Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование применения анти CD-5иммунотоксина для профилактики острого отторжения почечного аллотрансплантата

г \ ДО

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ

НАУЧНО-ИССЛВДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

На правах рукописи УДК; 616-089.843:611.6 +612.017.1:615.03

МУРОМЦЕВА Ирина Борисовна

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЫЮЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИ-С1>-5 ИММУНОТОКСИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ОСТРОГО ОТТОРЖЕНИЯ ПОЧЕЧНОГО АЛЛОТРАНСШ1АНТАТА

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-1997

Работа выполнена в Научно-Исследовательском Инстапуге Трансплантологии и Искусстиытьи органов МЗ РФ

Научный руководитель: Академик РАН и РАМН В.И. Шумах»»

Офицальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор B.C. Суековя, доктор ыеднцнпсзотх ваук В.Г. Качкмирод

В едущее учреждение - Научиый Цецтр Хирурпш РАМН

Защита состоятся 28 апреля 1997 года в 14.00 часов на заедании Специализированного Ученого совета Д.074.34.01 при Научио-ассяедоватыгьскоы институте трансплаитоыогин и искусственных оргаловМишдрава России (Москва, 123182,уп, Щукинская, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научпо-Ессзхедоватедьского института траненлаитодогнн н искусственных органов Минздрава России

Автореферат разослан 27 нарта 1997 годя

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат цедиципекюс наук

.ELA. Селезнева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В течение последних 15-и лет, прошедших после введения в клиническую практику циклоспорина А (Су А) аллотрансплантация почки стала методом выбора доя лечения большинства больных, страдающих терминальной хронической почечной недостаточностью (ХПН). Несмотря на существенное увеличение длительной выживаемости трансплантатов (8090% через год после операции), отторжение остается основной клинической проблемой при трансплантации почки (Шумаков В.И., 1995 ). Его предупреждение путем идеального подбора пары донор-реципиент по антигенам гжтосовместимости (HLA) практически затруднено, в первую очередь, из-за ограниченного количества доноров. С другой стороны, даже применение современных схем иммуносупресии после операции, базирующихся на СуА у ряда больных не позволяет предупредить развитие острых реакций отторжения в ранние сроки после операции (Rao К., Kasiske В., Dahe D., 1991). И хота эти эпизоды в подавляющем большинстве случаев оказываются обратимыми с использованием усиленной иммуносупрессии (стероидные гормоны, моноклонаяьные антитела - ОКТ-3, политональные антитела - АТГ), они оказываются небезразличными доя дальнейшей судьбы пациента и трансплантата. Так, в последнее время убедительно продемонстрирована прямая связь между количеством и тяжестью перенесенных кризов отторжения и вероятность развития хронического отторжения, обусловливающего преждевременную утрату функции трансплантата (Sumrani N., Delaney V., Daskalakis Р. et al., 1991).

Теоретически, исходя из современных представлений о механизмах иммунного ответа организма, представляется весьма логичным попытка снизить иммуногенность пересаженного органа путем предварительной элиминации aiггигенnpeseiпирующих клеток.

В настоящее время накапливается все больше данных о том, что собственные тканевые антигены, локализующиеся на клетках паренхимы

почки, могут нс являться основным барьером, который препятствует приживлению трансплантируемого органа. В 1957 г. Snell G. выдвинул предположение о том, что главным иммунизирующим фактором и ключевым пусковым агентом в реакции отторжения трансплантируемых тканей являются ассоциированные с трансплантатом лейкоциты донора, которые в последаее время чаще называются в литературе дендритными клетками. Они значительно отличаются от других типов клеток по плотности антигена и способам их представления иммунокомпетентным клеткам реципиента. Однако первые эксперименты по удалению таких лейкоцитов - "пассажиров" из трансплантируемых тканей облучением, обработкой циклофосфамидом, антшшмфоцитарной сывороткой или СуА, а также посредством использования промежуточных реципиентов бьши малоэффективны и в лучшем случае приводили только к незначительной задержке отторжения трансплантата (Goldberg L., Cook Т., Taube D., 1994).

В настоящее время достигну! значительный прогресс в создании цитотоксических фармакологических препаратов направленного действия ■ иммунотоксинов (ИТ), позволяющих высокоизбирательно удалять различные популяции клеток-мишеней. Особенности механизма и эффективность действия иммунотоксинов определяется их структурой. Ш представляют собой кошдогаты цитотоксических ферментов растательногс шш бактериального происхождения с моноклональными антишкш^ против поверхностных антигенов клеток-мишеней (Vallera D., 1994).

