Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Клинико-эндоскопические и морфологические критерии Helicobacter pylori – ассоциированной язвенной болезни с применением лектиновой гистохимии

На правах рукописи

Потапова Марина Валериановна

КЛИНИКО - ЭНДОСКОПИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ HELICOBACTER PYLORI- АССОЦИИРОВАННОЙ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЛЕКТИНОВОЙ ГИСТОХИМИИ

14.00.05 - внутренние болезни 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2009

003477143

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Учреждении Российской Академии наук «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» РАН, г. Саратов.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор медицинских наук, профессор

ЛИФШИЦ Владимир Борисович;

доктор биологических наук НИКИТИНА Валентина Евгеньевна.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор

ГРИЦЕНГЕР Виктор Романович;

доктор биологических наук, профессор ПОПОВ Юрий Алексеевич.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по' здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « »_2009г. в_час. на заседании диссертационного

совета Д 208.094.02 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Росздрава.

Автореферат разослан « »_2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Козлова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В последнее время всё большую актуальность приобретает хроническая патология желудочно-кишечного тракта. По-прежнему лидирует язвенная болезнь как классическое кислотозависимое заболевание, которым страдает до 8-10% населения [Ивашкин В.Т., 2001; Schabowski J., 2004]. Так, в России за последние годы доля больных с впервые выявленной язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки возросла с 18 до 26% [Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., 2002]. По распространенности преобладает дуоденальная локализация язв. Высоким остаётся процент рецидивов и осложнений, особенно у лиц молодого возраста.

Ведущая роль в патогенезе гастродуоденальных заболеваний, в частности, язвенной болезни, отводится нарушению равновесия между кислотно - протеолитической агрессией и местным барьером слизистой [Кривова H.A. и соавт., 1996; Atuma С., 2001; Gindzienski A., Zwierz К., Sarosiek J., 2003]. Уже на протяжении длительного времени признаётся весомым вклад Н. pylori в хронизацию данной патологии [Исаева Г.Ш., 2008;' Covacci А. et al., 1999; Whiting J. et al., 2004]. Но, несмотря на это, отсутствует единый взгляд на патогенетические основы изменений слизистой. Одним из пусковых моментов ульцерации является адгезия Н. pylori к слизистой желудка [Brink G. R. van den et al., 2000; Ofek 1., Sharon N., 2002]. В качестве главных рецепторов для данной бактерии выступают фукозилированные соединения слизистой [Karlsson К.-А., 2000; Bovenkamp J.H.B, van den, 2003]. Известно, что фукоза, наряду с другими углеводами, входит в состав гликопротеинов желудка. За счёт этого слизь приобретает вязкость и упругость. Соединения, богатые фукозой, оказывают и местное ферментпротективное действие [Madrid J. F., 1998]. Это может объяснять тот факт, что при обострении язвенной болезни слизь содержит меньше фукозы, связанной с белками, чем у здоровых людей [Рабинович П.Д., Потапова Р.Я., 1969; Кулаго Г.В. и соавт., 1978]. Однако относительно тканевой фукозы данных практически нет.

Из существующих в настоящее время методик определения углеводных составляющих достаточно широко применяются гистохимические. Среди них определённый интерес представляет лектиновая гистохимия. Лектины - соединения белковой природы, способные к обратимой и избирательной связи с теми или иными углеводными детерминантами. Это уникальное свойство предоставляет большие диагностические возможности [Франц X., 1980; Луцик М.Д. и соавт., 1981]. Большинство исследований проведено с применением растительных лектинов в силу большей доступности и изученности. Однако высокая токсичность и, зачастую, сезонная зависимость

сырья, лимитируют их использование. <v\

/

В гастроэнтерологии лектины применяются при проведении гистохимических исследований, в основном, при опухолевых процессах. Крайне мало данных по неопухолевым заболеваниям пищеварительного тракта. Так, с применением растительных лектинов в педиатрии, показано снижение активности синтеза фукозилированных и сиалированных гликопротеинов при обострении язвенной болезни [Гроздова Т. Ю.,1992; Гроздова Г. Ю., Черненков Ю.В., 1995]. В доступной литературе очень мало работ по сравнительной оценке лектинов различного происхождения.

Лектин азотфиксирующих бактерий, благодаря отсутствию токсичности, принадлежности к непатогенным бактериям и относительной технической простоте получения, нашёл применение в ряде медико -биологических исследований [Никитина В.Е., Итальянская Ю.В., 1987]. Следует подчеркнуть его ярко выраженную специфичность к фукозе как достаточно уникальное свойство, присущее лишь ограниченному числу известных лектинов.

Неоходимо отметить, что всё более широко в медицине применяется математическое моделирование, в частности, с целью прогнозирования. Однако по язвенной болезни в настоящее время встречаются лишь единичные работы [Лифшиц В.Б., 1998].

Таким образом, с одной стороны, фукоза является одним из главных защитных компонентов слизевого барьера, с другой - участвует в адгезии Н. pylori. В этой связи актуальными представляются исследования, направленные на уточнение изменений слизистой желудка при Н. pylori - ассоциированной язвенной болезни с применением фукозоспецифичных лектинов в гистохимии и построением новой модели прогнозирования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы являлось определение клинико-эндоскопических и морфологических критериев Н. pylori - ассоциированной дуоденальной язвы с применением гистохимии на основе фукозоспецифичных лектинов различного происхождения, выявление взаимосвязи указанных показателей с последующей разработкой математической модели прогнозирования заболевания.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить характер клинико - эндоскопических показателей и морфологических изменений гастродуоденальной слизистой при обострении и ремиссии дуоденальной язвы, обострении хронического гастрита.

2. Выделить электрофоретически гомогенный препарат фукозоспецифичного лектина с клеточной поверхности азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense Sp7 и получить его ФИТЦ - производное.

3. Применить ФИТЦ - меченый бактериальный лектин для определения характера перераспределения фукозосодержащих структур антральной слизистой в разные стадии язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и при обострении хронического гастрита в сравнении с растительным лектином бобовника анагиролистного (Laburnum anagyroides) с той же углеводной специфичностью.

4. Выявить корреляционную связь между клинико-эндоскопическими и морфологическими показателями при обострении и ремиссии язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хроническом гастрите.

5. На основе полученных статистически значимых совокупностей признаков с учётом гистохимических показателей разработать математическую модель прогнозирования при дуоденальной язве.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые в диагностике заболеваний гастродуоденальной системы применён метод лектиновой гистохимии с использованием бактериального лектина.

2. Впервые проведено сравнение свойств лектинов растительного и бактериального происхождения, специфичных к ¿-фукозе, при тестировании на слизистой желудочно-кишечного тракта человека.

3. Впервые показано соотношение клинико-эндоскопических и морфологических критериев Н. pylori - ассоциированной язвенной болезни с применением в гистохимии нетоксичного лектина непатогенных азотфиксирующих бактерий.

4. Впервые разработаны математические модели прогнозирования развития, тяжести течения, длительности клинико-эндоскопического заживления дуоденальной язвы и эрадикации Н. pylori с учётом гистохимических показателей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Метод гистохимии с применением фукозоспецифичных лектинов позволяет выявить количественное снижение фукозилированных структур слизистой антрального отдела желудка при обострении Н. pylori -ассоциированной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.

