Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование новых подходов к оценке поствакцинального противотуберкулезного иммунитета у детей для оптимизации эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом

На правах рукописи

ФОКИНА Лариса Анатольевна

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ НОВЫХ ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА И КОНТРОЛЯ ЗА ТУБЕРКУЛЕЗОМ

14 00 30 Эпидемиология 14 00 36 Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03065242

Пермь - 2007

003065242

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е А Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Пермь

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Фельдблюм Ирина Викторовна доктор медицинских наук, профессор Горовиц Эдуард Сендерович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Слободенюк Александр Владимирович доктор медицинских наук, профессор Шардаков Виктор Иванович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Омск

Защита состоится 25 сентября 2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208 067 04 при Пермской государственной медицинской академии (614000, г Пермь, ул Куйбышева, 39)

Автореферат диссертации размещен на сайте Пермской государственной медицинской академии (гейог@р8та ги)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной медицинской академии (г. Пермь, ул Коммунистическая, 26)

Автореферат разослан "24" августа 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Сандакова Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время туберкулез все еще остается чрезвычайно важной международ ной и национальной проблемой (Акоенова, 2002, Fneden, 2003) По оценке ВОЗ, в период 2000-2020 ir около 2 млрд. людей будет инфицировано микобакгериями туберкулеза, при этом 200 млн человек заболеет и 35 млн погибнет Глобальный нозоареал свидетельствует о наличии колоссального резервуара микобакгериальной инфекпщ, что обусловливает широкую дассеминащпо возбудителя среди населения и создает дополнительный риск инфицирования взрослых и детей (Хрулева, 2001, Король, Лазовской, 2005, Iseman, 2000, Mashal et al., 2007) Эпидемическая сшуация усугубляется распространением лекарственно-устойчивого туберкулеза, который, по мнению С. Dye et al. (2002), в настоящее время принимает характер мировой пандемии и способен дестабилизировать общество

Неблагоприятные тенденции в сложившейся эпидемической ситуации по туберкулезу отмечаются и в России (Аксенова, 2002, Оншценко, 2003, Переяьман, 2003, Шилова, 2004) Причинами распространения этого заболевания являются резко возросшие миграционные процессы, социально-экономические проблемы, недостаточное финансирование общественного здравоохранения, ухудшение экологической обстановки, а также хронический психоэмоциональный стресс, ставший постоянным спутником населения мегаполисов Все это в «конденсированном ввде» неизбежно влияет на иммунную реактивность организма, изменяя ало сопротивляемость инфекциям (Вишневский и др., 2002, Аксенова, 2003, Филатов, Шаханина. 2005, Crevel, 2002, Fneden, 2003) По результатам проведенного Центральным НИИ туберкулеза РАМН эпидемиологического анализа, наряду с другими регионами России, Пермский край отнесен к территориям с неблагополучной эпидемической ситуацией по тубфкулезу (Сазыкин, Сон, 2006)

Одним из наиболее массовых методов борьбы с туберкулезной инфекцией является вакцинация. Вместе с тем, од ни авторы отстаивают необходимость сохранения традиционных подходов к организации и проведению специфической профилактики заболевания (Аксенова, 2001, 2002, Мшинская, 2003, Аксклина, 2006, Bnttan, Palendra, 2003, Pulical, Fernandez, 2007) Другие исследователи считают, что влияние вакцинопрофилакшки на показатели эпидемического процесса незначительно и нет необходимости широкомасштабного использования вакцины БЦЖ для предупреждения туберкулеза (Маянский, 2000, Snmvasan et al, 2006) Тем не менее, вакцина БЦЖ широко используется и по сей день, выдержав «испытание временем» Ее безвредность, специфичность, иммуногенносгь проверена и доказана пракгакой (Мишнская, 2001) Цри этом существует научно обоснованное мнение, что использование профилактических прививок позволяет смешать ТЪ2-паляризованный иммунный ответ на различные антигены у детей раннего возраста в направлении Thl-orreera с выработкой инкрферона-у и ингерлейкина-2, являющихся активаторами циготоксических лимфоцитов и макрофагов, которые обеспечивают устойчивость организма к возбудителю туберкулеза (Ovsyarmikova et al., 2003, VijayaLakshmietaL, 2005, NaoeM. etaL,2007) Наиболее сложной задачей в этом вопросе остается способ контроля напряженности и длительности сохранения адапгавных реакций, обеспечивающих формирование протекшвных механизмов против вирулентных микобакгерий В современных условиях в системе эпидемиологического щазора и контроля за туберкулезом отсутствуют объективные

унифицированные критфии оценки состояния поствакцинального иммунитета. Единственными показателями индивидуальной и попупяционной состоятельности проведенной вакцинации остаются размер кожного знака и туберкулиновые пробы (Дюканова, 2003, Neurenberger et aL, 2005) Однако они, по мнению рада исследователей, не отражают истинной невосприимчивости к туберкулезу, особенно в случаях отсутствующею рубчика и отрицательной пробы Машу, а в отдаленные сроки после введения БЦЖ вообще утрачивают свое значение (Мишнская, 2003, Neurenberger et aL, 2005) Наряду с этим недостаточно изучена динамика развитая защитных реакций с позиций формирования специфического ответа, особенно у детей до периода их первой календарной ревакцинации Необходимость подобных исследований основывается, с одной стороны, на признании «туберкулеза иммунным заболеванием» (Каминская и др, 2001, Губкина, Овсянкина, 2005), а с фугой, на том, что недостаточно развитая прогавоинфекционная резистентность детского организма выполняет не только тригтерную функцию, но является и фактором риска, поддерживающим заболеваемость В свете вышеизложенного актуальным остается поиск и апробация новых, информативных, доступных для широкого практического применения методов контроля за длительностью и напряженностью противотуберкулезного иммунитета, как на организменном, так и популяционном уровнях.

