Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование применения аутогемомагнитотерапии в лечении рака молочной железы

На правах рукописи

Старжецкая Мария Владимировна.

Клиннко-экспериментальное обоснование применения аутогемомагнитотерапии в лечении рака молочной железы.

Специальность 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2002.

Работа выполнена в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте МЗ РФ, директор института академик РАМН Ю.С.Сидоренко.

Научный руководитель

Научный консультант Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Ю.Н.Бордюшков доктор медицинских наук Л.Я.Розенко доктор медицинских наук, профессор В.П.Задерин доктор медицинских наук, профессор Н.А.Огнерубов Ведущая организация - Волгоградская государственная медицинская

Академия

Защита состоится 2€ апреля 2002 г. вЗ часов на заседании диссертационного совета Д 208.083.01 при Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте МЗ РФ (344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского научно-исследовательского онкологического института МЗ РФ.

Автореферат разослан 2.4-, о 2 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Г.А.Неродо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования. На протяжении последних десятилетий рак молочной железы занимает одно из первых мест по заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований женщин в России с неуклонной, характерной для многих стран, тенденцией к росту заболеваемости (Чиссов В.И., Старинский В.В., с соавт. 1999).

По целому ряду причин, в том числе и социальных, более половины больных на момент обращения за медицинской помощью имеют местнорас-пространенную форму заболевания, с отдаленными скрытыми метастазами почти у 50% больных раком молочной железы 116 стадией и 80-90% с Шб стадией (Огнерубов Н.А. и соавт., 1996; Поддубная И.В., 1998; Летягин В.П. и соавт., 1996, 2001; Bonadonna G., et al, 1996, 2000; De la Garza J., et al. 2000; Braud A., et al., 2000).

Рак молочной железы, как системное заболевание, развивается на фоне нарушений иммунной системы, возникающих уже при предопухолевых заболеваниях, пропорционально усиливающихся с распространенностью опухолевого процесса и еще более усугубляющихся при проведении необходимого комплексного лечебного воздействия (операция, облучение, химио-гормонотерапия). Эта позиция объясняет стремление многих исследователей к дальнейшему изучению состояния иммунной системы и разработке новых, более эффективных схем лечения больных раком молочной железы (Моисе-енко В.М., 1998,2000; Новиков В.И., 1999).

На сегодняшний день одним из современных и перспективных направлений в онкологии является метод аутогемохимиотерапии, разработанным академиком РАМН, профессором Ю.С.Сидоренко в 1982 году.

Разработчиками этой проблемы была установлена высокая эффективность аутогемотерапии и ее модификаций при лечении злокачественных опухолей (Сидоренко Ю.С., 1985; Лазутин Ю.Н., 1996; Попова И.Л., 1999; Владимирова Л.Ю., 2000; Бордюшков Ю.Н., 1997; 2000, 2001; Верховцева А.И. и соавт. 2001; Айрапетов К.Г., 2002). Показано, что модифицированная кровь целенаправленно изменяет функциональное состояние внутренних ор-

ганов и реактивность организма. Как неоднородная многокомпонентная сис-тема;кровь обладает уникальными электрическими и магнитными свойствами, что определяет возможность ее результативного взаимодействия с факторами электромагнитной природы.

Известно, что биологическое действие переменного магнитного поля имеет преимущественно неспецифический характер и связано с изменением активности регуляторных систем организма. Выявлена взаимосвязь между положительной динамикой неспецифической резистентности организма под влиянием переменного магнитного поля и повышением его противоопухолевой сопротивляемости (Гаркави JI.X., Шихлярова А.И. и соавт., 1996, 2001; Бахмутский Н.Г., 2000). Однако влияние переменного магнитного поля на организм и его иммунную систему изучалось главным образом, в эксперименте in vivo (Л.Х.Гаркави и соавт., 1986; Е.Ю.Златаик и соавг., 1999; Бахмутский II.Г., 2000; А.И.Шихлярова, 2001). Лишь в отдельных работах анализировалось его действие непосредственно на иммунокомпетентные клетки при их обработке in vitro {А.А.Подколзип, В.И.Донцов, 1994; Е.Ю.Златаик и

соавт., 1997; Ю.Н.Бордюшков и соавт., 1997, 2000; С.С.Бессемельцев и cotí О—

авт., 1998, 2001). Эффекты переменного магнитного полЗРпараметры гомео-стаза организма человека и, в частности на клетки периферической крови, изучены крайне недостаточно. Вышеизложенное послужило основанием для изучения возможности использования сочетания действия метода аутогемо-химиотерапии и переменного магнитного поля при лечении больных местно-распространенным раком молочной железы.

Цель нашего исследования: экспериментально обосновать необходимость проведения аутогемомагнитотерапии в лечении рака молочной железы; а также изучить некоторые механизмы опосредованного действия переменного магнитного поля на организм больных раком молочной железы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. В эксперименте in vitro изучить иммуномодулирующее действие переменного магнитного поля различных временных, индукционных, частот-

пых характеристик на кровь как опытных животных, так и больных раком молочной железы; кроме того исследовать состояние клеточных мембран лимфоцитов опытных животных.

2. Оценить клиническую эффективность метода аугогемомагнитотерапии с экстракорпоральным фракционным воздействием переменного магнитного поля на аутокровь в комплексном лечении больных раком молочной железы.

3. Оценить изменение иммунного статуса больных раком молочной железы в процессе комплексного лечения.

4. Изучить адаптационные реакции у больных раком молочной железы в процессе проведения терапии.

5. Изучить лекарственный патоморфоз рака молочной железы с использованием методов световой и электронной микроскопии.