2. Лектин клеточной поверхности азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense Sp7, специфичный к L - фукозе является преимущественным диагностическим реагентом по сравнению с ранее изученным фукозоспецифичным лектином бобовника анагиролистного, в плане отсутствия токсичности, доступности сырья, принадлежности к непатогенным бактериям.

3. Разработанные математические модели прогнозирования при язвенной болезни и эрадикации Н. pylori позволяют считать показатели связывания бактериального лектина наиболее ориентирующим критерием, что важно для оптимизации лечебно-профилактических мероприятий.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Рецидивирование язвообразования сопряжено с однонаправленным действием целого ряда эндо- и экзогенных факторов. В большинстве случаев этот процесс ассоциирован с персистенцией Н. pylori.

2. Н. pylori - индуцированное обострение дуоденальной язвы сопровождается уменьшением фукозилированных структур в слизистой антрального отдела желудка.

3. Фукозоспецифичный лектин Azospirillum brasilense Sp7 благодаря принадлежности к непатогенным бактериям, отсутствию токсичности и доступности сырья, может считаться преимущественным при выборе гистохимического маркёра.

4. Гистохимические параметры, рассчитанные на основе показателей связывания бактериального лектина, могут быть использованы в создании математической модели прогнозирования развития и тяжести течения язвенной болезни, длительности клинико-эндоскопического заживления дуоденальной язвы и эрадикации Н. pylori.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы и результаты диссертационной работы внедрены в лечебно -диагностическую практику: НУЗ «ДКБ» на ст. Саратов - 2 ОАО «РЖД», МУЗ «Городская клиническая больница № 9» комитета здравоохранения администрации г. Саратова и ФГУЗ МСЧ ГУВД по Саратовской области.

Результаты работы используются в преподавании на кафедре терапии ФПК и ППС СГМУ, при чтении лекций и проведении семинаров со слушателями курсов по специальности «терапия», интернами и клиническими ординаторами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции интернов «Актуальные вопросы современной практической медицины» СГМУ (Саратов, 2002); на конференции «Проблемы морфологии» (теоретические и клинические аспекты) (Дагомыс, 2002); на III Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Дагомыс, 2002); на 7-й Путинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); на 64-й итоговой научно-практической конференции СГМУ «Молодые ученые-здравоохранению региона» (Саратов, 2003), на 65-й

итоговой научно-практической конференции СГМУ «Молодые ученые-здравоохранению региона» (Саратов, 2004); на IV съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004); на VI Международном СлавяноБалтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2004» (Санкт-Петербург, 2004); на 3-й межрегиональной школе-конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004).

Диссертационная работа обсуждена на совместном заседании кафедр пропедевтики внутренних болезней, терапии ФПК и ППС, микробиологии, вирусологии и иммунологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского и лаборатории микробиологии Учреждения Российской Академии Наук «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» г. Саратова.

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 1 статья в отечественном рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных наблюдений (4 главы), изложения, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 239 источников, из них 100 отечественных и 139 зарубежных авторов. Текст диссертации изложен на 162 страницах, содержит 24 таблицы и 13 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами были обследованы 85 пациентов. Из них 50 человек - больные с ЯБДК: 30 - с клинико - эндоскопическими признаками активной язвы; 20 - в стадии полной ремиссии. Группу сравнения составили 20 пациентов с обострением хронического гастрита (ХГ А+В). В качестве контроля взяты данные 15 практически здоровых людей. Все пациенты проходили стационарное и/или амбулаторное обследование и лечение в ФГУЗ МСЧ ГУВД по Саратовской области.

В исследовании не принимали участие пациенты с онкопатологией; заболеваниями дыхательной, сердечно - сосудистой систем, нарушениями функции печени и почек; получающие терапию нестероидными противовоспалительными препаратами и глюкокортикоидами; с болезнями обмена веществ, а также с операциями и травмами брюшной полости в анамнезе.

Постановка диагноза обострения язвенной болезни основывалась на клинических проявлениях, эндоскопически определяемых язвенных дефектах слизистой и рентгенологических признаках (симптом «ниши»). Полной ремиссией заболевания считалось отсутствие клинических симптомов заболевания и наличие эндоскопических признаков «белого» рубца двенадцатиперстной кишки. Общими для всех пациентов основной группы было проведение стандартной терапии, включая эрадикационные схемы лечения Я pylori (Ивашкин В.Т., 2003), поэтому в ходе статистической обработки данный фактор не учитывался.

Большинство больных язвенной болезнью было моложе 50 лет (90%). Соотношение мужчин и женщин вне зависимости от возраста составило 5,2:1. Средний возраст составил 34,8 ± 0,52 года. Отмечено доминирование обострения заболевания в возрастной категории от 31 до 40 лет (44%). Продолжительность заболевания варьировала от 1 года до 25 лет, в среднем -8,7 ± 0,72. года. У большинства больных язвенный анамнез составил до 5 лет (46, Т/о).

Группу больных с обострением ХГ (А+В) составили 13 женщин и 7 мужчин. Преобладала возрастная категория от 31 до 40 лет ( в среднем 38,5 ± 1,43 года) (57,1%). Длительность анамнеза в этой группе пациентов составила около 3,7 ± 1,29 года. В контрольную группу вошли 15 практически здоровых людей. Случайным образом в данной выборке мужчин оказалось вдвое больше, чем женщин (10 и 5 человек). Преобладали пациенты молодого возраста - от 21 до 30 лет (50 % у мужчин и 60% у женщин). Средний возраст у них составил 29,2 ± 1,82 года.

Анализ данных основывался на таких показателях, как наследственная предрасположенность к заболеванию (устанавливали клинико - генеалогическим анализом - в ходе беседы с пробандом и его родственниками, а также определением группы крови, проведением реакции изогемагглютинации стандартными сыворотками).

В лабораторных исследованиях были использованы лектины различного происхождения. Основной маркёр представлен бактериальным лектином, специфичным к ¿-фукозе и £>-галактозе, выделенным и очищенным с клеточной поверхности азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense Sp 7 (AL). В качестве растительного реагента применён лектин коры бобовника анагиролистного Laburnum anagyroides (LAL), специфичный к a -L-фукозе ( «Лектинотест», г. Львов).

Почвенные азотфиксирующие бактерии A. brasilense Sp 7 выращивали на среде следующего состава (г/л): буфер из КН2Р04 (27,2); NaOH (8,0) с pH - 6,8; агар - агар (20,0); компоненты среды: FeSo4 (0,01); Na2Mo04 (0,002); MgS04 (0,20); СаС12 (0,26); KN03 (0,05) и глюкоза (1,44).

