Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Клинико-генетические аспекты болезни Крона

СТЕПАНОВА Елена Владимировна

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БОЛЕЗНИ КРОНА

14.00.05 - Внутренние болезни 03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2009

Работа выполнена в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Лоранская Ирина Дмитриевна доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ольхин Валерий Александрович доктор медицинских наук Зинченко Рена Абульфазовна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится « лв » б'бялЛл. -Л2009 годз в часов

7 У

на заседании Диссертационного Совета Д.208.071.02 в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» (125445, г. Москва, ул. Беломорская, 19)

Автореферат разослан « сС X » 2009г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

Кицак В Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Болезнь Крона (БК) - хроническое воспалительное заболевание кишечника (ВЗК). Эта патология, впервые описанная в 1932г. B.Crohn, L.Ginsburg, G.Oppenheimer под названием «Regional ileitis», упорно не желает раскрывать свои тайны (Г.А.Григорьева, Н.Ю.Мешалкина, 2007г.).

Постоянный интерес к заболеванию обусловлен прежде всего тем, что несмотря на многолетнюю историю изучения до настоящего времени этиология болезни Крона остается неизвестной, а патогенез полностью неясен (И.Л.Халиф, И.Д.Лоранская, 2004г.).

Предрасположенность к болезни Крона определяют внешние средовые и генетические факторы. Большой вклад генетических факторов был проиллюстрирован высоким уровнем конкордантности между монозиготными близнецами в сочетании с семейным риском ВЗК (Hugot и др. 1999г.).

На нескольких хромосомах были идентифицированы гены, определяющие восприимчивость к развитию ВЗК (С. Fiocchi, 2006г., Daly M.J. и др., 2008г.). В 2001 году в трех независимых друг от друга исследованиях (Ogura Y„ Bönen D.K., Inohara N. и др., 2001г., Hugot J.P., Chamaillard М., Zouali Н., 2001г., Натре J., Cuthbert A., Croucher P.J., 2001г.) на длинном плече 16-ой хромосомы в пределах локуса IBD1 идентифицирован NOD2 - ген, который затем Международной комиссией по номенклатуре был переименован в CARD15.

Проведенные в последующие годы зарубежные исследования выявили различную степень влияния полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 на восприимчивость к болезни Крона у населения разных стран, в том числе известны случаи, когда такое влияние вообще отсутствует (Inoue N.. Tamura К., Kinouchi Y. и др., 2002г., Croucher P.J., Mascheretti S., Натре J. и др., 2003г.).

Многочисленными исследованиями установлено, что идентифицированные полиморфные варианты гена NOD2/CARD15 при болезни Крона достоверно ассоциированы с определенными клиническими параметрами болезни.

В связи с этим изучение частых полиморфных вариантов гена Ы002/САШ)15 в их связи с клиническими признаками и особенностями течения заболевания представляет большой интерес.

С другой стороны, дефицит надежных биомаркеров для проведения диагностики и последующего адекватного лечения болезни Крона остается пока главной проблемой для практикующих врачей. Выявление ИОБ2/СА1Ю15 в качестве гена предрасположенности к БК представляет важное исследовательское направление, позволяющее в будущем достичь лучшего понимания патогенеза ВЗК и вопросов диагностики (Р-ВгевБа, 2006г.).

Однако до настоящего времени подобные исследования в России не проводились.

Таким образом, изучение полиморфных вариантов ЫОВ2/СА1Ю15 у пациентов с болезнью Крона, проживающих на территории РФ, является актуальной задачей.

Цель работы: изучить клинические аспекты болезни Крона во взаимосвязи с носительством основных четырех полиморфных вариантов (.Р268Б, Ю02У?, втя и с.3020шС) гена И002/САЕ015.

Задачи исследования:

1. Проанализировать дебют, особенности клинической картины, течения, развитие осложнений и необходимость хирургического лечения в сформированной выборке пациентов с диагностированной болезнью Крона.

2. Изучить четыре частых полиморфных варианта гена ЫСЮ2/СА1Ю15 в выборке пациентов с БК и в группе популяционного контроля.

3. Определить ассоциацию носительства полиморфных вариантов гена Ы002/СА1Ю15 с болезнью Крона, а также риск развития БК в зависимости от количества полиморфных аллелей МСЮ2/СА]Ю15.

4. Оценить взаимосвязь между наличием каждого из изученных полиморфных вариантов, а также их сочетаний с дебютом, локализацией процесса, активностью, течением, другими особенностями клинической картины и осложнениями БК.

5. Определить значение полиморфных вариантов гена АЮ02/САК015 для прогноза течения заболевания, тактики ведения пациентов с БК.

Научная новизна:

1. Исследование генетических аспектов болезни Крона в России ранее не проводилось. Впервые в России определены частоты полиморфных аллелей гена МСЮ2/СА1Ю15 в выборке больных людей и группе популяционного контроля.

2. Установлено, что полиморфные варианты гена М002/САМ)15 достоверно ассоциированы с болезнью Крона у пациентов, проживающих на территории России.

3. Подтверждена связь носительства полиморфных вариантов гена Ы002/САШ)15 с локализацией патологического процесса, характером течения БК у пациентов, проживающих на территории России.

4. Определен риск развития БК, а также риск хирургического вмешательства в зависимости от носительства полиморфных вариантов Ы002/САЯШ5.

Практическая значимость

Полученные в ходе исследования результаты позволяют сопоставить дебют, локализацию, течение и другие клинические особенности БК с носительством основных полиморфных вариантов Ы0П2/САК015, а также прогнозировать риск развития и риск хирургического лечения БК и ее осложнений в зависимости от генотипа больного.

Личный вклад автора

В ходе работы автором лично, на основании осмотра, изучения историй болезни, сформирована уникальная выборка из 122-х пациентов с диагностированной БК, в которой затем при участии автора проведено молекулярно-генетическое типирование. Полученные данные были проанализированы автором лично, произведена их статистическая обработка. Результаты исследования группы больных сравнены с группой контроля и зарубежными данными. Это впервые позволило сопоставить

генотип и фенотип пациентов с болезнью Крона, проживающих на территории Российской Федерации.

Внедрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования используются при обследовании больных, наблюдающихся в ФГУ «Государственный Научный Центр Колопроктологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ» и включены в учебный процесс и практическую деятельность на кафедре гастроэнтерологии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава».

Апробация диссертационной работы состоялась 15 октября 2008г. на межкафедральной научной конфереции кафедры гастроэнтерологии ГОУ ДПО РМАПО Росздрава и кафедры неотложных состояний в клинике внутренних болезней ФППОВ ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова Росздрава. Диссертация рекомендована к защите.