Цепь исследования - разработка новых методических подходов к оценке поствакцинального противотуберкулезного иммунитета у детей в системе эпидемиологического надзора и кошроля за туберкулезом.

Основные задачи исследования

1 Провести сравнительный анализ состояния привитосги населения Пермского края в период действия региональной тактики специфической профилактики туберкулеза (1994-1999 гг) и после ее отмены (2000-2005 гт )

2. Изучил, многолетнюю динамику основных показателей, характеризующих эпидемическую ситуацию по туберкулезу на территории Пермского края за 1984-2005 гг, а также определить значимость вакцинопро4)илакгаки в предупреждении заболеваемости на современном этапе.

3 В условиях эксперимента установить основные закономерности развития адаптивных реакций поствакцинального иммунитета.

4 В различные сроки после БЦЖ-вакцинапии детей провести комплексный анализ функциональной активности эффекгорных клеток крови и специфических гуморальных факторов защиты организма с целью определения степени напряженности и длительности сохранения адапшвного противотуберкулезного иммунитета.

5 Разработать рекомендации по использованию предлагаемых методов исследования специфической реактивности организма для оценки состояния поствакцинального иммунитета у детей в системе эпидемиологического надзора и кошроля за туберкулезом

Научная новизна. Впервые на территории Пермского края в условиях естественного эпидемиологического эксперимента (отмены тактики ревакцинации детей с сомнительной реакцией Манту и регламентированного однократного введения бустер-доз БЦЖ в 7 или 14 лет) установлено негативное влияние снижения объемов вакцишпрофилакгики на уровень заболеваемости туберкулезом. Впервые для оценки поствакцинального противотуберкулезного иммунитета у детей

использован комплекс оригинальных иммунологических методов, позволивших регистрировать функциональную активность эффекгорных клеток 1фош В условиях эксперимента при иммунизации неполовозрелых животных изучены закономерности развишя специфических и неспецифических адативных клеточных и гуморальных реакций на различных этапах воспалительных изменений тканей в зоне введения БЦЖ-вакцины. Впервые проведен комплексный динамический анализ специфической реактивности детей в первые 4 года после введения БЦЖ-вакцины. Установлены показатели «естественного фона» у детей 6,5-7 лет перед регламентированной календарной их ревакцинацией, а также доказана универсальность индексов, позволяющая создать принципиально новый методический подход к определению состояния адаптивного противотуберкулезного иммунитета на органшменном и популяционном уровнях. Впервые на основании использованных оригинальных иммунологических методов исследования показано, что угасание посгвакцинального иммунитета у 41,4% детей 3-4- лет происходит задолго до их ревакцинац ии, обусловливая возможность их инфицирования и заболевания.

Теоретическое и практическое значение работы. Установленные закономерности развитая специфических и неспецифических адаптивных реакций организма при экшеримешальной БЦЖ-вакцинации, а также данные клинических наблюдений, могут служил» основой д тя дальнейшего изучения механизмов формирования противотуберкулезного иммунитета. Применение оригинальных иммунологических методов исследований функциональной активности эффекгорных клеток крови в комплексе с традиционно используемыми критериями анализа эффективности БЦЖ-вакцинации детей позволяет повысшь объективность оценки состояния их противотуберкулезной зашщы в различные сроки после иммунизации Полученные результаты могут быть внедрены в систему эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом в части обеспечения мониторинга напряженности поствакцинального популяционного иммунитета и совершенствования экстренной специфической профилактики контактных в эпидемических очагах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Снижение объемов профилактических прививок после отмены региональной тактики специфической профилактики туберкулеза явилось одним из факторов риска, обусловившего осложнение эпидемической ситуации на территории Пермского края.

2 Для ЕЦЖ-вакцинального процесса у неполовозрелых кроликов, наряду с фазностью изменений кожного прививочного знака, а так»® неспепцфических и специфических гуморальных факторов зашщы, характерно постепенное нарастание активности и доминирование клеточно-опосредованных иммунных реакций.