Выделение лектина осуществляли методом так называемой «стрижки» или «бритья» клеток, описанным в работе Eshdat К, Sharon N. (1983). Для отделения бактериальных клеток от культуральной жидкости накопленную биомассу растворяли в десятикратном объёме фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (pH - 7,4). В последующем центрифугировали с повторным перерастворением ФСБ. Лектиновые фракции диализовали против дистиллированной воды (24 - 48 часов при 4°С). Количество полученного белка определяли по Брэдфорду. Полученную смесь отфильтровывали и хранили в темной ёмкости. Очистку лектина проводили гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G - 75 с помощью детектора «Uvicord Sil» (LKB, Швеция) при X = 278 нм. В качестве элюянтов использовали 0,1 М раствор трихлоруксусной кислоты (СН3СООН с pH - 4,8) и ФСБ с 0,15 или 0,85 М раствором NaCl при pH - 7,0. Реакцию гемагглютинации проводили полуколичественным методом двукратных разведений препарата лектина в 0,15 М ФСБ на стандартных планшетах для иммунологических реакций с использованием нативных эритроцитов кролика. Титром гемагглютинации считали наибольшее разведение препарата, при котором визуально сохраняется агглютинация эритроцитов, в сравнении с контрольной лункой. Углеводную специфичность определяли по ингибированию реакции гемагглютинации. Способность различных углеводов ингибировать агглютинацию проверяли смешиванием равных объемов раствора лектина и 0,2 М раствора соответствующего углевода. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. с последующим добавлением взвеси эритроцитов и определением интенсивности гемагглютинации. Гель — электрофорез проводили в вертикальной камере (Helicon, Россия), используя 15%-ный полиакриламидный гель 0,1% - ного додецилсульфата натрия. Окраску гелей осуществляли азотнокислым серебром. Метку бактериального лектина флуоресцентным красителем флуоресцеинаизотиоцианатом (ФИТЦ) получали путём повторного перерастворения очищенного лектина ФСБ и холодным ацетоном с добавлением красителя. Полученный раствор многократно центрифугировали. Операцию повторяли до тех пор, пока надосадочная жидкость не становилась бесцветной. Конечный осадок растворяли ФСБ и хранили в холодильнике.

Проводилось цитологическое исследование в качестве основополагающего метода диагностики хеликобактериоза (Морозов И.А., 2000). Степень обсеменения определялась количеством S - и/или V - образно извитых скоплений бактериальных клеток в поле зрения микроскопа под увеличением 900. Различали 3 степени: слабую - до 20 бактериальных клеток (+), среднюю - до 50 (++), высокую - свыше 50 (+++).

При подготовке к гистологическим исследованиям нами применён модифицированный метод заливки ткани полиэтиленгликолем (ПЭГ) по Э.

Пирсу (1962). Готовили серии гистологических срезов толщиной 4-5 мкм с последующей окраской гематоксилином Карачи для определения морфологического типа гастрита, характера клеточной инфильтрации, метаплазии эпителия, степени выраженности отёка и полнокровия, наличия элементов соединительной ткани. Характер изменений слизистой оболочки желудка описывали в соответствии с Сиднейской системой (пересмотр 1994г.) (Аруин Л.И. и соавт., 1998).

Лектиновую гистохимию проводили по методу А.Д. Луцика с соавт. (1989). От каждого образца ткани готовили несколько серий срезов для обработки: ФИТЦ - меченым лектином коры бобовника, ФИТЦ — меченым лектином азоспирилл в различных концентрациях, а также ингибиторами связывания. В качестве контроля выступали неокрашенные срезы. Концентрации опытных лектинов: для AL - 12,5; 25 и 50 мкг/мл, для LAL - 12,5 мкг/мл. После инкубации в сухожаровом шкафу стёкол с сериями срезов их промывали несколькими порциями ФСБ с рН = 7,4; а затем наносили растворы опытных лектинов. Инкубировали в темноте в течение 40 мин - 1,5 часов, после чего повторно отмывали в трех порциях ФСБ по 15- 20 мин. На просушенные срезы наносили вазелиновое масло и накрывали покровным стеклом.

Ингибиторами связывания для бактериального лектина являются L-фукоза и D-галактоза в количествах 1,87 Мм/л и 20 Мм/л соответственно, для растительного лектина - 0,39 Мм раствор L-фукозы. Для бактериального лектина также была использована смесь L-фукозы и £>-галактозы. Растворы ингибиторов добавляли в «рабочие» концентрации лектинов (50 мкг/мл для бактериального). Время взаимодействия реагентов составляло не менее 15 мин, после чего ими обрабатывали срезы. Локализацию лектина в микропрепарате определяли по наличию характерного жёлтого свечения при помощи люминесцентного микроскопа «Leica DMLB» (Германия). Цифровая обработка данных производилась с программным обеспечением MathCad. Изображения микропрепаратов переводились в цифровой режим. По отношению площади свечения метки к общей площади среза высчитывался коэффициент связывания лектина, меченного флуорохромом.

Статистические методы. При обработке материала с помощью программы Microsoft Office Excel 2003 определялись средние значения, ошибка, доверительный интервал. При сравнении показателей между различными группами использовался критерий Стьюдента (t). При определении корреляционных отношений подсчитывали коэффициент (г). Считали, что связь умеренная при г от 0,3 до 0,5. Значительно выраженная -при г от 0,5 до 0,7, и сильно выраженная - при г до 0,9. Построение математической модели прогноза при язвенной болезни выполнялось на основе дискриминантного анализа при помощи программы STATISTICA 6,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ клинико - анамнестических данных показал, что имела место выраженная сезонность обострений заболевания. На это указывали 74% больных с обострением и ремиссией. Чаще всего заболевание рецидивировало и весной, и осенью (64%). В 10% случаев - только осенью. При этом, говоря о количестве обострений в году, из 50 пациентов с дуоденальной язвой 32 человека отмечали рецидив 1 раз (64%), а 18 человек - 2 раза и более в год (36%). Обострения заболевания в 64% случаев провоцировались различными стрессовыми ситуациями, а в 20% - погрешностью в питании.

Наследственная отягощённость у пациентов с ЯБДК составила 50%, причём 1 степень родства превалировала над II (в 5,2 раза; р <0,05). Незначительно преобладала I (О) группа крови среди пациентов с ЯБДК и ХГ (38% и 35% соответственно) относительно II (А) группы (по 30% в обеих группах больных) (р>0,05). У здоровых людей несколько чаще встречалась II (А) группа крови (40%). Доля III (В) группы составляла 24% при ЯБДК и 25% при ХГ (А+В), у здоровых - 20% (р>0,05). IV (АВ) группа крови встречалась реже: при ЯБДК - в 8% случаев, при ХГ (А+В) - в 10% и среди здоровых - в 6,7% случаев.

Эндоскопически у всех пациентов с язвенной болезнью выявляли гастрит. Поверхностный антральный гастрит в период обострения диагностирован в 33,4% случаев, несколько меньше в период ремиссии (25%). Реже обнаруживались признаки атрофического антрального гастрита: 13,3% при обострении и 10% в стадии ремиссии заболевания. Часто наблюдали поверхностный дуоденит: при обострении ЯБДК у 43,3% больных, а в период ремиссии - у 55%. В большом проценте случаев наблюдалось эрозивное поражение слизистой: 43,3% - для обострения и 50% - вне обострения. Преобладали эрозии антрального отдела (32%). У больных с ХГ (А+В) также превалировал поверхностный антральный гастрит (45%). Гораздо реже обнаруживали атрофический гастрит (10%). Также как у пациентов с ЯБДК, часто диагностировали эрозии (35%), преимущественно антрального отдела (57,2%).

