Автореферат и диссертация по медицине (14.00.44) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование применения культуры эндотелиоцитов и ангиогенных факторов роста в ангиохирургии

На правах рукописи

СОПЕЛЬНЯКОВ Виталий Владимирович

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ И АНГИОГЕННЫХ ФАКТОРОВ РОСТА В АНГИОХИРУРГИИ

14.00.44 — сердечно-сосудистая хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт - Петербург 2004

Работа выполнена в Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова.

Научный руководитель -лауреат Государственной премии РФ доктор медицинских наук профессор МАТВЕЕВ Сергей Анатольевич

Официальные оппоненты: лауреат Государственной премии СССР доктор медицинских наук профессор ЛЫТКИН Михаил Иванович,

доктор медицинских наук профессор ГРИЦЕНКО Владимир Викторович

Ведущее учреждение - ГО УДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования».

Защита состоится 24 мая 2004 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.10 в Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова.

Автореферат разослан 19 апреля 2004 года.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА доктор медицинских наук профессор ДУЛАЕВ Александр Кайсинович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Значительная распространенность облитерирующих заболеваний, связанных с атеросклеротическим поражением сосудов, их прогрессирующее течение, нередко приводящее к иивалидизации, в настоящее время диктует настоятельную необходимость дальнейшего совершенствования хирургической помощи при данной патологии,

В последнее время возрос интерес к возможностям ангиогенеза в лечении облитерирующих заболеваний, основным патогенетическим звеном которых является ишемия тканей. Несмотря на широкое распространение различных видов реконструктивных оперативных вмешательств и прогресс в разработке и создании многочисленных моделей имплантатов не всегда удается добиться адекватной перфузии ишемизированных тканей.

При тяжелой хронической ишемии успешная реконструктивная операция на сосудах является единственным средством сохранения конечности, а нередко и спасения жизни больного. Однако основной причиной неудачных реконструкций остается ранний послеоперационный тромбоз шунтов и протезов. Несмотря на предложенные многочисленные способы профилактики этого грозного осложнения, частота его, по данным разных авторов, колеблется в пределах от 2,6% до 29,5% (Затевахин И.И. с соавт., 1987; Лебедев Л.В. с соавт., 1990; Кудрявцев Ю.А., 1997; Матуренко Л.Л. с соавт., 2000; Бельков ЮА с соавт., 2003). Ранний послеоперационный тромбоз не только увеличивает сроки лечения, но и нередко приводит к глубокой инвалидизации пациентов, вплоть до летальных исходов, так как повторные операции по поводу реокклюзий не всегда заканчиваются успехом.

Одной из причин развития раннего тромбоза является несостоятельность периферического сосудистого русла при резко увеличивающемся притоке крови после операции (Силаев Ю.С. с соавт., 1990; Иващенко В.13., 1994; Вачев А.И. с соавт., 1997).

Основным принципом ангиореконструкции является восстановление магистрального кровотока, в то время как стимуляция ангиогенеза позволяет воздействовать на уровне микроциркуля горного русла, увеличивая плотность и общую площадь капиллярной сети, тем самым, способствуя росту компенсаторных возможностей периферического сосудистого русла.

Таким образом, представляется возможным перспектива комплексного использования методов стимуляции ангиогенеза наряду с реконструктивными опреациями па сосудах у ангиохирургических больных. Это побудило нас провести исследование по изучению возможностей стимуляции ангиогенеза в условиях ишемии тканей.

Цель исследования.

Оценить возможность использования культуры эмбриональных эндотелиоцитов и факторов роста для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей.

Задачи исследования.

1. Оценить ближайшие результаты хирургического лечения больных с облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей при реконструктивных операциях на магистральных сосудах.

2. Усовершенствовать и определить наиболее благоприятные условия культивирования эмбриональных эндотелиальных клеток.

3. Изучить способность факторов роста и эмбриональных эндотелиоцитов стимулировать ангиогенный ответ со сторопы сосудистого русла.

4. Определить возможность культуры эмбриональных эндотелиоцитов при имплантации встраиваться в структуру ткани реципиента.

5. Изучить морфологические изменения в скелетной мышечной ткани при стимуляции ангиогенеза.

Научная новизна. Систематизированы результаты исследований по стимуляции аигиогенеза и заместительной клеточной терапии. In vitro изучено поведение эмбрионалытых эндотелиогштов в первичной культуре после ферментативного суспензирования сердца эмбриона; модифицирован способ культивирования эндотелиальных клеток на коллагеновой подложке с применением коллагенового геля с концентрацией 2,5 мг/мл. In vivo выявлено стимулирующее влияние ангиогенных факторов роста и культуры эмбриональных эндотелиоцитов на процессы реваскуляризации тканей в условиях ишемии.

Впервые проведена серия экспериментов с применением культуры эмбриональных эндотелиоцитов и установлено, что имплантируемые эндотелиальные клетки успешно встраиваются в структуру мышечной ткани реципиента.

На экспериментальном материале показана возможность и перспективность использования клеточных технологий для стимуляции ангиогенеза в условиях ишемии тканей.

Практическая ценность исследования. Результаты проведенных экспсрименталып х исследований демонстрируют стимулирующий эффект факторов роста сосудов и культуры эмбриональных эндотелиоцитов, суспензированных в коллагеновом геле, на активность репаративных процессов в ишемически поврежденных тканях. Имплантация эмбриональных эндотелиальных клеток и введение ангиогенных факторов роста в зону ишемии тканей могут послужить одними из методов в комплексном лечении больных с заболеваниями, сопровождающимися ишемией тканей.

Дальнейшее развитие и внедрение в практику предложенных методов позволят улучшить результаты лечения ангиохирургических больных.

Положения диссертации, выносимые на защиту-

1. Необходимость тщательной профилактики тромботических осложнений существенно возрастает при оперативном лечении пациентов с

мультифокальными и дистальиыми видами атеросклеротического поражения артериального русла.

2. Имплантируемые эмбриональные эндотелиоциты, суспензированные в коллагеновом геле (концентрация коллагена 1 мг/мл), встраиваются в структуру ткани реципиента, не образуя гетерогенных участков в мышечной ткани.

3. Введение ангиогенных факторов роста и имплантация эмбриональных эндотелиоцитов оказывают стимулирующее влияние на процессы ангиогенеза в зоне ишемии тканей.

4. Ангиогенные факторы роста стимулируют пролиферативную активность эндотелиальных клеток.

5. Культивирование первичных культур эмбриональных эндотслиоцитов способствует увеличению численности клеток и снижению их антигенности.

Реализация результатов работы. Результаты исследований доложены на: межвузовских студенческих конференциях "Актуальные вопросы грудной и сердечно-сосудистой хирургии" (СПб, 2001, 2003); итоговых конференциях ВНОКиС академии (2001, 2002); УШ-м Всероссийском съезде сердечнососудистых хирургов (Москва, 2002).