Результаты диссертационного исследования доложены на Двенадцатой Российской Гастроэнтерологической Неделе, 2006г., Москва; симпозиуме «Левитановские чтения», 2007г., Москва, ГНЦ колопроктологии; Второй научно-практической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения В.Х. Василенко «Актуальные проблемы гастроэнтерологии», 2007г., Москва, ММА им. И.М.Сеченова; Европейской конференции по генетике человека, 2006г., Амстердам, Нидерланды (в форме стендового доклада); Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Неделе, 2008г., Москва.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе в рецензируемых журналах ВАК - 4 работы.

Объем и структура работы

Представленная диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста, включает 44 таблицы, 11 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, практических

рекомендаций и библиографического указателя, включающего 27 отечественных и 135 зарубежных источника.

Положения, выносимые на защит)'

1. Полиморфные варианты гена М0Э2/САЯО15 достоверно ассоциированы с болезнью Крона у пациентов, проживающих на территории РФ.

2. Риск развития БК повышается при носительстве двух и более полиморфных аллелей гена М002/САЯ015(преимущественно с.3020тхС 702\У, 908Я, особенно в сочетании друг с другом).

3. Основные полиморфные варианты гена Ы002/СА1Ю15 влияют на клинические аспекты болезни Крона:

- начало БК в молодом возрасте (до 40 лет) ассоциировано с носительством полиморфных вариантов гена ЫСЮ2/СМ015-

- развитие илеита достоверно ассоциировано с носительством полиморфного варианта с.3020твС\.

- колит, аноректальное поражение имеют отрицательную связь с носительством инсерции с.3020шС\

- хроническое непрерывное течение БК достоверно ассоциировано с носительством Я702 У/, с.3020т$С.

4. Риск хирургического лечения БК и ее осложнений повышается при наличии в генотипе пациентов полиморфных вариантов с.3020тС, вШЯ гена тП2/САШУ15.

5. Выявлено отсутствие ассоциации полиморфных вариантов с клинической симптоматикой, тяжестью обострения, осложненными формами, внекишечными проявлениями болезни Крона.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В диссертационной работе изложены результаты исследований 122 пациентов с болезнью Крона. Молекулярно - генетическое исследование проводилось на базе лаборатории ДНК-диагностики ГУ Медико-

генетического научного центра РАМН.1 Группа больных сформирована из пациентов, проходивших лечение, либо наблюдавшихся в ФГУ «Государственный Научный Центр Колопроктологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ» г. Москвы в период с 2000 по 2007г.2 В качестве группы популяционного контроля использовалась ДНК 54-х человек из банка ДНК лаборатории ДНК-диагностики ГУ Медико-генетического научного центра РАМН.

Диагноз БК основывался на данных анамнеза, характерных клинико-лабораторных, рентгенологических, эндоскопических критериях, в большинстве случаев подтверждался результатами морфологического исследования, ультразвукового исследования органов брюшной полости и тонкой, толстой кишок. Локализация воспалительного процесса определялась по классификации, предложенной проф. М.Х.Левитаном и В.Д.Федоровым в 1982г. По ней БК подразделяется на илеит, илеоколит и колит. Форма заболевания определялась согласно Венской классификации от 1998г.: стенозирующая (с образованием стриктур), пенетрирующая (перфоративная), не стенозирующая и не пенетрирующая. Тяжесть течения оценивалась по индексу активности БК-СОА1, называемому индексом Беста, включающему ряд клинических проявлений в течение 7 дней, данные объективного осмотра и показатели гематокрита, оценивающиеся в зависимости от выраженности количеством баллов.

Использовались критерии достоверного диагноза, предложенные ].Ьеппаг(1-]опе$ в 1989г:

1) Поражение от полости рта до анального канала

2) Прерывистый характер поражения

3) Трансмуральный характер поражения: язвы-трещины, абсцессы, свищи

1 Автор выражает особую благодарность ст. науч. сотр. лаборатории ДНК -диагностики ГУ МГНЦ РАМН, к.м.н. Щагиной O.A. за помощь в проведении генетических исследований и неоценимую консультативную помощь.

2 Автор выражает глубокую благодарность и признательность коллективу отделения гастроэнтерологии ФГУ ГНЦ колопроктологии и лично руководителю отделения, к.м.н. Михайловой Т.Л., зам. директора по научно-организационной работе, д.м.н., проф. Халифу И.Л., директору, академику РАМН, д.м.н., проф. Воробьеву Г.И. за поддержку и предоставленную возможность проведения диссертационной работы.

4) Фиброз: стриктуры

5) Лимфоидная ткань (гистология): афтозные язвы или трансмуральные лимфоидные скопления

6) Муцин (гистология): нормальное содержание муцина в зоне активного воспаления слизистой оболочки толстой кишки

7) Гранулемы

Достоверный диагноз БК устанавливался при наличии как минимум 3-х относительных критериев (от 1 до 6), а при выявлении гранулемы -еще одного относительного критерия (от 1 до 6).

Пациентам исследуемой группы после сбора жалоб, анамнеза, физикального обследования, проктологического осмотра с пальцевым исследованием per rectum проводились клинические анализы крови, мочи, биохимический анализ крови, коагулограмма, исследование кала. Колоноскопия с осмотром терминального отдела подвздошной кишки (при левостороннем колите - сигмоскопия, ректороманоскопия) и биопсия выполнялись по общепринятым методикам. ЭГДС проводилась с целью исключения поражения верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Используемая эндоскопическая техника: фиброгастроскопы «Olympus» GIF-30, фиброколоноскопы японской фирмы «Olympus» PCF-20. Рентгенологическое исследование (обзорное исследование брюшной полости, ирригоскопия, рентгенография пищевода, желудка и тонкой кишки), ультразвуковое исследование тонкой и толстой кишок, печени, желчного пузыря, почек (с использованием аппарата «Vivid pro 7» General Electric с датчиком 3,5 МГц по общепринятой методике) выполнялись всем пациентам на разных стадиях заболевания.

В группе из 122-х пациентов с диагностированной болезнью Крона проведено молекулярно-генетическое исследование образцов ДНК, выделенных из цельной крови (забор которой производился с информированного согласия больного) и парафиновых блоков (биоптаты слизистой оболочки толстой кишки и операционный материал) на наличие полиморфных аллелей 268S, 702W, 908R и c.3020insC гена NOD2/CARD15. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови, биоптатов проводили с помощью набора реактивов для выделения DIAtom™ DNAPreplOO по протоколу фирмы-производителя. Следующим

этапом проведения ДНК- диагностики была ПЦР фрагментов изучаемого гена с анализом полиморфизма длины амплифицированных/рестри-кционных фрагментов (ПДАФ/ПДРФ-анализ). ПДАФ-анализ выполнялся для идентификации полиморфного варианта c.3020insC. ПДРФ-анализ использовался для идентификации полиморфных вариантов P268S, R702W, G908R гена NOD2/CARD15. Для оценки результатов амплификации, рестрикции проводили электрофорез с использовнием полиакриламидного геля. Результаты исследования регистрировались на гель-документирующей системе GelDoc® 2000.