3 В системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом для определения степени напряженности и длительности сохранения у детей поствакцинального иммунитета, наряду с традиционными методами оценки результатов пробы Машу и определения величины прививочного рубчика, целесообразно исследовать функциональную активность эффекгорных клеток крови и особенности процесса специфического анппелообразования

Внедрение в практику. Подученные результаты исследования используются в учебном и научном процессах на кафедрах эпвдемиологии с курсом гигиены и эпидемиологии ФГЖ и 1111С, микробиологии, вирусологии и иммунологии, патологической физиологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е А Вагнера», а также в Пермском областном

противотуберкулезном даспансфе «Фгизиопупшонояопм» Методические рекомендации по фагоцитарной активности клеток крови используются детскими клиническими больницами г Пфми(№№ 13,15)

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на итоговых научных сессиях Пермской государственной медицинской академии им. акад ЕАВагаера, Пермь, 1998,2001,2002, V Международной научной конференции «Здоровье семьи -21 век», Мармарис, 2001, П конференции иммунологов Урала, Пермь, 2002, Межвузовской конференции микробиологов, Тома; 2006, совместных заседаниях кафедр патофизиологии, эпидемиологии, микробиологии и фтизиатрии ГОУ ВПО «ПГМА им академика ЕАВагаера» Росздрава, Пермь, 2006,2007

Публикации По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 - в нитруемых журналах Опубликованы методические рекомендации—«Применение метода диагностического определения специфической фагоцитарной реакции клеток крови у детей при туберкулезной инфекции и первичной вакцинации БЦЖ», 2006 Получен патент № 2302634 «Способ иммунодиагностики туберкулезной инфекции» Бюл. № 19,2007

Объем и структура диссертации. Диссертация излажена на 198 сгр машинописного текста. Состоит из введения, обзора данных литературы, главы «Материалы, объем и методы исследования», 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 246 источников цитируемой литературы, в том числе 98 отечественных и 148 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 33 таблицами и 32 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в крупном промышленном районе Западного Урала - Пермском крае На первом этапе исследования проведена оценка эпидемиологической значимости вакцинопрофилакшки в предупреждении заболеваемости туберкулезом в современных условиях. На втором - изучена кинетика иммунного ответа в условиях искусственного «моделирования» БЦЖ-вакцинального процесса. На третьем этапе, апробированные в эксперименте оригинальные методы, использованы в условиях рандомизированных клинических наблюдений с целью определения состояния адаптивного противотуберкулезного иммунитета у относительно здоровых детей

Материалы, объем и методы исследований Авалю состояния привигосги населения Пермского края против тубер^леза проведен за 1994-2005 гг по д анным годовых статистических отчетных форм №№ 5 и 6 Ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости, болезненности, смертности и летальности при туберкулезе осуществлен за 1984-2005 гг по данным официальной регистрации ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» Изучена многолетняя динамика заболеваемости туберкулезом среда всего населения и в отдельных возрастных группах с определением многолетней эпидемической тенденции и циклических колебаний (Шляхтенко и др., 1984) Исследованы также многолетняя динамика болезненности, смертности и легальности с определением тенденций развития эпидемического процесса. Выраженность тенденций оценивали по критериям, предложенным ВД Беляковым и др (1981)

Количественная оценка влияния объемов профилактических прививок на заболеваемость туберкулезом проведена с использованием /-критерия Стьюденга, корреляционного анализа и построения регрессионной модели

Для изучения механизмов развития БЦЖ-вакцинального процесса проведен эксперимент на 10 неполовозрелых кроликах породы «Шиншилла» массой до 1 кг, полученных из отделения подопытных животных НПО «Биомед» г Перми После определения показателей физиологической реактивности в исходном фоне, 6 {роликов были иммунизированы внугрикожно вакциной БЦЖ в дозе 0,05 мг Четырем кроликам (контрольная групги) иньепировали физиологический раствор натрия хлорида в той же дозировке. В последующем у всех животных одновременно анализировали местную реакцию кожи, а также забирали венозную кровь для исследования различных сывороточных и клеточных показателей иммунной реактивности организма в сроки-1,3,5,7,10,14,17,21,28,39,53,70 и 85 сутки после введения растворов Всего проведено 1390 исследований. Полученные результаты сравнивали с показателями исход ного фона до иммунизации животных, а значения опытной группы сопоставляли с данными контрольной группы кроликов в динамике наблюдений, осуществленных в соответствии с международным соглашением об экспериментах на животных. Полученные данные послужили основой для интерпретац ии адаптивных процессов, происходящих в организме вакцинированных детей

В клиническое обследование было включено 70 практически здоровых детей (Т-П группы здоровья), вакцинированных БЦЖ. Прививочная доза содержала 0,05 мг микобакгерий штамма БЦЖ-1 в 0,1 мл растворителя. Критерием отбора детей для исследований служили отсутствие инфицирования МБТ, контакта с бальными туберкулезом и д изентерией Зонне Все они проживали в г Перми, наблюд ались в поликлиниках ДКБ №№ 13 и 15 Обязательным условием явилось также наличие информированного добровольного согласия родителей (статья № 32 «Основ законодательства РФ об охране здоровья граждан»), отсутствие на момент забора крови для исследований острых заболеваний на протяжении 2 месяцев С учетом срока, прошедшего с момента БЦЖ-вакцинации, дети были рандомизированы по возрасту Выделено 3 группы. В первую вошли дети от 1 года до двух лег (16 человек), во вторую - 15 детей от 2-х до 3 лет; в третью группу включены дели 34 лег (29 человек) Десять здоровых детей 6,5-7 лег, находившиеся перед календарной ревакцинацией с туберкулинонегагивной реакцией (Приказ МЗ РФ № 229 от 27062001), составили 4 группу (группа сравнения) В клинике у всех детей анализировали состояние и величину рубчика после прививки БЦЖ и чувствительность к туберкулину по пробе Мантус2ТЕППД-Л.