Вышеизложенное, а также появление первых отечественных И'1 определило актуальность, цель и задачи данного исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: обосновать новый подход к профилактике острого отторжения почечнотс аллотрансплантата путем его предварительной обработки отечественнык нммунотоксином на основе anra-CD-5 моноклонаш>ного антитела и А-цеш рицина (анти-CD-S ИТ).

Для достижения поставленной цели были определены следующие

задачи:

1. Разработать методику предоперационной обработки почечного трансплантата анти-С0-5 ИТ.

2. Изучить степень и избирательность элиминации лимфоцитов из трансплантата при его обработке.

3. Подтвердить клиническую безопасность разработанной методики,

4. Оценить эффективность применения анти-СО-5 ИТ дня профилактики острого отторжения почечного трансплантата в госпитальном периоде.

5. Проанализировать отдаленные результата у больных с трансплантатом, обработанным анти-С0-5 ИТ.

6. Провеет клиническую апробацию методики обработки трансплантата анти-СО-45 моноклональным антителом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые для снижения иммуногепности почечного трансплантата применен анти~СО-5 ИТ.

Показана специфичность и высокая активность препарата по элиминации лимфоцитов - "пассажиров" из органа перед его трансплантацией .

Обоснован принципиально новый подход к решению проблемы отторжения в клинической трансплантации органов.

На клиническом материале впервые продемонстрировано, что предварительная обработка трансплантата анти-СО-5 ИТ снижает частоту и тяжесть течения ранних кризов отторжения, особенно у высоко-сенсибилизированных больных и при повторных трансплантациях.

Впервые успешно проведена клиническая апробация отечественных аити-СВ-45 моноклональных антител, как наиболее

перспективных дли эффективного снижения иммуногснности

трансплантата.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Разработана и оптимизирована методика обработки трансплантата анти-СО-5 ИТ в клинических условиях, отличающаяся простотой, воспроизводимостью и отсутствием побочных воздействий на трансплантат, не влияющая на стандартное течение операции.

Доказана полная клиническая безопасность применения препарата для больного. Продемонстрировано отсутствие его нефротоксического действия.

Применение анти-СО-5 ИТ снижает частоту и тяжесть ранних кризов отторжения, позволяет снизить суммарную иммуносупрессгао, снижает потребность в использовании дорогостоящих иммуносупрессантов.

Благодаря предварительной обработке почечного трансплантата анги-СО-5 ИТ и подобными препаратами данного класса появляется возможность улучшить результаты трансплантаций в 1руппе больных высокого иммунологического риска.

На основании анализа результатов применения анти-СП-45 моноклонального антитела разработан и утвержден протокол I стадии клинического испытания анти-СО-45 ИТ.

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ Результаты исследования используются в практической деятельности отделений пересадки почки НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, мо1уг быть использованы в других трансплантационных цетрах страны. Полученные данные также будут использоваться при разработке новых препаратов в ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в отечественной центральной печати и 4 за рубежом.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены на: XV Всемирном конгрессе Общества Трансплантации (Киото, Япония, август 1994 года); 2-ой Международной Конференции по новым направлениям в клинической и экспериментальной иммуносупрессии (Женева, Швейцария, февраль 1996 х-ода); заседании Ученого Совета НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ 17 июня 1996 года; межлабораторной конференции НИИТ и ИО, 28 марта 1997 года.

СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и практических рекомендаций, содержит таблиц, рисунков и

диахрамм. Указатель литературы включает работ отечественных и

работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Общая характеристика клинических наблюдении В период с ноября 1993 хода по январь 1997 года в отделении пересадки почки и печени НИИТиИО было проведено рандомизированное клиническое исследование но пересадке почечных трансплантатов, подвергнутых предварительной обработке аши-С0-5 ИТ.

Основная группа состояла из 36 наблюдений. В этот же промежуток времени были выполнены 32 контрольные операции, перед которыми трансплантированные почки анти-С0-5 ИТ не обрабатывались. Таким образом, в настоящей работе приведены исследования 67 больных, которым было выполнено 68 аллотрансплангаций трупной почки.

Распределение больных по возрасту и полу представлено в табл_№ 1.

Таблица Д» 1. Распределение больных по возрасту и полу.

Основная группа Контрольная труппа

Возраст М Ж Всего М Ж Всего

До 21 года 4 2 6 0 1 1

21 - 30 лет 6 1 7 5 2 7

31 -40 лет 7 5 12 6 4 10

41 -50 лет 5 1 6 7 3 10

Старше 50 лет 2 2 4 4 0 4

Всего 24 11 35 22 10 32

Таким образом, как видно из таблицы, большинство составили мужчины - 46 ( 68,7% ), женщин среди наблюдавшихся было - 21 (31,3%).