Статистическая обработка данных производились с помощью пакета прикладных программ «Statistics for Windows» v/6/0, StatSoft Inc. (США). Построение диаграмм осуществлено при помощи программы «Microsoft Excel». Для расчета статистической значимости различия между группами использовались следующие критерии: параметрические критерий £ по Пирсону или точный критерий Фишера (в случае малой численности выборки), а также f-критерий Стьюдента и непараметрический ¿/-критерий Манна-Уитни (для количественных признаков). При вычислении статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95%-й уровень значимости).

Оценка относительного риска (ОР) рассчитывалась по методу Вульфа (Woolf). 95%-й доверительный интервал (ДИ, 95% С1) вычислялся по формуле Mantel-Haenfzel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В составе группы их 122-х человек было 59 мужчин (48%), 63 женщины (52%) в возрасте от 16 до 78 лет (средний возраст - 39 лет). Диапазон длительности заболевания был от 1 года до 56 лет.

Дебютировала БК у большинства пациентов (90 человек, что составило 74% от общего числа больных) в возрасте от 10 до 40 лет.

Илеит диагностирован у 36 больных (что составило 30%), илеоколит - у 33 (27%), колит - у 53 (43%) больных.

В клинике активной стадии БК преобладали диарея и боль в животе, причем при илеите основным клиническим проявлением в 72% случаев (у 26 больных из 36) была боль в животе, при колите - диарея у

62% (33 из 53 пациентов), при илеоколите - боль в животе и диарея (в 66% - у 22 больных и 57,5% случаев - у 19 больных соответственно).

Согласно индексу активности БК (выше 450 баллов) высокая активность воспаления и тяжелое течение наблюдались у 13 (10,5%) пациентов исследуемой группы. У наибольшего числа - 66 (54%) больных индекс активности БК составлял от 301 до 450 баллов, что соответствовало умеренно выраженной активности воспаления и среднетяжелой форме БК. Легкая форма БК и индекс активности БК 150300 баллов - у 24 (20%) пациентов. Неактивный процесс и клиническая ремиссия БК на момент исследования (индекс активности БК менее 150 баллов) диагностированы у 19 (15,5%) пациентов группы.

Аноректальные проявления (свищи, стриктуры аноректальной области, парапроктиты, анальные язвы-трещины) диагностированы у 50 (41% от общего количества) пациентов с БК. Достоверно чаще (р<0,05) аноректальное поражение выявлялось при колите (у 33 больных, что составило 66% от числа больных с аноректальными проявлениями) по сравнению с другими формами локализации БК.

Внекишечные проявления выявлены у 45 пациентов (37% от общего числа больных). Встречались при всех локализациях БК, чаще при колите (у 24 больных, что составило 53,5% от общего числа больных с внекишечными проявлениями).

Стриктуры, пенетрации, сочетание стриктур и пенетраций имели 90 пациентов из 122, что составило 74%. Стенозирующая форма БК диагностирована у 14 больных (11,5% от общего числа пациентов с БК), пенетрирующая - у 47 больных (38,5%), сочетание стриктур и пенетраций - у 29 пациентов (24%), не стенозирующая и не пенетрирующая форма - у 32 больных (26%). Осложнения выявлялись при всех формах локализации БК, пенетрирующая форма БК преобладала при илеите (у 44,5% больных с илеитом).

На момент настоящего исследования у 25 (20,5%) пациентов впервые была диагностирована БК, поэтому характер течения заболевания у этих больных возможно только предположить. Хроническое непрерывное течение заболевания было у 60 (49,2%) больных, хроническое рецидивирующее течение - у 37 (30,3%) пациентов.

Хирургическое лечение было проведено 72 (59%) пациентам исследуемой группы, из них неоднократно оперированы 42 пациента; 51% (37 пациентов) имели анамнез БК свыше 10 лет. Чаще нуждались в хирургическом лечении БК и ее осложнений больные с илеитом (61% от общего числа пациентов с этой формой локализации) и 60% пациентов с колитом.

В исследуемой группе полиморфные варианты И002/САЕ015 имели 84 пациента из 122, что составило 69%. Полиморфный вариант Р268Б (замена пролина на серин в 268 положении аминокислотной последовательности или с.907С>Т - замена нуклеотида С на Г в положении 907 нуклеотидной последовательности) обнаружен у 59 из 122 больных (48%). Выявлены статистически значимые отличия в частотах аллелей между исследуемой и контрольной группами (35% и 22% соответственно, р<0,05), что свидетельствует об ассоциации данной аминокислотной замены с БК. У большинства пациентов (у 37 из 59, имеющих данный полиморфный вариант) аллель 2685 встречался в сочетании с другими полиморфными аллелями.

Полиморфный вариант /?7021У (замена аргинина в 702 положении на триптофан или с.2209С>Т - замена нуклеотида С на Т в положении 2209) обнаружен у 32 (26%) больных. Необходимо отметить, что аллель 702№ в гомозиготном состоянии встречался лишь у больных. Выявлены статистически значимые отличия в частотах аллелей между исследуемой и контрольной выборками (14% и 0,9%, р<0,05).

Полиморфный вариант с.3020тС (вставка С нуклеотида в положении 3020, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона или р.1007/5 - сдвиг рамки считывания белка с 1007 аминокислоты) выявлен у 41 пациента с БК (34%). Необходимо отметить, что в гомозиготном состоянии с.3020шС встречалась только в группе больных. Выявлены статистически значимые отличия в частотах аллелей между исследуемой и контрольной выборками (26% и 3,7% соответственно, р<0,05).

Полиморфный вариант С908Я (замена глицина в 908 положении на аргинин или с.2827С>С - замена нуклеотида б на С в положении 2827)

встретился только у 6 (5%) больных в гетерозиготном состоянии. Отличия в частотах аллелей между исследуемой и контрольной группами статистически незначимы (2,5% и 0, р>0,05) (рисунок 1, таблица 1).

Рис. 1. Аллельная частота в группе больных и контрольной группе 1 - больные; 2 - контрольная группа

Таблица 1

Частота встречаемости полиморфных аллелей М}/52/СА/?£>75 у пациентов

с болезнью Крона

Полиморфные аллели

2655 7024/ с.тзЖОС 90811

Боль- Конт- Боль- Конт- Боль- <онт- Боль- Конт-

ные роль ные роль ные роль ные роль

п=122 п=54 п=122 п=54 п=122 п=54 п=122 п=54

ВСЕГО 59 (48%) 22 (41%) 32 (26%) 1 (2%) 41 (34%) 4 (7%) 6 (5%) 0

Гомозиготы я 1 ч 26 2 3 0 22 0 0 0

Гетерозиготы ¡2 33 20 29 1 19 4 6 0

Аллельная частота, % 35 22 14 0,9 26 3,7 2,5 0

р=0,02 р=0,00015 р=10"7 р=0,18

(*) - выделены достоверно значимые различия

Таким образом, выявлены статистически значимые различия в частотах аллелей 268Б, 702У/, с.3020т$С в группе больных и контрольной группе, что свидетельствует об ассоциации этих полиморфных вариантов с БК. Возможно, что при расширении численности групп различия в частоте встречаемости 0908Н были бы статистически значимы. Кроме того, отсутствие этого полиморфного варианта в группе популяционного контроля позволяет предположить его существенное влияние на развитие БК.