В большинстве случаев изъязвления локализовывались на передней стенке двенадцатиперстной кишки (43,3%), реже - на задней (23,3%), и лишь в одном случае - на нижней стенке (3,3%). Сочетанная локализация наблюдалась у 9 пациентов (30%). Во всех случаях язвенные дефекты были одиночными. Диаметр варьировал от 3 до 13 мм и составлял в среднем 7,03 ± 0,04 мм. При этом язвы размером от 10 до 13 мм были сочетанной локализации. Длительность клинико - эндоскопического заживления дуоденальной язвы колебалась от 14 до 28 дней (19,3 ± 0,81 в среднем). У больных с ЯБДК высок

процент деформаций луковицы двенадцатиперстной кишки: в период обострения - в 83,3% случаев, и в 60% - в период ремиссии.

По данным цитологического исследования пристеночной слизи, при ЯБДК (о) Я pylori выявлен в 86,7% случаев (26 человек); несколько реже - в период ремиссии (у 10 пациентов), то есть в 50% (р<0,0001). Я pylori -позитивными были 40% больных с ХГ (А+В) (8 человек). Лишь у 20% здоровых (3 человека) обнаружен Н. pylori (рисунок 1). Таким образом, в большинстве случаев обострение ЯБДК было ff. pylori - ассоциированным. У всех Н. pylori - позитивных лиц, вне зависимости от нозологии, превалировала II степень микробного обсеменения (14 человек с ЯБДК (о) (46,7%), 5 - ЯБДК (р) (25%) и 4 человека с ХГ (А+В) (20%).

| ш Н. py!ori+ I 0 Н. pylori-

Рисунок 1. Доля Я. pylori - позитивных и Я. pylori - негативных случаев у больных язвенной болезнью, хроническим гастритом и здоровых.

При гистологическом анализе образцов тканей вне зависимости от фазы заболевания выявлены признаки хронического воспаления. Преобладал неатрофический гастрит: 22 случая (73,3%) при обострении ЯБДК, 15 случаев (75%) в период ремиссии. Атрофический гастрит в виде умеренно выраженной атрофии слизистой, диагностирован у 8 человек (26,7%) с обострением ЯБДК и у 5 (25%) - в период ремиссии. Ни в одном из гистологических препаратов дисплазия слизистой не была выявлена. Что касается метаплазии по тонкокишечному типу, то этот признак на фоне хронического воспаления отмечен в 40% и 45% случаев при ЯБДК (о) и ЯБДК (р) соответственно.

В группе с ХГ (А+В) также преобладали морфологические признаки неатрофического гастрита (60%). Несколько чаще, чем при ЯБ, наблюдали

ЯБДК (oj ЯБДК (р) ХГ А+В | Здоровье

атрофию слизистой - 40% (8 человек). Значительно реже у пациентов данной группы морфологически выявлялись признаки кишечной метаплазии (25%).

Локализацию лектинов в гистологических образцах определяли по наличию жёлтого свечения флуоресцентного красителя. Во всех случаях наблюдали преимущественное окрашивание железистого эпителия антральной слизистой. Наибольшими показатели связывания лектинов были при обработке неизменённой слизистой (для AL (50 мкг/мл) - б4,1±2,2); наименьшими - в образцах тканей, полученных у больных с обострением язвенной болезни (для AL (50 мкг/мл) - 31,8±1,6 (р<0,0001) (таблица 1). Наличие дуоденальной язвы сопровождается выраженными морфологическими изменениями антрума и низким связыванием фукозоспецифичного лектина. Это свидетельствует об уменьшении числа фукозилированных структур в слизистой антрального отдела желудка при Н. pylori - зависимом обострении дуоденальной язвы. По остальным группам получены промежуточные значения. Ремиссия ЯБДК и обострение ХГ (А+В) характеризуются некоторым усилением лектиносвязывания (р<0,00(П). Это, вероятно, обусловлено увеличением количества терминальных участков фу козы в составе рецепторов и отражает репаративные способности слизистой. Однако полного восстановления структуры слизевого барьера не происходит, что подтверждается максимальными значениями лектиновой метки только в группе здоровых людей.

Таблица 1

Влияние концентрации лектинов на показатель связывания с фукозосодержащими рецепторами антральной слизистой

Концентрации Группы больных

лектинов здоровые ЯБДК (о) ЯБДК (р) ХГ (А+В)

N=15 N = 30 N = 20 N=20

Контроль 15,9±0,8 11,9±0,6 13,9±0,7 13,4±0,7

(без лектина)

Лектин LAL 35,8±1,8 22,4±1,1 29,8±1,4 32,5±1,5

12,5 мкг/мл

Лектин AL 40,5±1,6 23,1±0,9 28,5±1,2 38,5±1,5

12,5 мкг/мл

Лектин AL 49,7±1,8 27,8±1,1 35,2±1,4 47,5±!,9

25 мкг/мл

Лектин AL 64,1±2,2 31,8±1,6 41,3±2,0 55,6±2,3

50 мкг/мл

При сравнении растительного и бактериального лектинов в одинаковой концентрации - 12,5 мкг/мл различия оказались недостоверны (р>0,05). Это может быть объяснено более выраженной специфичностью бактериального лектина к L - фукозе, несмотря на специфичность и к D-галактозе. Из используемых концентраций AL лучший результат получен при 50 мкг/мл.

Нами был проведён сравнительный анализ показателей связывания бактериального лектина в концентрации 50 мкг/мл в присутствии гаптенов. Использовали растворы L - фукозы (1,87 Мм/л), D - галактозы (20 Мм/л) и их смеси. Относительно исходной величины было достоверное уменьшение связывания лектина в образцах тканей всех групп обследуемых под влиянием фукозы (р<0,0001). В количественном выражении её ингибируюший эффект составлял 40 - 45% вне зависимости от нозологии. Это говорит о ведущей роли углеводной специфичности опытного лектина к L - фукозе. Сохранение активности молекул лектина обусловлено, вероятно, гидрофобными механизмами взаимодействия с углеводными составляющими. Действие галактозы в отношении ингибирования связывания было несколько менее выражено. Достоверного уменьшения показателей связывания лектина в присутствии смеси растворов двух ингибиторов не получено (р>0,05). Вероятно, для лектина азоспирилл логичнее упоминать только о специфичности, строго выраженной к L- фукозе, так как ингибирующая концентрация галактозы во много раз выше фукозы (20 мМ/л против 1,87 мМ/л).

Корреляционный анализ клинических и анамнестических данных у больных с обострением ЯБДК выявил прямую зависимость между курением, психо - эмоциональным напряжением на работе и длительностью клинико-эндоскопического заживления язв (г = 0, 38; г = 0, 42). Найдена выраженная прямая связь между активностью гастрита и инфильтрацией (г = 0, 74), а также отёком антральной слизистой (г = 0, 68). Характер клеточной инфильтрации напрямую коррелировал с показателем метки AL (12,5 мкг/мл) (г = 0, 76) и 50 мкг/мл г = 0, 62.