Научная новизна работы:

• в диссертационной работе впервые на субклеточном, клеточном, тканевом, системном, организменном уровнях раскрыты возможные механизмы ау-тогемомагнитотерапии как метода иммунокоррекции in vitro, in vivo;

• впервые in vitro изучено действие переменного магнитного поля на лимфоциты больных раком молочной железы;

• впервые изучена степень выраженности местных иммунных реакций в строме, паренхиме рака молочной железы после комплексного лечения с использованием аугогемомагнитотерапии;

• впервые проведено изучение электронно-микроскопических проявлений лечебного патоморфоза после указанного метода лечения;

• впервые изучены адаптационные реакции в процессе проведения аутоге-момагнитотерапии.

Практическая значимость работы:

• Разработан и применен в практику в качестве компонента комплексного лечения онкологических больных метод аутогемомагнитотерапии - «Спо-

соб лечения рака молочной железы», заявка №2000119252/14(020220), приоритетная справка от 19.07.2000.

• Предложен курс аутогемомагнитотерапии с экстракорпоральным фракционным воздействием переменного магнитного поля на аутокровь больных в плане комплексного лечения, позволяет достичь полной и частичной регрессии опухоли и региональных метастазов у 80-90% больных местнораспространенным раком молочной железы.

• Установлено, чтометод аутогемомагнитотерапии обеспечивает отсутствие выраженных проявлений лекарственной токсичности и позволяет осуществить иммунокоррекцию непосредственно в процессе лечения и может быть использован в качестве простого и доступного метода немедикаментозной иммунокоррекции в рамках терапии сопровождения комплексного лечения рака молочной железы

• Предложено применение эхокардиографического исследования в процессе мониторинга онкологических больных с проведением аутогемомагнитотерапии в комплексном лечении рака молочной железы.

Внедрение результатов исследования. Метод аутогемомагнитотерапии внедрен и применяется в клиниках Ростовского научно-исследовательского онкологического института.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Одной из сторон механизма опосредованного действия переменного магнитного поля на организм является модифицирующее его влияние на клетки крови, приводящее к позитивным изменениям их иммунобиологических свойств.

2. Метод аутогемомагнитотерапии является эффективным компонентом комплексного лечения больных местнораспространенного рака молочной железы, обеспечивая повышение непосредственных и отдаленных его результатов.

Апробация диссертации состоялась 14 марта 2002 г. на Ученом Совете Ростовского научно-исследовательского онкологического института.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 16 научных работах. Заявка на изобретение «Способ лечения рака молочной железы», №2000119252/14(020220), приоритетная справка от 19.07.2000.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на25Ллра-ницах; состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающег о3Сглитера-турных источников (¿^отечественных и/'^'зарубежных), содержит 35 таблиц и 68 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Экспериментальная часть работы выполнена на 40 белых беспородных крысах массой 150-200 г в возрасте 2-3 месяца, разводки вивария РНИОИ. Все животные были интактны.

Исследовали влияние омагничивания суспензии лимфоцитов и эритроцитов крови крыс, а также группы здоровых женщин (доноров) на структурно-функциональные показатели мембран клеток крови. Оценку относительной микровязкости мембран клеток крови осуществляли методом латеральной диффузии гидрофобного зонда пирена (Владимиров Ю.А., Доб-рецов Г.Е., 1980). Величину мембранного потенциала оценивали по интенсивности флюоресценции отрицательно заряженного поверхностного зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната (АНС). Интенсивность флюоресценции АНС, меняющуюся обратно пропорционально изменениям мембранного потенциала, определяли в лимфоцитах (Зацепина Г.Н., Венгрус Т.В., Горюнов H.H., 1993).

Определяли изменение активности макрофагального звена иммунитета у интактных животных по показателю макрофагальной трансформации, образование спонтанной реакции бластной трансформации лимфоцитов.

В основу клинической части работы положены данные о наблюдении за 80 больными местнораспространенным раком молочной железы, которые подвергались комплексному лечению в РНИОИ в 1999-2001 годах. Возраст больных колебался от 28 до 71 года.

В проспективное и контролируемое исследование отбирались больные, страдающие местнораспространенным раком молочной железы (116, Illa, III6 стадии), методом «слепого» отбора. Все больные были распределены на следующие группы:

• Основная группа -55 больных, каждая из которых получала неоадъю-вантную аутогемохимиотерапию с экстракорпоральным фракционным омагничиванием аутокрови. Основная группа была разделена на две подгруппы, из которых 25 больных (подгруппа А) получали предварительный курс экстракорпоральной аутогемомагнитотерапии, а у 30 больных (подгруппа В) этот курс отсутствовал.

• Контрольная группа - 25 больных, которые подвергались неоадыовант-ной традиционной аутогемохимиотерапии.

Распределение больных по степени распространения опухолевого процесса представлено в таблице 1.

Таблица I

Распределение больных по степени распространенности процесса.

tnm Основная группа Контрольная группа Всего

а В

t2n,m0 1 (4%) 4 (13,3%) 3 (12%) 8 (10%)

t2n2m„ 4 (16%) 1 (3,3%) 4(16%) 9(11,25%)

t3nxm0 3 (12%) 2 (6,6%) 0 5 (6,25%)

t3n,m„ 2 (8%) 7 (23,3%) 4(16%) 13 (16,25%)

t3n2mo 4(16%) 4 (13,3%) 2 (8%) 10 (12,5%)

T4nim0 0 0 2 (8%) 2 (2,5%)

T4nim0 5 (20%) 5 (16,6%) 3 (12%) 13 (16,25%)

t4n2m0 6 (25%) 7 (23,3%) 7 (28%) 20 (25%)

всего 25(100%) 30 (100%) 25 (100%) : 80,(100%)

Сравнительная характеристика групп больных проводилась по следующим критериям: возрасту, состоянию менструальной функции, степени распространенности процесса, клшшко-анатомической форме рака молочной железы, данным гистологического исследования опухолей молочной железы и региональных лимфатических узлов. Изучаемые группы были сопоставимы по всем указанным параметрам.