Производился расчет относительного риска развития БК в зависимости от носительства полиморфных вариантов гена М002/САМ)15. Риск индивидуума заболеть БК при наличии в генотипе вставки с.30201тС возрастает в 4,5 раза, при наличии Я702\¥ - в 14 раз, полиморфный вариант 09082? увеличивает риск БК в 6 раз, а полиморфный вариант Р268Б незначительно влияет на риск возникновения БК (ОР=1,2).

Один предрасполагающий к заболеванию полиморфный аллель гена Ы002/САЯ015 выявлен у 24 (20%) пациентов, два полиморфных аллеля - у 28 (23%) больных, по три аллеля - у 21 пациента (17%), у 7 больных (6%) обнаружено по 4 аллеля, а у четверых пациентов (3%) выявлено пять изменений последовательности гена, тогда как ни у кого из группы контроля не выявлено более двух полиморфных аллелей Ы002/СА1Ю15 в генотипе.

Согласно рассчитанному ¿/-критерию Манна-Уитни и f-кpитepию Стьюдента (р=0,00001), критерию Фишера (р=0,0003), получены статистически значимые различия по количеству полиморфных аллелей в группе больных и группе контроля в пользу преобладания количества в группе больных БК. Следовательно, количество предрасполагающих к заболеванию аллелей является важным фактором при оценке риска БК.

Проведено сравнение наличия полиморфных аллелей гена Ы002/САЯБ15 в группе больных и контрольной группе с оценкой относительного риска развития БК (таблица 2).

Таблица 2

Количество полиморфных аллелей гена АЮВ2/СА1Ю15 и относительный

риск развития болезни Крона

Количество полиморфных аллелей в генотипе п Больные п % Контроль п % Р ОР ДИ

0 38 31,1 32 59,3 0,0003* 0,53 0,3-0,9

1 24 19,7 15 27,7 0,13 0,71 0,3-1,24

2 28 23 7 13 0,05 1,77 0,8-3,8

3 и более 32 26 0 0 0,0001 .38 2 -86,5

(*) - выделены достоверно значимые различия

Относительный риск развития БК достоверно повышается при наличии в генотипе двух и более полиморфных аллелей И002/СА1Ю15. Два полиморфных аллеля повышают риск БК в 1,8 раза, а при носительстве трех и более полиморфных аллелей риск максимален, возрастает в 38 раз.

Из вышеизложенного можно сделать вывод, что риск развития БК ассоциирован с носительством полиморфных вариантов с.ЗОЮшС, В.702У} и С908Я гена Ы002/САЯ015, особенно в сочетании друг с другом или с другими полиморфными вариантами.

У большинства пациентов с БК - 90 больных (что составило 74% от общей выборки) заболевание дебютировало в возрасте от 10 до 40 лет, из них 62 пациента имели полиморфные варианты ЫОБ2/СА1Ю15 в генотипе. Таким образом, у большинства носителей полиморфных вариантов АЮБ2/СА]Ю15 (74% от общего числа пациентов с ПВ) заболевание развилось в молодом возрасте. Несмотря на отсутствие статистически значимой связи с.3020шС, Р268Б, R702W, 090811 с возрастом пациента к моменту начала заболевания (р>0,05), необходимо отметить, что у больных с возрастом дебюта БК от 10 до 40 лет наиболее часто выявлялся полиморфный вариант с.3020шС (у трети больных).

При анализе клинической симптоматики активной стадии БК среди пациентов с полиморфными вариантами и без таковых отмечено, что абдоминальные боли, нарушения стула, лихорадка, похудание, боли в заднем проходе, а также выявленные по лабораторным данным анемия, гипопротеинемия, лейкоцитоз и ускорение СОЭ встречаются как среди пациентов с полиморфными вариантами ЫСЮ2/САЮЭ15, так и без таковых. Статистически значимой связи (¿»0,05) клинической симптоматики БК и носительства полиморфных вариантов выявлено не было. Однако такие ведущие симптомы БК как боли в животе, диарея, анемия, похудание, лихорадка в большинстве случаев связаны с носительством с.5020ш«С и Р2688, часто в сочетании друг с другом (у трети больных).

Полиморфные варианты ^VOD2/CAi?D^5 имели 27 из 36 (75%) пациентов с илеитом, 30 из 53 (57%) пациентов с колитом, 27 из 33 (81%) больных илеоколитом. Проведен анализ зависимости локализации

воспалительного процесса от носительства полиморфных вариантов Ы002/СА1Ю15 (для этого сравнивались две группы больных с наличием полиморфных вариантов и без таковых), результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Анализ зависимости локализации воспалительного процесса от

носительства полиморфных вариантов N002/САЯО!5 при болезни Крона

Локализация БК Полиморфные варианты

\3020insC п=41 Без ПВ 1=81 Р ?702Ч/ п=32 Без ПВ 1=90 Р 908Я п=6 Без ПВ 1=116 Р п=58 Без ПВ 1=64 Р

Илеит п=36 19 17 ;0,05 8 28 >0,05 1 35 >0,05 20 16 >0,05

Колит п=53 8 45 :0,05 17 36 >0,05 4 49 >0,05 21 32 >0,05

Илеоколит п=33 14 19 >0,05 7 26 >0,05 1 32 >0,05 17 16 >0,05

Проанализировав данные представленной таблицы, можно сделать вывод, что для развития илеита статистически более значим (¿>=0,0037) полиморфный вариант с.3020шС. Развитие колита имеет статистически значимую (р=0,0002) отрицательную корреляцию с носительством полиморфного варианта с.3020иг.чС.

Выяснялась зависимость локализации патологического процесса от количества полиморфных аллелей в генотипе больных. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4

Зависимость локализации патологического процесса при болезни

Крона от количества полиморфных аллелей 1ЮР2/САИР15 в генотипе

Локализация БК Количество больных

0ПА п=38 п % 1 ПА п=24 п % 2 ПА п=28 п % 3 и более ПА п=32 п %

Илеит п=3б 9 24 4 17 13 46 10 31

Колит п=53 23 60,5 7 29 10 36 13 41

Илеоколит п=33 6 16 13 54 5 18 9 28

При статистической обработке данных таблицы выявлено, что илеит достоверно чаще встречается у носителей двух и более

полиморфных аллелей гена ЫОВ2/САИО]5, что в совокупности с вышеизложенным означает ассоциацию илеита с с.ЗОЮшС в гомозиготном состоянии или сочетания с.3020шС в гетерозиготном состоянии с другими аллелями. Количество полиморфных аллелей в генотипе пациента не оказывает значимого влияния на развитие колита и илеоколита. Так, колит достоверно чаще развивается у пациентов, не являющихся носителями полиморфных аллелей гена Ы002/САЯ015, а илеоколит - у носителей одного полиморфного аллеля.

