Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Изменение структуры артерий после кратковременного и длительного механического растяжения

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЯРОСЛАВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫ!! МЕДИЦИНСКИИ ИНСТИТУТ

РГ8 ОД

11а правах рукописи

3 /ai

УДК 611-018.74-146:610-003.9

ФИЛИППОВ Сергей Владимирович

ИЗД\ЕНЕНИЕ СТРУКТУРЫ А °ТЕРИЙ

ПОСЛЕ KPATKOBPEMF' ОГО И ДЛИТЕЛЬНОГО МЕХА ЧИ1 -ского РАСТЯЖЕНИЯ TL (14.00.02.—гшатоши! >века)

А п т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ярпгллпль 1001

Работа выполнена п Ивановском государственном меди цписком институте им. А. С. Бубнова.

На у ч п ы и руководите л ь—

доктор медицинских наук, профессор А. А. Миронов.

Официальные оппоненты:

доктор .медицинских наук, профессор В. В. Баннн, кандидат медицинских наук, доцент В. В. Шадров.

Ведущая организация—Росашская Медицинская Акг демия Последипломного Образования.

Защита диссертации состоится « . . . » . . . . 1994 :

в . . . часов па заседании специализированного совет К 084.32.02 при Ярославском государственном медицииско институте (150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЯГМ1-

Аиторефсрат разослан « . . . »..... 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

С. В. ИВАНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ' АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последнее время вопросы функциональной морфологии клеточных элементов стенки артерий вызывают повышенный интерес у ученых-медиков и биологов различных специальностей. Изучение закономерностей структурно-функционал ной организации и гистогенеза артерий и услових нормы, повреждения и регенерации позволило сделать значительный шаг в понимании клеточных аспектов патогенеза атеросклероза, сахарного диабета и ряда осложнении, возникающих посгэ хирургических манипуляций на сосудах.

Однако, из поля зрения исследователей ускользнул важный вопроо функциональной морфологии стенки артерий в условиях повышенной механической нагрузки. Под механической нагрузкой мы прежде зсего подразумеваем силу растяжения. Одной из характерных особенностей функционирования сосудов артериального типа является тот факт, что с момента закладки и в течение всей последущей жизни организма артерии подвергаются постоянному действию силы растяжения со стороны кровотока (Laneille,1993;).

В онтогенезе основные этапы становления структуры артерий четко коррелируют во времени о изменениями параметров гемодинамики и, в частности, о подьемои артериального давления. Локальное увеличение гемодинамичесного стресса в месте коарктации артерий или после артериовеноэнсго шунтирования также- сопровождаются комплексом морфологических изменений в артериях (Seidel. Chlldineyer, 1087; Rekhter st al., 1993;).

В литературе тлеются лишь отрывочные данные относительно влияния силы растяжения на эвдотелиальные и гладкомышечные.клетки артерий. Болызинство фактов получено в ходе экспериментов в культуре ткани и касаются в основном вопросов изменения ориентации и цитоскелега клеток (Dartsch, Hsnrnerle, 1986;). In situ существуют лишь единичные исследования , которые были посвещены

ультраструктуре эндотелиоцитов и вопросам эластогенеза в средней оболочке артерии (Илизаров Г.А. и др., 1984; Илизаров Г.А. и ДР.. 1S87;).

Таким образом, в настоящее время отсутствуют целостное_ представление относительно изменений трехмерной организации и структуры внутренней, средней и наружной оболочек артерий после механического растяжения. Неизвестно, каким образом сила растяжения влияет на кооперацию эндотелиоцитов и глэдкомышечных клеток, и как это влияние отражается на поведении клеток.

Решение указанных проблем имеет как общебиологическое,. так и практическое значение. В общебиологическом аспекте важным представлялось изучение закономерностей тканевой организации эндотелия, субмикроскопического строения эндотелиоцитов, влияния силу растяжения на структуру эндотелиального пласта. Особый интерес имело изучение трехмерной организации и особенностей кооперации клеток средней и наружной оболочек артерии, закономерностей индукции ангиогенеэа в стенке артерии при ее растяжении.

Клиническое значение работы определяется тем, что экспериментальная модель длительного растяжения взята непосредственно ив клиники. При удлинении конечности по методу Илиэарова, успех операции во многом определяется сохранением и поддержанием адекватного кровотока в оперированной конечности. Результаты данного исследования могут помочь при прогнозировании возможных сосудистых осложнений и выборе основных направлений их профилактики.

Все это доказывает, что исследование пространственной организации и сруктуры артерий после механического растяжения имеет не только больше теоретическое, но и существенное практическое значение и безусловно являётся АКТУАЛЬНЫМ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ, Целью работа стало изучение структуры артерий после кратковременного и длительного механического рао-тяжения in situ.

В Соответствии с указанной цехыа были поставлены следующие основные задачи исследования.

1.Изучить динамику изменении структуры эндотелия артерий после кратковременного растяжения.

2.Определить влияние кратковременного растяжения на морфологии средней и наружной оболочек артерии.