После обследования и установления диагноза всем пациенткам проводилось лечение, которое на первом этапе включало неоадъювантную аутоге-мохимиотерапию.

• в подгруппе А основной группы лечение начинали с проведения курса ау-тогемомагнитотерапии (АГМТ) с экстракорпоральным воздействием переменного магнитного поля на аутокровь. Для этого в день лечения у больной производился забор 200-250 мл аутокрови во флакон с глюгициром. На аппарате «Градиенг-2» аутокровь подвергалась воздействию переменным магнитным полем заданными параметрами (50Гц 25мТл, 100Гц 50мТл в течение 20 мин), при постоянном вращении с реверсом. Затем проводилась реинфу-зия аутокрови. Манипуляции проводились каждый день в течении 5 дней. Через 7 дней начинали проведение курса аутогемохимиотерапии с экстракорпоральным фракционным воздействием переменного магнитного ноля (ПеМП) на аутокровь: у больной производился забор аутокрови в 2 флакона с глюгициром по 150-200 мл; первый флакон с аутокровью подвергали воздействию переменным магнитным полем используя примененные ранее параметры, во второй - добавляли смесь химиопрепаратов (винкристин по 1 мг в 1,8 день; метотрексат по 25 мг в 1,8 день; 5 Ш по 500 мг в 1,3,5,8,10,12 дни; циклофосфан по 200 мг в 1,3,5,8,10,12 дни; доксорубицин по 30 мг в 1,3,5,8,10,12 дни) и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течении 40 минут. Реинфузию производили последовательно: сначала флакон с омагниченной аутокровью, затем флакон с химиопрепаратами. Через 2 недели проводили второй аналогичный неоадыовантный курс аутогемохимиотерапии с экстракорпоральным фракционным воздействием переменного магнитного поля на аутокровь. Суммарные дозировки химиопрепаратов составили: винкристин - 4 мг; метотрексат - 100 мг; 5 Ш - 6000 мг; циклофосфан -2400 мг; доксорубицин -360 мг. В течение всего лечения каждой пациентке подгруппы А проводилось 17 процедур аутогемотерапии с экстракорпоральным воздействием переменного магнитного поля на аутокровь. Всем 25 больным этой группы проведено 425 процедур аутогемомагнитотерапии;

• у пациенток подгруппы В основной группы лечение сразу начиналось с проведения неоадъювантного курса аутогемохимиотерапии с экстракорпоральным фракционным воздействием переменного магнитного поля на ау-токровь по описанной выше методике, 30 больным этой группы проведено 360 процедур аутогемомагнитотерапии, каждая больная получила по 12 таких процедур. Схемы, режимы проведения химиотерапии и параметры омаг-ничивания аутокрови были аналогичны подгруппе А.

• в контрольной группе из 25 больных аутогемохимиотерапия (АГХТ) про -водилась по схеме химиотерапии, описанной выше.

Через 2 недели по окончании неоадъювантного лечения 80 больным было проведено оперативное лечение в объеме радикальной мастэкто-мии по Пейти. В послеоперационном периоде всем больным проведена дистанционная гамматерапия на пути лимфоопока в суммарной очаговой дозе по 40 Гр на каждую зону.

Воздействие переменным магнитным полем осуществлялось на аппарате «Градиент-2». Режимы омагничивания 50Гц 25мТл, 100Гц 50мТл, в течении 20 минут.

При анализе побочных токсических проявлений химиотерапии использовалась классификация степеней токсичности ВОЗ (Переводчикова Н.И., 1996; Гершановкч МЛ. с соавторами 1999).

Оценку эффективности лечения проводили через 2 недели после окончания курса аутогемохимиотерапии согласно критериям ВОЗ по стандартизации оценки результатов лечения (Переводчикова Н.И., 1996) на основании объективных клинико-лабораторных исследований.

Для изучения динамики иммунного статуса больных проводилось иммунологическое исследование до лечения и на его этапах: через 7 дней после окончания курса аутогемомагнитотерапии, после первого и второго курсов. В контрольной группе иммунологические исследования проводили до начала лечения, после первого и второго курсов АГХТ.

и

Количество Т- и В-лимфоцитов, их субпопуляционный состав, активность макрофагального звена и NK клеток определяли по стандартным методикам (Jondal et al., 1972; Goldstein A.J. et al., 1983; Фримель X., 1987).

Идентификацию адаптационных реакций по методу Л.Х.Гаркави (1990) с подсчетом лейкоцитарной формулы не менее, чем на 200 клетках на мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза проводили у больных раком молочной железы до и после проведения АГМТ, а также после каждого курса стандартной АГХТ и аутогемохимиотерапии с предварительным экстракорпоральным фракционным омагничиванием аутокрови.

Весь послеоперационный материал подвергался морфологическому исследованию. Во всех группах преобладал инфильтрирующий протоковый рак: в подгруппе А - 19 (76%) наблюдений, в подгруппе В - 23 (76,7%), в контрольной группе - 20 (80%). В единичных наблюдениях встречались не-инфильтрирующий внутрипротоковый рак, тубулярный рак, внутрипротоко-вый рак.