Проанализирована активность БК у пациентов с полиморфными вариантами К002/САК015 и без таковых (таблица 5).

Таблица 5

Активность болезни Крона у пациентов с полиморфными вариантами И002/САК015 и без таковых

Актив-ность БК пв

\3020insC 0=41 ЗезПВ п=81 Р Я702У/ п=32 Без пв п=90 Р 908Я п=6 >ез ПА п=116 Р Р2№ п=58 Без пв п=64 Р

Ремиссия (ИБ<150) п=19 10 9 >0,05 10 9 <0,05 1 18 >0,05 11 8 ■0,05

Легкая форма (ИБ 150-300) п=24 8 16 >0,05 4 20 >0,05 2 22 ' >0,05 9 15 •0,05

Ср. тяж. (ИБ 301-450) п=66 17 49 >0,05 14 52 >0,05 2 64 >0,05 32 34 ■0,05

Тяж. (ИБ>450) п=13 6 7 >0,05 4 9 >0,05 1 12 >0,05 7 6 •0,05

Статистический анализ данных, приведенных в таблице, показал, что различия между частотой встречаемости полиморфных вариантов при различных формах БК не являются достоверно значимыми (р>0,05), за исключением полиморфного варианта Я702У/, который достоверно чаще выявляется у пациентов с ремиссией БК. Таким образом, на активность (тяжесть обострения) БК не оказывает влияние носительство полиморфных вариантов И002/СА1Ю15.

Из 45 больных с внекишечными проявлениями у 28 выявлен хотя бы один полиморфный аллель, что составило 62%. Из-за малых групп пациентов с различными внекишечными проявлениями четкую

ассоциацию того или иного полиморфного варианта с определенным внекишечным проявлением установить не представляется возможным.

Выяснялась связь наличия внекишечных проявлений БК и носительства полиморфных вариантов NOD2/CARD15 (для этого сравнивались 2 группы больных с наличием внекишечных проявлений и без таковых проявлений). Результаты анализа представлены в таблице 6.

Таблица 6

Внекишечные проявления болезни Крона и наличие в генотипе пациента _ полиморфных вариантов ЫОР2/СА1Ю15_

Полиморфный вариант Больные с внекишечными проявлениями БК п=45 п % Больные без внекишечных проявлений БК п=77 п % Р

с.3020тзС 16 36 25 32,5 0,703

117024/ 14 31 18 23 0,613

908Я 1 2 5 6,5 0,930

Р2688 22 49 37 48 0,256

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии статистически значимой связи между внекишечными проявлениями БК и носительством полиморфных вариантов Р2683, С908Я, с.3020т$С и В.702У/ гена И002/СА1Ю15.

Однако было решено проанализировать связь наиболее часто встречаемых внекишечных проявлений (ЖКБ, МКБ, артриты и/или артралгии) с каждым из полиморфных вариантов ЫСЮ2/СА1Ю15. Выявлено, что на развитие такого внекишечного проявления как ЖКБ достоверно (р<0,05) оказывает влияние носительство полиморфного варианта с.3020шС.

Тридцать два пациента из 50 (64%) с аноректальным поражением имели полиморфные аллели Ы002/САШ)15. При сравнении группы пациентов, имеющей аноректальное поражение, и группы без таковых выявлена статистически значимая (р<0,05) зависимость между отсутствием аноректальных проявлений и носительством полиморфного варианта с.3020шС (таблица 7).

Таблица 7

Аноректальные проявления болезни Крона и наличие в генотипе пациента полиморфных вариантов МОР2/САЯР15___

Полиморфный вариант Больные с аноректаль-ными проявлениями п=50 п % Больные без аноректальных проявлений п=72 п % Р ОР ДИ

с.3020т$С 11 22 30 42 0,024

К702У/ 12 24 20 28 0,644 0,69 0,49-

908Я 3 6 3 4 0,648 0,97

Р268Б 23 46 36 50 0,667

Таким образом, носительство с.3020шС оказывает значимое отрицательное влияние на развитие аноректальных проявлений БК. Риск развития аноректальных проявлений у носителей полиморфных вариантов М002/САЯ015 низок (ОР<1).

Проведен анализ частоты выявления полиморфных вариантов среди больных с различными формами БК (согласно Венской классификации 1998г) (таблица 8).

Таблица 8

Форма болезни Крона и носительство полиморфных вариантов

N002/0АКБ 15

Стенозирующая, пенет- Не стенозирующая и не

Полиморфный рирующая формы, их сочетание пенетрирующая форма

вариант п=90 п=32 У

п % п %

с.3020ииС 34 38 7 22 0,104

Ю02\У 26 29 6 19 0,266

908Я 5 6 1 3 0,589

Р268Б 43 48 16 50 0,83

По результатам, представленным в таблице, достоверно значимых различий между частотой встречаемости полиморфных вариантов Р2655, С908Я, с.3020т$С и В.702№ среди пациентов с осложненными формами БК (стриктуры, пенетрации, их сочетание) и не стенозирующей, не пенетрирующей формой не выявлено. Однако необходимо отметить, что в группе больных со стриктурами, пенетрациями с.3020'шС выявлялась почти в 2 раза чаще, чем в группе с не стенозирующей, не пенетрирующей формой, а полиморфный аллель 908Я встречался преимущественно у больных с осложнениями.

Несмотря на отсутствие статистически значимой связи носительства основных полиморфных вариантов гена Ы0и2/САК015 с осложненными формами БК, наблюдается тенднеция к повышению риска развития осложнений (ОР =1,2) при выявлении полиморфных аллелей гена.

Проведен анализ зависимости характера течения БК от носительства основных полиморфных вариантов И002/СА1Ю15, результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9

Носительство полиморфных вариантов ЫСЮ2/САШ)15 среди больных с

разными формами течения болезни Крона

Полиморфный вариант Хроническое непрерывное течение п=60 Хроническое рецидивирующее течение п=37 Р

п % п %

с.ЗОЮтхС 26 43 7 19 0,016

ЮШ 22 37 6 16 0,039

908Я 5 8 1 2,7 0,402

Р268Б 30 50 18 48 0,92

Примечание: 25 пациентов с впервые диагностированной болезнью Крона

Статистический анализ данных, представленных в таблице, позволяет сделать вывод, что непрерывное течение БК по сравнению с рецидивирующим течением достоверно чаще встречается у носителей полиморфных вариантов с.3020тС и И702V/ гена М002/СА1Ю15.