3.Провести сравнительный морфологический анализ особенностей строения эндотелия артерий в различных отделах зоны дистрак-цни после длительного растяжения.

4.Исследовать влияние длительного растяжения на трехмерную организацию и микро-субмикросгапическое строение гладкомшечных клеток средней оболочки артерий.

5.Провести комплексное морфологическое исследование наружной оболочки артерии после-ее длительного растяжения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые in situ проведено комплексное, с использованием самых различных методов высокого разрешения, исследование морфологии клеточных элементов артерий после кратковременного идлительного растяжения.. Продемонстрирована роль межклеточной кооперации в поддержании структурно-функционального гомеостаза артерий. Новыми являются данные о динамике изменения микрорельефа внутренней поверхности артерии после фатковременного растяжения. Впервые продемонстрирована неоднородность изменении, эндотелиалъяого монослоя в различных отделах збласти длительного расгяженкя. Оригинальными являются данные о :каневой организации эндотелия артерий в зоне дистрачции. Впер-ше исследованы особенности трехмерной организацот средней обо-

лочхи артерии в условиях длительного растяжения. Новыми являются данные о полиморфности популяции гладких миоцитов по форме и типам межклеточных взаимодействий. Более детально исследованы закономерности изменения фенотипа гладко мышечных клеток в зоне, дистракции. Впервые продемонстрирована возможность индукции ан-гиогенеза в артериях, подвергавшихся длительному растяжению. Оригинальными являются данные □ трехмерной организации и ультраструктуре наружной оболочки в зоне дистракции.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ заключается в том, что ее результаты позволяют объяснить ряд важных закономерностей повреждения стенки артерий в условиях повышенной механической нагрузки со стороны кровотока.

Кроме того, поскольку экспериментальная модель длительного растяжения взята непосредственно из клиники, полученные данные могут ■ помочь в разаОотке основных путей профилактики сосудистых осложнений после проведения комлрессионно-дистракционного остео-оинтеза.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫНОСЯТСЯ НА ЗАЩИТУ.

1. Сила механического растяжения реализует свое биологическое действие на строение стенки артерий через нарушение межклеточных контактных взаимодействий.

2. В основе ответа на кратковременное растяжение лежит стресс-реакция эндотелия - универсальное морфологическое проявление реактивности эндотелия артерий.

3. Изменения в строении артерий в условиях длительного растяжения носат адаптационный характер и направлены на увеличение прочности артериальной стенки и ее приспособление к возросшей механической нагрузке.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на заседаниях Ивановского облзстного отделения Всероссийского общества анатомов, гистологов и эмбриологов в 1994г.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

СШЬЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на

_ страницах машинописи, содержит _ страниц текста,

_ таблиц, _ рисунков. Она включает введение, обзор литературы, _ разделов собственных данных, обсуждение полученных

результатов, заключение, выводы, указатель литературы. Список

использованной литературы включает_источников, из них

_отечественных и_иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В настоящем исследовании проведены эксперименты на 17 беспородных собаках обоего пола массой от 4,5 до 1В кг и на 65 крысах линии Вистар обоего пола массой 200-250г.

Моделирование кратковременного растяжения проводилось на инфраренапьнсм отделе бркигаой аорты крысы. Инфраренадьный сегмент сосуда аккуратно выделяли, освобождая от окружающих тканей и прилежащего участка нижней полой вены. Выделенный сегмент аорты захватывали вручную ниже места отхождения от нее почечных артерий и в области бифуркации. Иммобилизованный таким образом .участок аорты растягивали в продольном- направлении на 1/3 первоначальной длинны в течение 5 сек.

Для контроля и стандартизации режима растяжения,, рядом с' .аортой помещали пластиковую пслоску, градуированную по 1мм. Время рзстя.тсим определяли по секундомеру. Места фиксации стенки асрты метились угольной пудрой . Материал для исследования заби-

радея через ЗОыин., 1, 3 суток, 1, 2 недели и 1 месяц после операции.

Моделирование длительного растяжения артерии проводилось о помощью аппарата для компрессионно-дистракционного остеосинтеза, рааработанного в КНИИЭКОГ проф. Г.А. Илизаровым."

Перед операцией животные наркотизировались нембуталом (40 мг/кг., внутримышечно). Раствором, бриллиантового зеленого помечались места кортикотомии (центр голени) и наложения спиц (5 см. проксимальнее и дистальнее костного деффекта).

С помощью электрической дрели стальные спицы проводились через больпеберцовую кость во взаимино перпендикулярных плоскостях. Кольца аппарата жестко фиксировали к спицам при помощи специальных болтов. После того, как кольца были зафиксированы, в заранее помеченном месте рассекали кожу и обнажали поверхности большеберцовой и малоберцовой костей. Пререлом костей производили при помощи тонкого долота, защищая от повреждения окружающие ткани. После создания костного деффекта кожу ушивали.