По материалам исследований опубликовано 14 печатных работ, зарегастрировано 3 рационализаторских предложения (№№7812/8, 7813/8, 7814/8 от 27. 12.2001г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 89 отечественных и 78 иностранных источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 26 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Структура материала и его объем

Клиническая часть исследования.

Для оценки ближайших результатов реконструктивных операций на магистральных сосудах изучен опыт хирургического лечения 558 больных с облитерирующими поражениями аорты и ее ветвей. Все пациенты проходили лечение в клинике сердечно-сосудистой хирургии имени П.Л.Куприянова ВМедА имени С.М.Кирова. Все пациенты были разделены на 2 группы. I, группу . (406 чел.) составили больные, которым производились реконструктивные операции на аорто-бедрешюм сегменте. Во II группу (152 чел.) вошли пациенты с преимущественным поражением бедренно-подколенного сегмента, им выполнялись ангиореконструкции на бедренно-подколенном сегменте. Обе группы мало отличались по возрасту пациентов: от 49 до 78 лет в I группе и от 46 до 71 года во II группе. Подавляющее большинство (96%) обследованных пациентов составили лица мужского пола.

При анализе результатов лечения обращали внимание на следующие показатели: длительность госпитализации, и какая она по счету (по основному

заболеванию), предварительный диагноз при поступлении, сопутствующие заболевания, окончательный диагноз, наличие и характер осложнений основного заболевания на момент госпитализации и анамнестически. Учитывали уровень поражения кровеносных сосудов, оценивали тактику оперативного лечения и наличие осложнений в послеоперационном периоде.

Диагноз у обследованных больных был установлен и подтвержден по результатам клинического и лабораторно-инструментальных исследований (жалобы, анамнез заболевания и анамнез жизни, физикальные методы обследования, биохимические показатели крови, ангиография, ультразвуковая дошшерография).

Для оценки степени ишемии использовалась классификация R.Fontaine (1972) в модификации АВ.Покровского (1979). Показанием к оперативному лечению облитсрирующего атеросклероза артерий нижних конечностей является ишемия конечностей И-Б степени и более. Поэтому в нашем исследовании больных с I и II-А степенью ишемии не было (табл. 1).

Таблица 1

Распределение больных в зависимости от стадии артериальной недостаточности

Степень ишемии I группа II группа

п % п %

И-Б 129 31,8 58 38,2

III 174 42,9 66 43,4

IV 103 25,3 28 18,4

ВСЕГО 406 100 152 100

При анализе результатов инструментальных и лабораторных исследований обращали внимание не только на заболевания сосудистой системы, но и учитывали сопутствующую патологию. Для изучения факторов риска развития раннего тромбоза использовались методы рентгенкоитрастной ангиографии, ультразвуковое исследование артерии нижних конечностей, интраоперационная ревизия бедренных артерий и компьютерная томография. Обращалось внимание на степень поражения сосудистого русла атеросклеротичесхим процессом, скоростные характеристики кровотока.

Оценку результатов хирургического лечения больных с облитсрирующими заболеваниями аорты и артерий нижних конечностей осуществляли после хирургического лечения по степени изменения клинического статуса по отношению к дооперационному периоду. Основными показателями, с помощью которых определяли проходимость реконструированной зовы, являются: наличие пульсации или систолического шума над имплантатом в области дистального анастомоза; сохранение кровопроводящих свойств искусственного сосуда по данным ангиографии или ультразвукового исследования; восстановление мобильности и трудоспособности больного.

Проведен анализ видов хирургического лечения в зависимости от уровня поражения артерий. Обращали внимание на типы имплантатов, применявшихся для пластики кровеносных сосудов. Все операции выполнялись под эндотрахеальным наркозом практически одной бригадой сосудистого отделения клиники.

Экспериментальная часть исследования.

Для реализации поставленных задач исследования выполнены серии опытов in vitro на культурах эндотелиоцитов (трансформированной и первичной) и эксперименты in vivo — на беспородных крысах.

Культуральная техника и микроскопические методы.

Использование трансформированной культуры эндотелиоцитов человека ECV 304 (in vitro). ECV-304 - спонтанно-трансформированная постоянная клеточная линия эндотелия, полученная из вены нормального пупочного канатика человека. Культивирование клеток производили во флаконах Карреля, более удобных для наблюдения за культурами, либо в пластиковых чашках Петри. Питательную среду (10% FBS - fetal bovine serum + среда 199) меняли через день. Культивирование трансформированных эндотелиоцитов постоянной линии ECV-304 проводилось с целью отработки методики выращивания первичных культур клеток. Предложен способ культивирования эндотелиальных клеток на коллагеновой подложке с концентрацией 2,5мг/мл (рац. предложение №7812/8 от 27. 12. 2001г.). Для этого в условиях низкой температуры (0° С - +4°С) готовился раствор коллагена в концентрации 2,5 мг/мл. Жидкий раствор равномерно наносили на дно чашек Петри, где он быстро приобретал консистенцию желе. На подготовленные пластиковые чашки переносили культуру эндотелиоцитов с добавлением питательной среды. На коллагеновой подложке происходило распластывание эндотелиальных клеток и их активная пролиферация, что контролировалось с помощью микроскопии культур клеток.

Получение коллагена I типа из сухожилии крысиных хвостов. Коллаген I тина, цельный, с телонептидами (гелеобразующий), получали из сухожилий хвостов крыс по методу G.Chandrakasan ct al. (1976), в модификации Института цитологии РАН. Хвосты хранились замороженными при -60°С. Все маншгуляции выполнялись при -5°—8°С. Из 25 хвостов получали примерно 1г коллагена с концентрацией 4-7 мг/мл.

Получение факторов роста эндотелиальных клеток. Факторы роста эндотелиальных клеток получали по методу. T.Maciag et al. (1979) в модификации Института цитологии РАН. Данный препарат представляет собой экстракт, выделенный из эмбриональной мозговой ткани человека (абортивный материал на сроках 18-20 недель беременности). Это естественная смесь ангиогенных факторов роста, в состав которых входят семейство FGF и VEGF. Основные этапы получения препарата: 1) приготовление гомогената нервной ткани в 500 мл 0,1М NaCl на 370г ткани; 2) инкубирование в течение 12 часов при +4°С; 3) центрифугирование 40 мин при 14000 об/мин; 4) добавление к супернатанту 0,5% раствора стрептомицина сульфата (5 мг/мл); 5) доведение до

ph 7,0 , используя 1М NaOH; 6) инкубирование в течение 12 часов при +4°С; 7) центрифугирование в течение 1 часа при 14000 об'мин.