Проведен анализ зависимости характера течения БК от количества полиморфных аллелей в генотипе больного. Так, один полиморфный аллель имелся у 13 пациентов с непрерывным течением и у 9 пациентов с рецидивирующим течением; два и более полиморфных аллеля имели 35 пациентов с непрерывным течением и 13 - с рецидивирующим. При статистической обработке данных сравнения групп пациентов с непрерывным и рецидивирующим течением БК выявлена статистически значимая (р<0,05) зависимость между носительством 2-х и более полиморфных аллелей Ы002/САЯ015 и непрерывным течением БК. Таким образом, хроническое непрерывное течение БК ассоциировано с носительством с.3020шяС, Я702\У, особенно в гомозиготном состоянии

или в компаунд-гетерозиготном состоянии (в сочетании друг с другом или с другими полиморфными вариантами).

Проведен анализ встречаемости полиморфных вариантов в группе пациентов, перенесших оперативное вмешательство, и в группе пациентов без него (таблица 10).

Таблица 10

Носительство полиморфных вариантов гена ЫСЮ2/САЛ015 среди

больных, перенесших оперативное вмешательство и без него

Полиморфный вариант Перенесли хирургическое вмешательство п=72 Без хирургического вмешательства п=50 Р ОР ДИ

п % п %

c.3020insC 29 40 12 24 0,062 1,7 0,95-2,96

R702W 20 28 12 24 0,644 - -

908R 6 8 0 0 0,07 9,9 1,23-49,5

P268S 36 50 23 46 0,667 - -

Статистический анализ данных таблицы показал, что различия в носительстве полиморфных вариантов в группе больных, перенесших оперативное вмешательство, и без него, значимы для носителей аллеля 908 и c.3020insC. Полиморфный аллель 908R встречался исключительно у пациентов, перенесших хирургическое лечение. Необходимо отметить, что c.3020insC выявлялась в большом проценте случаев, у 40% оперированных больных. Судя по статистической связи c.3020insC и 908R с необходимостью оперативного вмешательства (р=0,06 и 0,07 соответственно), можно высказаться, что вероятнее всего при увеличении группы пациентов связь этих полиморфных вариантов с риском хирургического лечения БК будет достоверна. Относительный риск хирургического вмешательства при наличии у пациентов полиморфного варианта гена NOD2/CARD15 c.3020insC составил 1,7, а при носительстве 908R - 9,9 . Таким образом, у носителей полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 G908R, c.3020insC можно прогнозировать повышенный риск хирургического лечения БК и ее осложнений.

ВЫВОДЫ

1. Для пациентов с болезнью Крона, проживающих на территории РФ, характерно: начало болезни Крона в молодом возрасте (до 40 лет) у большинства (74%) больных, ассоциированное с носительством полиморфных вариантов гена ЫОВ2/СА1Ю15\ преобладание колита у 43% больных (с аноректальными проявлениями) над другими формами локализации, среднетяжелой формы БК (у 54% больных); высокая частота развития осложнений (у 74% больных).

2. Полиморфные варианты гена ЫСЮ2/САШ)15 достоверно ассоциированы с БК: аллели 2685, 702IV, с.3020шС гена встречались достоверно чаще (р=0,02; 0,00015 и 10*7 соответственно) у больных с болезнью Крона по сравнению с группой популяционного контроля.

3. Наличие одного полиморфного аллеля гена АГСЮ2/СА1Ю15 в генотипе не оказывает значительного влияния на риск развития БК, а двух полиморфных алелей повышает риск болезни Крона в два раза. Носительство трех и более полиморфных аллелей гена 1Юй2/САК015 увеличивает риск развития БК в 38 раз.

4. Развитие илеита при болезни Крона ассоциировано с выявлением инсерции с.3020т$С в гомозиготном состоянии или сочетания с.3020шС в гетерозиготном состоянии с другими полиморфными вариантами. Аноректальные проявления, развитие колита имеют отрицательную корреляцию с носительством полиморфного варианта с.3020тзС.

5. Хроническое непрерывное течение болезни Крона в отличие от рецидивирующего достоверно ассоциировано с носительством полиморфных вариантов Я702Ш, с.3020шС в гомозиготном состоянии или сочетания их гетерозиготного состояния с другими полиморфными вариантами.

6. С носительством полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 (преимущественно c.3020insC, G908R) ассоциирован повышенный риск хирургического лечения болезни Крона и ее осложнений.

7. Исследование основных полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 необходимо для определения прогноза течения заболевания и тактики лечения пациентов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациентам с болезнью Крона целесообразно исследовать основные полиморфные варианты NOD2/CARD15 (R702W, c.3020insC, G908R), что позволит прогнозировать особенности дальнейшего течения заболевания (хронический непрерывный характер течения заболевания в случае выявления c.3020insC и/или R702W, илеит при наличии c.3020insC, повышенный риск оперативного вмешательства при выявлении c.3020insC и/или G908R).

2. Изучение полиморфных вариантов NOD2/CARD15 у родственников пациентов с болезнью Крона позволит определить риск развития заболевания, возраст его дебюта и локализацию патологического процесса.

3. Исследовать основные полиморфные варианты NOD2/CARD15 целесообразно с целью дифференциальной диагностики БК с язвенным колитом, недифференцируемым неспецифическим колитом.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ:

1.Лоранская И.Д., Степанова Е.В., Халиф И.Л., Михайлова Т.Л., Щагина O.A., Поляков A.B. Полиморфизм гена NOD2/CARD15 у российских пациентов с БК // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -2006.-T.XVI.-№5. -Приложение №28

«Материалы Двенадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели, 16-18 октября 2006г., Москва». - С.55.

2. Лоранская И.Д., Степанова Е.В., Халиф И.Л., Михайлова Т.Л., Поляков А.В. Клинико-генетическая ассоциация БК и полиморфизмов гена NOD2/CARD15 // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.-2007.-Приложение №1 «Материалы VII съезда Научного общества гастроэнтерологов России, посвященного 40-летию Всесоюзного НИИ гастроэнтерологии-Центрального . НИИ гастроэнтерологии. Москва, 20-23 марта 2007г.» .-М.: Анахарсис.-2007.-С.297-298.

3. E.V. Stepanova, О.А. Schagina, I.D. Loranskaya, A.V. Polyakov NOD2/CARD15 nonsynonymic single nucleotide polymorphisms in Russian patients with Crohn's disease // Journal of Human Genetics. - 2006. - V.14. -suppl.l. - "European Human Genetics Conference 2006, May 6-9, 2006, Amsterdam, The Netherlands. Abstracts". - P.267 (P0773).