Иммобилизацию костных отломков осуществляли при помощи стальных стержней с нарезанной резьбой (шаг-О.Бмм.), которые гайками фиксировали на закрепленных кольцах. После каждой операции правильность ■ расположения костных отломкав контролировали рентгенографически.

Через 5 суток после операции начинали дистракцив в режиме 1 мм.' в сутки. Растяжение проводили до тех пор, пока длина голени не увеличивалась на 307. от первоначальной. В течении всего эксперимента регулярно проводился рентгенографический контроль стабильности костных отломков.

Для вебго комплекса - морфологическое методов исследования применяясь стандартная процедура лэрфузионной фшазации. Под

нембуталовым наркозом производилось обнажение бифуркации аорты. Аорта крыс канглировалась. ретроградно, аорта собак - по направлению кровотока. В течение 30 сек сосуды отмывали от крови путем перфузии средой 199 с добавлением гепарина (10 Ед/мл; рН-7,4; t-37 С) под среднефизиологическим давлением (для крыс-100мм.рт. ст., для собак-160мм.рт.ст.). Поело отмывки сосуды перфуэировали в течение 5 минут 2,БТ. раствором глутарового альдегида ("Reanal" ЧДА) на среде 199 (рН-7,4; t-37 С). После окончания перфузионной фиксации у крыс иссекали инфраренальный сегмент аорты, исключая помеченные участки, а у собак фрагмент больпеберцовой артерии, ралолагавшийся между проксимальной и дистальной точками приложения силы. Иссеченные фрагменты сосудов помещались на 24 часа в тот же фиксатор (t-20 С).

Пленочные препараты использовались для возможного выявления делящихся зндотелиальных клетск; оценивалась степень гетероморф-ности различных участков эндстелиального пласта, определялось также наличие многоядерных эндотелиоцитов.

Препараты изготовлялись по методу Schwartz, Bendltt (1973) в модификации М.Д.Рехтера (рац.предложение N. 1718). Для этого после фиксации сосуды промывали в среде 199 и вскрывали вдоль. После обезвоживания в этаноле восходящей концентрации на поверх-нгость эндотелия наносили раствор целлоидина в смеси абсолютного спирта и диэтилового эфира (1:1), отделяли от пробки и прижимали эндотелиальной стороной к стеклу, предварительно покрытому целлоидином. Затем стекло с прикрепленным сосудом помесили на 3 мин.в 30 этанол, после чего пинцетом отрывали ткань от отекла. В результате на стекле оставайся зндотелиальный слой. Препараты асрашивались метиленозой синью и анализировались в микроскопе МНИ-15 (ЛОМО, СССР).

- в -

Форму и размеры ГМК исследовали, анализируя мазки суспензии клеток. Для приготовления взвеси ГМК мы использовали метод спир-тово-щелочной диссоциации тканей (Orekhov et al., 1984).Срагыен-ты артерии без наружной оболочки взвешивали на микровесах и полностью диссоциировали в растворе этоксида калия. Затеи клетки дважды отмывали центрифугированием в бидистилированной воде. Кашпо полученной клеточной взвеси наносили на предметное стекло, высушивали и окрашивали метиленовым синим. Колличество клеток в данном обьеме клеточной взвеси подсчитывали в камере Горяева- и рассчитывали абсолютное количество ГМК в 1 мг ткани.

Тотальные ("en face") препараты использовали для исследования ориентации ГМК и изучения морфологии иикрососудов наружной оболочки сосудов.

Для каждого отдела зоны растяжения измеряли величину угла отклонения продольной оси ГМК от продольной оси артерии (в дальнейшем - угол отклонения продольной оси ГМК). Ориентацию ГМК характеризовали дисперсией этих значений и формой кривой их распределения (Автандилов, 1990). Контролем служила ориентация ГМК в артериях контрааатеральных конечностей (аппарат без дистракции).

Для исследования рельефа- поверхности эндотелия применялся метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) нативных препаратов. .

Подготовка для СЕМ включала следующие этапы: _20-минутную промывку препаратов в среде 199, 30-минутную обработку в П растворе танниновой киолоты на 0,1М какодилатном буфере (рН-7,4), постфиксацию в' течение часа в IX растворе OsO', отмывку в 0,05М какодилатном буфере (рН-7,4), и повторную 30-минутную обработку 17» танниновой кислотой. Все операции проводились при комнаткой температура. После отмывки в дистиллированной воде

препараты обезвоживались в этаноле восходящей концентрации, и в абсолютном ацетоне. Затем препараты высушивались путем перехода через критическую точку в жидкой СО (Миронов A.A., 1985) в аппарате конструкции Бабца H.H. (Киевский НИИ эндокринологии) или в установке НСР-2 (Hitachi, Япония). Высушенные образцы монтировались на столики для СЗМ и напылялись слоем золота толщиной 10 нм в аппарате "Elico" или платиной в аппарате JFC-11C0 (Hitachi). Исследование образцов осуществлялось в сканирующих электронных микроскопах Hitachi S-405A и Hitachi S -570.