Получение суспензии эндотелиальных клеток. Культуры эндотелиальных клеток получали из сердец плодов крысы на 15-19-е сутки беременности. Использовались следующие рабочие растворы: I - питательная среда: среда 199 + эмбриональная сыворотка (20%) + бикарбонат Na (1мМ) + гентамицин (40мкг/мл среды) + гепарин (5 ЕД/мл среды); II - раствор Хенкса (без Са++) + гентамицин; III — изотонический фосфатный буфер PBS + гентамицин; IV - диссоциирующий раствор (0,15% раствор трипсина + 0,05% раствор коллагеназы + гентамищш). Под эфирным наркозом после декапитации и ланаротомии у беременной самки плоды извлекались, освобождались от плодных оболочек, подвергались декапитации и торакотомии. Извлеченные сердца трижды отмывались от крови в растворе III, отсекали сосудистый пучок. Препаровку тканей при необходимости проводили под бинокулярной лупой МБС-1. Миокард желудочков и предсердий, измельченный до фрагментов 1x1 мм, промывали в растиоре III,- заливали диссоциирующим раствором (раствор IV) и помещали на 20 мин на качалку в термостате при +37°С. После первого этапа диссоциации надосадочную жидкость, содержащую много погибших клеток и их фрагментов, сливали. Ткань вновь заливали диссоциирующим раствором IV и помещали в те же условия па 60 мин. Затем супернатант тщательно собирали в центрифужную пробирку. Остаток ткани после аккуратного пипетирования со свежим раствором IV обычно полностью диссоциировал и смешивался с собранным супернатантом. К суспензий клеток в растворе ферментов добавляли 2 мл раствора I для инактивации протеолиза и дважды отмывали полученные клетки в растворе III последовательным центрифугированием по 5 мин. с частотой 1000 об/мин. Далее к полученному осадку добавляли 5 мл питательной среды (раствор I), пипетировали и центрифугировала в течение 5 мин. с частотой 500 об/мин. Ввиду значительно больших размеров кардиомиоцитов и фибробластов, клетки при данной частоте оборотов осаждались, в то время как эндотелиальные клетки, обладая меньшей массой, оставались в надосадочной жидкости.

Эндотелиальную природу и чистоту культуры проверяли иммупофлюоресценцией с кроличьей антисывороткой к VIII фактору свертывания крови, который проявляли антителами, коньюгированными с флюоресцеии-изоцианатом. В среднем около 90% клеток содержали этот антиген.

Полученные клетки высевали либо во флаконы Карреля, более удобные для наблюдения за культурами, либо в пластиковые чашки Петри на подготовленные накапуне посева коллагеновые подложки (2,5 мг/мл). В обоих случаях эндотелиоциты культивировались в питательной среде (раствор I) в условиях СО2-инкубатора [NBS CO2-incubator model CO-21 (USA)] при 5% СО2 и +37°С. На следующий день после выделения культуры клеток меняли питательную среду для удаления не прикрепившихся и разрушенных клеток. В дальнейшем в процессе культивирования смену среды осуществляли через

день. Все манипуляции с клетками проводились в стерильном боксе, оснащенном ламинарным боксом «Munktell» (Швеция).

Подсчет клеток в суспензии и определение их жизнеспособности. Для динамического наблюдения (определения роста, жизнеспособности и подсчета клеток) за первичной культурой в проходящем свете использовали инвертированный фазово-контрастный микроскоп («Биолам-Ш», ЛОМО). Подсчет клеток в суспензии осуществляли с помощью камеры Фукса-Розенталя (глубина - 0,2 мм, 16 больших квадратов по 1мм2). К суспензии клеток добавляли 0,2% раствор трепа нового синего 1:4, перемешивали, выдерживали в термостате при +37°С в течение 5 мин. Подсчитывали живые (неокрашенные) клетки. Проникновение красителя внутрь клетки свидетельствовало о нарушении целостности клеточной мембраны.

Гистологические методы исследования. Исследуемые образцы мышечной ткани фиксировались в фиксаторе Буэна (пикриновая кислота + формалин + уксусная кислота) в течение суток с последующей заливкой в парафин. Далее, в соответствии с общепринятой гистологической техникой, производилась резка срезов, и наклейка их на стекла. Обеспарафиненныс срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты исследовали на микроскопе «Jenaval» (Carl Zeiss, Jena, ГДР) с полным использованием диапазона его разрешающей способности.

Гистохимические методы исследования. Гистохимическая методика выявления активности щелочной фосфатазы калышево-кобальтовым методом по Гоморн (Агеев Л.К., 1969) позволяет определить фосфатазную активность, присущую эндотелиальным клеткам капилляров. С ее помощью удалось визуализировать эндотелиоциты микрососудов, пронизывающих массив мышечной ткани.

Фиксацию образцов мышечной ткани производили в 96° спирте при +2°-+4°С с экспозицией в течение суток. Полученные препараты заливали в парафин, на предметные стекла наклеивали улыратонкис срезы. Обсспарафиненные срезы помещали в инкубационный раствор (глицерофосфат натрия (0,5 г) + мединал (0,5 г) + 2% раствор хлорида кальция (5 мл) + 2% раствор сульфата магния (2 мл) + дистиллированная вода (до общего объема 100 мл)] в термостат при +37°С на 1 час. После инкубации срезы быстро промывали проточной водой и помещали на 5 мин. в 2% раствор сульфата кобальта. Затем препараты промывали в течение 1 мин. в нескольких порциях дистиллированной воды и помещали в слабый раствор (0,5-1%) сульфида аммония. Здесь в них соответственно местам активности фермента выпадал черный нерастворимый осадок сульфида кобальта. После этого срезы через спирт и ксилол заключали в бальзам.

Полученные микропрепараты исследовались на микроскопе «Jenaval» (Carl Zeiss, Jena, ГДР), где с помощью окулярной сетки производили подсчет количества капилляров на единицу площади ткани. Посредством видеосистемы получены микрофотографии гистологических срезов образцов мышечной ткани.

Исследования in vivo.

Исследования проведены на 136 беспородных крысах различного пола и возраста; массой тела 25О±3Ог. Для создания модели ишемии задпей конечности всем крысам выполняли перевязку бедренной артерии правой задней конечности. Операции производили в стерильных условиях под эфирным наркозом. Для решения поставленных задач исследования животные были разделены на три группы. На 14-е сутки после наложения лигатуры на бедренную артерию в ишемизированную конечность внутримышечно вводили: I группе животных (50 крыс) - культуру эмбриональных эндотелиальных клеток, суспензированных в коллагеновом геле (1 мг/мл); II группе (45 крыс) -смесь, ангиогешгых факторов роста (суммарная доза 9 мг/кг); III группе (41 крыса) - 0,9% раствор хлорида натрия в аналогичном объеме.

После выведения, животного из опыта выполняли препаровку оперированной конечности с взятием мышечной ткани в месте введения препаратов и производили гистологическое и гистохимическое исследования полученных образцов ткани.