Преимущественный возраст реципиентов составил от 21 до 50 лет (77,6%).

В табл-МЬ 2 представлена характеристика распределения пациентов по заболеваниям, приведшим к ХПН.

Таблица № 2. Распределение больных по заболеваниям.

Диагноз Основная группа, п=36 Контрольная группа, п=32

Хронический гаомерулонефрит 29 80,5% 24 75,0%

Хронический пиелонефрит 2 5,5% 5 15,7%

Поликистоз 3 8,3% —

Диабетическая нефропатия 1 2,8%

Амилоидоз — 1 3,1%

СКВ — 1 3,1%

Врожденная аномалия развития почек 1 2,8% 1 3,1%

Операция осуществлялась по общепринятой методике у пациентов обеих групп.

Начальную трехкомпонентную иммуносупрессию полегчало подавляющее большинство наблюдаемых больных в основной группе -33 (91,6%) и 32 (100%) - в контрольной. Эта схема включала в себя СуА, который назначался больным с первых часов после операции с целью наиболее быстрого достижения терапевтического уровня в крови. На вторые сутки послеоперационного периода присоединяли преднизолон и азатиоприн. В зависимости от функции трансплантата применялся различный подход к дозировкам препаратов. Реципиенты, у которых функция пересаженной почки восстанавливалась фазу же после трансплантации, получали относительно высокие дозы СуА с первого дня -5-6 мг/кг веса и менее высокие дозы хортихостероидных гормонов -прсднизолона - не более 0,5 мг/кг1 веса больного. Больные же с острым канальцевым некрозом (ОКН) трансплантата получали преднизолон в дозе 0,8 мг/кг веса, со снижением ее до 0,5 мг/кг веса к концу первого месяца. Азатиоприн назначался по 2-4 мг/кг веса в зависимости от количества лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови, функции печени.

Трое (8,3%) реципиентов из основной группы в качестве четвертого компонента иммуносупрессивиой терапии с первого дня получили АТГ (двое) и 01СГ-3 (один). Показанием к назначению 4-х компонентой терапии явилось наличие у реципиентов высоких титров предсуществующих антител (60%, 80%, 100%).

Лабораторный мониторинг функции трансплантата и состояния больного проводили по следующим показателям:

а) общий анализ крови;

б) мочевина плазмы крови уреазным методом по реакции с фенолгипохлоритом (В.Г.Колб, В.С.Камышников, 1982);

в) креатинин плазмы крови по цветной реакции Яффе (В.Г.Колб, В.С.Калашников, 1982);

г) электролиты плазмы крови методом плазменной фотометрии;

д) кислотно-щелочное состояние крови на аппарате Микро-АСТ-РУП;

е) билирубин сыворотки крови колорометрическим диазометодом по Йондрашику, Клепориу, Грофу;

ж) трансаминазы (АлАТ, АсАТ) сьшоротки крови колорометрическим динтрофенилгидразиновым методом по Райтману, Френкелю;

з) радиоиммунологическое определение Су А в цельной крови;

и) общий анализ мочи;

к) исследования на вирусы ЦМВ, герпеса, гепатита В и С.

Отторжение - наиболее важная проблема, решаемая в послеоперационном периоде. Его клинические проявления характерны -повышение температуры тела, увеличение размеров трансплантата, боли, снижение диуреза, повышение уровня креатинина плазмы, артеральная гипертензия - хота на фоне применения Су А часто наблюдалась нечеткая картина. Данный диагноз подтверждался ультразвуковыми признаками и доплеросонохрафией (аппарат MARK.4, USA).

Наибольшие трудное™ возникали при диагностике отторжения на фоне ОКН, когда у больного исходно имелся высокий уровень азотемии, олигоанурия.

Если диагноз острого отторжения вызывал сомнения, выполнялась прицельная тонкоигольная аспирационная или пункционная биопсия трансплантата под ультразвуковым контролем. Результаты цитолотческого и пистолошческох'о исследований позволяли точно определить наличие и характер отторжения и дифференцировать его от ишемических и воспалительных поражений, нефротоксичности.

Лечение отторжения начинали с пулъсотерапии мстилпреднизолоном, который вводился внутривенно в дозе 500-1000 мг в течение 3 суток. Кроме того, увеличивалась базисная иммуносупрессия, когда отторжение развивалось на фоне низкого уровня Су А в крови.

При повторных эпизодах острого отторжения проводилось аналогичное лечение, но при его проведении старались не превышать суммарную дозу метшшреднизолоиа 5 г.