Для изучения трехмерной организации компонентов средней и наружной оболочек артерии использовался метод сканирующей электронной микроскопии химически диссоциированных прератов.

Способ предстазляет соб'эй вариант спиртово- щелочной диссо-циащш тканей (Orekhov et al.. 1984). Фрагменты артерий после предварительного механического удаления наружной оболочки подвергали дозированному травлению смеси 95%-ного этанола и ЗОХ-но-го- КОН в соотношении 1:1 до появления первых изолированных клеток (Рехтер М.Д. и др., 1992,). Дальнейшую подготовку образцов для исследования в сканирующем электронном микроскопе проводили так, как это списано нами ранее.

Для оценки ультраструктурнсй организации артериальной стенки был применен метод просвечивающей электронной микроскопии ультратонких срезов. Во всех случаях электрснномикрос.котпескому исследованию предшествовала грицельная ультратомия на основе изучения полутонккх срезов.

Изучаемые образны после ^шхяшш отмывались в буфере Милло-яигз (10 мич.), постфиксировагись в фиксаторе Милхокига (1 час), промывались в каксдилатнсм буфере (разз?деяие 1:3), инкубировались в IX таянияозой кислоте (50 мин.), трижды отмывались в 1.Z

растворе сульфита натрия. Затем образцы обезвоживались и заливались в Аралдит. После полимеризации гоовшшсь полутонкие срезы (1,0-2,0 мкм), которые окрашивались метиленовым синим.

Прицельно заточенные блоки ультратомировалиоь на ультрамикротоме LKB-III. Ультратонкие срезы контрастировали«! уранилаце-татом и цитратом свинца и просматривались в просвечивающем электронном микроскопе ЭВМ-100 АК.

Количественный анализ полученных морфологических данных проведен в соответствии с принципами случайности и репрезентативности выборки.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью паке- ■ та стандартных программ на ЭВМ IBM PC/AT.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Внутренняя поверхность инфраренального сегмента брюшной аорты крысы представлена монослоем эндотелиальных клеток (ЭК). Ломинальная поверхность аорты гладкая и атромбогенная. Клетки плотно прилежат друг к другу боковыми поверхностями, имеют уд-лкннёную форму и ориентируются таким образом, что их длинная ось располагается параллельно, направленно кровотока. Ядросодержащие зоны клеток контурируются в виде округлых, уплощенных возвышений. В области межклеточных стыков видны маргинальные складки со олабо выраженными маргинальными выростами.

Через ЭОмин. после растяжения внутренняя поверхность аорты была покрыта многочисленными интиыальными складками. В монослое ЭК мы обнаружили микродефэкты в виде сильно расширенных межклеточных промежутков и деэндотелизированных участков, площадь которых не превышала плошдци'одной ЭК.

Расширение межклеточных промежутков чаще возникали в облас-

ти каудального конца эндотелиоцитов. Появление межклеточных щелей сопровождалось сокращением ЭК. Клетки, прилежащие к расширенным межклеточным промежуткам характеризовались резкой гипертрофией маргинального рельефа и уплощением цнентральных отделав цитоплазмы. .

Через, сутки после воздействия интимальные складки на внутренней поверхности аорты сохраняются. Монослой ЭК восстанавливает непрерывность, микродефекты пласта исчезают. Маргинальный рельеф клеток сглаживается за счет распластывания краев эндотелиоцитов . Рельеф центральных отделов клеток, напротив, углубляется. На люминальной цитолеммэ клеток формируются микропузыри и блебсы. Возрастает полиморфизм ЭК, к поверхности клеток начинают ядгеэировзться единичные лейкоциты.

Через трое суток количество и выраженность интимальных складок резко- уменьшается. Межклеточные стыки плотно закрыты. Рельеф ЭК еще более углубляется, ядросодержалрга зоны клеток резко выступают в просвет сосуда. На внутренней поверхности аорты наблюдается множество прилипгах лейкоцитов.

Через неделю после однократного растяжения интимальные складки исчезают, внутренняя поверхность аорты становится гладкой. Адгезированныз лейкоциты располагаются группами преимущественно в местах межклеточных сгкков. В области межклеточных границ возникают локальные вздутия цитолеммы клеток и кратеры. Варьирование ЭК по форме и размерам становится еще более заметным.-

Через две недели микролельф эндотелия почти не отличается от контроля. На поверхности клеток сохраняются единичтаэ локальные вздутия цитолеммы и единичные прилипшие лейкоциты.

Полнат нормализация структуры эндотелиальяого плаота завер-

шается через месяц после экспериментального воздействия.

При исследовании структуры tunica media и tunica externa Сыло обнаружено, что в ответ на острое растяжение аорты измене-. Пия возникают только во внутренней оболочке аорты. Структура средней и наружной оболочек не отличалась от контроля.

В условиях длительного.растяжения изменения' во внутренней Оболочке артерий в различных отделах зоны дистракции были'не одинаковы.