Имплантация эмбриональных эндотелиальных клеток. Полученные из сердец плодов беременных крыс (на 15-19-е сутки беременности) эмбриональные эндотелиоциты культивировались п течение 5-ти суток в пластиковых чашках Петри с предварительным нанесением слоя коллагена I типа. Для этого в условиях низкой температуры готовится раствор коллагена в ко1щентрации 2,5 мг/мл. Жидкий раствор равномерно наносили на дно чашек, где он быстро приобретал консистенцию желе. На коллагеновой подложке происходило распластывание эндотелиальных клеток и их активная пролиферация, что контролировалось с помощью микроскопии культур клеток. По истечении срока культивирования (5 дней) питательную среду из чашек удаляли и бережно гашетировали эндотелиальные клетки, распластанные на коллагеновой подложке, свежеприготовленным раствором коллагена в концентрации 1,0 мг/мл. Все манипуляции с коллагеновым раствором проводились при температуре 0° - +4°С. Полученную суспешию эндотелиоцитов с концентрацией около 9,6x104 клеток/мл после обработки кожи задней конечности крысы вводили (однократно) с помощью инсулинового шприца внутримышечно ниже места перевязки бедренной артерии в объеме 0,02 мл в зону ишемии животным I группы.

Введение ангиогенных ростовых факторов. Введение факторов роста проводили трижды с интервалом 2 дня. С этой целью предварительно размороженную смесь ростовых факторов (экстракт мозговой ткани хранится в замороженном виде) до +4°С растворяли изотоническим раствором хлорида натрия. Свежеприготовленный раствор в объеме 0,02 мл вводили внутримышечно после обработки кожи в зону ишемии ниже места перевязки бедренной артерии животным II группы в дозе 3 мг/кг. Введение ростовых факторов осуществляли инсулиновым шприцем, приспособленным для целей эксперимента.

Введение изотонического раствора хлорида натрия. Инъекции 0,9% растора хлорида натрия проводились животным III группы в качестве

контроля на введение инертного раствора. При этом инъекции осуществлялись трижды с интервалом 2 дня в мышечный массив правой задней конечности крысы через 14 дней после перевязки бедренной артерии.

Методы статистической обработки.

Для статистической обработки данных, полученных в ходе исследования, была создана электронная база данных с использованием пакета программ Microsoft Excel XP, с последующей обработкой с применением пакетов программ Statistica for Windows 5.0. Определялись средние значения, стандартное отклонение, средняя квадратичная ошибка, коэффициент корреляции. При небольшом числе наблюдений достоверность различий определяли непараметрическими методами. При проведении параметрических методов статистического анализа предварительно определялось соответствие исследуемых выборок закону нормального распределения. Достоверность различий средних значений показателей определялась с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Пациентам I группы (406 чел.) при ангиореконструкции аорто-бедренного сегмента применяли в основном шунтирующие операции: АББШ, АгББШ, АБШ и лишь при высокой окклюзии аорты - ее протезирование (АББП -2,2%). Для пластики кровеносных сосудов у данной группы пациентов чаще использовали имплантаты фирмы «Север» — в 74,5% (302 чел.) случаев. Политетрафторэтиленовые (ПТФЭ) протезы имплантировали: фирмы «Гортекс» - в 8,9% случаев (36 чел.) и «Экофлон» - в 11,5% (47 чел.). Искусственные сосуды «Васкутек» применяли у 5,1% (21 чел.) больных I группы.

При оценке ближайших исходов, которую проводили непосредственно в стационаре и на этапе послеоперационного амбулаторного наблюдения, пользовались следующими критериями:

- хороший результат - значительное уменьшение или исчезновение ишемической симптоматики (купирование болей покоя, заживление трофических ячв или ран после некрэктомий, увеличение дистанции безболевой ходьбы, исчезновение патологической зябкости) — компенсация кровообращения;

- удовлетворительный результат - субкомпенсация кровообращения: сохранение конечности при критической ишемии, значительное уменьшение болей покоя (отказ от сильнодействующих и наркотических анальгетиков), тепденция к заживлению язв, выполнение ампутации на сегмент ниже традиционного при данной локализации поражения;

- неудовлетворительный результат - отсутствие какого-либо эффекта от вмешательства, прогрессирование ишемии, тяжелые местные осложнения, ампутация конечности.

Анализ ближайших результатов оперативного лечения окклюзии аорто-подвздошного сегмента приведен в табл. 2.

Таблица 2

Ближайшие результаты хирургических вмешательств на

виды реконструктивных операций ближайший результат

кол-во ангисреконструкции

больных хороший удовлетворительный неудовлетворительный

ЛББШ 143 91 39 13

ЛгКБШ 68 43 18 7

ЛБШ 186 118 53 15

ЛББП 9 6 2 1

Всего абс. 406 258 112 36

% 100 63,6 27,6 8,8

При хорошем результате оперативного вмешательства восстановление регионарного кровообращения в конечности с нормализацией микроциркуляторного русла не только устраняло явления ишемии, но и возвращало больных к активной трудовой деятельности.

Анализ причин неудовлетворительных результатов реконструктивных операций свидетельствует, что они обусловлены состоянием дистального артериального русла, специфическими и общими осложнениями. Частота и характер осложнений при реконструктивных операциях на аорто-бедренном сегменте, встречающихся в раннем и позднем послеоперационном периоде (до 1 года), отражены в табл. 3.

Таблица 3

Частота и характер осложнений при реконструктивных

осложнения ангиореконструкции аорто-бедреннош сегмента

абс. число %

острая сердечно-сосудистая недостаточность 41 10,2

острый инфаркт миокарда 4 0,9

ос!рос нарушение мозгового кровообращения 9 2,3

послеоперационная энцефалопатия 23 5,6

кровотечение ю зоны анастомоза 14 3,5

ранний тромбоз 35 8,7

поздний тромбоз ' 44 10,9

гнойно- инфекционные осложнения: - поверхностная раневая инфекция - глубокая раневая инфекция ■ 26 2 6,5 0,5

олигурия 62 15,1

лимфорея 76 18,6

Серьезным специфическим осложнением операций на аорто-бедренном сегменте у 7,8 - 15,3% больных являются тромбозы артерий и протезов. В наших наблюдениях ранний тромбоз наблюдался у 35 (8,7%) больных. Изучение причин этого осложнения показало, что ими являются технические погрешности, недооценка дистального сосудистого русла или неустойчивость гемодинамики.

Тяжелым осложнением ближайшего послеоперационного периода являются кровотечения. В исследуемой группе кровотечения отмечены у 14 (3,5%) больных. Причиной развития кровотечения являются передозировка антикоагулянтов, развитие синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и глубокая раневая инфекция в области анастомоза.