При стероидореэистехгшых кризах отторжения использовались препараты поликлональных (ATG, Fresenius) и моноклональных (ОКТ-3) антител к Т-лимфоцитам. ATG применялся в дозе 4-5 мг/кг веса в течение 14-21 суток, ОКГ-З в дозе 5 мг/сут в течении 10 дней. Когда не наблюдалось позигивной динамики в функции трансгашнатата, к лечению добавляли экстракорпоральные методы, в частности, - плазмаферезы.

Сроки наблюдения составили от 2 лет 3 месяцев до 3 лет 3 месяцев.

Характеристика anm-CD-5 иммунотоксина

CD5 антиген-шикопротеид с молекулярной массой 67 кОа экспрессируется на тимоцитах, на большинстве .зрелых Т-лимфоцитов (Reinherz Е., Kung Р., Goldstein G. et al., 1979; Royston I., Majda J., Baird S., 1980). Em плотность на поверхности клеток увеличивается в зависимости от степени зрелости Т-клеток. Он также обнаружен на малой популяции В-клеток (Барышников А., 1990; Wemer-Favre С., Vischer Т., Wohlwend D. et al., 1989; Lydyard P., Mackenzie L-, 1989).

Мышиное моноклональное анитело JITl (Ig 1) против антигена CD5 Т-лимфоцитов человека было получено д.б.н. Филатовым A.B. (Институт иммунолохии МЗ РФ). Отечественный airm-CDS ИТ, использованный в нашем исследовании, был изготовлен в ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов путем конъюгации А-цепи рицина с этим антитителом против дифференцировочного антигена CD5 лимфоцитов человека с использованием 1^-сукцишшидил-3(2- цепи рицина с этим антителом против дифференцировочного пиридилдитио) пронионата (СПДП) по оригинальной методике (Шумаков В.И., 'Гоневицкий А.Г., Топтыгин А.Ю., 1995; рис_№ 1).

Схема получения иммунотоксина

Л

©т<?

АНТИТЕЛО ( Д \c.cj В

0-МЕКАРПТОЭТАНОЛ

СПАП —^ ^

©да

н*<32> ОЧ

и | ИОНООБМЕННАЯ

А

ХРОМАТОГРАФИЯ

нэ

ТИОЛ-ДИСУЛЬ^ИДНЫЙ ОБМЕН__/

5=у>

КОНЪЮГАТ

Рис. 1

Полученный конъюгат очищали от непрореагировавших мономеров гельфильтрацией на Сефарозе CL4B в изотоническом фосфатно-солевом буфере, содержащем 20 мМ D-лактозы. После стерилизации фильтрованием через мембраны с порами, диаметром 0,22 мкм, препараты тестировали на отсутствие пирогенов и определяли специфическую активность в цитотоксическом тесте по ингибированию включения 3Н-тимидина клетками-мишенями и клетками котрольных Jшний, не экспрессирукнцими антиген CD5.

Препарат поставлялся в стерильных флаконах по 100 мкг и хранился при температуре от +4° до +8 ° С.

Методика обработки почечного трансплантата

Непосредственно перед трансплантацией почку в условиях операционной подготавливали стандартно (выделение сосудов, удаление избытков жировой капсулы). Затем при пережатой почечной вене сосудистое русло трансплантата заполняли через артерию 100 мл раствора Евроколинз, содержащим 200 мкг ИТ ( 15 наблюдений ) или 50 мл раствора Евроколинз с тем же количеством ИТ (21 наблюдение). После этого пережимали почечную артерию и помещали трансплантат в обычные условия консервации до момента формирования сосудистых анастомозов. Среднее время экспозиции (воздействия ИТ на трансплантат) колебалось от 40 до 150 мин, составив в среднем 87 мин.

В 30 наблюдениях перед наложением анастомозов производили отмывку почки от ИТ. Собранный перфузат направлялся доя экспериментального исследования в ГНИИ генетики и селекции промышленных микрооорганизмов с целью:

1) изучения состава клеток-пассажиров почечного трансплантата;

2) определения эффективности действия ИТ на прореагировавшие клетки.

В последних 6 наблюдениях подобную отмывку не производили.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Экспериментальная оценка действия иммунотоксияа Специфическую активность ИТ определяли в циготоксическом тесте по ишпбироааншо включения 3Н-тимидина клетками-мишенями Jurkat (CD5+) и клетками контрольных линий Daudi (CD5-) (Для оценки эффективности действия ИТ ЛТ1-РА в условиях консервации трансплантируемых органов (гипертермии) был модифицирован цитотоксический тест. Первая стадия - инкубация клеток-мишеней с иммунотоксином - проводилась при +4° и при +37° С, с последующим определением включения 3Н-тимидина в стандартных условиях, после отмывки от несвязавшегося ЛТ1 -РА.