Степень обсеменения Н. pylori при обострении ЯБДК напрямую связана с наличием эрозий (г = 0, 49), активностью гастрита (г = 0, 49), характером клеточной инфильтрации (г = 0, 44) и наследственной отягощённостью (г = 0, 39). Обратная связь выявлена между Я pylori -обсеменением, наличием дуоденита (г = - 0, 76) и морфологическим типом гастрита (г = - 0, 54). Локализация язвенного дефекта также зависима от степени обсеменения (г = - 0, 43) (рисунок 2). Что касается диаметра язвы, то имеется отрицательная связь, но с показателем AL (50 мкг/мл) (г = - 0, 56), менее выраженная по LAL (г = - 0, 39). Обсеменение Я. pylori при ЯБДК (о) коррелирует также с гистохимическими показателями. Так, обратной была связь между степенью обсеменения и AL (12,5 мкг/мл) (г = - 0, 58), меткой LAL (г = -0,47) и AL (50 мкг/мл) (г = -0,36). Интересно, что вне обострения

заболевания, обсеменённость и показатель мечения бактериальным лектином (50 мкг/мл) находятся в прямой, более сильной зависимости (г = 0, 68). Это можно объяснить снижением количества фукозы в слизистой антрального отдела желудка при ЯБДК, то есть, в обострении заболевания большему значению метки лектином (а значит, большему содержанию фукозы) соответствует уменьшение микробной колонизации.

Рисунок 2. Корреляция между Н. pylori обсеменением и некоторыми параметрами при обострении язвенной болезни.

Для построения математической модели прогноза при ЯБДК выполнялся дискриминантный анализ с помощью пакета статистического анализа данных STATISTICA. Дискриминантный анализ как статистический метод позволяет изучать различия между двумя и более объектами по нескольким параметрам одновременно. С помощью дискриминантного анализа можно определить вероятность правильного распознавания (классификации) имеющихся статистических данных, а также вычислить дискриминантные функции для оценки принадлежности новых данных к заданным кластерам (группам).

В общем виде дискриминантная функция hk для к - й группы имеет

вид:

р

h = ho + I hr xi = ho + hi ■ x\ + hi ■ xi + ••• + hp ■ xp > /=1

где p - число переменных, к - номер группы, Xj - значение i -переменной. Коэффициенты bkt рассчитываются по результатам дискриминантного анализа имеющихся данных.

Основанием отнесения случая к к — ой группе является наибольшее значение дискриминантной функции /г*. Качество классификации оценивается Х-статистикой Уилкса, что является мерой различий между классами по нескольким дискриминантным переменным. Она принимает значения от 0 до 1. Величины X, близкие к нулю, свидетельствуют о высокой степени различия (классификации) между классами. Максимальное значение X, равное 1, характеризует отсутствие различий между классами.

В работе были решены следующие задачи прогнозирования:

- прогноз вероятности развития ЯБ у здоровых лиц и у лиц с хроническим гастритом;

- прогноз длительности клинико-эндоскопического заживления (по клиническим, морфолог ическим, гистохимическим параметрам);

- прогноз тяжести течения ЯБ;

- прогноз эрадикации Н. pylori.

При расчёте вероятности развития ЯБ у здоровых людей были рассмотрены два случая: ЯБ в стадии обострения и ремиссии. Наиболее информативным параметром в плане прогноза обострения заболевания следует считать AL (50 мкг/мл). Эта переменная позволила достоверно различать два состояния (97,30% в среднем). Наибольшая вероятность развития ЯБ в стадии ремиссии - 98,74 % в среднем была рассчитана для сочетания параметров: морфологический типа гастрита, степень обсеменения Я. pylori и AL (50 мкг/мл). В данном случае Wilks' Lambda = 0,1934821, что говорит о хорошем качестве классификации, р < 0,0000...

Расчёт вероятности развития ЯБ у больных хроническим гастритом также проводился отдельно для ЯБДК (о) и ЯБДК (р). Для прогноза обострения при наличии ХГ (А+В) значимо совместное влияние таких признаков, как возраст, наследственность, тип гастрита, Я. pylori обсеменение и AL (50 мкг/мл) (98,00 % в среднем). Wilks' Lambda = 0,2758761 (хорошее качество классификации), р < 0,0000... Для развития ЯБДК (р) у пациентов с ХГ наибольшее значение имеют возраст, длительность заболевания, курение, морфологический тип гастрита и AL (50 мкг/мл) с долей вероятности 87,50 % в среднем. В данном случае Wilks' Lambda = 0,5313864 (достаточное качество классификации), р < 0,0004.

При прогнозировании длительности клинико-эндоскопического заживления язвы сроки заживления разделили следующим образом: до 20

дней включительно и свыше 20 дней. Наибольшая вероятность правильного распознавания (80,00% в среднем) обнаружена при сочетании возраста, курения, диаметра язв, эндоскопического характера гастрита и AL (50 мкг/мл). При добавлении к этим переменным наличия эрозий вероятность распознавания также была 80,00 % в среднем. С учётом эрозий, Wilks' Lambda = 0,6537554 (хорошее качество классификации), р < 0,1025.

Тяжесть течения ЯБ оценивали по частоте обострений в году. Наиболее информативны параметры: сочетание возраста, длительности заболевания, курения, морфологического типа гастрита и AL (50 мкг/мл). При этом наборе переменных вероятность распознавания при решении данной задачи - 71,43 % в среднем. Wilks' Lambda = 0,6786365 (хорошее качество классификации), р < 0,0050,

Для прогнозирования эрадикации Н. pylori было определено два варианта: отсутствие Н. pylori и наличие Я. pylori без учёта степени обсеменения. Весьма весомым прогнозным фактором можно считать алкоголь (74,00 % в среднем при сочетании с AL (50 мкг/мл). Ещё выше качество распознавания было при одновременной оценке с наличием эрозий (78,00 % в среднем). В данном случае Wilks' Lambda = 0,7874575 (хорошее качество классификации), р < 0,0267. Полученное значение указывает на сложность поставленной задачи, связанной с редкими случаями отсутствия обсеменения Я. pylori у пациентов с язвенной болезнью.

Таким образом, большинство случаев обострения ЯБДК были Н. pylori - ассоциированными. Частота обнаружения И. pylori в желудочной слизи меняется в зависимости от нозологии (больше при обострении). Во всех группах превалирует II степень микробного обсеменения. Обращает на себя внимание частое сочетание язвенной болезни и хронического антрального гастрита даже в отсутствие Н. pylori. Большая частота обнаружения Н. pylori в образцах пристеночной слизи при язвенной болезни, уменьшающаяся во время ремиссии, несомненно, подтверждает участие данного агента в поддержании механизмов ульцерогенеза. Тот факт, что у здоровых лиц Я. pylori обнаружен лишь в 20% случаев, говорит о возможном здоровом носительсггве. Полученные результаты свидетельствуют об уменьшении фукозы и в составе рецепторов желудочного эпителия при Я. pylori - ассоциированном обострении ЯБДК. Это согласуется с немногочисленными литературными данными о снижении активности синтеза фукозилированных и сканированных гликопротеинов при обострении ЯБДК у детей [Гроздова Т.Ю., 1992].