Наиболее опасными в сосудистой хирургии являются инфекционно-септические осложнения. Они несут не только угрозу потери конечности, но и предопределяют высокую летальность, особенно при вовлечении в инфекционный процесс имплантатов (до 75%), а при сепсисе - до 100%. В исследуемой группе больных частота поверхностной раневой инфекции составила 6,5% (26 чел.), глубокая раневая инфекция наблюдалась в 2 случаях (0,5%).

Общие осложнения реконструктивных операций, отягощая течение послеоперационного периода, нередко являются причиной летального исхода. В наших исследованиях у 4 (0,9%) пациентов отмечали острый инфаркт миокарда, у 9 (2,3%) - острое нарушение мозгового кровообращения, у 34 (8,4%) - 1шевмонию. Общая послеоперационная летальность составила 3,9% (16чел.).

Пациентам II группы (152 чел.) выполнялись восстановительные операции на бедренно-подколенном сегменте сосудистого русла. При этом ангиореконструкции с применением метода шунтирования артерий применялись чаще - у 108 пациентов (71,1%), а протезирования реже - в 44 случаев (28,9%). У 127 больных (83,6%) в качестве имплантата использована аутовена. Причем у 12 чел. (7,9%) она была взята со "здоровой" конечности. Искусственные сосуды фирмы "Экофлон" применены у 8 пациентов (5,2%), и у 2 чел. (1,3%) протезы Тортекс". Фторлонлавсановые протезы использовались в 4 случаях (2,6%). Бедренно-подколенное шунтирование пуповиной выполнено 10 пациентам (6,5%). В 1-ом случае для протезирования использовалась дезоблитерированная артерия.

Для оценки ближайших результатов ангиореконструкции на бедренно-подколенном сегменте (табл. 4) применяли те же критерии. При хорошем результате, который отмечен у 63 (41,4%) больных, пульсация после реконструкции определялась на всех периферических артериях нижней конечности. Ангиографически выявлено, что подколенная и магистральная артерии голени хорошо проходимы и имеют лишь незначительные признаки атеросклеротического поражения.

Таблица 4

Ближайшие результаты хирургических вмешательств на бедренно-подколенном сегменте артериального русла

Удовлетворительный кровоток отмечен у 59 (38,6%) пациентов. У данной категории больных после операции пульсировала подколенная и одна из аргерий голени, тогда как вторая артерия имела значительные атсросклсротические изменения в виде излишней извитости, сужений и окклюзий.

В тех случаях, когда пульс определялся только на подколенной артерии -30 (20,0%) больных, констатировался неудовлетворительный результат. Исход оперативного вмешательства в таком случае оставался сомнительным.

Проанализированы частота и характер осложнений, встречающихся в раннем и позднем послеоперационном периоде (до 1 года) при ангиореконструкции бедренно-подколенного сегмента (табл. 5).

Таблица 5

Частота и характер осложнений при реконструктивных _операциях на бедренно-подколенном сегменте_

осложпения

ангиореконструкции бедрснно-подколешюго сегмента

абс. число

%

ранний тромбоз

27

17,4

поздний тромбоз

23

15,2

гнойно-инфекционные осложнения:

- поверхностная раневая инфекция

- глубокая раневая инфекция_

15 7

9,8 4,5

послеоперационный отек

112

74,1

лимфорея

26

16,7

У 112 больных (74,1%) возникли отеки оперированных конечностей. У 26 пациентов (16,7%) наблюдалась лимфорея в области послеоперационных ран. Среди специфических осложнений раневая инфекция, которая является наиболее тяжелой по своим последствиям, отмечена у 22 (14,5%) пациентов, из них поверхностная у 15 (9,8%), глубокая раневая инфекция у 7 (4,5%).

Ранний послеоперационный тромбоз не только увеличивает сроки лечения, но и нередко приводит к глубокой инвалидизации пациентов, вплоть до летальных исходов. Таким образом, наиболее частым и тяжелым по характеру осложнением, определяющим исход раннего и отдаленного

результата оперативного лечения, является тромбоз имплантанта. Следовательно, при оценке эффективности любых способов реконструктивных операций на сосудах при облитерирующих поражениях правомерно брать за основу именно частоту тромбозов.

Анализ послеоперационного периода пациентов II группы показал, что тромбоз в течение первых 3-х месяцев после операции развился у 27 человек (17,4%). После выписки из стационара развитие тромбоза на протяжении года отмечено у 23 больных (15,2%). Таким образом, тромботические осложнения зоны реконструкции в течение года наблюдались у 32,6% пациентов, прооперированных на уровне бедренпо-нодколенного сегмента.

Проведенный анализ результатов оперативного лечения больных с окклювионно-стенотичскими поражениями аорты и артерий нижних конечностей показал отчетливую зависимость частоты возникновения раннего и позднего тромбоза в зависимости от уровня поражения сосудистого русла. Частота тромботических осложнений заметно выше у пациентов с поражением бедренно-подколенного сегмента, по сравнению с больными, оперированными на аорто-бедренном сегменте артериального русла. Учитывая широкую распространенность атеросклеротического процесса (поражение аорты и ее ветвей, коронарных и церебральных артерий), восстановительные операции на аорте и артериях нижних конечностей остаются вмешательствами с повышенным риском для жизни больных Кроме того, в настоящее время нет возможности эффективного восстановления кровотока в дистальных отделах конечностей с помощью ангиореконструктивных операций. Это диктует необходимость поиска новых подходов в комплексном лечении заболеваний связанных с нарушением кровоснабжения тканей.

Исследования in vitro.

Традиционные методы выращивания различных культур клеток, например фибробластов, кардиомиоцитов, имеют существенные недостатки при культивировании эндотелиальных клеток из-за особенностей строения цитоплазматической мембраны. Выявлено, что наиболее благоприятные условия для культивирования культуры эндотелиоцитов обеспечиваются при выращивании клеток на коллагеновой подложке (2,5 мг/мл), которая служит естественной матрицей для монослоя эндотелиоцитов (в отличие от пластиковой или стеклянной поверхности лабораторной посуды). На коллагеновой подложке происходит распластывание эндотслиальных клеток и их активная пролиферация. При культивировании клеток наблюдали постепенную организацию: от единичных прикрепившихся и распластанных клеток на 1 - 2-е сутки инкубации, до образования монослоя с 2-х по 5-е сутки. При этом клетки формируют отростки, расположенные по направлению друг к другу, образуя межклеточные связи.

Первичные культуры эндотелиоцитов получали путем ферментативного суспензирования сердец эмбрионов крыс на 15 - 19-е сутки беременности. Данная методика позволяет получить до 95% жизнеспособных клеток. Помимо отмывания клеток полученной суспензии от раствора ферментов и разрушенных клеток путем щадящего центрифугирования удается удалить

кардиомиоциты и фибробласты, ввиду их значительно большей массы. Абсолютное большинство клеток, получаемых после очистки суспензии от фибробластов и кардиомиоцитов - эндотелиоциты, что подтверждали иммунофлюоресцентной меткой на VIII фактор свертывания крови. В среднем около 90% клеток содержали этот антиген.