В проксимальном и дистальнсм отделах области растяжения, т.е. в местах, расположенных нзиболее близко к точкам приложения силы, на внутренней поверхности артерии формировались интималь-ные.складки. Под действием силы растяжения нарушалась непрерывность монаслоя ЭК - между клетками возникали широкие щели. Чаще расширение межклеточных промежутков обнаруживалось в интервалах между интимальными складками. Структура ЭК в интервалах между интимальными складками характеризовалась резкой гипертрофией маргинального рельефа клеток и сглаживанием рельефа в цетральных отделах цитолеммы.

В центре области растяжения внутренняя поверхности артерии оставалась гладкой. Микродефекты в ыонослое андотелиоцитов формировались в виде расширенных межклеточных промежутков, однако протяженность и ширина межклеточных щелей была значительно меньше, чем в проксимальном и дистальном отделах зоны дистракции.

На внутренней поверхности артерии формировались интимальные ямки, в области межклеточных отыков встречались локальные вздутия цитолеммы андотелиоцитов.

Эндотелиальные клеш* в центре зоны дистракции характеризо-

заяись выраженным полиморфизмом. Варьирование клеток во величине и форме было особенно выражено вблизи зоны гиперплазии ЭК.

Гиперпластическая зона формировалась только в центральных отделах зоны растяжения. Клетки составляющие ее были представлены мелкими зндотелиоцитами веретеновидной формы. Область, прилежащая к край зоны гиперплазии была, наоборот, представлена крупными распластанными зндотелиоцитами.

Ультраструктура ЭК в зоне дистракции характеризовалась истончением цитоплазмы клеток, гипертрофией внутриклеточных орга-нелл и нарушением-контактных взшшодейстЕш"1 зндотелиоцитов.

Данные проведенного исследования показали, что длительное растяжение большеберцовой артерии вызывает изменение'структуры и пространственной организации во всех трех ее слоях.

Во внутренней ободочке артерии эти изменения касались преимущественно монослоя ЭК. В средней сболочке артерии уже на све-тооптическом уровне был виден выраженный ыедиосклероз. Увеличение содержания внеклеточного соединительнотканного матрикса было особенно заметно вблизи границы между средней и наружной оболочками артерии. Обьемная плотность гладксмыпечных клеток (ГМК) уменьшалась на фоне увеличения абсолютного количества клеток в иг. ткани.

В условиях длительного растяжения степень ориентированности ГМК снижалась, причем в центре зоны дистракции ГМК были более дезориентированы, чем в проксимальном и дистальном отделах области растяжения.

При исследовании пространственной организации и формы ГМК было показано, что в средней оболочке" артерии расширяются межклеточные промежутки.. Основным видом межклеточных взаимодействий становятся контакты по типу "конвц-в-бок". Как правило отроотки

ГМК контактируют o боковыми поверхностями соседних клеток. Иногда в средней оболочке встречались свободнолежгяцие отростки гладких миоцитов. В популяции ГМК увеличилась доля отросчатых клеток, которые были представлены мисцитами Y-образной и звездчатой формы.

При исследовании ультраструктуры ГМК было показано, что В условиях длительного растяжения происходит изменение фенотипа клеток от сократительного к синтетическому.

В наружной оболочке сеть -соединительнотканных волокон становилась более густой. В фибробластах были обнаружены ультраструктурные признаки усиления синтетической активности клеток.

Особо следует отметить тот факт, что в условиях длительного растяжения индуцируется ангиогенная активность в vasa vasorum наружнсй оболочки сосуда с формированием сосудистых почек и прорастанием вновь образованных микрососудов глубоко в среднюю оболочку артерии.

Прежде чем приступить к выполнению экспериментальной. части ■ данного исследования, мы должны были определиться в выборе модели-. позволяющей осуществить кратковременной и длительное растяжение артерии. По нашему мнению, оптимальный вариант экспериментальной модели должен отвечать следующим требованиям: 1) простота воспроизведения; 2) минимальная травматизация стенки артерии; 3) хорошо контролируемые режимы растяжения.

Анализ данных литературы (Илизаров Г.А., 1982,1980; Илиза-ров Г.А. и др., 1984;) показал, что для моделирования длительного растяжения артерии наиболее подходит аппарат для компрессионно- дистракционного остеосинтеза, разработанный Г. А.Илизаровым (в дальнейшем-аппарат Шшзарова). Сила растяжения, генерируемая ал-

паратом Илизарова приложена к кости, на стенку артерии она передается через окружающие мягкие ткани, что исключает возможность грубого повреждения артерии в зоне дистракции. Кроме того, при помощи аппарата Илизарова можно задавать и стандартно воспроизводить любые режимы растяжения.

В доступной нам литературе, данные о способа* моделирования кратковременного растяжения■артерии были крайне немногочисленными (Clowes et al., 1S89;).