Анализ взаимосвязи клинико - эндоскопических, морфологических и гистохимических показателей при обострении язвенной болезни двенадцатиперстной кишки наглядно демонстрирует её полиэтиологическую природу, когда развитие заболевания возможно при одновременном однонаправленном действии нескольких агентов. В данном случае-это

реализация ряда наследственных факторов, неблагоприятных внешних воздействиях, при которых ослабевает местная защита слизистой и усиливается кислотно-протеолитическая агрессия. Бактериальный лектин выступает надёжным показателем в плане прогноза развития язвенной болезни, тяжести течения, длительности клинико - эндоскопического заживления язвы и эрадикации Н. pylori. Отличительным преимуществом данного лектина можно считать принадлежность к непатогенным бактериям, выраженную специфичность к L - фукозе, отсутствие токсичности и относительную простоту в технологии получения.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что у больных ЯБДК наследственная отягощённость составила 50% с превалированием I степени родства над II (в 5,2 раза; р<0,05). Несколько чаще определялась I (О) группа крови (38% и 35% соответственно), чем 11 (А) (по 30%) (р>0,05), и у больных с ЯБДК, и с ХГ (А+В). Среди здоровых лиц принадлежность к II (А) группе крови выявлена в 40%. Гистобактериоскопически Н. pylori выявили у большинства пациентов с обострением дуоденальной язвы (86,7%), реже - в период ремиссии (50%). В группе с ХГ (А+В) частота обнаружения составила 40%, а у здоровых лиц -лишь 20%, Превалировала II степень микробного обсеменения (ЯБДК (о) -46,7%, ЯБДК (р) - 25% и ХГ - 20%).

2. Выделен чистый препарат лектина азоспирилл, специфичный к L-фукозе, с молекулярной массой 36 кДа, и получено его ФИТЦ-меченое производное.

3. Впервые в гистохимических исследованиях применён фукозоспецифичный лектин бактерий Azospirillum brasilense Sp7. Наибольшие показатели связывания его ФИТЦ - производного были получены в образцах тканей здоровых людей. Наименьшие - в случае обострения язвенной болезни (в 2,02 раза; р < 0,0001). По остальным группам получены промежуточные значения. К здоровым приближены показатели ХГ (А+В) и ЯБДК (р) (р>0,05), то есть, можно говорить об уменьшении количества фукозосодержащих рецепторов при обострении Н. pylori - ассоциированной дуоденальной язвы.

4. Впервые установлено, что из трёх концентраций бактериального лектина, применённых в гистохимических исследованиях, концентрация 50 мкг/мл выявляет наиболее достоверные различия в показателях связывания со слизистой между разными группами пациентов. При сравнении двух различных лектинов (растительного и бактериального) в одинаковой концентрации 12,5 мкг/мл, различия оказались недостоверны (р > 0,05).

5. Выявлена прямая корреляция между Н. pylori и наличием эрозий (г = 0, 49), морфологическим типом гастрита (г = 0, 49), характером клеточной инфильтрации (г = 0,44). Обратной зависимость была между степенью

микробного обсеменения и наличием дуоденита (г = - 0, 76), локализацией язв (г = - 0, 43), меткой AL (12, 5 мкг/мл) (г = - 0, 58), и AL (50 мкг/мл) (г = - 0, 36). Вне обострения степень микробного обсеменения коррелировала лишь с признаками дуоденита (г = 0, 42), а при ХГ (А+В) - с эндоскопически определяемым гастритом (г = 0, 63).

6. Разработана математическая модель прогнозирования развития и тяжести течения язвенной болезни, длительности клинико-эндоскопического заживления дуоденальной язвы и эрадикации Я. pylori на основе результатов корреляционного и дискриминантного анализов клинико- эндоскопических и морфологических критериев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Бактериальный лектин, специфичный к L - фукозе, по показателям связывания в ткани слизистой антрального отдела желудка позволяет достоверно определить стадию язвенной болезни.

2. Из двух фукозоспецифичных лектинов различного происхождения, лектин клеточной поверхности Azospirillum brasilense Sp7 может считаться премущественным в выборе гистохимического реагента по сравнению с лектином коры бобовника анагиролистного.

3. Математическое моделирование с учётом клинико-эндоскопических и морфологических критериев позволяет прогнозировать развитие и тяжесть течения язвенной болезни, длительность клинико-эндоскопического заживления дуоденальной язвы и эрадикацшо Я. pylori, демонстрируя наибольший прогностический вклад гистохимических критериев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лечение заболеваний органов пищеварения: Учеб. пособие / В.Б. Лифшиц, И.В. Присяжнкж, Е.А. Симонова, М.В. Потапова. - Саратов: Изд-во Сарат. мед. ун-та, 2001.-60 с.

2. Потапова, М.В. Диагностика инфекции Helicobacter pylori / М.В. Потапова, В.Б. Лифшиц /7 Гомеостаз и инфекционный процесс: Материалы III Всероссийской конференции. - М: Изд-во РАЕ, 2002,- С. 65.

3. Потапова, М.В. Оценка защитных свойств слизистой оболочки гастродуоденальной системы с помощью лектинов / М.В. Потапова, В.Б. Лифшиц // Проблемы морфологии: теоретические и клинические аспекты: Материалы Всероссийской конференции,- М: Изд-во РАЕ, 2002. - С.42.

4. Потапова, М.В. Применение лектинов при язвенной болезни / М.В. Потапова // Актуальные вопросы современной практической медицины: Материалы науч.-практ. конф. интернов. - Саратов: Изд-во Сарат. мед. ун-та, 2002. - С. 52 - 53.

5. Потапова, M.B. Применение метода пектиновой гистохимии для оценки факторов защиты и агрессии в патогенезе язвенной болезни / В.Б. Лифшиц, М.В. Потапова // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 2002. - № 14/15. - С. 42 - 43.

6. Бактериальный фукозоспецифичный лектин как гистохимический реагент при патологии гастродуоденальной системы / М.В. Потапова, В.Б. Лифшиц, В.Е. Никитина, Е.Г. Пономарёва // Биология - наука XXI века: Материалы 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых,- Пущино: Изд-во Пущинского научного центра РАН, 2003. - С. 77.

7. Потапова, М.В. Гистохимические аспекты изучения состояния местной защиты при патологии гастродуоденальной системы /М.В. Потапова // Молодые учёные - здравоохранению региона: Материалы 64-й итоговой науч.-практ. конф. СГМУ. - Саратов: Изд-во Сарат. мед. ун-та, 2003. - С. 272.

8. Бактериальный лектин в изучении некоторых аспектов формирования гастродуоденальной патологии / М.В. Потапова, В.Б. Лифшиц, В.Е. Никитина // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Материалы И Межрегиональной школы - конференции молодых учёных. - Саратов: Научная книга, 2004. - С. 34.

9. Лектиновая гистохимия и вторичная профилактика язвенной болезни / М.В. Потапова, В.Б. Лифшиц, В.Е. Никитина и др. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология,- 2004. - № 1. - С. 174.