Жизнеспособность полученных клеток оценивали с помощью раствора трепанового синего. Окрашивание клетки свидетельствовало о повреждении клеточной оболочки. При подсчете неокрашенных живых клеток выявлено, что разрушение межклеточных связей протеолитическими ферментами по описанной методике не нарушает целостность внешних мембран большинства клеточных элементов, позволяя получать жизнеспособные активнопролиферирующие клетки.

Несмотря на разрушепие связей между клетками при суспензировании протеолитическими ферментами, при культивировании клеток наблюдали постепенную реорганизацию межклеточных контактов с формированием скоплений клеток. На протяжении всего срока культивирования клетки активно пролиферировали, что при микроскопическом наблюдении за культурами проявлялось ростом клеточных скоплений.

Рецепторы к стимуляторам ангиогенеза располагаются на цитоплазматической мембране эндотелиальных клеток микрососудов. При взаимодействии рецепторов с факторами роста происходит стимуляция пролиферативной активности эндотелиоцитов, инициируется каскад процессов, связанных с образованием новых кровеносных сосудов. Ангиогенная активность, применяемого экстракта эмбриональной мозговой ткани человека, подтверждается серией экспериментов in vitro, проводимых как на спонтанно-трансформированной постоянной клеточной линии ECV-304, так и при культивировании первичной культуры эндотелиальных клеток. Культуры клеток выращивались в условиях С02-инкубатора при 5% СО2 и +37°С. Добавление смеси ангиогенных факторов роста в питательную среду способствовало росту пролиферативной активности эндотелиоцитов, что характеризовалось увеличением численности колоний клеток.

Длительность культивирования клеточных линий перед имплантацией экспериментальным животным составляла 5 дней. За это время колонии эндотслиальных клеток, ввиду активного размножения, существенно приумножали свою численность.

Исследования in vivo.

В обычных условиях в процессе гемоциркуляции участвуют лишь 30-40% общего количества сосудов малого калибра и при затруднении кровотока по магистральным сосудам, также как при физической нагрузке, число функционирующих мелких сосудов резко увеличивается. Этот компенсаторный механизм позволяет предотвратить развитие явлений острой артериальной непроходимости. Так, в послеоперационном периоде (после перевязки бедренной артерии) макроскопических изменений, характерных для острой артериальной непроходимости, в оперированной конечности не выявлено. Следовательно, потенциальные возможности сосудистого русла достаточно

велики, а компенсаторные процессы при нарушении магистрального кровообращения в определенной степени осуществляются за счет включения в кровоток большого числа сосудов малого калибра, которые в обычных условиях не функционируют.

Первый день после операции животные были адинамичны, отказывались от пищи, однако в последующие дни активизировались. Двигательная активность оперированной конечности полностью восстанавливалась к 2 - 3 суткам.

Однако, несмотря на то, что перестройка сосудистой сети происходила на фоне почти полной нормализации функции оперированной конечности, выявлены значительные микроскопические изменения мышечной ткани ниже места окклюзии. Некоторые мышечные волокна (на 3, 5 сутки после операции) выглядели резко набухшими, ядра сохраняли, как правило, нормальный вид. В отдельных мышечных волокнах ядра подвергались лизису. Описанные дистрофические изменения принадлежат, очевидно, к типу зернистой дистрофии. Огдсльные мышечные волокна истончались.

На более поздних сроках (28 сутки) по данным гистологического исследования наблюдалась оживленная реакция со стороны соединительнотканных элементов мышц. Эндомизий и внутренний перимизий значительно утолщались и были представлены рыхлой соединительной тканью, которая содержала довольно плотные коллагеновыс волокна. Поражение мышечной ткани носило мозаичный характер.

Гистологическое исследование показало, что на 14-е сутки после экспериментальной окклюзии бедренной артерии соединительно-тканные структуры в мышечной ткани еще не организуются, а выраженность явлений острой артериальной непроходимости минимальны. Поэтому для введения исследуемых препаратов был выбран именно этот срок.

Стимуляция ангиогенеза при ишемии тканей с помощью культуры эмбриональных эндотелиоцитов. Гистологический анализ образцов мышечной ткани, проводимый на 2, 5, 10-е сутки после имплантации эмбриональных эндотелиальных клеток, суспензированных в коллагеновом геле, показал способность культуры встраиваться в структуру мышечной ткани реципиента. На полученных микропрепаратах не обнаружено воспалительных изменений в месте введения суспензии клеток, что свидетельствует о низкой антигешюсти, вводимых эмбриональных эндотелиоцитов.

При гистологическом исследовании мест инъекции суспензии эмбриональных эндотелиоцитов в зону ишемического повреждения, на ранних сроках (через 2, 5, 10 суток) после имплантации определялись клетки, сгруппированные вдоль раневого канала, образованного вколом иглы. Признаки организации соединительной ткани отсутствовали. Также не обнаружено морфологических проявлений иммунной реакции, что свидетельствует о низкой антигешюсти имплантированных эмбриональных эндотелиоцитов.

При гистологическом исследовании зоны имплантации эмбриональных эндотелиоцитов на поздних сроках после введения (через 28 дней)

идентифицировать имплантированные клетки не удалось, что, вероятно, объясняется окончательной дифференцировкой эмбриональных клеток с формированием микрососудов. Нарушений морфологии ткани, признаков очагового повреждения и клеточной инфильтрации не выявлено.

Основные эффекты имплантации фетальных клеток обеспечиваются мощной индукцией репаративных процессов в месте повреждения. На модели ишемического повреждения задней конечности крысы оценивалось качественное состояние капиллярного русла - по микропрепаратам, окрашенным гематоксилином и эозином (общегистологическое исследование). Количественная оценка системы микроциркуляции производилась по данным гистоэнзимологической реакции по выявлению активности щелочной фосфатазы (гистохимическое исследование).

При гистологическом исследовании препаратов мышечной ткани животных I группы (имплантация культуры эмбриональных эндотелиальных клеток, суспензированных в коллагеновом геле) обнаружена выраженная васкуляризация в зоне имплантации. Визуализируется ремоделирование капиллярного русла, что проявлялось в увеличении диаметра и общей площади существующих микрососудов и образованием новых капилляров.

Ввиду неспсцифической окраски клеток по микропрепаратам, окрашенным гематоксилином и эозином, было затруднительно производить подсчет капилляров в поле зрения каждой из исследуемых групп. С этой целью выполнялось гистохимическое исследование по выявлению активности щелочной фосфатазы. Активность щелочной фосфатазы определялась кальциево-кобальтовым методом по Гомори, который является в техническом отношении простим и не требует дефицитных реактивов.