Для морфологического исследования операционного материала, вырезали кусочки опухоли из центральной и периферической ее части, размером 1x0,5x0,1-0,2 см, общим количеством 10 штук (по 5 кусочков), заведомо избегали некротизированные участки. Для морфометрических исследований был использован морфометрический измерительный комплекс «САГА» на базе ПЭВМ, разработанный совместно РНИОИ и Таганрогским НИИ связи. Полуколичественная оценка лимфоплазмоцитарной инфильтрации опухоли осуществлялась по баллам. Оценку иммунологической активности региональных лимфатических узлов проводили по 3-балльной системе, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, (А.Котье с соавт., 1973). Биопсийный материал 12 больных был подвергнут электронно-микроскопическому исследованию, по полутонким срезам, окрашенным метиленовым синим (по Lynn, 1965), производили прицельную заточку блоков. Ультратонкие срезы приготовляли на ультрамикротоме УМТП-4, контрастировали уранилацетатом (по Watson, 1958) и цитратом свинца (по Reynolds, 1963).

Расчет выживаемости проводился с помощью классического непараметрического метода Каплана-Мейера (1958).

Для статистической обработки клинических результатов и данных лабораторных исследований пользовались критериями Стьюдента Вилкоксо-на-Манна-Уитни и углового преобразования Фишера (Гублер Е.В., 1978). Нижним порогом достоверности считался уровень 0,05.

Результаты исследования.

Экспериментальный раздел.

При проведении в эксперименте аутогемохимиотерании с одновременным фракционным омагничиванием порции крови животных установлено, что омагничивание крови позволило сохранить более высокий уровень лейкоцитов в 1,6 раза по сравнению с контролем, и, главное, абсолютное количество лимфоцитов (в 1,5 раза). При омагничивании крови опытных животных in vitro были получены данные об существенном усилении процесса макрофагальной трансформации моноцитов (41,10+2,51% против 34,09+2,51% в контроле); усиление реакция бластгрансформации лимфоцитов. Таким образом, условия омагничивания крови способствовали сохранению функциональной активности того пула лейкоцитов, через который реализуется клеточный противоопухолевый иммунитет.

Кроме того, анализ биофизических клеточных параметров показал, что омагничивание образцов крови приводило к увеличению текучести мембран лимфоцитов опытных животных, уменьшению заряда мембранного потенциала лимфоцитов, определяемый по интенсивности флюоресценции ЛИС.

Изучение влияния ПеМП на иммунобиологическое состояние лимфоцитов крови больных РМЖ in vitro (рис. 1) показало сходные изменения при использовании изученных режимов (50Гц 25мТл; 100Гц 50мТл; экспозиция - 20 минут), заключающиеся в стимуляции функциональной активности

Т- и ИК клеточных звеньев, усилении адгезивных свойств Т-лимфоцитов и разнонаправленных изменениях экспрессии субпопуляционных рецепторов.

100 80 60 40 20 О -20

Рис 1. Влияние различных режимов ПеМП при экстракорпоральной обработки крови оикобольных на иммунологические параметры лимфоцитов (% от фона).

Примечание: * - статистически достоверные отлнчия от фоновых значений (р<0,05).

Установлено, что использованные режимы ПеМП привели к стимуляции активности N 1С-клеток в ЦТТ, при этом максимальный эффект (повышение на 80%) достигался при омагничивании крови в режиме 100Гц 50мТл. Использование ПеМП с более низкой индукцией (50Гц 25мТл) вызывало повышение данного показателя лишь на 40%. Любопытно, что несмотря на отсутствие статистически достоверных изменений уровня СБ 16+ клеток при омагничивании крови, все использованные режимы ПеМП привели к стимуляции активности Т^К-клеток в ЦТТ. При этом отдельное омагничивание клеток-мишеней не увеличивало значений ЦТТ. Это может свидетельствовать о том, что ПеМП использованных режимов не обладает ни самостоятельным цитотокснческим действием, ни сенсибилизирующим тест-культуру К 562 к действию МК-клеток, а полученный эффект стимуляции N К-клеток связан именно с усилением цитотоксической активности последних.

Оценка функциональной активности Т- и В-клеток (рис. 1) под действием ПеМП продемонстрировала ее статистически достоверную стимуляцию при всех использованных режимах. Исследование влияния ПеМП на

* *• к к 1 * □ 50Гц25мТл И 100Гц 50мТл * Л гй * * # I Р! гП Ш л гП гп

^ ^ / /У^ / / //уЦ

экспрессию субпопуляционных и активационных рецепторов на лимфоцитах онкологических больных показало отсутствие статистически достоверных изменений содержания клеток с С1)8+, СО 16+, СБ25+ и НЬЛ-Б11+ рецепторами вне зависимости от использования режимов омагничивания. Рецептор В-клеток (СБ20+) стимулировался ПеМП при обоих изученных режимах. Активационный рецептор С095+, участие которого в реализации апоптоза по Раз-зависимому механизму является необходимым, хотя и недостаточным, стимулируется ПеМП при режиме 50Гц 25мТл и 100Гц 50мТл.

Омагничивание проб крови больных усиливало способность лимфоцитов образовывать розетки с эритроцитами барана и мыши (рис. 2.), что указывало на повышение адгезивных свойств лимфоцитов, благодаря которым обеспечивается межклеточный контакт, а также проникновение

СОЗ+

у

ж/ V.

•*уь,5 \у

ж / \ ^ фон

СЭ20+ *—^—»- - у *ЕМ-РОК - - после ПеМП

V \ / ж

-V \ ' ж

-V V

Е-РОК

Рис. 2. Влияние экстракорпорального воздействия переменного магнитного поля на лимфоциты больных раком молочной железы.