10. Потапова, М.В. ФИТЦ-меченые лектины в оценке Н. pylori-ассоциированных изменений слизистой желудка /М.В. Потапова // Молодые учёные - здравоохранению региона: Материалы 65-й юбилейной науч.-практ. конф. СГМУ. - Саратов: Изд-во Сарат. мед. ун-та, 2004. - С. 48-49.

11. Потапова, М.В. Эндоскопические и гистохимические аспекты инфекции Helicobacter pylori / М.В. Потапова, В.Б. Лифшиц, В.Е. Никитина // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2004. - № 2/3. - С. 117.

12. Потапова, М.В. Фукозоспецифичный лектин в оценке структурных изменений слизевого барьера при дуоденальной язве / М.В. Потапова // Фундаментальные исследования. - М: Изд-во РАЕ, 2008.-№ 3.- С. 91-92. - URL: www.rae.ru/zk/arj/2008/02/Potapova.pdf.

13. Фукозоспецифичный бактериальный лектин в изучении местной защиты слизистой при Н. pylori - ассоциированной дуоденальной язве / М.В. Потапова, В.Б. Лифшиц, В.Е. Никитина, Е.Г. Пономарёва // Кубанский научный медицинский вестник.- 2008. 1-2. - С. 83-86.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ФИТЦ - флуоресцеинаизотиоцианат (флуоресцентный краситель)

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ХГ (А+В) - хронический гастрит А+В

ЯБДК - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки

ЯБДК (о) - обострение язвенной болезни двенадцатиперстной кишки

ЯБДК (р) - ремиссия язвенной болезни двенадцатиперстной кишки

AL - лектин Azospirillum brazilense Sp 7 (A. brazilense Sp 7)

LAL - лектин Laburnum anagyroides (бобовника анагиролистного)

H. pylori - Helicobacter pylori

Подписано в печать 4.09.2009 Формат 60x84 11/6. Бумага офсетная Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объём - 1 усл. печ. л. Тираж 100. Заказ № 51

Отпечатано с готового оригинал-макета В ООО «СП-Принт» по адресу адресу: 410004, г. Саратов, ул. Астраханская, 43 Тел.: (8452) 59-59-66, 51-93-98

\

.'У

ООО «СП-Принт» 410004, г. Саратов, ул. Астраханская, 43 Тел.: (8452) 59-59-66, 51-93-98

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ В последнее время всё большую актуальность приобретает хроническая патология желудочно-кишечного тракта. По-прежнему лидирует язвенная болезнь как классическое кислотозависимое заболевание, которым страдает до 8-10% населения [28, 220, 236]. Наиболее распространена дуоденальная локализация язв. По некоторым данным, в России, за последние годы доля больных с впервые выявленной язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки возросла с 18 до 26% [59]. Высоким остаётся процент рецидивов и осложнений, особенно у лиц молодого возраста. Всё это определяет наибольшую значимость исследований в плане уточнения механизмов язвообразования.

Ведущая роль в патогенезе гастродуоденальных заболеваний отводится нарушению равновесия между кислотно-протеолитической агрессией и местным барьером слизистой [7, 89, 102, 124, 150, 218]. Безусловным прорывом последних десятилетий является признание Helicobacter pylori (Н. pylori) одной из значимых причин формирования хронической патологии желудочно - кишечного тракта, в частности, язвенной болезни [7, 28, 164, 215]. Несмотря на это, многие аспекты остаются нераскрытыми.

Одним из главных моментов является адгезия патогена к слизистой, медиированная гликопротеинами желудка [21, 27, 152, 204]. Накоплены данные о главенствующей роли фу козы как рецептора для Н. pylori [116, 184, 197, 217]. Ранее было обнаружено, что устойчивость слизи к действию ферментов придают именно фукозосодержащие соединения. А при обострении язвенной болезни достоверно снижается содержание фукозы в желудочной слизи [39, 85]. Однако сведений относительно тканевой фукозы в литературе практически нет.

Из существующих в настоящее время методик определения углеводных составляющих достаточно широко применяются гистохимические. Среди них определённый интерес представляет лектиновая гистохимия. Лектины - соединения белковой природы, способные к обратимой и избирательной связи с теми или иными углеводными детерминантами. Это уникальное свойство предоставляет большие диагностические возможности [44, 51, 53, 91, 219]. Большинство исследований проводится с применением растительных лектинов в силу большей их доступности и изученности. Однако высокая токсичность и, зачастую, сезонная зависимость сырья, лимитируют их использование. Лектины бактериального происхождения известны лишь с позиции их участия в инфекционном процессе.

С этой точки зрения большой интерес представляет лектин клеточной поверхности почвенных бактерий Azospirillum brasilense Sp 7. Следует отметить его ярко выраженную специфичность к фукозе - достаточно уникальное свойство, присущее лишь ограниченному числу растительных лектинов. Благодаря отсутствию токсичности, принадлежности к непатогенным бактериям и относительной технической простоте, он нашёл применение в ряде медико - биологических исследований [1, 64]. В качестве гистохимического реагента данный лектин ранее не использовался.

Неоходимо отметить, что всё более широко в медицине применяется математическое моделирование, в частности, с целью прогнозирования. Однако по язвенной болезни встречаются лишь единичные работы [48].

В этой связи актуальными представляются исследования, направленные на уточнение ультраструктурных изменений слизевого барьера при Н. pylori - ассоциированной язвенной болезни, с применением лектиновой гистохимии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы являлось определение клинико-эндоскопических и морфологических критериев Н. pylori - ассоциированной дуоденальной язвы с применением гистохимии на основе фукозоспецифичных лектинов различного происхождения, выявление взаимосвязи указанных показателей с последующей разработкой математической модели прогнозирования заболевания.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить характер клинико - эндоскопических показателей и морфологических изменений гастродуоденальной слизистой при обострении и ремиссии дуоденальной язвы, обострении хронического гастрита.

2. Выделить электрофоретически гомогенный препарат фукозоспецифичного лектина (AL) с клеточной поверхности азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense Sp7 и получить его ФИТЦ - производное.

3. Применить ФИТЦ - меченый бактериальный лектин для определения характера перераспределения фукозосодержащих структур антральной слизистой в разные стадии язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и при обострении хронического гастрита (А+В) в сравнении с растительным лектином бобовника анагиролистного (LAL) с той же углеводной специфичностью.

4. Выявить корреляционную связь между клинико - эндоскопическими и морфологическими показателями при обострении и ремиссии язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хроническом гастрите.

5. На основе полученных статистически значимых совокупностей признаков с учётом гистохимических показателей разработать математическую модель прогнозирования при дуоденальной язве.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые в диагностике заболеваний гастродуоденальной системы применён метод лектиновой гистохимии с использованием бактериального лектина.

2. Впервые проведено сравнение свойств лектинов растительного и бактериального происхождения, специфичных к L - фукозе, при тестировании на слизистой желудочно-кишечного тракта человека.