' Поскольку готового способа моделирования кратковременного растяжения артерии мы не нашли, нами была проведенз серия предварительных экспериментов. Мы использовали специально сконструированные приспособления для генерации силы растяжения с максимально стандартными параметрами. К сакалению, любые варианты таких приспособлений предусматривают их фиксацию непосредственно к растягиваемому сосуду. В этом случае иммобилизация и растяжение артерии сопровождаются очень грубыми ее повреждениями, включая разможжение стенки и разрывы эластических мембран.

, Поэтому, мы остановились на ручном способе иммобилизации и растяжения сосуда. В качестве основных критериев для стандартизации воздействия были выбраны амплитуда растяжения (1/3 первоначальной длинны растягиваемого сегмента аорты) и время воздействия (Беек.). Как показали предварительные эксперименты, растяжение в таком режиме в наименьшей степени травмирует стенку аорты.

После кратковременного и длительного растяжения сосудов на их внутренней поверхности появлялись множественные интимапьные складки. По мнению большинства исследователей, интимальные складки являются одним кз тигагчных артефактов иммерсионной фиксации. Бри фиксации сосудов методом перфузии, интимальные склад-

ки могут появляться в результате падения перфузионного давления (Алиев Г.М., 1988).

Поскольку во всех случаях мы тщательно следили за условиями перфузионной фиксации, есть основания утверждать, что различия в микрорельефе люминалыюй поверхности контрольных и опытных сосудов возникли в результате экспериментального воздействия и не являются артефактом.

Кроме того, после . длительного растяжения, интимальные складки формируются только в проксимальном и дистальном отделах зоны дистракцки. тогда как рельеф центрального отдела всегда был гладким. Этот факт трудно объяснить случайны;.! падением перфузионного давления, поскольку в этом случае интимальные складки были бы равнймэрно распределены на внутренней поверхности артерии. Исходя из того, что интимальные складки в условиях длительного растяжения появлялись только в тех местах, котосые находились в непосредственной близости к точкам приложения силы (проксимальный и дпотальныл отделы зоны дистрачции), мы считаем, что их возникновение есть результат пересокращения ГМК средней оболочки в ответ на чрезмерную экзогенную нагрузку. По нашему мнению, та же причина лежит в основе формирования интимальных складок после кратковременного растяжения аорты.

Нам кажется, что расширение межклеточных промежутков происходит в результате непосредственного действия силы растяжения на зндотелиэльный монослой. Еозмс/шо, при этом обнажаются поверхностно расположенные коллаген IV типа базальной мембраны или элас'ин, не обладающие способностью к стимуляции тромбоцитов (Н";-шг1, Вепсй^, 1987).. Поэтому область расширенных межклеточных промежутков молет оставаться атромбогенной.

Вместе с тем, в просвете артерии обнарулиззвтсп едкшг-гные

пристеночные микротромбы. Методом СЭМ мы не. можем точно идентифицировать повехность, к которой они прикрепляются.Вероятно, микротромбы образуются или в области расширенных межклеточных промежутков ■ или непосредственно на поверхности эндотелиальных клеток. В первом случае, можно предположить, что при растяжении обнажаются не только поверхностные, но и более глубоко расположенные структуры, в частности коллаген I и III. типов, вызывающий In vitro агрегацию тромбоцитов (Madri et al., 1930). Образование микротромбов на поверхности эндотелиальных клеток возможно в результате нарушения состава и атромбогенных свойств клеточных ыембранСМагеоНэ et al.,1979; Zetter et al., 1978). In vitro показано, что расположение белковых молекул на плазмалемме эндотелиальных клеток в значительной степени определяется межклеточными контактными взаимодействиями (Marffolis et al.,1979; Zetter et al., 1978).которые, вероятно, нарушаются при разобщении эндоте-лиоцитов под влиянием механического растяжения.

Не исключено, так же, что в результате механического растяжения надрываются структуры ВЭ4 с формированием на люминальной поверхности артерии интимальных ямок на месте фенёстр ВЗМ, Известно, что к их образованию может приводить растяжение артериальной стенки в условиях острой и хронической гипертензии и при старении (Караганов Л.Я. и др., 1986; Миронов В.А. и др.., 1989).

Причины возрастания полиморфизма эндотелия до конца не понятны. Считается , что решающая роль здесь принадлежит распластыванию и деленют эндотелиальных клеток (Караганов Л.Я. и др., 1986; Миронов А.А. и др., 1983). Возможно, сходные процессы происходят и-в условиях нашего эксперимента. При этом крупные эндо-телиоциты образуются, вероятно, в результате распластызания или палишюидпэаши клеток, а более мелкие клетки гиперпластической

еоны - в ревультате деления эндотелиоцитов.