лимфоцитов из периферической крови в очаг поражения. При этом, вероятно, повышалась сорбция химиопрепаратов на омагниченных клетках, что играет важную роль при проведении АГХТ. В пользу такого предположения говорит то обстоятельство, что действие ПеМП приводило к возрастанию экспрессии СЭ2+. Полученная стимуляция спонтанной и митоген-индуцированной РБТЛ под действием ПеМП свидетельствовала о его способности усиливать синтетические процессы в ядре лимфоцитов. Увеличение цитотоксичности Г^К-клеток под действием ПеМП позволяет говорить о его стимулирующем влиянии на важнейшее звено противоопухолевой рези-

стентности. Подобный эффект, достигаемый с помощью экстракорпоральной обработки лимфоцитов цитокинами (например, интерлейкином-2) с образованием ЛАК (лимфокин-активированных киллеров), описан в литературе и применялся в клинике (Rosenberg S.A. et al., 1985; Новиков В.И. и соавт., 1999). Однако способность ПеМП вызывать аналогичное действие ранее нигде не описывалось. Весьма вероятно, что в его основе лежит усиление продукции и рецепции цитокинов омагниченными иммунокомпетентными клетками.

Нами установленно повышение ЛПС-индуцированной продукции TNF-a при действии на кровь больных ПеМП в режиме 100Гц 50мТл. Так, если исходный индекс стимуляции был резко снижен и составлял 1,27±0,66, то в омагниченных пробах он достигал 3,97±0,97 (р<0,05). Сходная динамика прослежена и в отношении продукции IL-1J3 (рис. 3).

□ фон спонт

□ фон индуц 050Гц 25мТл спонт

□ 50Гц 25 мТл индуц

□ ЮОГц 50мТл спонт 0100Гц 50мТл индуц

IL-1

TNF-

Рис. 3. Влияние переменного магнитного поля на продукцию монокинов у больных раком молочной железы.

Клинические исследования.

Анализ непосредственных результатов лечения (рис.4.) в основных группах показал, что в подгруппе А с проведением предварительного курса АГМТ полная клиническая регрессия опухоли установлена в 5 (20%) наблюдениях, частичная в 18 (72%), стабилизация процесса - у 2 (8%) из 25 пациенток (р<0,01).

В подгруппе В без предварительного курса АГМТ, соответственно, в 4 (13,3%) случаях регистрировалась полная регрессия, у 21 больной (73,3%)

- частичная регрессия, стабилизация процесса имела место в 5 (16,7%) из 30 больных (р<0,01).

В контрольной группе с проведением стандартной АГХТ полная регрессия отмечена у одной больной (4%), частичная - у 14 (56%) и у 10 (40%) их 25 больных выявлена только стабилизация процесса (р<0,01). Про-грессирования заболевания в изучаемых группах не обнаружено.

100 80 72%* 70% И подгруппа А И подгруппа В

60 II 56% □ контрольная группа

40 20 0 50%* 13.3% ГШ^ ш 16,7°/ 8%*|§1 40% 0% 0% 0%

ПР ЧР • Ст Пр

Рис. 4. Непосредственные результаты лечения.

Примечание: ПР - полная регрессия; ЧР - частичная регрессия;

Ст - стабилизация процесса; Пр - прогрессировать процесса; -достоверно при (р<0,01) по сравнению с контрольной группой: * - с подгруппой А; **- с подгруппой В.

Гематологическая токсичность во всей основной группе больных была представлена лейкопенией I степени в 5% случаях. После проведения АГХТ в контрольной группе наблюдалась выраженная лейкопения П-1У степени в 24% наблюдений (р<0,01).

Негематологическая токсичность в группах была представлена в основном мукозитами (диарея, стоматит, цистит), диспептическими симптомами 1-Н степени.

Проведение курса АГМТ с экстракорпоральным фракционным воздействием ПеМП на аугокровь привело к достоверному повышению, по сравнению с исходным уровнем, процентного содержания "активных" Т-лимфоцитов (с 21,6±0,9% до 25,0±1,3%). Это сопровождалось усилением экспрессии С095+ (с 19,4±1,2% до 23,5+1,2%), а также митогенного ответа В-лимфоцитов (с 16,0±0,7% до 17,9±1,5%).

Дальнейшее лечение, включающее аутогемохимиотерапию с введением фракций омагниченной аутокрови (рис. 5), вызвало повышение содержания Т- (до 25,4±0,7% против исходных 21,6+0,92%) и В-клеток (до 18,5±0,4% против 16,0+0,7%). Одновременно отмечено увеличение их функциональной активности. Произошло снижение процента лимфоцитов с

Т-л

фон

контрольная группа 'основная группа

Рис. 5. Влияние аутогемохимиотерапнн с введением омагниченной аутокрови на иммунный статус больных РМЖ (109/л).

маркерами ранней (С025+) (до 10,4+1,2% с 22,0+3,9%) и поздней (СБ95+, НЬА-ОН+) активации (до 16,8±2,5% с 19,4±1,2% и 18,0±2,7% с 21,7±3,4% соответственно). Выявленная динамика свидетельствует о направленности в сторону нормализации. Кроме того, АГХТ с воздействием ПеМП на ауток-ровь способствовала повышению количества лимфоцитов, обладающих ци-тотоксическими свойствами (СБ8+ и СО 16+) у больных основной группы (до 0,51+0,05х109/л и 0,39±0,07х109/л соответственно) по сравнению с контрольной (до 0,4+0,13x10% и 0,24±0,03х109/л соответственно).

Следует отметить, что именно проведение АГМТ (еще до начала неоадъювантнон АГХТ) являлось причиной повышения многих абсолютных параметров клеточного иммунитета вплоть до его полной нормализации. Продолжение неоадъювантных курсов АГХТ с фракционным экстракорпоральным воздействием ПеМП на аутокровь не привело к угнетению иммунологических показателей - все они остались значительно выше исходных.