3. Впервые показано соотношение клинико-эндоскопических и морфологических критериев Н. pylori - ассоциированной язвенной болезни с применением в гистохимии нетоксичного лектина непатогенных азотфиксирующих бактерий.

4. Впервые разработаны математические модели прогнозирования развития, тяжести течения, длительности клинико-эндоскопического заживления дуоденальной язвы и эрадикации Н. pylori с учётом гистохимических показателей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Метод гистохимии с применением фукозоспецифичных лектинов позволяет выявить количественное снижение фукозилированных структур слизистой антрального отдела желудка при обострении Н. pylori -ассоциированной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.

2. Лектин клеточной поверхности азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense Sp7, специфичный к L - фукозе является преимущественным диагностическим реагентом по сравнению с ранее изученным фукозоспецифичным лектином бобовника анагиролистного, в плане отсутствия токсичности, доступности сырья, принадлежности к непатогенным бактериям.

3. Разработанные математические модели прогнозирования при язвенной болезни и эрадикации Н. pylori позволяют считать показатели связывания бактериального лектина наиболее ориентирующим критерием, что важно для оптимизации лечебно-профилактических мероприятий.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Рецидивирование язвообразования сопряжено с однонаправленным действием целого ряда эндо- и экзогенных факторов. В большинстве случаев этот процесс ассоциирован с персистенцией Н. pylori.

2. Н. pylori - индуцированное обострение дуоденальной язвы сопровождается уменьшением фукозилированных структур в слизистой антрального отдела желудка.

3. Фукозоспецифичный лектин Azospirillum brasilense Sp7 благодаря принадлежности к непатогенным бактериям, отсутствию токсичности и доступности сырья, может считаться преимущественным при выборе гистохимического маркёра.

4. Гистохимические параметры, рассчитанные на основе показателей связывания бактериального лектина, могут быть использованы в создании математической модели прогнозирования развития и тяжести течения язвенной болезни, длительности клинико-эндоскопического заживления дуоденальной язвы и эрадикации Н. pylori.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы и результаты диссертационной работы внедрены в лечебно -диагностическую практику: НУЗ «ДКБ» на ст. Саратов-2 ОАО «РЖД», МУЗ «Городская клиническая больница № 9» комитета здравоохранения администрации г. Саратова и ФГУЗ МСЧ ГУВД по Саратовской области.

Результаты работы используются в преподавании на кафедре терапии ФПК и ППС СГМУ, при чтении лекций и проведении семинаров со слушателями курсов по специальности «терапия», интернами и клиническими ординаторами.

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 1 статья в отечественном рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции интернов «Актуальные вопросы современной практической медицины» СГМУ (Саратов, 2002); на конференции «Проблемы морфологии» (теоретические и клинические аспекты) (Дагомыс, 2002); на III Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Дагомыс, 2002); на 7-й Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); на 64-й итоговой научно-практической конференции СГМУ «Молодые ученые-здравоохранению региона» (Саратов, 2003), на 65-й итоговой научно-практической конференции СГМУ «Молодые ученые-здравоохранению региона» (Саратов, 2004); на IV съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2004); на VI Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2004» (Санкт-Петербург, 2004); на 3-й межрегиональной школе-конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004).

Диссертационная работа обсуждена на совместном заседании кафедр пропедевтики внутренних болезней, терапии ФПК и ППС, микробиологии, вирусологии и иммунологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского и лаборатории микробиологии Учреждения Российской Академии Наук «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» г. Саратова. и

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных наблюдений (4 главы), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 239 источников, из них 100 отечественных и 139 зарубежных авторов. Текст диссертации изложен на 159 страницах, содержит 29 таблиц и 13 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что у больных ЯБДК наследственная отягощённость составила 50% с превалированием I степени родства над II (в 5,2 раза; р<0,05). Несколько чаще определялась I (О) группа крови (38% и 35% соответственно), чем II (А) (по 30%) (р>0,05) и у больных с ЯБДК, и с ХГ. Среди здоровых лиц принадлежность к II (А) группе крови выявлена в 40%. Гистобактериоскопически Н. pylori выявили у большинства пациентов с обострением дуоденальной язвы (86,7%), реже - в ремиссию (50%). В группе с ХГ частота обнаружения составила 40%, а у здоровых лиц - лишь 20%. Превалировала II степень микробного обсеменения (ЯБДК (о) - 46,7%, ЯБДК (р) - 25% и ХГ А+В - 20%).

2. Выделен чистый препарат лектина азоспирилл, специфичный к L-фукозе с молекулярной массой 36 кДа и получено его ФИТЦ-меченое производное.

3. Впервые в гистохимических исследованиях применён фукозоспецифичный лектин бактерий Azospirillum brasilense Sp7. Наибольшие показатели связывания его ФИТЦ - производного были получены в образцах тканей здоровых людей. Наименьшие - в случае обострения язвенной болезни (в 2,02 раза; р < 0,0001). По остальным группам получены промежуточные значения. К здоровым приближены показатели ХГ А+В и ЯБДК (р) (р>0,05). То есть, можно говорить об уменьшении количества фукозосодержащих рецепторов при обострении Н. pylori — ассоциированной дуоденальной язвы.

4. Впервые установлено, что из трёх концентраций бактериального лектина, применённых в гистохимических исследованиях, концентрация 50 мкг/мл выявляет наиболее достоверные различия в показателях связывания со слизистой между разными группами пациентов. При сравнении двух различных лектинов (растительного и бактериального) в одинаковой концентрации 12,5 мкг/мл, различия оказались недостоверны (р > 0,05).

5. Выявлена прямая корреляция между Н. pylori и наличием эрозий (г = О, 49), морфологическим типом гастрита (г = 0, 49), характером клеточной инфильтрации (г = 0, 44). Обратной зависимость была между степенью микробного обсеменения и наличием дуоденита (г = - 0, 76), локализацией язв (г = - 0, 43), меткой (AL) (12, 5 мкг/мл) (г = - 0, 58), и (AL){50 мкг/мл) (г = -0, 36). Вне обострения степень микробного обсеменения коррелировала лишь с признаками дуоденита (г = 0, 42), а при ХГ - с эндоскопически определяемым гастритом (г = 0, 63).

6. Разработана математическая модель прогнозирования развития и тяжести течения язвенной болезни, длительности клинико-эндоскопического заживления дуоденальной язвы и эрадикации Н. pylori на основе результатов корреляционного и дискриминантного анализов клинико- эндоскопических и морфологических критериев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Бактериальный лектин, специфичный к L - фукозе, по показателям связывания в ткани слизистой антрального отдела желудка, позволяет достоверно определить стадию язвенной болезни.

2. Из двух фукозоспецифичных лектинов различного происхождения, лектин клеточной поверхности Azospirillum brasilense Sp7 может считаться премущественным в выборе гистохимического реагента по сравнению с лектином коры бобовника анагиролистного (LAL).

3. Математическое моделирование с учётом клинико-эндоскопических и морфологических критериев позволяет прогнозировать развитие и тяжесть течения язвенной болезни, длительность клинико-эндоскопического заживления дуоденальной язвы и эрадикацию Н. pylori, демонстрируя наибольший прогностический вклад гистохимических критериев.