Результаты этих экспериментов, представленные на рис. 2, показали, что конъюгат обладает избирательным ингибирующим действием на клетки, несущие антиген-маркер, в то время как практически никакого подобного эффекта не наблюдалось в отношении CD5-отрицательных клеток. Концетрация ИТ, при которой наблюдается 50% иншбирование включения 3Н-тимидина, составляет примерно !010 М дня клеток-мишеней. Составные части ИТ не оказывали заметного влияния и при Ю-7 М. Важно отмстить, что цитотоксичсская активность ЛТ1-РА по отношению к клеткам-мишеням при понижении температуры инкубации практически не изменяется. Более того, неспецифическая активность этого препарата несколько уменьшается, что повышает терапевтический индекс ЛТ 1 -РА в указанных условиях использования.

Исследования перфузатов почки, полученные перед введением ИТ, подготавливаемой к пересадке по стандартной методике, показали, что экстенсивной перфузией из такой почки можно выделить значительное (до 4 млн/100 мл) количество мононуклеарных клеток. Как следует из результатов субпопупяционного анализа этих клеток с помощью проточной цшофлоуметрии (Диагр. №1), они являются, пивным образом, Т-лимфоцитами и NK-клетками.

(У Е->

S О

к

о ж В1

2-3 с

X CQ

Концентрация иммунотоксина, М

Рис. 2. Цитотоксическое действие ЛТ1-РА на клетки линий Jurkat (CD5+) - 1 и 2, и Daudi (CD5-) - 3 и 4.

1 и 3 - инкубация с ИТ при 3?°С

2 и 4 - инкубация с ИТ при 4°С

Фукциоиальную активность выделенных клеток оценивали по включению 3Н-тимидина после их активации митогенами. Индекс стимуляции выделенных мононуклеарных клеток составил 74,1 при использовании в качестве митогена фитогемашпотинина и 36,9 при использовании конканвалина А.

Диаграмма №1. Субпопуляционный состав мононуклеарных клеток перфузата почечных 1рансшшггдтов.

Л

у

■

X,

! /

СМ

со;

СО 7

1С

у

00)6

С045

Представленные данные показывают, что во время трансплантации почки вместе с органом в организм реципиента попадает значительное количество лейкоцитов-"пассажиров", в основном Т- и ИК-клеток. Их высокую мигогеннухо активность можно полностью подавлять посредством обработки анги-Т-клеточным иммуногоксином.

Исследование перфузатов, собираемых после инкубации почечных трансплантатов с ЛТ1-РА, показало, что они по-прежнему содержат значительное количество мононуклеарных клеток (до 2 млн/100 мл), не обладающих, однако, функциональной активностью: эти клетки не включали ЗН-тимидин в ответ на стимуляцию вышеперечисленными митогенами. Это указывает на то, что обработка иммунотоксином приводит к эффективному подавлению функциональной активности клеток-мишеней,

несмотря на отсутствие их лизиса на первом этапе их обработки ИТ. При дальнейшем нахождении в стандартных условиях культивирования (аналогичных условиям организма) происходит их литическая элиминация. Это доказывает, что полученный препарат ИТ высоко активен не только в условиях культуры клеток, но и при обработке целого органа в реальном режиме консервирования.

Оптимизация клинического протокола применения анта-СВ-б ИТ

Первоначальное клиническое использование объема 100 мл для заполнения трансплантата во всех случаях сопровождалось его отеком, чего не наблюдалось при использовании объема 50 мл, которому и было отдано предпочтение.

Как показали наши последние клинические наблюдения за шестью пациентами, у которых перед реваскуляризацией не отмывали трансплантат от ИТ, системные реакции в виде гипотензии, гипертермии, дыхательных нарушений, аллергических реакций как во время наркоза, так и в ближайшем послеоперационном периоде отсутствовали. Это позволило нам в окончательном варианте протокола отказаться от отмывки трансплантата перед наложением анастомозов.

Результаты клинического применения аигга-С1)-5 иммунотшеенпа Анализ результатов в сравниваемых группах проводи™ по следующим клиническим параметрам: характер восстановления функции трансплантата, частота и выраженность кризов отторжения.

В табл_№ 4 представлены основные характеристики исследованных групп, которые могли бы повлиять на исходы трансплантации вне зависимости от применения ИТ.