В культуре тканни распластывание, миграция и пролиферация эндотелиоцитов могут индуцироваться нарушением непрерывности монослоя клеток (Heimark, Schwartz,. 1988). Существующие способы моделирования нарушения целостности эндотелиального монослоя ( механическое, криогенное и осмотическое повреждения ), как правило, сопровождаются образованием значительных по площади зон деэндотелизации. При этом происходит массивная адгезия клеток крови к деэндотелизированной'поверхности и выделение многочисленных митогенных факторов, которые сами по себе могут индуцировать пролиферацию эндотелиоцитов. В таких условиях.трудно разделить влияние фасторов роста и нарушения межклеточных контактов на индукцию морфогенетических реакций эндотелиальных клеток.Использованная нами экспериментальная модель в значительной мере лишена этих недостатков. Мы не наблюдали в просвете, артерии процесса массивного тромбообразования. Влиянием факторов роста, которые, возможно, выделяют клетки пристеночных микротромбов, по нашему мнению можно пренебречь, так как микротромбы единичные и встречаются довольно редко. Кроме того, мы ни разу не обнаруживали микротромбов в пределах гиперпластической зоны или прилежащих к ней областей. Очевидно,основная роль в индукции распластывания и деления эндотелиальных клеток в гоне дистракции принадлежит снятию контактного торможения врезультате механического растяжения.

Уменьшение объемной плотности мкофиламентов в ГМК и увеличение содержания в клетках профилей гранулярной эндоплазматичес-кой сети и митохондрий в настоящее время принято обозначать как изменение фенотипа ГМК от сократительного к оинтетическому (Campbel, Campbel 19S7, Thyberg et al., 1990). Синтетическая ак-

тивность таких клеток, вероятно, ведет к накоплению в межклеточном пространстве соединительнотканных структур, что может вызывать еще большее разобщение ГМК. Известно, что ГМК синтетического фенотипа'обладают преимущественной способностью к образованию отростков (арборизации), поскольку образование отростков ГМК -цитоскелетэависимый процесс,' включающий стабилизацию микротрубочек и дезинтеграцию актиновых. филаменгов (Chaldakov et al.,

1989). Мы допускзем, что в условиях нашего эксперимента отростки ГМК могут формироваться как пассивно, за счет механического вытягивания цитоплазмы в местах сохранившихся фокальных контактов между клетками, так и активно, за счет псевдоподиальной реакции

. клеток в ответ на разобщение. Помимо способности к образованию отростков, синтезу и секреции компонентов внеклеточного матрикса ГМК синтетического фенотипа обладают преимущественной способ. ностью к пролиферации (Schwartz et al., ■ 198В, Thybere et al.,

1990).

По данным Г.А. Илизарова с соавторами (1984), удлинение конечности в режиме 1 мм / сут не. ведет к деэндотелизации и тром-бообразованио з артериях. В зоне диотракции мы 'не обнаружили повреждения или гибели ГМК артериальной стенки, также как и проникновения в нее лейкоцитов и макрофагов. . Поэтому, в условиях нашего эксперимента пролиферация ГМК, вероятно, обусловлена на столько экзогенными стимуляторами роста (Schwartz et al., 1990), активация которых, как правило, связана с серьезным повреждением стенки артерии ( Liu et-al., 1989), сколько нарупеннем баланса во взаимодействии эндогенных стимуляторов и ингибиторов роста ГМК (Schwartz et al., 1990, Thyberg et al., 1990) в.результате нарушения межклеточных контактных взаимодействий.

Ориентация ГМК в контрольных артериях определяется силой

-¿о -

пульсового давления, которая растяпшает артериальную стенку в поперечном направлении (Seidel, Schildmeyer, 1987). Мы считаем, что неодинаковое изменение ориентации ГМК артерий в зоне дист-ракции, возможно, происходит а результате неравномерного распределения силы продольного растяжения в проксимальном, центральном и дистальном отделах. В условиях нашего эксперимента сила растяжения приложена к кости, а на артериальную стенку передается через окружающие ткани. Поэтому логично предположить, что растяжение артериальной стенки будет больше в тех участках, которые располагаются ближе к точкам приложения силы, т.е.' в проксимальном и дистальном отделах области растяжения. В центре зоны дист-ракции сила растяжения, действующая на артериальную стенку, вероятно, будет уменьшаться за счет эластичности окружающих тканей. Кроме того, силы продольного растяжения, приложение дис-тальнее и проксимальнее центрального отдела зоны дистакции, имеют противоположные векторы. Таким образом, в центре зоны дист-ракции результирующий вектор силы, .действующей на артериальную стенку, вероятно, не будет иметь определенной налравлености. Ориентация ГМК в центре зоны дистракции очень напоминает картину ip vitro, где в аналогичных условиях артериальные ГМК остаются беспорядочно ориентированными (Buck, 1980, 1983, Dartsch, Hammerle , 1986).

В проксимальном и дистальном отделах области растяжения клетки сохраняют ориентацию, отличающуюся от ориентации ГМК контрольных артерий. Вероятно, эти отличия определяются изменением векторов сил, действующих на артериальную стенку, вЗлйзй точек приложении сил продольного растяжения.