4. E.V. Stepanova, O.A. Schagina, I.D. Loranskaya, A.V. Polyakov NOD2/CARD15 mutation analysis and genotype-phenotype correlation in Russian patients with Crohn's disease // European Journal of Human Genetics. - 2007. - V.15. - suppl.l. - "European Human Genetics Conference 2007, June 16-19,2007, Nice, France. Abstracts". - P.267 (P1052).

5. Лоранская И.Д., Степанова E.B., Поляков A.B. Болезнь Крона и полиморфизм NOD2/CARD15 II Успехи теоретической и клинической медицины: Материалы научных исследований Российской медицинской академии последипломного образования.-М.: РМАПО.-2007.-вып.7.-Т.1.-С.46-50.

6. Лоранская И.Д., Степанова Е.В., Халиф И.Л., Михайлова Т.Л., Щагина О.А., Кадникова В.А., Поляков А.В. Клинико-генетическая ассоциация болезни Крона и полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 И Медицинская генетика-2008.- №9 (75). - С.40-44.

7. Шумилов П.В., Малахинова H.A., Сапрыкина Е.А., Цимбалова Е.Г., Степанова Е.В., Щагина O.A., Поляков A.B., Потапов A.C. Особенности генотипа при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2008.-Т. XVIII.-№5.-Приложение №32 «Материалы Четырнадцатой Российской Гастроэнтерологической Недели, 6-8 октября 2008г., Москва»,- С.65.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БК болезнь Крона

ВЗК воспалительные заболевания кишечника

ДИ доверительный интервал ДНК (DNA) дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖКБ желчнокаменная болезнь

МКБ мочекаменная болезнь

ОР относительный риск

ПА полиморфный аллель

ПВ полиморфный вариант

ПДАФ полиморфизм длин амплифицированных фрагментов

ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР полимеразная цепная реакция

СОЭ скорость оседания эритроцитов

СРБ С-реактивный белок

CARD CAspase Recruitment Domain - домен активации каспазы

ВЗК (IBD) воспалительные заболевания кишечника

LRR Leucine Rich Repeat - богатый лейцином повтор

N0D2 Nucleotide Oligomerisation Domain 2 - нуклеотид-связывающий домен

NBD Nucleotide Binding Domain - нуклеотидсвязывающий домен

NFkB ядерный фактор каппа-В

УЗИ ультразвуковое исследование

ЭГДС эзофагогастродуоденоскопия

Заказ №571. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Актуальность темы

Болезнь Крона (БК) - хроническое воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) - одно из самых загадочных заболеваний. Эта патология, впервые описанная в 1932г. B.Crohn, L.Ginsburg, G.Oppenheimer под названием «Regional ileitis», упорно не желает раскрывать свои тайны (Г.А.Григорьева, Н.Ю.Мешалкина, 2007г.).

Постоянный интерес к заболеванию обусловлен прежде всего тем, что несмотря на многолетнюю историю изучения до настоящего времени этиология БК остается неизвестной, а патогенез полностью неясен (И.Л.Халиф, И.Д.Лоранская, 2004г.).

Предрасположенность к БК определяют внешние средовые и генетические факторы. Большой вклад генетических факторов был проиллюстрирован высоким уровнем конкордантности между монозиготными близнецами в сочетании с семейным риском ВЗК (Hugot и др. 1999г.).

На нескольких хромосомах были идентифицированы гены, определяющие восприимчивость к развитию ВЗК. Полагают, что определяющее значение в формировании высокой чувствительности к развитию ВЗК в настоящее время имеют более 30 локусов на хромосомах 1, 5,6,7,9, 10, 12, 14, 16 и 19(DalyM.J. и др., 2008г., Barrett J.C. и др., 2008г.).

В 2001 году в трех независимых друг от друга исследованиях идентифицирован NOD2 - ген, который затем Международной комиссией по номенклатуре был переименован в CARD15. Он кодирует внутриклеточный протеин в моноцитах, макрофагах, клетках Панета, интестинальных эпителиальных клетках, характеризующийся выраженной способностью к связыванию бактериальных липополисахаридов своим богатым лейцином (LRR) доменом. В норме связывание липополисахаридов бактериальной стенки с NOD2/CARD15 сопровождается активацией ядерного фактора NFkB который присутствует в цитоплазме нейтрофилов и мононуклеарных клеток, является фактором, стимулирующим и контролирующим синтез противовоспалительных цитокинов) (InoharaN., Ogura Y., Fontalba A., 2003).

Идентифицированные полиморфные варианты NOD2/CARD15 могут модифицировать структуру LRR домена или смежной области белка и вызывать измененный ответ на бактериальный агент (Girardin S.E., Boneca I.G., Viala J., 2003г).

Проведенные в последующие годы зарубежные исследования выявили различную степень влияния полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 на восприимчивость к болезни Крона у населения разных стран, в том числе известны случаи, когда такое влияние вообще отсутствует (Inoue N., TamuraK., Kinouchi Y. и др., 2002г., Croucher P.J., Mascheretti S., Натре J. и др., 2003г.).

Многочисленными исследованиями установлено, что идентифицированные полиморфные варианты гена NOD2/CARD15 при болезни Крона достоверно ассоциированы с определенными клиническими параметрами болезни.

В связи с этим изучение частых полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 в их связи с клиническими признаками и особенностями течения заболевания представляет большой интерес.

С другой стороны, дефицит надежных биомаркеров для проведения диагностики и последующего адекватного лечения болезни Крона остается пока главной проблемой для практикующих врачей. Выявление NOD2/CARD15 в качестве гена предрасположенности к БК представляет важное исследовательское направление, позволяющее в будущем достичь лучшего понимания патогенеза ВЗК и вопросов диагностики ( Bressa F., 2006г.).

Однако до настоящего времени подобные исследования в России не проводились.

Таким образом, изучение полиморфных вариантов NOD2/CARD15 у пациентов с болезнью Крона, проживающих на территории РФ, является актуальной задачей.

Цель работы: изучить клинические аспекты болезни Крона во взаимосвязи с носительством основных четырех полиморфых вариантов (P268S, R702W, G908R и c.3020insQ гена NOD2/CARD15.

Задачи исследования

1. Проанализировать дебют, особенности клинической картины, течения, развития осложнений и необходимость хирургического лечения в сформированной выборке пациентов с диагностированной болезнью Крона.

2. Изучить четыре частых полиморфных варианта гена NOD2/CARD15 в выборке пациентов БК и в контрольной группе.

3. Определить ассоциацию носительства полиморфных аллелей гена NOD2/CARD15 с болезнью Крона, а также риск развития, дебют БК в зависимости от количества полиморфных аллелей NOD2/CARD15.

4. Оценить взаимосвязь между наличием каждого из изученных полиморфных вариантов, а также их сочетаний, с локализацией процесса, активностью, течением, другими особенностями клинической картины и осложнениями БК.