Материалом для исследования служила кровь. В динамике развития адаптивных реакций у иммунизированных кроликов стандартной методикой определяли лейкоцитарную формулу Для изучения состояния естественной прошвомикробной зашщы организма в эксперименте и клинике определяли фагоцитарную активность лейкоцитов (ФАЛ) ФАЛ оценивали прямым визуальным модифицированным методом (Каплин и др, 1992), используя в качестве объектов фагоцитоза формалинизированные эритроциты барана в концентрации 50-60 млн/мл (ФЭБ, НПО «Биомед» г Пермь) Суммарный фагоцитоз выражали в виде процента фагоцитоза (ПФ), фагоцитарного числа (ФЧ) и индекса акгивности фагопиюв (ИАФ) В клинике вычисляли также индекс активности фагоцитов стандартизованный (ИАФсг), который не зависит от генетически детерминированной

функциональной активности фагоцитов Контрольная его величина, рассчитанная по стандартам, составляла 0,70-1,40 (Каплин и др, 1992) При значениях ниже 0,70, констатировали недостаточность фагоцитарной защипы организма, а выше 1,40 - стимуляцию фагоцитоза. Наряду с этим в работе использовали оригинальный метод выявления специфических изменений ФАЛ крови (Каплин, Санакоева, 1995) с применением специфического и контрольного объектов фагоцитоза (ОФ) В качестве первого служили ФЭБ, сенсибилизированные фосфатидным аншгеном микобакгерий туберкулеза (ФЭБ туб), в качестве другого - зршроцигы, нагруженные липополисахаридным (ЛПС) антигеном из шигелл Зонне (ФЭБ Зонне), полученные из РАО «Биопрепарат» (г С -Петербург) Контрольные ОФ предварительно окрашивали черным анилиновым красителем с целью дифференциальной их диагностики в мазках крови, обработанных по Романовскому-Гимзе При этом одновременно учишвали поглотительную способность лейкоцитов по отношению к обоим типам ФЭБ и определяли ФЧ. Количественную оценку ФАЛ осуществляли по изменению соотношения уровней фагоцитоза специфического и контрольного (неспецифического) объектов и выражали в процентах относительно соответствующих средних величин контрольной группы. Эту же методику применяли и в клинических исследованиях. Такой подход к оценке ФАЛ позволил использовалъ унифицированный показатель - индекс специфического фагоцитоза (ИСФ) При этом были установлены его контрольные границы, составившие у кроликов 0,2-2,0, а у детей - 0,6-1,5 (Каплин, Санакоева, 1995) Выход за указанные пределы свидетельствовал о наличии специфических изменений (угнетении или стимуляции) ФАЛ крови.

Помимо фагоцитоза изучали функциональную активность ангагенсвязывающих лимфоцитов (АСЦ) крови, используя методику проф ВН. Кашина и ЛГ Казанцевой (1999) Принцип метода заключается в определении способности высокоактивных лимфоцитов (ВАЛ) к одновременной адгезии 3-х и более специфических и контрольных объектов При этом проводили вычисление унифицированного количественного критерия - индекса специфической лимфоцитарной адгезии (ИСЛА) Пределы его колебания при экспериментальных исследованиях составили 0,50-1,50 Выход за указанные границы отражал либо усиление реакций адгезии специфического характера (в случае > 1,50), либо их угнетение (в случае < 0,50) Оценка адгезивной способности лимфоцитов по ИСЛА позволила повысить достоверность результатов и выявить характер индивидуальных клеточных реакций у детей, а также лабораторных животных в динамике наблюдений По уровню адгезии гетерогенных ФЭБ в клинике, лимфоцнгьт, в соответствии с работами ВН. Кашина и ЛГ Казанцевой (1999), были разделены на 2 типа В первый вошли высокоактивные лимфоциты (ВАЛ) с 3 и более объектами адгезии (либо специфических, либо неспецифических ФЭБ) Второй тип составили малоактивные лимфоцшы (МАЛ), адгезирующие на своей поверхности по 1 объекту Их отношение также выражали в форме ИСЛА, контрольные величины, которого имели границы 0,40-1,80 В случае выявления диагностического значения ИСЛА носил альтернативный характер В дальнейшем нами выделено два класса ВАЛ Высокоактивные лимфоциты I класса - с плотным прилежанием 3-х и более специфических шш неспецифических объектов адгезии, условно названные, как «истинные» или «иммунные», и косвенно свидетельствующие о «высокой плотности» паперн-распознаюшцх рецепторов (ЛВППРР I кп - ВАЛ I кл.) Высокоактивные лимфоциты П класса - с преимущественно разрозненным расположением 3-х и более объектов

адгезии, условно названные как едиффузные», косвенно свидетельствующие о «низкой плотности» пахгерн-распознаюцщх рецептаров (ЛНППРР П кл - ВАЛ П кл.) Подобное разделение лимфоцитов предложено нами в связи с тем, что характер распределения адгезированных ФЭБ различной специфичности на поверхности высокоактивных лимфоцитов у вакцинированных кроликов и детей оказался различным в сравнении с животными и детьми групп сравнения. Это позволило ввести шщекс специфического расположения объектов -ИСЮ Формула расчета.

YA ЛВППРРсп I кл. / ЛНППРР от П кл.