Большинство из известных механических факторов .индуцирующих процессы ачгиогепеза. связаны с лекальным усилением кровото-

ка, гемодинамическим отрессом и повреждением эндотелиальных клеток. В зоне дистракции мы не наблюдали гибели андотелиоцитов в уазз уаБогиш .Вероятно, в условиях нашего эксперимента значительного повреждения эндотелия микрососудов не, происходит, так как сила растяжения не приложена непосредственно к стенка артерии, а передается на нее через окружающие ткани.Возможно, что при этом нарушаются только контакты между отдельными элдотели-альными клетками, что само по себе может индуцировать их пролиферацию. Кроме того,нарушение межклеточных контактных взаимодействий . вызывает активацию ряда протеолитических ферментов мембран эндотелиоцитов, что в свою очередь создает условия для миграции клеток. Нельзя также исключить, что подвергающиеся растяжению гладкомышечные клетки в средней оболочке артерии выделяют ангиогенные факторы, индуцирующие рост микрососудов в сторону средней оболощш.

ВЫВОДЫ

1. Кратковременное растяжение аорты крысы вызывает изменения преимущественно во внутренней оболочке сосуда и не оказывает существенного влияния на морфологию средней и наружной оболочек.

2. Изменения в структуре монослоя эндотелиоцитов аорты крысы появляются через 90 минут после кратковременного растяженкл сосуда и характеризуются образованием микрадефектов в.монсслов эндотелиальных клеток, расширением межклеточных промежутков, усилением рельефа маргинальных зон эндотелиоцитов и нарушением атрсмбогенносги пласта.'

3. Непрерывность монослоя эндотелиальных клеток восстанавливается через сутки посл^ кратковременного растяжения аорты крысы. Нормализация микрорель:|а клеточной поверхности завершается через две недели после экспериментального воздействия.

4. После длительного растяжения в проксимальном и дистальном отделах зоны дистракции во внутренней оболочке большеберцовых артерий собаки расширяются межклеточные промежутки, нарушается атромбогенность монослоя эндЬтелиоцитов, изменяется микрорельеф клеточной поверхности. В центре зоны дистракции в результате распластывания и деления эндотелиальных клеток возрастает полиморфизм эндотелия, изменяется тканевая организация монослоя эн-дотелиоцитов.

5. В условиях длительного'растяжения большеберцовой артерии собаки происходит дезинтеграция гладкомышечных клеток средней оболочки сосуда, изменяется тип межклеточных йзаимодействий, форма, ориентация и фенотип гладких миоцитов от сократительного к синтетическому. Возникает фиброз артериальной стенки.

6. При длительном растяжении большеберцовой артерии собаки возрастает содержание соединительнотканных волокон в наружной оболочке сосуда. В фиброблзстах наружной оболочки появляются ультраструкгурные признаки усиления синтетической активности клеток. ,

7. Длительное растяжение большеберцовых артерий собаки индуцирует ангкогенез в микрососудах наружной оболочки с прорастанием vasa vasorum в среднюю оболочку артерии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Филиппов C.B., Рехтер М.Д., Полицук P.C., Воронов С.Н., Червяков В.И., Миронов A.A. Изменение пространственной организз-ции и структуры гладкомышечных клеток средней оболочки магистральных артерий в условиях продольного растяжения In situ // Цитология- 19ЭЗ. -Т.35, NB. -С.3-8.

2. Филиппов C.B., Рехтер М.Д., Полишук P.C., Гуркин C.B.,

-Z3-

Воронов С.H., Червяков В.И., Миронов A.A. Изменение ориентации гладкомьшечных' клеток средней оболочки магистральных артерий в условиях постоянного продольного растяжения in situ // Цитология - 1993. -Т.35, N9. -С.62-65.

3. Полшук P.C., Филиппов C.B., Колпаков В.А., Рехтер М.Д., Миронов A.A. изменение ориентации и формы клеток . эластико-гиперпластического слоя интимы аорты человека в области устьев межреберных артерий. // Цитология - 1993. -Т.35, 118. -С.7-9.

4. C.B. Филиппов, М.Д. Рехтер, A.A. Миронов, С.Н. Воронов, В.И. Червяков. Изменение структуры эндотелия магистральных артерии в условиях продольного растяжения in vivo (по данным сканирующей электронной микроскопии). // Морфология - 1993. -Т.104, N1-2. -С.50-57.

5. C.B. Филиппов, М.Д. Рехтер, A.A. Миронов, В.И. Червяков. Влияние механической стимуляции на васкуляризацию стенки магистральной артерии. // Билл. Эксп. Биол. Мед. 1992. -T.CXIII, N.4. -С.437-439.

6. C.B. Филиппов, М.Д. Рехтер Моделирование ангиогенеза при растяжении тканей. В кн.: В.В. Куприянова, В.А. Миронова, A.A. Миронова, О.Ю. Гуриной. Ангиогенез. Образование, рост и развитие кровеносных сосудов. С.97-99.

■ 7. Philippov S.V. Influence of the in vivo stretching on the structure of arterial wall. In: Abstract Book of 7th International Medical Sciences Student Coneress, May 23-25, Istanbul University, Faculty of Medicine. Istanbul 1991, Turkey. (In Enal.).