По большинству параметров не вьивлеио статистически значимых различий, что делает их сравнимыми в целом по неиммунологическим факторам. Однако, обращает на себя внимание, что в основной группе статистически значим был проценг высоко сенсибилизированных реципиентов и повторных операций (р<0,05). Это потребовало у 3 из них

применения 4-х компонентной иммуносупрессии на этапе иццукции (первые 10-14 дней).

Таблица № 4. Характеристика реципиентов сравниваемых групп.

Критерии сравнения Основная группа, п=36 Контрольная группа, п=32 Р

Пол, м/ж 25/11 22 ПО >0,05

Возраст Ср-возраст (кол-во лет) 14-56 36,2+2,3 19-56 38,4+2,2 >0,05

Операция: первичная повторная третья 26 72,2% 9 25,0% 1 2,8% 29 90,6% 2 6,2% 1 3,1% >0,05 <0,05 >0,05

Предсуществующие антитела: до 30% 30-50% выше 50% 27 75,0% 1 2,8% 8 22,2% 27 84,4% 3 9,4% 2 6,2% >0,05 >0,05 <0,05

Средний уровень совместимости по НЬЛ (количество совпадений по антигенам ИЬА) 1,74 1,67 >0,05

Время холодовой ишемии (час) 18,8+0,9 18,6+0,9 >0,05

трех-компонсшная супрессия 33 91,6% 32 100% >0,05

четырех- компоненшая супрессия 3 8,3% - -

Таким образом, преимущественно в основной группе сосредоточился более тяжелый, в плане риска развития отторжения, контингент реципиентов почечных трансплантатов, что и было учтено при анализе результатов.

Диаграмма №2. Распределение пациентов основной группы по содержанию предсущесгвующих антител.

Диаграмма №3. Распределение пациентов контрольной группы по содержанию предсущесгвующих антител.

Характер восстановления функции трансплантатов представлен в табл_№ 5. Под немедленным функционированием подразумевали отсутствие

а

необходимости в проведении гемодиализа в течение 1 недели после операции (достаточный диурез, самостоятельное снижение уровня азотемии). К случаям острого канадьцевого некроза трансплантата (ОКН) относили временное отсутствие функции с ее последующим восстановлением, потребовавшее проведения хотя бы одного сеанса гемодиализа в течение первой недели.

Таблица № 5. Характеристика начальной функции трансплантатов.

Основная 1руппа, п=36 Контрольная группа, п=32 Р

Немедленное функционирование трансплантата 22 61,2% 16 50,0% >0,05

ОКН с последующим восстановлением функции трансплантата 9 25,0% 13 40,6% >0,05

НефункционирующиЙ трансплантат 5 13,8% 3 9,4% >0,05

Меньшая частота 0 <Н в основной группе свидетельствует, безусловно,

об отсутствии прямого нефротоксического эффекта ИТ на пересаженную почку, однако, позволяет предположить и его прямое влияние на торможение ранних острых повреждений трансплантата иммунного характера, которые, по некоторым данным, играют определенную роль в развитии ОКН (МиЬеЬасЬег, 1993).

У 14 из 31 больных основной группы, наблюдавшихся не менее 1 месяца, отмечено 16 кризов отторжения (у 2-х по 2 криза), в то время как в контрольной группе в течение этого же периода 17 кризов отторжения развилось у 16 из 29 больных (у одного дважды) (см. табл.№ 6, в таблице не учтены больные с первично нефункционирующим трансплантатом и больные, погибшие в течение первого месяца).

Таблица № 6. Характеристика кризов отторжения в течение 1 месяца после

операции.

Основная группа, п=31 Контрольная группа, п=29 Р

Кол-во больных с кризами 14 45,1% 16 55,1% >0,05

Кол-во кризов 16 17

Кол-во кризов на 1 больного 0,52 0,59 >0,05

Доза метипреда па 1 больного с кризом (в граммах) 1,7 1,95 >0,05

Стероидно-резистентный криз 6 37,5% 6 35,3% >0,05

Обратимость стероидо-резистентных кризов 50,0% 50,0% >0,05

Кол-во спонтанных разрывов трансплантатов — 2

Анализ частоты ранних кризов отторжения, их морфологической характеристики, тяжести течения и обратимости, на первый взгляд , не выявил существенных различий между группами. Однако, необходимо подчеркнуть, что в основной труппе, несмотря на значительно более высокую встречаемость больных высокого иммунологического риска (41,6 % в основной группе против 15,6% в контрольной, р<0,05), кризы наблюдались несколько реже и потребовали меньшего усиления иммуносупрессии в виде дополнительного назначения пульсотерапии метилпреднизолоном.