ИСРО --

£А ЛВППРР несп I кл / £ А ЛНППРР несп II кл

где в числителе - отношение сумм адгезированных объектов на поверхности специфических высокоакгавных лимфоцитов I и П классов с высокой и низкой плотностью патгерн-распознающих рецепторов, в знаменателе - то же, но относительно к процессу «неотепифической» адгезии Были рассчитаны контрольные значения ИСРО у ингакгных кроликов - 0,08-0,6, а у детей группы сравнения от 0,25 до 2,00 Выход показателей ИСТО за верхнюю установленную границу в эксперименте и в клинике при одновременно выооком значении ИСА, свидетельствовали о наличии напряженного адапгавного поствакцинального иммунитета (патент № 2302634 «Способ иммунодиагностики туберкулезной инфекции» Бюлл «Изобретения. Полезные модели» № 19, 2007)

Процесс специфического анппелообразования исследовали в реакции непрямой гемаплютинации (РИГА) Для повышения диагностической значимости РИГА использовали оригинальный способ трактовки результатов по соотношению тигров противотуберкулезных и противошигеллезных антител (Каплин, 1996) При оценке результатов РИГА применяли унифицированный показатель - индекс специфического сдвига титров аншгел (ИССТ) Повышение значений ИССТ относительно установленной верхней контрольной границы в эксперименте (0,5-3,0) и в клинике (0,25-4,0, Касимова, Каплин, 1998) свидетельствовали о стимуляции гуморального иммунного ответа с доминирующей выработкой противотуберкулезных антител (ГГГАТ), по сравнению с противошигешгезными антителами (ПШАТ) Абсолютные значения тигров представлены в виде logI0_ Для дифференцированного учета ПТАТ классов М и G использовали 2 МЭ (Квтш, 1991) Параду с этим в сыворотках крови кроликов определяли третирующие иммунные комплексы (ЦИК, усл. ед) по методике, основанной на осаждении ЦИКполиэтиленгликшем (Кетлинский, Калинина, 1998) Одновременно исследовали активность комплемента (Cffio) путем титрования по 50% иммунному гемолизу (Кетлинский, Калинина, 1998), а также содержание С-реактивнош белка (СРВ) с использованием латекеного теста (Deyo et ей, 1980, Warworth, Wadswoth, 1984)

Полученные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики (Боровиков, 2003, Зайцев и др, 2003, Петри, Сэбин, 2003, Пегрухина, Старостина, 2003) Для переменных, представляющих анализируемую выборку, вычисляли арифметическое среднее (М), стандартное отклонение (о) и стандартную ошибку среднего (т). В работе использовали электронные таблицы Microsoft Excel для Windows, пакет статистических программ «Diasta» (МГУ, Россия) и программы «Биосгат» для Windows (Microsoft), версия 403 (Stanton, Glantz, 1998) В

результате статистической проверки на соответствие закону нормального распределения выявлено, что большинство исходных данных соответствует нормальному распределению Для определения достоверности различий между группами использовали параметрический непарный (для независимых выборок), парный (для зависимых выборок) ¿-критерий Стьюдента и критерий х2 для сравнения частоты встречаемости признаков При малом количестве наблюдений, а также, если распределение не соответствовало нормальному, достоверность различий вычисляли по непараметрическому U-критерию Манна-Уигни. Наличие связи между явлениями определяли с помощью коэффициента линейной корреляции и регреосии Различия считали достоверными при р<0,05

Результаты исследований и их обсуждение

Вакцинация, как известно, является одним из основных мероприятий по повышению уровня невосприимчивости населения к инфекционным заболеваниям (Медуницын, 2003) На модели эпидемического процесса туберкулезной инфекции в Пермском крае работами И.В Фельдблюм и М.Ю Девяткова (1994) было доказано, что упреждающее влияние БЦЖ-вакцииации на заболеваемость достигается при объемах профилактических прививок 33-35 на 1000 совокупного населения в год Для этих целей с 1994г на территории края была введена региональная тактика иммунизации против туберкулеза, согласно которой ревакцинацию получали семилетние дети не только с отрицательной, но и сомнительной реакцией Машу (Приказ ОУЗ № 146/257 от 23 081994 г) В итоге объемы профилактических прививок существенно возросли Однако в 2000 г данная такшка иммунизации была отменена В соответствии с постулатами эгщдемиологического метода исследования, это означает, что с 2001 г Пермский край оказался в условиях естественного эпидемиологического эксперимента.

Рассматривая в данном контексте полученные результат, нами установлено, что переход на национальную тактику иммунизации обусловил резкое сокращение объемов профилактических прививок. Цри этом следует заметить, что охват БЦЖ-вакцинацией новорожденных в родильных домах Пермского края, по-прежнему, остается на достаточно высоком уровне Так, к 2005 г, по сравнению с 1994 г, охват прививками увеличился на 2,3% и достиг 98,99%, при среднемноголешем показателе периода 1994-2005 тг - 98,19t0,30%. Вместе с тем, ежегодно значительное количество детей выписывается из роддомов без иммунизации, подвергаясь риску инфицирования и заболевания туберкулезом. Среднемногопетнее число детей, ежегодно выписывающихся из учреждений родовспоможения без вакцинации, составило - 467,92±75,03 Однако при общей благоприятной тенденции увеличения охвата прививками новорожденных, число детей, получающих ревакцинацию против туберкулеза, за анализируемый период сократилось в 8,6 раза, с 50 985 человек-в 1994г до5954-в2005г Это обусловлено, как резким уменьшениям доли детей с туберкулинонегативной реакцией (с 57,2% - в 1994 до 17,9% - в 2005 гг),таки отменой Приказа ОУЗ № 146/257 от 1994 г, предусматривающего введение бустер-доз БЦЖ-вакицны детям 7 лег с сомнительными результатами пробы Машу

Сравнительная оценка охвата населения Пермского края ревакцинирующими прививками в период осуществления региональной тактики специфической профилактики туберкулеза и после ее отмены выявила существенные сокращения объемов профилактических прививок (табл. 1) Так,

Таблица!