В местах активности щелочной фосфатазы наблюдалось выпадение черного нерастворимого осадка (сульфид кобальта). Так как щелочная фосфатаза находигся в составе цитоплазмы эндотелиальных клеток, то места выпадения осадка позволяют судить о локализации и плотности расположения капилляров, пронизывающих массив мышечной ткани.

При подсчете количества капилляров на единицу площади ткани в мышечной ткани животных I группы выявлено значительное увеличение количества капилляров на единицу площади ткани по сравнению с животными контрольной группы. Плотность капиллярной сети в мышечной ткани крыс I группы составила 756±28 капилляров/ед. пл. (р<0,05).

Стимуляция ангиогенеза при ишемии тканей с помощью ангиогенных факторов роста. Всем животным II группы производили троекратное введение ангиогенных факторов роста в дозе 3 мг/кг с интервалом 2 дня. Суммарная доза препарата составила 9 мг/кг.

На полученных микропрепаратах мышечной ткани не обнаружено признаков воспаления в месте инъекции антиогенных факторов роста. Капилляры располагаются вдоль мышечных волокон, ядра капиллярных эндотелиоцитов визуализируются как тяжи ядер, расположение по длине капилляров. Определяется перестройка микроциркуляторного русла, характеризующаяся увеличением плотности сосудистого русла и ростом

диаметра существующих микрососудов. Наблюдаемая картина во многом схожа с таковой при изучении микропрепаратов животных I группы (введение эмбриональных эндотелиоцитов), однако изменения более диффузны и равномерны.

При гистологическом анализе микропрепаратов контрольной группы не наблюдали микрососудов, в которых определялись эритроциты, что, свидетельствует о небольшом диаметре существующих капилляров. Отмечаются дистрофические изменения в мышечной ткани. Значительно меньшая плотность расположения ядерных тяжей указывает на слаборазвитую капиллярную сеть.

Для оценки количественных показателей проводили гистохимическую реакцию по выявлению мест активности щелочной фосфатазы. Так как данный фермент обнаруживается в цитоплазме эндотелиальных клеток, то по выпадению черного нерастворимого осадка удается определить локализацию в мышечной ткани эндотелиоцитов. Что позволяет судить не только о развитии микроциркуляторного русла, но и производить подсчет плотности капилляров на единицу площади ткани. При подсчете количества капилляров на единицу площади ткани плотность капиллярной сети у животных II группы составила 729+27 канилляров/ед. пл. (р<0,05).

Суммируя приведенные выше экспериментальные данные, можно заключить, что стимуляция антиогенеза при ишемии тканей как с помощью имплантации культур эмбриональных эндотелиоцитов, так и посредством введения в зону ишемии ангиогенных факторов роста способствует развитию микроциркуляторного русла в тканях при их ишемическом повреждении.

Проведенный анализ полученных микропрепаратов показал значительное увеличение плотности капиллярной сети в мышечной ткани животных I и II групп но сравнению с контрольной группой. Плотность капилляров в мышечной ткани животных I и II групп составила соответственно 756±28 капилляров/ед. пл. и 729+27 капилляров/ед. пл. В то время как у животных контрольной группы этот показатель составил 376+14 капилляров/ед. пл. (р<0,05).

Динамика морфологических изменений. С целью определения динамики изменений микроциркуляторпого русла гистохимическое исследование опытных образцов мышечной ткани производили па 14-е и 28-е сутки после имплантации суспензии эмбриональных эндотелиальпых клеток (I группа) и введения смеси, ангиогенных ростовых факторов (II группа). Обнаруженные небольшие количественные вариации являются статистическими незначимыми (р>0,05). Это позволяет предположить, что вновь образованные микрососуды и коллатерали не регрессируют, так как их постоянно поддерживает непрерывный кровоток.

Развитие исследований по использованию клеточных технологий в ангиохирургии открывает новые перспективы в хирургическом лечении больных с патологией сосудистой системы. Результаты проведенных исследований позволяют надеяться на то, что методы стимуляции ангиогенеза в

будущем займут прочное место в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся ишемией тканей.

ВЫВОДЫ

1. Анализ результатов хирургического лечения 558 больных облитерирующими заболеваниями сосудов нижних конечностей показал, что наибольшая частота тромботических осложнений наблюдается у пациентов с дистальными и многоуровневыми формами атеросклеротического поражения артерий нижних конечностей.

2. Наиболее благоприятные условия для культивирования и последующей имплантации культуры эмбриональных эндотелиоцитов обеспечиваются при выращивании клеток на коллагеновой подложке (с концентрацией 2,5 мг/мл).

3. Культура эмбриональных эндотелиальных клеток, суспензированных в коллагеновом геле (концентрация 1,0 мг/мл), после имплантации успешно встраивается в структуру ткани, не вызывая иммунной реакции со стороны реципиента.

4. Имплантация культуры эмбриональных эпдотелиоцитов, суспензированных в коллагеновом геле (концентрация 1,0 мг/мл), и введение смеси ростовых факторов (суммарная доза 9,0 мг/кг) в зону ишемии вызывают ангиогенный ответ со стороны сосудистого русла, характеризующийся увеличением плотности капиллярной сети.

5. Культура эмбриональных эндотелиальных клеток, суспензированных в коллагеновом геле, и смесь антиогенных факторов роста могут рассматриваться как перспективный материал для стимуляции антиогенеза при ишемии тканей in vivo.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью создания наиболее благоприятных условий для выживания и пролиферации имплантируемых эндотелиоцитов целесообразно проводить культивирование клеток на коллагеновой подложке (концентрация коллагена 2,5 мг/мл).

2. Для увеличения популяции эмбриональных эндотелиальных клеток необходимо осуществлять культивирование первичных культур не менее 5-ти дней.

3. Имплантацию эмбриональных эндотелиоцитов для стимуляции антиогенеза в зоне ишемии целесообразно выполнять в виде инъекции суспензии клеток на основе коллагенового геля с концентрацией коллагена 1,0 мг/мл.

4. Для стимуляции ангиогенсза ростовыми факторами следует производить многократное (не менее 3-х раз с интервалом 2 дня) внутримышечное введение в зону ишемии антиогенных факторов роста (3,0 мг/кг).

5. Имплантация эмбриональных эндотелиоцитов, суспензированных в коллагеновом геле, или введение ангиогенных факторов роста могут выступать в качестве дополнительного этапа операции после прямой реваскуляризации зоны нарушения регионарного кровообращения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Реконструктивные операции на сосудах // Материалы конференции "Актуальные вопросы грудной и сердечно-сосудистой хирургии". - СПб.,

2000.-С.41-43.