В>

Можно предположить, чтсГоснове полученного эффекта от введения омагниченной аутокрови лежит усиление продукции цитокинов, стимулирующих

пролиферацию, диффереицировку, миграцию и эффекторные функции лимфоцитов. Данный эффект связан с выраженным возрастанием содержания лимфоцитов в периферической крови, которое впервые регистрировалось после курса аутогемомагнитотерапии и поддерживалось на протяжении всего предоперационного лечения, а также с отсутствием на протяжении курсов химиотерапии выраженных гематологических и негематологических осложнений.

Сопоставление иммунологических изменений у больных, получавших АГХТ с экстракорпоральным фракционным воздействием разных режимов переменного магнитного поля на аутокровь, выявило ряд различий (рис.6). Так, после 1 курса при использовании режима ПеМП 100Гц 50мТл относительное содержание СБ4+ (37,85±2,9%) и СБ8+ (30,1±1,2%) клеток, а СБ25+ в относительном и абсолютном (17,2±1,8% и 0,33±0,05х109/л) значениях, было существенно выше, чем при режиме 50Гц 25мТл (29,2+1,9%, 23,8+1,9% и 10,0±1,7% и 0,17+0,02x10% соответственно). После окончания 2 курса сохранялась та же тенденция по количеству С04+ клеток. Остальные показатели, в том числе функциональные, не демонстрировали достоверных отличий в зависимости от использованных режимов переменного магнитного поля в комплексе с аутогемохимиотерапией.

лимфоциты

200

ППС

Т-л

КонА

В-л

фон

100Гц 50мТл 50Гц 25мТл

С016+

СР4+

СР8+

Рис. 6. Сравнительная характеристика иммунного статуса больных РМЖ основной группы при использовании различных режимов переменного магнитного поля (%).

В нашем исследовании мы выявили, что фоновую структуру адаптационных реакций у больных в исследуемых группах составила, в основном, реакция тренировки. Сопоставляя характер общих реакций организма при проведении стандартной АГХТ и АГХТ в комплексе с фракцией омагни-ченной аутокрови у больных РМЖ, мы отметили разнонаправленность вектора адаптивных процессов. В контрольной группе в структуре адаптационных реакций превалировали реакции стрессорного типа, являющиеся неблагоприятным фоном для эффективного лечения. Введение фракции омагниче-ной аутокрови оказывало модифицирующее влияние АГХТ на организм и позволило к концу лечения провести ее на основе развития преимущественно реакции повышенной активации, что обеспечило большую физиологичность и высокую эффективность данного способа лечения больных местнораспро-страненным раком молочной железы.

При морфометрическом исследовании материала выявлены изменения количественных характеристик структурного показателя опухоли. Соотношение структурных компонентов, касающиеся площади стромы и паренхимы опухоли в подгруппе А с предварительным курсом аутогемомагни-тотерапии, а именно 79,1% и 20,9% и подгруппе В, соответственно 80,6% и 19,4% было практически одинаковым (рис. 7). В целом, после обоих методов лечеиия отмечался значительный перевес в сторону развития соединительной

100 80 60 -40 -20

79,1% 80,6%

60,1%

20'9О/19.4°1

38,8%

И подгруппа А Шподгруппа В □ контрольная группа

0% 0%1,1%

строма

паренхима

некроз

Рис. 7.Сравнительный анализ морфометрическнх параметров в исследуемых группах.

Примечание: - достоверно при (р<0,05) по сравнению с контрольной группой: * - с подгруппой А; **- с подгруппой В.

0

ткани. Вместе с тем, показатели площади стромы в контрольной группе (60,1%) были достоверно ниже, а площадь паренхимы (38,8%) - выше, чем в обеих основных группах. Только в этой группе был отмечен некроз в 1,1%.

В нашем исследовании наибольший интерес приобрели данные о различной выраженности лимфоплазмоцитарной инфильтрации в первичной опухоли (рис. 8) и регионарных лимфатических узлов (рис. 9). Важнейшим отличием подгруппы А, с предварительным курсом АГМТ, от подгруппы В и контрольной группы явился более высокий уровень лимфоплазмоцитарной инфильтрации как в строме и паренхиме опухоли, так и в Т- и В-зонах регионарных лимфатических узлах.

А В контр гр А В контр гр

■ +++выраженная ЛПИ 0 ++умеренная ЛПИ

□ +минимальная ЛПИ О отсутствие ЛПИ

Строма Паренхима

Рис. 8. Лимфонлазмоцитарная инфильтрация паренхимы и стромы рака молочной железы после лечения.

А В кон гр А В кон гр

В +++выраженная ЛПИ О ++умеренная ЛПИ □ ^минимальная ЛПИ □ - отсутствие ЛПИ_

Т-зона л/узлов В-зона л/узлов.

Рис. 9. Лимфоплазмоцитарная инфильтрация Т- и В-зон лимфатических узлов.

Поскольку сравнительная оценка выраженности лечебного пато-морфоза при визуальной световой микроскопии выявила сходные изменения в основных А и В подгруппах, представляло значительный интерес провести исследование структуры опухоли на более тонком электроно-микроскопическом уровне.

Выявлено, что степень выраженности деструктивных изменений в опухолях после обоих методов лечения была практически одинаковой. В подавляющем большинстве клеток обнаружены необратимые патологические изменения, которые можно отнести к летальным повреждениям.

На клеточном уровне отмечался количественный перевес в соотношении структурных компонентов опухоли в сторону соединительнотканной прослойки в обеих подгруппах. Она была представлена обширными полями коллагеновых волокон, которые образовывали мощные пучки, ориентированные различным образом и составляли большую часть опухолевого остатка.