Объемы профилактических прививок БЦЖ-вакщшой среда совокупного населения Пермского края в период действия региональной тактики ревакцинации (1994-1999 гг.) и после ее отмены (2000-2005 гг.) в показателях на 1000

Период набгасдений

Год

1994

1995

1996

1997

1998

1999

М±т

2000 2001 2002

2003

2004

2005

МВт

Объемы профитакпнеских прививок

Овдидяейдо 15 лет

123,01 128,49 123,46 111,51 112,49 111,08

11834*3/»

108,81 103,49 70^4 77,42 8321 59,77

83^4^7,74*

Средгнаоежния

27,82 30,04 28,85 25,77 23,41 22,12

2633±Щ

20,40 19,01 12^1 13,Ю 13,42 9,65

14ДЩ,70*

Примечание достоверность разшмийф<0,01)меящуобьемами15ишш(жвразпичш.1епдиюдь1 в 1994-19991Г (период работы медиц инских учреждений общей лечебной сети по региональной такппсе введения бустер-доз вакцины БЦЖ и регааменгированной 2-1фатной ревакцинации детей в7и 14 лег), ежегодный охват прививками детей до 15 лет в показателях па 1000 данного возраста колебался от 111,08 - в 1999 г до 128,49-в 1995 г, при феднемногшетнем показателе в эти годы, равном 118,34±3,08 В 2000-2005 гг (период отмены региональной тактики иммунизации и переход на однократную ревакцинацию) объемы ежегодных прививок БЦЖ-вакциной сократились до 83,94±7,74, составив по итогам 2005 г лишь 59,77 на 1000 детей до 15 лет При этом почш в 3 раза (по сравнению с 1994 г) уменьшилось число профилактических прививок среди совокупного населения, едва достигнув к 2005 году 9,65, при требуемом нормативном показателе 35 на 1000 населения (табл. 1)

На фоне резкого сокращения числа профилактических прививок эпидемическая ситуация по туберкулезу в Пермском крае может бьпь охарактеризована как неблагополучная Выраженная тенденция заболеваемости к росту со среднегодовым темпом прироста - 8,9% наблюдалась на территории края с 1993 г (рис. 1) Ежегодно регистрировалось свыше 2000 манифестных форм туберкулеза. За деа последних года показатель заболеваемости увеличился, по сравнению с 1992 г, более чем в 2 раза и составил 80,85-в 2004 г и 79,24 - в 2005 г на 100 000 населения, превысив показатель по России, в целом, на 12,8 и 12,2 %%, соответственно

Углубленный анализ многолетней динамики заболеваемости за более длительный период (1958-2005 гг), поволил установил., что естествонный цикл активности эпидемического процесса при туберкулезе длится 38 лет (рис 2) и состоит из «отрипательной» фазы, протяженностью 19 лет

100 1— 90 --

1934 19Й6 19ВВ 1990 1992 1394 1996 1998 2000 2003 2004

Рис. 1. Многолетняя динамика заболеваемости туберкулезом населения Пермского края за период 1984-2ШВ п .

Примечи тс. Сгагй 1ы гажазяель заболеваемости щ 100 СШнаселения; ----вырав] швание диначическиорчдатю функщш пфаболы 2 порядю.

(1963-1981 гг.), и «псшсшлельной», также - 19 лет (1982-2000 1Г.}. Согласно выявленной закономерности, с 2001 г. эпидемический процесс находится в фазе пониженной активности. Тем не менее, заболеваемость продолжает ¡шя. Это свидетельствует о действии на терршцрии Пермского края факторов риска, способствующих дестабилизации эпидемической обстановки. Дифференцированный анализ заболевашости среди взрослых и детей выявил неоднозначность тенденций в жпенсивносш развитая эпидемического процесса. В возрастной структуре заболевших цреобладашэ вэросйая часть населения, тогда как многолетняя динамика заболеваемости детей оценивалась кик ошосительно стабильная. Среднегодовой теми прироста заболеваемости взрослых за период 1993-2005 гг. составил 13,2%, против 1,7% - у детей до 15 лет

Пермского края в 1958-2005 гг.

(в 7,8 раза меньше), Вместе с там, высокая заболеваемость взрослых, отражая эпидемический процесс прошлых лет, по мнению Л,И. ЩляхтенкО (1998), приводит к накоплению среда населения все бо льшего количества источников возбудителя инфекции с высоким лойма-1 юю шшом, что в современных условиях значительно увеличивает риск инфицирования детей и возникновения новых случаев заболевания. Наибольший уровень заболеваемости пабшсдапся в возрастных группах 1-2 гада и 4-5 пег, где средгеэдастожхте показатели за 19962005 гг. составили 12,92±2,09 и 14,50*2,43, превысив таковой среда общего числа детей до 15 лет (9,08) в 1,4 и 1,6 раза, соответствии ю (рис. 3).

0-1 гад 1 -2 года 2-3 года 3-4 года 4-3 пет 5-блет 6-7 лет 7-14лет всего

Рис. 3 Заболеваемость туберкулезоив отдельных возрастных группах дегей за 1996-2005 гг. но Пермскому краю (в показателях на 1 ООО)

С целью характеристики истинной распространенности туберкулеза, нами проанализирована многолетняя динамика болезненности. Болезненность, традиционно превышая заболеваемость, с 2000 г. постепенно снижалась со среднегодовым темпом убыли 4,8% (рис. 4). Причиной выявленной тенденции, как показали результаты дальнейших наблюдений, явилось увеличение

Рис.4. Многолетняя дттампабапезнешкнтитубфкулезом населения Пермского краяза1984-2005 гг.

Примечание Стлбщл—давазажяь югкзаявдеш ш ЮООООпасслсгшя; ЕЫраинивание динмиявскоги ¡яда гк> н|гуп илии параболы 2

смертности, показатель которой к 2005 г. вырос в 2 раза, по сравнению с предыдущим [0-лепшм и достиг максимального значения завесь период наблюдений -24,47 на 100 ООО населения (рис. 5),

зо

25 20 15 ■ 10 5 0 ■

-Г # У > # ^ # ф £ # # #ч $ $ #

Рис. 5. Многолетняя динамика смертности от туберкулеза населения Пермского края за 1984-2005 гг.

Примечание. Скмбцы - покгоятегаымфтосш на 100000 населения; ----выравнивание динамического рядаш функции параболы 2 порота.

(Существенные изменения за последние годы претерпели и показатели летальности при туберкулезе. С 2001 г. отмечалась со выраженная тенденция к рояу да среднегодовым темпом прироста 6,6%. В 2005 г. летальность, также кис и смертность, достигла максимального своего значения за весь период наблюдений 30,9%.

Как показал проведенный корреняционнорсгрессионный алалт,одаим ш факторов риска осложнения эпилемической ситуации по туберкулезу в Пермском кртс явился недосшоч) или охват населения профилактическими прививками (рис. 6). Коэффициент корреляции между

30

во

70 60 50 40 30 20 10 о

[мп [395 1от6 1997 1498 1999 2000 21101 21102 2003 30114 мп 5

Рис. 6. Шпшкие объемов проф!шакп1ческих прививок на заболеваемость

туберкулезом

Примечание. Столбцы -шказэтель заболеваемости ш ТОО 000 кислен™: кривая-ЧИЗЮ П(*-фт8(гш1Я5йзН прин (бок [ш 1000 нассги о ¡я.

заболеваемостью и объемом профилактических прививок составил -0,73 (обратная высокая корреляционная связь), коэффициент регрессии -0,76 Эпидемический процесс туберкулеза в современных условиях, как показали наши исследования, на 533% детерминируется вакцинопрофилактикой.

Сравнительный анализ и оценка основных эпидемиологических показателей, с учетом функционирования системы 1фаевого здравоохранения по региональной (1994-1999 гг) и национальной (2000-2005 гг) тактике вакцинопрофилактики, подтвердили влияние объемов профилактических прививок на эпидемическую ситуацию по туберкулезу Установлено, что в период 1994-1999 гг среднемноголегаие показатели заболеваемости, смертности и летальности были достоверно ниже, чем в 2000-2005 гг (табл. 2)

Таблица2

Заболеваемость и смертность (в показателях на 100 000 населения), легальность (в %) при туберкулезе в Пермском крае за 1994-1999 гг. и 2000-2005 гг.

Период наблюдений Год Население Заболеваемость Смертность Летальность

а 1994 3091500 5530 10,85 19,62

к Ь « а ^ 1995 3024100 65,40 11,14 17,03

Й § я « ь ^ о а и 1996 3009400 69Д) 10,43 15,07

5 ^ У § я а £?®ч 1997 3009400 70,00 11£8 17,11

Й к 8-П! § 8 | 1998 2990804 72,04 10,43 14,48

1999 2972136 7290 1456 19,97

Ко'-' 4—- О Сц №ш 301622333ь 1674123 67,47^2,70 11,56*0,64 17Д1±1,13

ев 2000 2968595 81,80 15,24 18,63

2001 2954735 76,М 14,83 19Д)

1 § 1 а ь н о £ 2 £ 2002 2917999 76,60 17,7 23,11

§ " У и в: в к 2 2003 2769799 74,05 18,77 2535

2004 2736031 80,85 19,12 23,64

2005 2656600 79Д4 24,47 30,88

|оЕ ~ ж М±т 2833959ДУ= 5319839 78,091:123* 1835Н,42* 23,52Ы,80*

Примечание. * - досговфностъ различий (р < 0,05) между эпидемиотогическими показателями в периоды действия региональной тактики шедафической профилактики туберкулеза и ее отмены.