Стероидорезисгагхные кризы отторжения в обеих ipynnax характеризовались одинаковой частотой и обратимостью при применении ат-илимфоцитарных препаратов.

Анализ отдаленных результатов проведен методом построения актуариальных кривых (Busson М., Нога J., 1975) и не выявил достоверных различий между группами по выживаемости трансплантатов в сроки до 3-х нет (Рис. 3).

Рис.Л* 3. Актуриарная выживаемость трансплантатов.

МЕСЯЦЫ

Однако, несколько большая выживаемость трансплантатов через 12 мес в основной группе, оцениваемой как более тяжелой в плане иммунологического риска, свидетельствует о позитивном эффекте предоперационной обработки почечного трансплантата анти-СО-5 ИТ.

Первый клшшчсекий опыт применения анти-СЕ>-45 моноклонального автитсла для обработки почечного трансплантата С Б 45 атиген является наиболее перспективной мишенью для воздействия мАТ, так как экспрессируется практически на всех лейкоцитах -гранулоцитах, Т~ и В-пимфоцитах, макрофагах и дендринных клетках, что было подтверждено нашими исследованиями перфузатов из почечного трансплантата (См. Диагр,№1).

Главными элементами, подлежащими элиминации с целью снижения иммуногенности трасплантата, являются CD45+ (положительные) интерстициальные дендритические клеточные элементы (ИДК). Перфузия почки мАт против антигенов ИДК является специфической процедурой для удаления подобных клеток (Goldberg L., Cook Т., Taube D., 1994). В свете наших исследований, дальнейшее развитие этого направления связано с разработкой amn-CD-45 ИТ.

Первый этап клинической апробации ограничился 3 донорскими почками и, соответственно, таким же числом реципиентов. Процедура перфузии почки airm-CD-45 мАт проводилась по описанному клиническому протоколу. В почечную артерию вводилось 50 мл охлажденного до 4° С раствора Евроколлинз, содержащего 2 мг мАт.

В настоящее время мы не располагаем достаточным количеством наблюдений для обобщения, но предварительная оценка результатов (1 криз на 3-х пациентов, что значительно ниже, чем в общей популяции) убеждает в перспективности дальнейших исследований. Следует особо отметить, что единственный криз был отмечен у больной с высоким титром антител, и был достаточно легко купирован.

Полученные предварительные результаты ограниченных клинических испытаний (3 наблюдения с послеоперационным периодом от 6 до 12 месяцев) однозначно показывают отсутствие клинически значимых побочных или токсических эффектов от применения мАТ для обработки трансплантата. Препарат также не обладает нефротоксическим действием, что подтверждается данными интраоперационных биопсий и течением послеоперационного периода.

Для продолжения начатых исследований в Государственном НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов были впервые синтезированы отечественные ИТ к CD45 антигену лейкоцитов человека, обладающие избирательным циготоксическим действием на клепси-мишени. В настоящее время ведутся исследования по изучению их активности in vitro

(Темяков Д.Е., 1996). Данные коныогаты являются перспективными препаратами для применения в клинике, в частности, при трансплантации органов.

Таким образом, наши наблюдения за пациентами, перенесшими трансплантацию почки, подвергнутой предварительной обработке анти СО-5-ИТ показали, что с клинической точки зрения методика проста и воспроизводима во всех случаях, не усложняет проведения операции, не вызывает дополнительной травмы трансплантата, не требует дополнительного удлинения времени холодовой ишемии. Препарат не обладай' нефротоксическим действием, более того, при его использовании чаще наблюдается немедленная функция трансплантата. Также не отмечено никаких побочных реакций со стороны реципиентов на его применение. Тем самым доказана клиническая безопасность описанной методики. По вопросу эффективности исследованного нами нетрадиционного подхода к профилактике отторжения пересаженной почки в настоящее время высказаться определенно не представляется возможным в силу отсутствия статистически значимых различий результатов, полученных в сравниваемых группах. Тем не менее, у нас создается впечатление о более редком развитии кризов отторжения и их меньшей тяжести «о клиническому течению после применения иммунотоксина, особенно у больных высокого иммунологического риска. Для подтверждения этого требуются, безусловно, расширенные по количеству наблюдений исследования. Приводимые доказательства положительных эффектов обработки почечных трансплантатов анти-С0-5 ИТ способствуют не только улучшению результатов трансплантации почки, но и сокращают расходы на лечение за счет1 снижения потребности в послеоперационном гемодиализе и дорогостоящих иммунодепрессантах (АТГ, ОКТ-3) и уменьшения длительности госпитализации.

Не вызывает- сомнения целесообразность проведения дальнейших экспериментальных и клинических исследований в данном направлении.