2. Профилактика инфекционных осложнений при протезировании сосудов // Материалы конференции "Инфекционные болезни: диагностика, лечение профилактика". - СПб., 2000. - С.162. (соавт. Гудымович В.Г., Кухарева Л.В., Матвеев С.А., Семенова Е.Г., Соловьев И.А.).

3. Осложнения после реконструктивных операций при облитерирующем атеросклерозе // Материалы итоговой конференции ВНОКиС ВМедА -СПб., 2001. - С.203-204. (соавт. Смородский А.В.).

4. Роль культуры эмбриональных эндотелиоцитов в стимуляции ангиогенеза при тканевой ишемии // Бюлл. НЦССХ им. Бакулева РАМН. -

2001. - Т.2, №6. - С.249. (соавт. Гудымович В.Г, Матвеев С.А., Семенова Е.Г., Соловьев И.А.).

5. Морфологические изменения в мышечной ткани крыс после стимуляции ашиогенеза // Материалы конференции "Актуальные вопросы грудной и сердечно-сосудистой хирургии". - СПб., 2001. - С.ЗЗ. (соавт. Соловьев И.А.).

6. Изменения в мышечной ткани при стимуляции неоангиогенеза в условиях хронической ишемии // Бюлл. НЦССХ им. Бакулева РАМН.- 2002. - Т.З, №11. - С.309. (соавт. Гудымович В.Г., Матвеев С.А., Семенова Е.Г., Соловьев И.А.).

7. Способ культивирования эндотелиальных клеток на коллагеновой подложке // Материалы в сборнике "Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике". Вып.№33. - СПб., 2002. - С.64. (соавт. Кухарева Л.В., Семенова Е.Г., Смородский А.В.).

8. Способ усиления пролиферации эндотелиоцитов в культуре // Материалы в сборнике "Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике". Вып.№33. - СПб., 2002. - С.64. (соавт. Семенова Е.Г., Смородский А.В., Соловьев И.А.).

9. Стимуляция неоангиогенеза при хронической ишемии в эксперименте // Материалы итоговой конференции ВНОКиС ВМедА. - СПб., 2002. - С.106-107. (соавт. Смородский А.В.).

10. Способ фиксации ушек предсердий крыс // Материалы в сборнике "Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике". Вып.№33. - СПб., 2002. - С.62. (соавт. Гудымович В.Г., Семенова Е.Г., Смородский А3.).

11. Клеточные технологии в сердечно-сосудистой хирургии: шаг в будущее // Материалы конференции "Актуальные вопросы грудной и сердечнососудистой хирургии", - СПб., 2003. - С.35. (соавт. Ерохина И.Л., Кухарева Л.В., Семенова Е.Г., Соловьев ИА).

12. Перспективы применения клеточных культур в сердечно-сосудистой хирургии // Материалы в сборнике "Актуальные проблемы хирургии сердца и сосудов". - СПб., 2003. - С.113-115. (соавт. Ерохина И.Л., Кухарева Л.В., Матвеев С.А., Махнев Д.А., Семенова Е.Г., Соловьев И.А.).

13. Применение культуры эндотелиоцитов и ангиогенных факторов роста для стимуляции ангиогенеза in vivo // Цитология. - 2003. - Т.45, №9. - С.901-902. (соавт/Ерохина И.Л., Кухарева Л.В., Матвеев С.А., Семенова Е.Г., Соловьев И.А.).

14. Стимуляция ангиогенеза при' экспериментальной ишемии тканей // Материалы итоговой конференции ВНОКиС ВМедА. - СПб., 2003. - С. 140141.

Подписано в печать Б,ОЧ,СЧ Формат 60x84'/,

Объем У Уу пл._Тираж экз._Заказ №42/

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

4. Ангиогенные факторы роста стимулируют пролифератив-ную активность эндотелиальных клеток.

5. Культивирование первичных культур эмбриональных эндо-телиоцитов способствует увеличению численности клеток и снижению их антигенности.

Реализация результатов работы.

Результаты исследований доложены на: межвузовских студенческих конференциях "Актуальные вопросы грудной и сердечно-сосудистой хирургии" (СПб, 2001, 2003); итоговых конференциях ВНОКиС академии (2001, 2002); УШ-м Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2002).

По материалам исследований опубликовано 14 печатных работ, зарегистрировано 3 рационализаторских предложения (№№7812/8, 7813/8, 7814/8).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 89 отечественных и 78 иностранных источников. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 26 рисунками.

ВЫВОДЫ.

1. Анализ результатов хирургического лечения 558 больных облитерирующими заболеваниями сосудов нижних конечностей показал, что наибольшая частота тромботических осложнений наблюдается у пациентов с дистальными и многоуровневыми формами атеросклеротического поражения артерий нижних конечностей.

1. Наиболее благоприятные условия для культивирования и последующей имплантации культуры эмбриональных эндоте-лиоцитов обеспечиваются при выращивании клеток на коллаге-новой подложке (с концентрацией 2,5 мг/мл).

3. Культура эмбриональных эндотелиальных клеток, суспензированных в коллагеновом геле (концентрация 1,0 мг/мл), после имплантации успешно встраивается в структуру ткани, не вызывая иммунной реакции со стороны реципиента.

4. Имплантация культуры эмбриональных эндотелиоцитов, суспензированных в коллагеновом геле (концентрация

1,0 мг/мл) и введение смеси ростовых факторов (суммарная доза 9,0 мг/кг) в зону ишемии вызывают ангиогенный ответ со стороны сосудистого русла, характеризующийся увеличением плотности капиллярной сети.

5. Культура эмбриональных эндотелиальных клеток, суспензированных в коллагеновом геле и смесь ангиогенных факторов роста могут рассматриваться как перспективный материал для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей in vivo.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью создания наиболее благоприятных условий для выживания и пролиферации имплантируемых эндотелиоцитов целесообразно проводить культивирование клеток на коллагеновой подложке (концентрация коллагена 2,5 мг/мл).

2. Для увеличения популяции эмбриональных эндотелиаль-ных клеток необходимо осуществлять культивирование первичных культур не менее 5-ти дней.

3. Имплантацию эмбриональных эндотелиоцитов для стимуляции ангиогенеза в зоне ишемии целесообразно выполнять в виде инъекции суспензии клеток на основе коллагенового геля с концентрацией коллагена 1,0 мг/мл.

4. Для стимуляции ангиогенеза ростовыми факторами следует производить многократное (не менее 3-х раз с интервалом 2 дня) внутримышечное введение в зону ишемии ангиогенных факторов роста (3,0 мг/кг).

5. Имплантация эмбриональных эндотелиоцитов, суспензированных в коллагеновом геле, или введение ангиогенных факторов роста могут выступать в качестве дополнительного этапа операции после прямой реваскуляризации зоны нарушения регионарного кровообращения.

109