Ультраструктурные отличия между образцами тканей в изученных группах коснулись количества и функционального состояния таких клеточных компонентов стромы, как лимфоциты и макрофаги, ответственных за формирование местного противоопухолевого иммунитета. При электронно-микроскопическом исследовании тканей опухолей из подгруппы А, в отличие от подгруппы В, встретилось существенно большее количество лимфоцитов. Кроме того, отмечались многочисленные контакты между отдельными лимфоцитами. Также, только в подгруппе А обнаружены макрофаги, контактировавшие как с некротизированными остатками опухолевых клеток, так и с самими опухолевыми клетками.

В клинической онкологии основным определяющим моментом целесообразности и эффективности использования различных способов терапии, является анализ непосредственных и отдаленных результатов лечения: показатели безрецидивной трехлетней и общей выживаемости в зависимости от проводимой терапии представлены соответственно на рис. 10 и рис. 11.

В подгруппе А с проведением курса аутогемомагнитотерапии нам удалось добиться 100% трехлетней безрецидивной выживаемости, что достоверно отличало эту 1руппу от подгруппы В? где она составила - 85,4% и от контрольной группы - 40,9%.

-1-1-г

О мес 12 мес 24 мес 36 мес

Рис. 10. Трехлетняя безрецидивная выживаемость больных в изучаемых группах.

Примечание: - достоверно по сравнению с контрольной группой: * - при р<0,001; **- при р<0,01.

В подгруппе А с предварительным курсом аутогемомагнитотерапии трехлетняя общая выживаемость имела место у 100% больных, в подгруппе В - у 95% пациенток, что было существенно выше на 35% и 30%, чем в контрольной группе без проведения экстракорпорального воздействия переменного магнитного поля на аутокровь, где этот показатель составил лишь 65%.

Рис. 11. Общая выживаемость.

Примечание: - достоверно по сравнению с контрольной группой:

* - при р<0,001; **- при р<0,01.

Таким образом, совокупность экспериментальных данных по изучению влияния переменного магнитного поля на клеточном уровне позволило выявить опосредованное благотворное его воздействие с усилением цито-токсической активности клеток периферической крови, обеспечивающее активацию и четко выраженную тенденцию к нормализации отдельных звеньев противоопухолевой резистентности, что сопровождалось восстановлением электромагнитных и других биофизических параметров клеточных структур.

Из проведенных экспериментов, результатов клинико-лабораторных исследований следует, что использование магнитного поля в качестве фактора, модулирующего функциональное состояние лимфоцитов, является оптимальным для реализации противоопухолевого эффекта ауто-гемохимиотерапии.

Выявленные механизмы реализации опосредованного противоопухолевого эффекта способствовали разработке нового подхода к сопроводительной аутогемомагнитотерапии местнораспространенного рака молочной железы, что, в целом, позволило значительно улучшить непосредственные и отдаленные результаты комплексного лечения в целом.

Дальнейшая разработка исследования в этом направлении представляется чрезвычайно целесообразной.

ВЫВОДЫ.

1. Воздействие переменного магнитного поля на кровь опытных животных in vitro приводит к модифицирующему изменению показателей клеточного иммунитета и к нормализации биофизических параметров мембран иммунокомпетентных клеток. При использовании изученных режимов омагничивания (50Гц 25мТл, 100Гц 50мТл) крови больных раком молочной железы in vitro, обнаружена стимуляция функциональной активности Т- и NK клеточных звеньев, с усилением адгезивных свойств Т-лимфоцитов и разнонаправленных изменений экспрессии субпопуляци-онных рецепторов.

2. Применение аутогемомагнитотерапии с экстракорпоральным фракционным воздействием переменного магнитного поля на аутокровь в комплексной терапии местнораспространенного рака молочной железы позволяет достигнуть лучших непосредственных результатов лечения по сравнению с традиционной аутогемохимиотерапией. Полная и частичная регрессия опухоли в основной группе составляет в среднем 87,7%, что на 27,7% выше, чем в контрольной группе (60%) без применения аутогемомагнитотерапии (р<0,01).

3. Проведение аутогемомагнитотерапии в комплексном лечении больных местнораспространенным раком молочной железы обеспечивает трехлетнюю безрецидивную и общую выживаемость, соответственно у 92,7% и 97,5% больных, что на 51,8% и 32,5% соответственно выше, чем при традиционной аутогемохимиотерапии (40,9% и 65%, при р<0,001).

4. При использовании курса аутогемомагнитотерапии, предваряющего ауто-гемохимиотерапию, имела место выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация как стромы опухоли (42,9%), так и регионарных лимфатических узлов (Т-зоны 85,7%, В-зоны 57,1%). Отказ от предварительного курса аутогемомагнитотерапии снижает степень лимфоплазмацитарной инфильтрации как в строме опухоли, так и в лимфатических узлах (21,5%, 64,3%, 28,6% соответственно). При традиционной аутогемохимиотерапии без омагничивания - лимфоплазмоцитарная инфильтрация выявлена только в Т-зоне (21,5%) регионарных лимфатических узлов (р<0,01).

5. При изучение лечебного патоморфоза в опухолях молочной железы площадь паренхимы в контрольной группе составила 38,8±6,5%, что на 18,7% выше, чем с основной группе, где плащадь паренхимы составила 20,1+4,4%, (р<0,01).

6. На электронно-микроскопическом уровне установлено, что предварительный курс аутогемомагнитотерапии помимо необратимых повреждений опухолевых клеток приводит к увеличению числа и функциональной ак-

тивности макрофагов и Т-лимфоцитов в строме опухоли по сравнению с другими вариантами аутогемохимиотерапии.

7. Проведение аутотемомагнитотерапии с экстракорпоральным фракционным воздействием переменного магнитного поля на аутокровь в комплексном лечении местнораспространенного рака молочной железы обладает иммуномодулирующим действием, выражающимся в стимуляции количественных и функциональных параметров 'Г-, В- и клеточных звеньев (повышение содержания Т-лимфоцитов, их основных субпопуляций, ответа на митоген, усиление естественной цнтотоксичности).

