and phaeochromocytoma/paraganglioma - a novel syndrome with a heterogeneous genetic background // Endocrine Abstracts. - 2013. V. 31. - OC5.8. -doi:10.1530/endoabs.31.0C5.8.

Список основных сокращений

АКТГ - адренокортикотропный гормон

ИРФ-1 - инсулиноподобный ростовой фактор 1 типа

ЛГ - лютеинизирующий гормон

МРТ - магнитно-резонансная томография

МЭН-1 - множественная эндокринная неоплазия 1 типа

МЭН-4 - множественная эндокринная неоплазия 4 типа

СТГ - соматотропный гормон

СТГ/ОГТТ - наименьший уровень СТГ в ходе орального глюкозотолерантного

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

AIP - взаимодействующий белок арилуглеводородного рецептора

ИРА - семейные изолированные аденомы гипофиза

MLPA - мультиплексная амплификация с лигированием.

Подписано в печать: 30.12.13 Тираж: 100 экз. Заказ № 1091 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru