Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование применения аллогенных фибробластов для лечения ожоговых ран IIIА степени

1

4844795

Жиркова Елена Александровна

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ АЛЛОГЕННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОЖОГОВЫХ РАН ШЛ СТЕПЕНИ

14.01.17-хирургия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 20II г.

2-8 АПР 2011

4844795

Работа выполнена в научно-исследовательском институте скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Сергей Владимирович Смирнов доктор биологических наук Елена Георгиевна Колокольчикова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Николай Владимирович Островский доктор медицинских наук, профессор Константин Михайлович Крылов

Ведущая организация:

ФГУ Институт хирургии им. А.В.Вишневского Минздравсоцразвития

Защита диссертации состоится « » ^-¿Сс^Я-у 2011 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.850.010.01 при НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского (129090, г. Москва, Б.Сухаревская пл., дЗ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского (129090, г. Москва, Б.Сухареаская пл., дЗ).

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

доктор медицинских наук, профессор А.А. Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В настоящее время наметилась тенденция к сокращению численности больных, госпитализируемых с ожогами во все стационары России. В 1999 г. сообщалось о 600 тысячах случаев в год [Азолов В.В., 1999]. По последним данным, в России регистрируется около 500 тысяч случаев ожогов, что составляет 6-8% в общей структуре травматизма [Зиновьев Е.В., 2008]. Несмотря на уменьшение общего уровня ожогового травматизма, летальность от ожогов в целом по стране не только не сократилась, а напротив, заметно возросла [Азолов В.В. с соавт., 2003]. У 60-80% больных госпитализируемых в стационары имеются поверхностные ожоги II-IIIA степени [Герасимова Л.И. с соавт., 1996; Вихриев Б.С. с соавт., 1986].

Ожоги IIIA степени относят к пограничным, они заживают за счет сохранившихся в дерме придатков кожи. При этом около 1/3 из них заживают, оставляя после себя гипертрофические и келоидные рубцы, которые в дальнейшем требуют длительного консервативного и оперативного лечения [Варес А.Ю. с соавт., 1981]. При ожогах IIIA степени мозаичность поражения кожи часто затрудняет самостоятельное заживление, особенно при обширных ожогах, когда за счет нарушений микроциркуляции и инфицирования эпидермальные производные находятся под угрозой гибели [Ермолов A.C. с соавт., 2008]. В таких условиях раны могут «углубляться» [Федоров В.Д. с соавт., 1999]. Кроме того, при сочетании обширных пограничных ожогов IIIA степени с глубокими ожогами IIIB-IV степени заживление пограничных ожогов на фоне тяжелой ожоговой болезни часто «задерживается». Повышается риск генерализации инфекции, значительно ухудшается прогноз и результаты лечения термической травмы [Алексеев A.A., 1993]. Таким образом, поиск средств, способствующих ускорению

эпителизации поверхностных ожогов, является одной из основных задач комбу стиологии.

В 1993 г. в Институте хирургии им. A.B. Вишневского РАМН был разработан эффективный способ лечения ожоговых ран на основе применения культивированных клеток [Федоров В.Д. с соавт., 1993; Саркисов Д.С. с соавт., 1995]. Этот метод принципиально отличался от всех известных в мировой практике тем, что в качестве основного компонента культивируемого пласта клеток впервые были использованы фибробласты. В дальнейшем была показана эффективность применения аллофибробластов на ожоговые раны ШАБ степени и донорские раны. Однако авторами этих работ аллофибробласты применялись в поздние сроки после отторжения струпа на этапе эпителизации ран IIIA степени или перед аутодермопластикой гранулирующих ран [Рахаев A.M., 2000]. В первом случае отмечали ускорение эпителизации в среднем в 2 раза. Во втором случае при аутодермопластике использовали большую степень перфорации кожных лоскутов (1:6,1:8) и наблюдали быструю (на 12 или 18 сутки соответственно) эпителизацию ячеек [Федоров В.Д. с соавт., 1999]. Донорские раны при применении АФ заживали к 5-8 суткам [Федоров В.Д. с соавт., 1999; Рахаев A.M., 2000].

Однако, несмотря на то, что этот метод хорошо себя зарекомендовал, до сих пор не установлены оптимальные сроки использования клеток, не раскрыты механизмы стимулирующего влияния на рану пересаженных клеток. Морфологические работы, посвященные этому вопросу, единичны, выполнены на сравнительно небольшом клиническом материале и не поддаются системному анализу.

Цель исследования

Клинически и экспериментально обосновать целесообразность трансплантации аллофибробластов для лечения ожогов IIIA степени и исследовать механизмы их действия.

Задачи

1. Определить клиническую эффективность трансплантации аллофибробластов в сравнении с традиционными методами местного лечения.

2. Провести сравнительную клинико-морфологическую оценку восстановления кожи у пациентов с ожоговой раной IIIA степени при использовании аллофибробластов и традиционном методе лечения.

3. На разработанной экспериментальной модели ожога III А степени провести морфологическое (гистологическое и радиоавтографическое) исследование влияния трансплантации аллофибробластов на заживление ожоговой раны.

4. Определить механизмы влияния аллофибробластов на процесс заживления ожоговой раны IIIA степени в эксперименте на мышах 2-х генетических линий (беспородных белых и мутантных линии ЯА/#А).

Научная новизна

Определены клинические показания и оптимальные сроки применения аллофибробластов для лечения ожоговых ран IIIA степени.

Впервые для изучения механизмов стимулирующего влияния трансплантированных аллофибробластов на заживление ожоговых ран выполнено экспериментальное морфофункциональное исследование с использованием светомикроскопического радиоавтографического метода.

На основании результатов морфофункционального исследования показано стимулирующее влияние аллофибробластов на пролиферативную активность стволовых/прогениторных клеток, участвующих в заживлении раны.

Впервые показано, что репаративная регенерация кожи при ожоге IIIA степени у безволосых мышей с мутацией в гене Нг имеет те же закономерности, что и восстановление кожи у беспородных белых мышей.

Практическая значимость

В результате усовершенствования тактики применения трансплантации аллофибробластов на поверхность ожоговой раны ША степени значительно сократились сроки эпителизации раны. Заживление ожоговой раны ША степени после трансплантации аллофибробластов происходит с хорошим косметическим эффектом, без образования гипертрофического рубца.

Внедрение

Методика применения повязки на основе живых аллофибробластов, разработанная в рамках данного исследования, внедрена в клиническую практику ожогового центра НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского.

Материал диссертации использован в информационном письме (Информ. письмо № 5 / НИИ СП им. Н.В.Склифосовского. -М.,2008.-7с.), в 2 патентах на изобретение (№ 2320349 «Способ лечения ожоговых ран» от 27.03.2008 г., № 2373944 «Способ лечения ожоговой раны» от 27.11.2009 г.).

Апробация работы

Апробация диссертации проведена на научной конференции в рамках ППК №9 «Клеточные технологии в неотложной медицине и трансплантологии» от 24.12.2010 г.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции студентов и молодых ученых «Пироговские чтения» в г. Москве в 2007 г.; II съезде комбустиологов России в 2008 г.; 6 международном конгрессе по шоку в Кельне (Германия) в 2008 г.; Восьмой Московской ассамблее "Здоровье столицы" в 2009 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликована 21 научная работа, из них в журналах, рецензируемых ВАК - 3.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных

результатов и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы. Содержит 19 таблиц, 28 рисунков. Библиографический указатель включает 188 источников, из них 69 - отечественных и 119 - зарубежных.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа включает клиническое и экспериментальное исследование, которое было проведено для более детального изучения влияния аллофибробластов (АФ) на заживление ожоговой раны IIIA степени.

Клиническая часть основана на анализе результатов обследования и лечения 70 больных. В зависимости от метода местного лечения ран больные были разделены на 2 группы - основную и контрольную.

В основную группу вошли 40 больных, которым местное лечение ран проводилось при помощи повязок с АФ. Для трансплантации на раны клетки подготавливали в лаборатории культивирования тканей НИИ СП в соответствии с Методическими рекомендациями МЗ РФ. Использовали диплоидные фибробласты дермы эмбриона человека клеточной линии М-22 15-25 пассажей. Трансплантируемые АФ представляли собой монослой культивированных клеток на кремнеорганической пленке «Карбосил-П». По данным радиоавтографии, интенсивный синтез ДНК в ядрах фибробластов свидетельствовал об их высокой пролиферативной активности. В нашем исследовании впервые для лечения ран IIIA степени использовали повязки с АФ, которые накладывали на рану в ранние сроки до формирования струпа (1-3 сутки). Раны, на которые накладывали повязки с АФ, должны быть чистыми. Не допускалось присутствие на ранах струпа, плотно спаянного с подлежащими тканями фибрина, гнойного раневого отделяемого. Перед трансплантацией АФ проводили тщательный туалет ожоговой раны, удаляли с раневой поверхности десквамированный эпидермис, наложения фибрина.

Обрабатывали рану раствором антисептика. На ожоги ША степени накладывали повязки с АФ, которые фиксировали влажно-высыхающей марлевой повязкой. Все остальные раны закрывали повязками соответственно степени ожога.

В группе сравнения 30 больным лечение ожоговых ран проводили традиционным способом, а оценку результатов лечения проводили на основе ретроспективного анализа историй болезней.

В обеих группах больные были сопоставимы по полу, возрасту, площади и глубине ожогов, показателям прогностических индексов ПИПС и ПИФ (таб. 1). Все больные поступили в первые часы после травмы.

Таблица 1

Характеристика клинических групп

Сравниваемые показатели в группах Группы больных

основная (повязки с алло-фибробластами) сравнения (мазевые и влажно-высыхающие повязки -традиционный метод)

Число больных, чел. 40 30

Средний возраст, лет 38,9 ± 15,8 39,2 ± 15,1

Средняя площадь ожогов, % п.т. 32,6 ±14,3 39,2 ±15,1

Средний ПИПС, ед. 71,5 ±19,3 71,8 ±19,0

Средний ПИФ, ед. 40,9 ± 19,6 42,0 ± 19,0

С помощью клинического метода оценивали тяжесть состояния больного, площадь и глубину ожоговых ран; на основании полученных данных также определяли прогностические индексы - ПИФ и ПИПС. В качестве критериев сравнения заживления ран, леченных разными способами, были выбраны время наступления эпителизации и площадь эпителизации за равный промежуток времени. Так как не всегда раны полностью эпителизировались под действием АФ, был введен процентный показатель Э/П - отношение площади эпителизировавшихся ран после

применения АФ к площади всех ран, закрытых АФ. Выбрано 3 диапазона значений Э/ТТ, по которым результат лечения оценивался как «удовлетворительный», «хороший» и «очень хороший». Определена зависимость показателя Э/П и времени наступления эпителизации от возраста больного, общей площади ожога, от показателей прогностических индексов.

Морфологический анализ включал цитологическое исследование отпечатков с ожоговой поверхности и гистологическое исследование биоптатов раны. Материал брали до пересадки АФ и после пересадки во время перевязок спустя 2-3, 5-7, 13-14, 21-23 сутки. В качестве контроля параллельно производили аналогичный забор материала с тех участков тела больных, на которые АФ не пересаживали.

Экспериментальное исследование на беспородных белых мышах и безволосых мышах мутантной линии //А/Я/' («hairless») было осуществлено с целью сравнения процессов репаративной регенерации у животных этих 2-х генетических линий. Представляло интерес исследовать, как будет протекать заживление ожоговой раны у мутантных мышей с нормально сформированным в эмбриогенезе и впоследствии разрушенным волосяным фолликулом (ВФ), который является одним из основных источников стволовых эпителиальных клеток при повреждениях кожи.

По предварительно разработанной методике мышам обеих линий наносили 2 ожоговые раны IIIA степени общей площадью 2-3% поверхности тела (п.т.). По способу ведения ран мыши были разделены на группы: самостоятельное заживление или применение раневого покрытия (таб. 2).

После выведения животных из эксперимента через 6 часов, 1, 3, 5, 7 суток рану полностью иссекали и измеряли ее площадь. Однако надо отметить, что при применении у мышей повязок с АФ эпителизация раны наступала одновременно на всей поверхности и в короткие сроки, в отличие от контрольной группы, где заживление происходило за счет краевой

эпителизации. Это не позволило использовать для сравнения разных групп метод планиметрии. Основными методами нашего исследования были рутинный гистологический и метод световой радиоавтографии.

Таблица 2

Распределение мышей с ожогами по группам в зависимости от

способа ведения ран

Вид раневого покрытия Абсолютное число особей, п

беспородные «ЬаМезэ»

Без покрытия (самостоятельное заживление) 16 16

Кремнеорганическая пленка 12 12

Аллофибробласты 28 28

Всего: 56 56

Основные результаты исследования и их обсуждение

Исследование двух групп больных, в одной из которых лечение ожогов ША степени проводили традиционным методом, а в другой - при помощи повязок с АФ, показало, что средние сроки наступления эпителизации поверхностных ожогов при применении АФ сокращались с 22,5 сут. до 7 сут. Под влиянием АФ эпителизация проходила стремительно и равномерно на всей поверхности раны в отличие от краевой и островковой эпителизации при традиционном лечении. Заживление ожога происходило без образования грубого гипертрофического рубца.

Как показали клинические исследования, наиболее эффективно применение повязок с АФ было у больных с общей площадью ожогов менее 30% поверхности тела. Чем меньше были показатели общей площади ожогов и прогностических индексов (ПИФ и ПИПС), тем быстрее наступала эпителизация ран. Установлено, что оптимальными сроками наложения повязок с АФ на ожоговую рану для получения хороших результатов лечения были первые трое суток после получения травмы.

Рис. 1. Заживление ожоговых ран П1А степени у больных: а) ожоговая рана П1А степени б-ного П.: отсутствие эпидермиса, отек и деструктивные изменения дермы, воспаление. В глубине раны сохранены придатки кожи (стрелка). Окраска гемотоксилином и эозином. 10х; б) ожоговая рана ША степени б-ного А. через 2 сут. после трансплантации АФ. Очажки неоэпителия на ее поверхности (стрелки). В дерме -активная клеточная реакция со стороны сосудов и придатков кожи: скопление большого числа клеток вокруг них (двойная стрелка). Окраска гемотоксилином и эозином. 10х; в) эпителизация раны через 7 суток после применения повязки с АФ у б-ного В. Новообразованный эпителий - плоский, межсосочковые клинья в нем отсутствуют (стрелки). Полутонкий срез. Окраска толуидиновым синим. 10х; г) рана, зажившая под мазевой повязкой на 22 сутки у б-ного В. Отторгающийся струп (стрелки). Образовавшийся эпителий (двойные стрелки) - неполноценный, с измененной структурой и неравномерный по толщине. Окраска гематоксилином и эозином. 20х

Гистологическое исследование показало, что рана после ожога ША ст. характеризовалась отсутствием эпидермиса, отеком, воспалением, деструктивными изменениями дермы - денатурацией коллагенового

матрикса, разрушением клеток и сосудов (рис. 1а). Однако в глубине раны сохранялись отдельные придатки кожи - ВФ, сальные и потовые железы, некоторые сосуды и фибробласты.

Через 2 суток после наложения на рану АФ на ее поверхности можно было наблюдать очажки неоэпителия (рис. 16). При этом в дерме отмечали активную клеточную реакцию со стороны сохранившихся придатков кожи или их фрагментов, а также вокруг сосудов. Среди клеток, окружающих сосуды, появлялись фибробласты. Это свидетельствовало об инициации пролиферативных процессов, как в эпителиальных клетках придатков, так и в клетках стенки сосудов (эндотелиоцитах и перицитах) и их ближайшем окружении.

Эпителизацию раны наблюдали через 7 суток после наложения на нее АФ (рис. 1в). Новообразованный эпителий был плоским, межсосочковые клинья в нем еще не образовались. Некоторая дезорганизация клеток в эпителиальных слоях свидетельствовала о продолжающихся процессах их дифференцировки и формирования. Однако слой базальных клеток был хорошо выражен. В регенерирующей дерме среди рыхлых коллагеновых волокон располагались фибробласты, которые были преобладающими клетками, и микрососуды.

Заживление раны под мазевой повязкой при не осложненном раневом процессе происходило обычно в течение 20-22 суток (рис. 1г). Однако часто образовавшийся эпителий был неравномерным по толщине и неоформившимся. Нередко заживление раны сопровождалось образованием гипертрофического рубца.

При ожоге ША степени регенерация эпителия осуществляется за счет эпителиальных стволовых клеток (СК), расположенных в придатках кожи -ВФ, сальных и потовых железах. В регенерации дермы важнейшая роль принадлежит клеткам стенки микрососудов. Установлено, что стенка микрососудов является камбиальной зоной и содержит мезенхимальные СК.

Доказано также, что микрососуды поставляют в рану кожи костномозговые СК, необходимые для регенерации дермы. Наше исследование показало, что на ранних стадиях после применения АФ усиливается функциональная, прежде всего, пролиферативная, активность клеток сохранившихся придатков кожи, содержащих СК. Выраженной была также клеточная реакция со стороны сосудов.

Заживление ран у мышей белых беспородных и мышей генетической линии Нг""/Н^г происходило аналогичным образом. Сроки эпителизации и ее характер совпадали у мышей обеих линий как при лечении повязками с АФ, так и при самостоятельном заживлении (таб. 3).

Таблица 3

Результаты эксперимента

Харакгер-ка эпителизации Самостоятельное заживление Кремнеорганическая пленка Аллофибробласты

мыши беспород ные мыши «hairless» S § 1 % s 1 5 а ю мыши «hairless» мыши беспород ные мыши «hairless»

Время эпителизации в сут. 5-7 5-7 5-6 5-6 3 3

Образование струпа да да нет нет нет нет

Характер эпителизации краевая и островковая эпителизация одновременно на всей поверхности

Интактная кожа мышей линии Я/7#/г в возрасте 3-5 месяцев характеризуется полным отсутствием волос. В их коже вместо обычных волосяных фолликулов, которые у беспородной белой мыши пронизывают всю толщу кожи (рис. 2а), присутствуют два вида структурных эпителиальных образований (рис. 26). Это, во-первых, связанные с эпидермисом и с сальной железой гиперкератинизированные мешочки «угреподобной» формы. Вторым структурным образованием являются

хорошо развитые разных размеров цисты или пузыри, окруженные однослойным эпителием и расположенные рядами в дерме.

При самостоятельном заживлении ран у мышей наблюдали естественный ход процесса эпителизации, который осуществлялся за счет краевой эпителизации (рис. 2в, г) в максимальные сроки (5-7 сут.). В группе, где применяли кремнеорганическую пленку, сроки эпителизации раны несколько сократились (5-6 сут.) за счет создания благоприятных условий для раны (влажной среды), однако, заживление происходило также за счет краевой эпителизации. В группе, где применяли биологически активные повязки с АФ, образование эпителия на поверхности раны заканчивалось через 3 суток. Отмечалась одномоментная эпителизация всей поверхности раны (рис. 2д, е).

Уже через 6 часов после ожоговой травмы, как у нормальных, так и у мутантных мышей, на фоне деструктивных изменений тканей кожи была отмечена реакция со стороны придатков кожи, в первую очередь ВФ или их дериватов у мутантных мышей, в виде набухания, пролиферации и миграции их эпителиальных клеток. Активность этой реакции была заметно более выраженной при использовании для заживления ран повязки с АФ.

К*»'' *»-ф'* • •*»#•.

.«■'у-Vе* * Ш

Рис. 2. Интактиая кожа мышей (а, б) и заживление у них ожоговых ран П1А степени через 3 суток после травмы (в - е). Окраска гематоксилином и эозином. 10х: а) кожа беспородной мыши с тонким эпителием и большим количеством ВФ; б) кожа мутантной мыши. В дерме - два вида эпителиальных структур: мешковидные образования (стрелка), связанные с эпидермисом и сальной железой, и разных размеров пузыри (две стрелки); в) ожоговая рана беспородной мыши, самостоятельное заживление. Неравномерный тонкий эпителий (стрелки) не полностью покрывает рану. В дерме сохраняются деструктивные изменения; г) ожоговая рана мутантной мыши, самостоятельное заживление. Очаговая микробная инвазия (двойная стрелка) образовавшегося тонкого эпителия (стрелки). Разрушение дермы, тромбоз микрососудов, воспаление; д) ожоговая рана беспородной мыши, заживление под повязкой с АФ. Полная эпителизация раны - образование молодой кожи; е) рана мутантной мыши, заживавшая под повязкой с АФ, практически полностью закрыта эпителием. На отдельных участках эпителий был утолщенным (стрелка).

Выражена пролиферативная активность эпителиальных клеток дермальных цист (двойные стрелки).

По данным радиоавтографии, через 6 часов после ожога активная пролиферация (включение 3Н-тимидина - синтез ДНК) обнаружена в эпителиальных клетках ВФ и потовых желез у беспородных мышей (рис. За), особенно интенсивная при использовании повязки с АФ (рис. 36, в). У мышей линии Н^/Нг1"" при самостоятельном заживлении была зафиксирована белково-синтетическую активность (включение 3Н-уридина - синтез РНК) эпителиальных клеток потовых желез (рис. Зг), а также клеток стенки микрососудов (эндотелиоцитов и перицитов) и фибробластов. В ранах, заживавших под повязкой с АФ, у этих мышей отмечен синтез ДНК в эпителиальных клетках дериватов ВФ - цистах (рис. Зд).

Через 1 сутки после ожога реакция клеток раны, отмеченная через 6 часов, была более выраженной. Пролиферирующий и мигрирующий эпителий начинал покрывать рану с различной скоростью у разных групп животных. При использовании АФ большая часть поверхности ран была закрыта эпителием, при самостоятельном заживлении - меньшая. При лечении ран с помощью АФ и у беспородных, и у мутантных мышей заметно выраженной была реакция со стороны сосудов, - возрастало количество капилляров и клеток вокруг сосудов (в первую очередь, фибробластов), обнаруживалась митотическая активность эндотелиоцитов и перицитов микрососудов и окружающих их клеток. Как показало радиоавтографическое исследование, особенно выраженной пролиферативная активность была в эндотелиальных клетках сосудов у мутантных мышей (рис. Зе).

На 3 сутки ожоговые раны у мышей обеих линий, заживавшие под повязками, эпителизировались. Через 5-7 суток покрывались эпителием раны при самостоятельном заживлении.

Рис. 3. Биосинтетическая активность клеток при заживлении ожоговой раны. Полутонкие срезы. Окраска толуидиновым синим. 63х (объяснение в тексте)

Интенсивная пролиферация эпителиальных клеток ВФ и потовых желез у беспородных мышей и эпителия глубоких дермальных цист у мутантных мышей (синтез ДНК), обнаруженная через 6 час после ожога при использовании АФ, может свидетельствовать о стимуляции стволовых/прогениторных клеток в придатках кожи у беспородных мышей, и в дериватах ВФ у мутантных мышей. У последних, как установлено, после дезинтеграции ВФ область выпячивания его наружного корневого влагалища, которую считают «тканевой нишей» СК эпителия кожи, сохраняется в глубоко расположенных дермальных цистах.

Микрососуды в ткани служат не только для осуществления обменных процессов, но и имеют первостепенное значение в процессе регенерации дермы, т.к. являются центрами клеточной пролиферации и дифференцировки. В настоящее время установлено, что стенка микрососудов является нишей для резидентных СК ткани, обеспечивающих ее регенерацию.

Таким образом, на основании проведенного нами исследования можно заключить, что биологически активные повязки с живыми АФ оказывают выраженный стимулирующий эффект на заживление ожоговых ран ША степени. Основными механизмами стимулирующего влияния повязки с АФ на заживление ожоговой раны считаем следующие:

Во-первых, культивированные АФ вместе с синтезированным ими в процессе культурального роста коллагеном играют роль первичной экзогенной дермы, которая временно, на ранней стадии заживления, заменяет разрушенную ожогом дерму и обеспечивает необходимые условия для миграции сохранившихся кератиноцитов.

Во-вторых, большой вклад в эффект стимуляции принадлежит ростовым факторам и цитокинам, образующимся в результате разрушения трансплантированных на рану АФ, а также присутствующим в раневом экссудате на ранней стадии раневого процесса. Полагаем, что именно за счет этих биологически активных веществ на ранней стадии заживления стимулируется пролиферативная активность стволовых и/или прогениторных эпителиальных клеток в придатках кожи, а также пролиферативная и функциональная активность клеток стенки микрососудов, что имеет первостепенное значение для регенерации дермы.

Наше исследование также показало, что в своей основе в одинаковых условиях репаративная регенерация кожи у безволосых мышей с мутацией в гене Нг имеет те же закономерности, что и восстановление кожи у беспородных белых мышей. Несмотря на существенное изменение

морфологии ВФ у мутаитиых мышей и нарушение его основной функции -образования волоса, значение его как одного из основных источников эпителиальных СК, сохраняющихся в его дериватах (дермальных цистах), не утрачивается. Репаративная регенерация дермы у этих мышей не имеет никаких отклонений от нормы.

ВЫВОДЫ

1. Применение повязок с аллофибробластами в первые трое суток после травмы обеспечивает заживление ожоговых ран ША степени в течение 6-9 суток без образования патологического рубца в отличие от традиционного метода лечения, при котором раны заживают на 20-22 сутки, нередко с образованием гипертрофического рубца.

2. Морфологическое (цитологическое и гистологическое) исследование, проведенное на различных стадиях раневого процесса показало выраженный стимулирующий эффект трансплантации аллофибробластов на заживление ожоговых ран ША степени в 1-3 сутки после наложения повязки.

3. Морфофункциональное исследование на основе разработанной экспериментальной модели ожога ША степени на мышах позволило выявить основные механизмы стимулирующего влияния аллофибробластов на заживление ожоговых ран.

4. Трансплантированные аллофибробласты стимулируют пролиферацию стволовых и/или прогениторных клеток в ране кожи: эпителиальных — в придатках кожи и дермальных - в стенке микрососудов, главным образом, за счет действия биологически активных веществ, освобождаемых при разрушении аллофибробластов.

5. У мутантных мышей не утрачивается значение волосяного фолликула как одного из источников эпителиальных стволовых клеток, несмотря на

значительное изменение его морфологии и нарушение функции образования волоса.

Практические рекомендации

1. Рекомендуем использовать повязки с АФ в максимально ранние сроки после травмы (1-3 сутки) с целью ускорения эпителизации ожогов III А степени и снижения риска образования гипертрофического рубца.

2. Для достижения максимального эффекта повязки с АФ рекомендуем применять пациентам, имеющим общую площадь ожогов не более 30% п.т., показатели прогностических индексов ПИФ в пределах 70 ед. и ПИПС до 100 ед.

3. Повязки с АФ следует применять на чистые раны. Не допускается присутствие на ранах струпа, плотно спаянного с подлежащими тканями фибрина, гнойного раневого отделяемого.

4. Перед трансплантацией АФ рекомендуем провести тщательный туалет ожоговой раны, обработать рану раствором антисептика, наложить повязку с АФ на ожоги IIIA степени, зафиксировать ее влажно-высыхающей марлевой повязкой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Местное использование клеток соединительной ткани -аллофибробластов, для стимуляции заживления ожоговых ран IIIA степени / В.Б. Хватов, C.B. Смирнов, О.И. Конюшко, Е.Г. Колокольчикова, Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский, B.C. Бочарова // Вестн. службы крови.-2006.-№ 4.-С.20-23.

2. Жиркова, Е.А. Перспективы сокращения сроков заживления поверхностных ожогов IIIA степени при использовании биологической повязки на основе аллофибробластов / Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский: [Актуальные проблемы термической травмы: материалы междунар. конф., посвящ. 60-летию ожогового центра НИИ скорой помощи им. И.И.

Джанелидзе, г. Санкт-Петербург, 20-22 июня 2006 г.] // Скорая мед. помощь.-2006.-№ 3.-С.171-172.

3. Сычевский, М.В. Сравнительный анализ влияния трансплантации живых аллогенных фибробластов и повязки на основе коллагена I С PDGF-ВВ на эпителизацию ожоговых ран II-IIIA степени / М.В. Сычевский, Е.А. Жиркова: [Актуальные проблемы термической травмы: материалы междунар. конф., посвящ. 60-летию ожогового центра НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе, г. Санкт-Петербург, 20-22 июня 2006 г.] // Скорая мед. помощь.-2006.-№ З.-С. 178-179.

4. Эффективность раннего применения аллофибробластов в лечении обширных ожогов ША степени / Е.А. Жиркова, B.C. Бочарова, Е.Г. Колокольчикова // Здоровье столицы-2006: прогр., тез. докл., каталог участников выставки V Моск. ассамблеи, 14-15 дек. 2006 г.-М.:ГЕОС,2006.-С.196.

5. Эффективность раннего применения биологической повязки на основе живых аллогенных фибробластов линии М-22 для лечения субдермальных ожогов / B.C. Бочарова, О.И. Конюшко, Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский [Биология клетки в культуре: тез. докл. Всерос. симп., г.Санкт-Петербург, 1719 октября 2006 г.] // Цитология.-2006.-№ 9.-С.747-748.

6. Эффективность трансплантации аллофибробластов в ранние сроки после получения травмы у пострадавших с ожогами ША степени / Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский, ЕЛО. Коршунова, C.B. Смирнов // Человек и лекарство: тез. докл. XIII Рос. нац. конгр., г.Москва, 3-7 апр. 2006 г.-М.,2006,-С.627.

7. Жиркова, Е.А. Регуляция фибробластами заживления ожоговой раны в эксперименте на мышах / Е.А. Жиркова, И.Н. Пономарев [материалы Всерос.конф. студентов и молодых ученых «Пироговские чтения», г. Москва, 30 ноября 2007г.] // Вестник РГМУ.-2008.-№2.-С.141.

8. Влияние компонентов экссудата ожогового пузыря на ранозаживление / C.B. Смирнов, В.Б. Хватов, Н.В. Боровкова, М.В. Сычевский, Е.А. Жиркова,

B.C. Бочарова // Материалы V Всерос. науч. конф. общих хирургов объединенной с пленумом пробл. комиссии РАМН «Неотложная хирургия» и «Инфекция в хирургии» межведомственного науч. совета по хирургии.- М.; Ростов н/д., 2008.-С.190-191.

9. Жиркова, Е.А. Влияние новых технологий лечения ран в комбустиологии на сроки пребывания больных в стационаре / Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский, C.B. Смирнов // Сб. науч. тр. II съезда комбустиологов России, г. Москва, 2-5 июня 2008 г.- M., 2008.-С.222-223.

10. Жиркова, Е.А. Изучение механизма влияния трансплантации аллофибробластов на заживление ожоговых ран (экспериментальное исследование) / Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский [Новые технологии в неотложной и восстановительной медицине: тез. докл. науч.-практ. конф. молодых ученых, 12-14 окт., г.Ялта, (Украина)] // Вестн. неотложной и восстановительной медицины.-2008.-№ 3.-С.433-444.

11. Морфофункциональная оценка влияния биологически активных повязок на заживление ожоговых ран IIIA степени / Е.Г. Колокольчикова,

C.B. Смирнов, Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский, В.Б. Хватов // Здоровье столицы-2008: прогр., тез. докл., каталог участников выставки VII Моск. ассамблеи, 18-19 дек. 2008 г.-М.:ГЕОС,2008.-С.262-263.

12. Опыт лечения больных с термической травмой в научно-исследовательском институте скорой помощи им. Н.В. Склифосовского / Л.П. Логинов, B.C. Борисов, C.B. Смирнов, С.Б. Матвеев, Т.Г. Спиридонова, М.В. Сычевский, Е.А. Жиркова, М.В. Шахламов, Ю.В. Степанова [Специальные аспекты хирургической помощи населению в современной России: сб. материалов Всерос. науч. конф. с междунар. участием] // Успенские чтения.-Вып.5.-Тверь, 2008.- С.215-216.

13. Способ местного лечения ожоговых ран с использованием биологической повязки на основе коллагена типа I и полидиметилсилоксан-поликарбонатного блок-сополимера / Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, B.C. Бочарова [Современные технологии и возможности реконструктивно-восстановительной и эстетической хирургии: материалы I междунар. конф., г.Москва, 22-23 апр.2008 г.] // Альманах ин-та хирургии им. А.В. Вишневского.-2008.-№2.-С.15-16.

14. Сравнительные результаты заживления ожоговых ран при применении повязок на основе коллагена типа I с тромбоцитарным фактором роста и аллофибробластов / Е.А. Жиркова, М.В. Сычевский, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, Е.Г. Колокольчикова // Тез. докл. IV Всерос. съезда трансплантологов памяти акад. В.И. Шумакова, г.Москва, 9-10 нояб. 2008 г.-М., 2008.-С.302-303.

15. Сравнение эффективности повязок на основе коллагена типа I с тромбоцитарным фактором роста и аллофибробластов при лечении ожоговых ран / С.В. Смирнов, М.В. Сычевский, Е.А. Жиркова, Е.Г. Колокольчикова // Высокие медицинские технологии XXI века: материалы VII междунар. конф., Испания, Бенидорм, 26 октября - 2 ноября 2008 г.- М., 2008,- С.27.

16. Biological ailofibroblast-based dressing decreases the duration of superficial burn healing / E.A. Zhirkova, S.V. Smirnov, L.L. Mironova, O.I. Koniushko, M.V. Sychevsky, E.G. Kolokolchikova, V.B. Khvathov, K.S. Smirnov, V.S. Bocharova [Е.А. Жиркова, С.В. Смирнов, Л.Л. Миронова, О.И. Конюшко, М.В. Сычевский, Е.Г. Колокольчикова, В.Б. Хватов, К.С. Смирнов, B.C. Бочарова] // Abstracts of6th congr Interactional Federation of Shock Societies (IFSS) and 3Ist Annual Conf. of Shock, Cologne, 28 june -2 jule 2008 / eds. by E.A.M. Neugebauer.-Cologhe, 2008 .-reprint.-P. 161-165.

17. Biological allofibroblast-based dressing decreases the duration of superficial burn / E.Zhirkova, S. Smirnov, V. Khvathov, M. Sychevsky, K. Smirnov [E.A. Жиркова, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, М.В. Сычевский, К.С. Смирнов] [Abstr.

6th congr International Federation of Shock Societies (IFSS) and 31st Annual Conf. of Shock, Cologne, 28 june -2 jule 2008] // Shock.-2008.-Vol.29.- Suppl.l.-P. 40. (P. 108).

18. Заместительная клеточная терапия / В.Б. Хватов, А.Ю. Ваза, Е.А. Жиркова, B.C. Бочарова// Трансплантология ,-2009.-№ 1.-С.31-33.

19. Изучение репаративной регенерации кожи у безволосых мышей линии «Hairless» / Е.Г. Колокольчикова, Е.А. Жиркова, П.К. Головатенко-Абрамов, В.Б. Хватов // Актуальные вопросы патологической анатомии: материалы III съезда Рос. о-ва патологоанатомов, г.Самара, 26-30 мая 2009 г.: в 2-х т,-Самара, 2009.- T. 2.-С.240-241.

20. Основные механизмы стимулирующего влияния коллагеновой повязки на заживление ожоговых ран IIIA степени / Е.Г. Колокольчикова, М.В. Сычевский, Е.А. Жиркова, C.B. Смирнов, В.Б. Хватов, B.C. Бочарова // Здоровье столицы-2009 прогр., тез. докл., каталог участников выставки VIII Моск. ассамблеи, 17-18 дек. 2009 г.-М.:ГЕОС,2009.-С.230-231.

21. Морфофункциональная оценка влияния биологической повязки на основе коллагена 1-го типа на регенерацию кожи после ожоговой травмы у мышей двух генетических линий / Е.Г. Колокольчикова, Е.А. Жиркова, П.К. Головатенко-Абрамов, Е.С. Платонов, B.C. Бочарова, В.Б. Хватов // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2010.-№1.-С.47-54. Патенты

Пат. 2320349 Российская Федерация, МПК5,А61К 33/00; А61К 35/12; А61Р 17/02 Способ лечения ожоговых ран / Ермолов A.C., Смирнов, C.B., Хватов В.Б., Сычевский М.В., Жиркова Е.А., Копылов В.М., Райгородский И.М., Иванов Д.В.; заявитель и патентообладатель Московский городской НИИ СП им. Н.В. Склифосовского.-2006124648/14; заявл. 11.07.06; опубл. 23.03.08, Бюл. №9.-7 с.

Пат. 2373944 Российская Федерация, МПК51А61К 35/48; А61К 38/39; А61К 33/00; А61Р 41/00 Способ лечения ожоговой раны / Ермолов A.C., Смирнов,

C.B., Хватов В.Б., Миронова Л.Л., Конюшко О.И., Жиркова Е.А., Бочарова B.C.; заявитель и патентообладатель Московский городской НИИ СП им. Н.В. Склифосовского.-2008125033/14; заявл. 23.06.08; опубл. 27.11.09, Бюл. №33.-5с.

Список основных сокращений

АФ - аллофибробласты

ВФ - волосяной фолликул

ПИФ - прогностический индекс Франка

ПИПС - прогностический индекс «правило сотни»

СК - стволовая клетка

% п.т. - процент поверхности тела

Подписано в печать:

06.04.2011

Заказ № 5276 Тираж -110 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность исследования

В настоящее время наметилась тенденция к сокращению численности больных, госпитализируемых с ожогами во все стационары России. В 1999 г. сообщалось о 600 тысячах случаев в год [3]. По последним данным, в России регистрируется около 500 тысяч случаев ожогов, что составляет 6-8% в общей структуре травматизма [21]. Несмотря на уменьшение общего уровня ожогового травматизма, летальность от ожогов в целом по стране не только не сократилась, а, напротив, заметно возросла [2].

Исход ожоговой травмы зависит не только от площади глубоких ожогов, но и от общего поражения. Это положение отражает прогностический индекс Франка, который определяет тяжесть и возможный исход ожоговой болезни [29]. Из числа обожженных, госпитализируемых в стационары, у 60-80% больных имеются поверхностные ожоги П-ША степени, которые во многом определяют тяжесть травмы и ее прогноз [12, 60]. По нашим данным, больные с ожогами II и IIIА степени, госпитализированные в ожоговый центр НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского за последние 5 лет, составляли 70% от общего числа больных.

Пограничные ожоги ША степени могут заживать самостоятельно за счет сохранившихся эпидермальных придатков кожи, которые, однако, находятся под угрозой гибели. Этот процесс самостоятельного заживления при обширных ожогах может длиться до 30-36 дней. При этом около 1/3 ожогов ША степени заживают, оставляя после себя гипертрофические и келоидные рубцы, которые в дальнейшем требуют длительного консервативного и оперативного лечения [32].

При ожогах ИГА степени мозаичность поражения? кожи часто затрудняет самостоятельное заживление, особенно при- обширных ожогах,, когда за снет нарушений микроциркуляции и инфицирования эпидермальные производные находятся' под угрозой-- гибели; [43]. В таких условиях раны, могут «углубляться». . [24]. Кроме того, при сочетании обширных пограничных ожогов: IIIA степени с глубокими ожогами IIIB-IV степени; заживление пограничных ожогов на фоне тяжелой ожоговой! болезни« часто; «задерживается». Повышается риск генерализации инфекции; значительно;-ухудшается прогноз и результаты лечения термической травмы [7]. Порой, в подобной ситуации, для спасения жизни больного приходится прибегать к аутодермоп ластике, основными недостатками которой являются дополнительная- кожная рана в месте забора лоскута и невозможность применения этой технологии при обширных поражениях [71, 81, 149, 150].

Современные разработки в области клеточной биологии и тканевой инженерии дали возможность вплотную подойти к решению проблемы восстановления кожи посредством тканеинженерных конструкций на основе кератиноцитов, фибробластов и коллагеновой матрицы в различных их сочетаниях [11, 14, 53^ 55, 62, 76, 152, 178]. Достижения науки позволяют производить новые поколения сложных повязок временно заменяющих кожу и стимулирующих регенерацию собственной-кожи в максимально короткие сроки и без образования выраженных рубцов. Однако механизмы,, в* результате действия которых формируются и восстанавливаются ткани, все еще недостаточно изучены, разработка методов лечения с использованием культивированных клеток кожи и ее эквивалентов требует совершенствования на всех этапах, начиная от формирования трансплантата и до его применения. Таким образом, научный поиск оптимальных методов восстановления дермы и эпидермиса продолжается, оставаясь актуальной проблемой в комбустиологии.

Цель исследования

Клинически и экспериментально обосновать целесообразность трансплантации аллофибробластов для лечения ожогов ША степени и исследовать механизмы их действия.

Задачи

1. Определить клиническую эффективность трансплантации аллофибробластов в сравнении с традиционными методами местного лечения.

2. Провести сравнительную клинико-морфологическую оценку восстановления кожи у пациентов с ожоговой раной ША степени при использовании аллофибробластов и при традиционном методе лечения.

3. На разработанной экспериментальной модели ожога ША степени провести морфологическое (гистологическое и радиоавтографическое) исследование влияния трансплантации аллофибробластов на заживление ожоговой раны.

4. Определить механизмы влияния аллофибробластов на процесс заживления ожоговой раны ША степени в эксперименте на мышах 2-х генетических линий (беспородных белых и мутантных линии Нг1Г/Нгь~).

Научная новизна

Определены клинические показания и оптимальные сроки применения аллофибробластов для лечения ожоговых ран ША степени.

Впервые для изучения механизмов стимулирующего влияния трансплантированных аллофибробластов на заживление ожоговых ран выполнено экспериментальное морфофункциональное исследование с использованием светомикроскопического радиоавтографического метода.

На основании результатов морфофункционального исследования показано стимулирующее влияние аллофибробластов на пролиферативную активность стволовых/прогениторных клеток, участвующих в заживлении' раны.

Впервые показано, что репаративная регенерация кожи при-ожоге ША степени у безволосых мышей с мутацией в гене Нг имеет те же закономерности, что и восстановление кожи у беспородных белых мышей.

Практическая значимость

В результате усовершенствования тактики применения трансплантации аллофибробластов на поверхность ожоговой раны ША степени значительно сократились сроки эпителизации раны. Заживление ожоговой раны ША степени после трансплантации аллофибробластов происходит с хорошим косметическим эффектом, без образования гипертрофического рубца.

Внедрение

Методика применения повязки на основе живых аллофибробластов, разработанная в рамках данного исследования, внедрена в клиническую практику ожогового центра НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. Материал диссертации использован в информационном письме (Информ. письмо № 5 / НИИ СП им. Н.В.Склифосовского. -М., 2008.-7с.), в 2 патентах на изобретение (№ 2320349 «Способ лечения ожоговых ран» от 27.03.2008 г., № 2373944 «Способ лечения ожоговой раны» от 27.11.2009 г.).

Личный вклад соискателя

выводы

1. Применение повязок с аллофибробластами в первые трое суток после травмы обеспечивает заживление ожоговых ран ША степени в течение 6-9 суток без образования патологического рубца в отличие от традиционного метода лечения, при котором раны заживают на 20-22 сутки нередко с образованием гипертрофического рубца.

2. Морфологическое (цитологическое и гистологическое) исследование проведенное на различных стадиях раневого процесса, показало выраженный стимулирующий эффект трансплантации аллофибробластов на заживления ожоговых ран ША степени в 1-3 сутки после наложения повязки.

3. Морфо функциональное исследование на основе разработанной экспериментальной модели ожога ША степени на мышах позволило выявить основные механизмы стимулирующего влияния АФ на заживление ожоговых ран.

4. Трансплантированные АФ стимулируют пролиферацию стволовых и/или прогениторных эпителиальных клеток в придатках кожи, а также биосинтетическую активность клеток стенки микрососудов за счет биологически активных веществ, выделяющихся в результате разрушения АФ и содержащихся в раневом экссудате в 1-3 сутки после травмы.

5. У мутантных мышей не утрачивается значение волосяного фолликула как одного из источников эпителиальных стволовых клеток, несмотря на значительное изменение его морфологии и нарушение функции образования волоса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуем использовать повязки с АФ в максимально ранние сроки после травмы (1-3 сутки) с целью ускорения эпителизации ожогов ША степени и снижения риска образования гипертрофического рубца.

2. Для достижения максимального эффекта повязки с АФ рекомендуем применять пациентам, имеющим общую площадь ожогов не более 30% п.т., показатели прогностических индексов ПИФ в пределах 70 ед. и 11И11С до 100 ед.

3. Повязки с АФ следует применять на чистые раны. Не допускается присутствие на ранах струпа, плотно спаянного с подлежащими тканями фибрина, гнойного раневого отделяемого.

4. Перед трансплантацией АФ рекомендуем провести тщательный туалет ожоговой раны, обработать рану раствором антисептика, наложить повязку с АФ на ожоги ША степени, зафиксировать ее влажно-высыхающей марлевой повязкой.