8. Применение аутотемомагнитотерапии у больных основной группы с применением аутогемомагнитотерапии в комплексной терапии рака молочной железы сопровождается развитием адаптационных реакций, преимущественно реакций повышенной активации, в то время как в контрольной группе превалируют реакции стрессорного типа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

• При лечении местнораспространенного рака молочной железы целесообразно использовать в плане комплексного лечения аутогемохимиотерапию с экстракорпоральным фракционным омагничиванием аутокрови.

• Пятидневный курс аутогемомагнитотерапии использованный предварительно до аутогемохимиотерапии существенно улучшает эффективность лечения в целом.

• Рекомендуемые параметры омагничивания - 100Гц 50мТл, 50Гц 25'Гл, экспозиция - 20 минут.

• Доступность методики аутот емомагнитотерапии, отсутствие больших материальных затрат позволяют рекомендовать этот метод в качестве немедикаментозной иммунокоррекции в рамках терапии сопровождения комплексного лечения рака молочной железы с использованием в любом онкологическом учреждении.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Клинический опыт применения аутогемомагнитотерапии в лечении РМЖ.

// V-я Всероссийская конференция «Паллиативная помощь в онкологии» 2001. №2-3. С.28.

2. Изменение индекса интоксикации в процессе комплексного лечения РМЖ.

// V-я Всероссийская конференция «Паллиативная помощь в онкологии» 2001. №2-3. С.32. (Соавт. Бордюшков Ю.Н.).

3. Значение УЗИ в объективизации результатов лечения РМЖ. // V-я Всерос-

сийская конференция «Паллиативная помощь в онкологии» 2001. №2-3. С.68. (Соавт. Арзамасцева М.А.).

4. Аутогемотерапия и экстракорпоральное воздействие ПеМП на кровь в

комплексном лечении рака молочной железы. // Всероссийская научная конференция «Организационные вопросы ранней диагностики, профилактики злокачественных новообразований и паллиативной помощи онкологическим больным». Казань. 2001. С.273-276. (Соавт. Верховцева А.И., Златник Е.Ю.).

5. Неоадъювантное лечение рака молочной железы. //1 Congress national de

oncologic (culegere de articole si teze). Moldova, Chisinau, 2000. C.256. (Соавт. Сидоренко Ю.С., Верховцева А.И.).

6. Переменное магнитное поле и иммунобиологическое состояние лимфоци-

тов. // 4-й Конгресс Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов (РААКИ) «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» Москва, 2001. С.63. (Соавт. Златник Е.Ю., Закора Г.И., Верховцева А.И.).

7. Влияние переменного магнитного поля на иммунобиологическое состоя-

ние лимфоцитов больных РМЖ. // Материалы 1-го Международного Конгресса «Новые медицинские технологии» Санкт-Петербург, 2001. С.102-103 (Соавт. Сидоренко Ю.С., Златник Е.Ю.).

8. Результаты ультразвуковой допплерографии в оценке неоадъювантной хи-

миотерапии. // Материалы 1-го Международного Конгресса «Новые медицинские технологии» Санкт-Петербург, 2001. С.74-75. (Соавт. Сидоренко Ю.С., Арзамасцева М.А.).

9. Пути улучшения результатов аутогемо- и аутолимфохимиотерапии. // Пер-

спективы развития науных исследований в предстоящем столетии. Ростов-на-Дону. 2001. С.253-261. (Соавт. Бордюшков Ю.Н., Малятина Л.И., Трепетаки Л.К., Козель Ю.Ю.).

10. Роль УЗИ в неоадъювантной АГХТ местнораспространенного РМЖ. // 4-я Всероссийская Онкологическая Конференция, Москва, 2000. С.65. (Соавт. Сидоренко Ю.С., Арзамасцева М.А.).

11. Улучшение результатов аутогемохимиотерапии (АГХТ) рака молочной железы. // 2-я Российская конференция молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва. 2001. С.422.

12. Возможности УЗИ и допплерографии в оценке неоадъювантной АГХТ РМЖ. // 2-я Российская конференция молодых ученых с международ-

ным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва. 2001. С.422.

13. Исследование аппоптоза при аутогемохимиотерапии местнораспростра-ненного рака молочной железы. // 2-я Российская конференция молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва. 2001. С.419.

14. Клинический опыт экстракорпорального применения магнитного поля на аутокровь в комплексном лечении рака молочной железы. // «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии». Материалы конференции молодых ученых и специалистов к 70-летнему юбилею РНИОИ, Ростов-на-Дону, 2001. С.28-31.

15. Неоадъювантное лечение РМЖ. // «Отечественная онкология - основные пути развития» К 70-летнему юбилею РНИОИ. Ростов-на-Дону. 2001. С.229-233.

16. Возможности УЗИ в оценке лечения местнораспространенного РМЖ. // «Отечественная онкология - основные пути развития» К 70-летнему юбилею РНИОИ. Ростов-на-Дону. 2001. С.250-253.

ИЗОБРЕТЕНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Заявка на изобретение «Способ лечения РМЖ»,

№2000119252/14(020220), получена приоритетная справка от 19.07.2000.

(Соавторы: Сидоренко Ю.С., Бордюшков Ю.Н., Верховцева А.И.,

Старжецкая М.В., Златник Е Ю.)

Объем 1,0 п.л. Формат 60 х 84 /16.' Печать офсетная. Бумага офсетная.: Заказ №56. Тираж 100 экз.' Отпечатано в КМЦ "Колибри", Б. Садовая, 79