5. Определить значение полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 для прогноза течения заболевания, тактики ведения пациентов с БК.

Научная новизна

1. Исследование генетических аспектов болезни Крона в России ранее не проводилось. Впервые в России определены частоты полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 в выборке больных людей и группе популяционного контроля.

2. Установлено, что полиморфные варианты гена NOD2/CARD15 достоверно ассоциированы с болезнью Крона у пациентов, проживающих на территории России.

3. Подтверждена связь носительства полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 с локализацией патологического процесса, характером течения БК у пациентов, проживающих на территории России.

4. Определен риск развития БК, а также риск хирургического вмешательства в зависимости от носительства полиморфных вариантов NOD2/CARD15.

Работа частично поддержана грантом Президента РФ по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации НШ 5736.2006.7

Практическая значимость

Полученные в ходе исследования результаты позволяют сопоставить дебют, локализацию, течение и другие клинические особенности болезни Крона с носительством основных четырех полиморфных вариантов NOD2/CARD15, а также прогнозировать риск развития БК и необходимость хирургического вмешательства БК и ее осложнений в зависимости от генотипа больного.

Личный вклад автора

В ходе работы автором лично, на основании осмотра, изучения историй болезни, сформирована уникальная выборка из 122-х пациентов с диагностированной болезнью Крона, в которой затем при участии автора проведено молекулярно-генетическое типирование. Полученные данные были проанализированы автором лично, произведена их статистическая обработка. Результаты исследования группы больных сравнены с группой популяционного контроля и зарубежными данными. Это впервые позволило сопоставить генотип и фенотип пациентов с БК, проживающих на территории Российской Федерации.

Внедрение результатов исследования

Результаты настоящего исследования используются при обследовании больных, наблюдающихся в ФГУ «Государственный Научный Центр Колопроктологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ», включены в учебный процесс и практическую деятельность на кафедре гастроэнтерологии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава».

Апробация диссертации

Состоялась 15 октября 2008г. на межкафедральной научной конференции кафедры гастроэнтерологии ГОУ ДПО РМАПО Росздрава и кафедры неотложных состояний в клинике внутренних болезней ФППОВ ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава. Диссертация рекомендована к защите.

Результаты диссертационной работы доложены на следующих научных конференциях:

1. Двенадцатая Российская Гастроэнтерологическая Неделя, 2006г., Москва.

2. Симпозиум «Левитановские чтения», 2007г., Москва, ГНЦ колопроктологии.

3. II научно - практическая конференция, посвященная 110-летию со дня рождения В.Х. Василенко «Актуальные проблемы гастроэнтерологии», 2007г., Москва, ММА им. И.М. Сеченова.

4. Европейская конференция по генетике человека, 2006г., Амстердам, Нидерланды (стендовый доклад).

5. Четырнадцатая Российская Гастроэнтерологическая Неделя, 2008г., Москва.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе в рецензируемых журналах ВАК - 4 работы.

Положения, выносимые на защиту

1. Полиморфные варианты гена NOD2/CARDI5 достоверно ассоциированы с болезнью Крона у пациентов, проживающих на территории РФ.

2. Риск развития БК повышается при наличии в генотипе двух и более полиморфных аллелей гена Л;0О2/О4/?О75(преимущественно c.3020insC 702 W, 908R, особенно в сочетании друг с другом).

3. Основные полиморфные варианты гена NOD2/CARD15 влияют на клинические аспекты болезни Крона:

- начало БК в молодом возрасте (до 40 лет) ассоциировано с носительством полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15; развитие илеига достоверно ассоциировано с носительством полиморфного варианта c.3020insC;. колит, аноректальное поражение имеют отрицательную связь с носительством инсерции c.3020insC\

- хроническое непрерывное течение БК достоверно ассоциировано с носительством R702W, c.3020insC;

4. Риск хирургического лечения БК и ее осложнений повышается при наличии в генотипе полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 (преимущественно c.3020insC, G908R).

5. Выявлено отсутствие ассоциации полиморфных вариантов с клинической симптоматикой, тяжестью обострения, осложненными формами, внекишечными проявлениями болезни Крона.

Объем и структура работы

Представленная диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста, включает 44 таблицы, 11 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 27 отечественных и 135 зарубежных источника.

ВЫВОДЫ

1. Для пациентов с болезнью Крона, проживающих на территории РФ, характерно: начало болезни Крона в молодом возрасте (до 40-ка лет), ассоциированное с носительством полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15\ преобладание колита (с аноректальными проявлениями); хроническое непрерывное течение заболевания; среднетяжелая форма; высокая частота развития осложнений.

2. Полиморфные варианты гена NOD2/CARD15 достоверно ассоциированы с БК: аллели 268S, 702W, c.3020insC гена встречались достоверно чаще (р=0,02; 0,00015 и 10"7 соответственно) у больных с болезнью Крона по сравнению с группой популяциоиного контроля.

3. Носительство одного полиморфного аллеля гена NOD2/CARD15 в генотипе не оказывает значительного влияния на риск развития БК, а двух полиморфных алелей повышает риск болезни Крона в два раза. Наличие трех и более полиморфных аллелей гена NOD2/CARD15 увеличивает риск развития БК в 38 раз.

4. Развитие илеита при болезни Крона ассоциировано с выявлением инсерции c.3020insC в гомозиготном состоянии или сочетания c.3020insC в гетерозиготном состоянии с другими полиморфными вариантами. Аноректальные проявления, развитие колита имеют отрицательную корреляцию с носительством полиморфного варианта c.3020insC.

5. Хроническое непрерывное течение болезни Крона в отличие от рецидивирующего достоверно ассоциировано с носительством полиморфных вариантов R702W, c.3020insC в гомозиготном состоянии или сочетания их гетерозиготного состояния с другими полиморфными вариантами.

6. С носительством полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 (преимущественно c.3020insC, G908R) связан повышенный риск хирургического лечения болезни Крона и ее осложнений.

7. Исследование основных полиморфных вариантов гена NOD2/CARD15 необходимо для определения прогноза течения заболевания и тактики лечения пациентов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациентам с болезнью Крона целесообразно исследовать основные полиморфные варианты NOD2/CARD15, что позволит предположить особенности дальнейшего течения заболевания (хронический непрерывный характер течения заболевания в случае выявления c.3020insC и/или R702W, илеит при наличии c.3020insC, увеличение риска развития оперативного вмешательства при выявлении c.3020insC и/или G908R).

2. Изучение полиморфных вариантов NOD2/CARD15 у родственников пациентов с болезнью Крона позволит определить риск развития заболевания, возраст его дебюта и локализацию патологического процесса.

3. Исследовать основные полиморфные варианты NOD2/CARD15 целесообразно с целью дифференциальной диагностики болезни Крона с язвенным колитом, недифференцируемым неспецифическим колитом.