Возможно, недостаточно четкий клинический эффект применения анти - CD-5 - ИТ связан с тем, что он элиминирует только зрелые лимфоциты (Т и В субпопуляции), содержащиеся в органе, не воздействуя на другие яейкоциты-"пассажиры" (макрофаги, дендритные клетки и др.). Усиление эффективности метода может бьггь достигнуто путем использования моноклонального ИТ более широкого спектра действия (например, анти -CD- 45 ИТ) или же комбинацией ИТ, направленных против различных CD-антигенов, представленных на дендритных клетках.

ВЫВОДЫ:

1. Предложенная методика предоперационной обработки почечного трансплантата amn-CD-5 иммунотоксином проста и воспроизводима во всех случаях, не усложняет проведения операции, не вызывает дополнительной травмы трансплантата, не требует дополнительного удлинения времени холодовой ишемии.

2. Ahth-CD-5 иммунотохсин подавляет действие 65% мононуклеарных клеток (лейкоцитов-'пассажиров") перфузата почечного трансплантата путем их дезактивации и лизиса даже при 4° С, т.е. при реальном режиме консервации органа. Этим определяется частичное снижение иммуногенности трансплантата.

3. Отмечается значительное снижение частоты ОКИ (с 40, 6 % в контрольной до 25, 0 % в основной). Более того, при его использовании чаще наблюдается немедленная функция (61,2 % - в основной ipynne против 50,0 % - в контрольной). При применении анти-СО-5 иммунотоксина не отмечается системных побочных эффектов, что определяет клиническую безопасность методики.

4. Обработка почечного аллотрансплантата анта-СО-5 иммунотоксином снижает риск развития отторжения в раннем послеоперационном периоде: частота кризов отторжения на 10 % меньше в группе больных с обработанным трансплантатом , чем в контрольной (45,1 % и 55,1 %, соответственно).

5. Применение иммунотоксина без усиления иммуносупрессии достоверно улучшает непосредственные и отдаленные результаты трансплантации почки в группе больных высокого иммунологического риска, делая их сравнимыми с результатами трансплантации у иссенсибшшзированных больных .

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Время воздействия анш-CD-S иммунотоксина на трансплантат должно составлять не менее 120 мин.

2. Целесообразно производить введение препарата в трансплантат параллельно с началом анастезиологаческого пособия реципиенту в операционной.

3. Трансплантат не нуждается в дополнительной отмывке перед наложением сосудистых анастомозов.

4. Сосудистые клеммы на артерии и вене транешшггата могут бып. сняты непосредственно перед включением кровотока после наложения анастомозов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. First clinical trial of ricin A chain containing itrnnunotoxin against human T lymphocytes for treatment of kidney allogfafts, Abstracts of X-th World Congress of the Transplantation Sociery, Kyoto, Japan, August 28 -September 2, 1994, p. 289. (co-authors : L.P. Alexeev, A ,Yu. Toptygin, S.V. Chucanov et al.)

2. Использование иммунотоксина против антигена CD-5 Т-лимфоцитов человека дня удаления лимфоцитов-пассажиров из почечных трансплантатов, Доклады Академии Наук, 1995, т. 342, н. 1, с. 138-140 (В.И.Шумаков, А.Г.Тоиевицкий, A.IO .Топтыгин и др.).

3. Первый клинический опыт использования airm CD-5 иммунотоксина для обработки донорских почек перед трансплантацией, Трансплантология и искусственные органы, 1995, N 1, с. 29-33 ( В.И. Шумаков, Я. Г. Мойьток, И. Б. Муромцева).

4. Pretreatment of kidney allografts with anti-CD5 immunotoxin (IT): the first clinical experience , Abstracts of 2nd International Conference on New Trends in Clinical and Experimental Immunosuppression, Geneva, Switzerland, February 15-18,1996, p. 51 (V.I.Shumakov, Y.G.Moisiuk, I.B. Muromtseva et al.)

5. Pretreatment of kidney allografts with anti-CD5 immunotoxin (IT) in highly sensitized recipients , Abstracts of 2nd International Conference on New Trends in Clinical and Experimental Immunosuppression, Geneva, Switzerland , February 15-18, 1996, p. 78 ( L.PAlexeev, A. G. Dolbin, A.Yu.Toptygin et al.).

6. Pretreatment of kidney allografts with anti-CD5 immunotoxin (IT) - a new chance for high responder recipients, Abstracts of the Fourth International Congress of the Society for Organ Sharing, Washington, USA, 1997, (in press), (L.P. Alexecv, A.Yu. Toptigin, E.V. Korenkova et al.)