Следовательно, недостаточный охват профилактическими прививками детского населения может рассмаприваться в качестве одного из факторов риска, детерминирующим уровень заболеваемости в Пермском крае и способствующим осложнению эпидемической ситуации по туберкулезу Осуществляемые на территории края объемы профилактических прививок не оказывают в современных условиях контролирующего влияния на развитие эпидемического процесса и требуют не только количественной коррекции, но и качественной оценки вакцинального статуса привитых лиц. Между тем, несмотря на многолетнюю историю развили иммунобиологических основ БЦЖ-вакцинащи и значительные успехи в области создания

искусственной ашиинфекционной зашщы, вопросы иммунологической перестройки организма, наступающей в результате введения БЦЖ, особенно у детей, изучены недостаточно В условиях неблагополучной эпидемической ситуации по туберкулезу возникла обоснованная необход имость использовал, дополнительные методы исследования, которые позволили бы на организменном и популяционном уровнях, не только регистрировал, развитие иммунного ответа, но и проводил, комплексный анализ показателей специфической реакгавности на основе нормативных унифицированных критериев

С этой целью предварительно был проведен эксперимент на неполовозрелых кроликах. Клинически вакцинальный процесс у животных оценивали по эволюции развитая прививочного аффекта в зоне введения БЦЖ. Кожная реакция не только моделирует процессы, направленные на локализацию и инактавапию вакцинного штамма микобактерий туберкулеза (МИ), но и косвенно отражает иммуноморфолошческие преобразования в органах иммуногенеза (Митинская, 1975) Местная реакщга у неполовозрелых кроликов при БЦЖ-вакцинации в тканях кожи протекала в три фазы инфильтративно-экссудативную (1-28 супя), продуктивную (39-53 суши) и фиброза (70-85 сутки) Цикл специфических изменений составил, в среднем, 10 недель. Подобная закономерность процессов имеется и у новорожденных детей, иммунизированных БП Ж-вакциной (Янченко, Греймер, 1999) Параллельно стадиям и течению воспалительной реакции кожи происходили соответствующие изменения количественного состава клеток крови и их функциональной активности.

При анализе лейкоцитарной формулы установлено, что на этапе формирования посгвакщшальной гиперемии и папулы (вплоть до 10 сут) развивался относительный и абсолютный нейтрофильный лейкоцитоз с одновременной лимфо-моноцитопенией. К юнцу 1-й и началу 2-й фазы воспаления происходило однонаправленное увеличение числа нешрофилов и лимфоцитов (4,68±1,16 х 109/л нешрофилов, 11,75±0,72х 109/л лимфоцитов -на 39 супя, против 2ДШ)Д1х109/л и 8,97±0,82х 109/л - в исход ном фоне, соответственно (р<0,05), сменяющегося в фазе фиброза лимфоцнгозом (13,15±lß6*10% - на 85 сугки) Оба этих показателя -последовательная воспалительная реакция тканей кожи и изменение клеточного состава клеток крови косвенно свидетельствовали о состоявшемся прививочном эффекте

Изучение изменения содержания в крови нешецифических факторов защиты (СРБ и комплемента) выявило раннюю (на 1 сут) и значительную (с 7 дня) активизацию выработки СРБ, а затем на 3 сутки и комплемента. В эти сроки и, вплоть до 53 дня, содержание СРБ воерастало, а тшсшизирующая активность сыворотки постоянно оставалась ниже фоновых показателей (очевидно, в силу реакции потребления комплемента) Максимума содержание СРБ достигало на 21 день (112,0ftt 16,77, прошв 24,00±5,37 - в исходном фоне), притом что концентрация комплемента снижалась до минимума - на 10-е (1,15±0,73, против 5,6&Ю,28 - в исходном фоне; р<0,001) и на 21 сугки СН50 все еще оставался в 1,5 раза меньше, чем до вакцинации. Установленная база корреляционных зависимостей между выраженностью локальных воспалительных реакций, уровнем СРБ и активностью СН50 предполагает участие этих неспецифических факторов зашщы в формировании иммунной гранулемы Как комплемент, так и СРБ, наиболее активно действуют в течение первого месяца вакцинального процесса, а затем содержание СРБ значительно снижается после формирования гранулемы (конец 2 фазы) на фоне увеличения показателей СН50 С

образованием гранулемы микобакгфии уходаг из-под лигаческого удара указанных факторов естественной резистентности, но одновременно с этим создаются условия для становления и дательного сохранения клегочно-опосредованного иммунитета, поддерживающего напряженность специфической противотуберкулезной защиш организма (Зейфарт, 1977, Серов, Пауков, 1995, Маянский, 2000, MiyezawaKciji, Inoue Kazo, 1990, Fenian, Vermeulen, 1996)

При оценке клеточных фагоцитарных реакций крови выявлено увеличение ПФ и ФЧ уже на 1 супси. С 5-го и по 53-й дни исследований (первые две фазы воспаления) доминируют, пивным образом, высокоактивные формы фагоцитов Это нашло отражение в достоверно высоких показателях ИАФ, относительно данных исходного фона и контрольной группы животных При этом величина индекса коррелировала с активностью 1 фазы воспалительного процесса в коже (г= 0,93, р<0,001) По мере стихания воспаления в зоне введения БЦЖ фагоцитарная активность лейкоцитов прогрессивно снижалась Это, с одной стороны, указывает на тесную взаимосвязь оцениваемых сопряженных процессов, с другой - позволяет использовать ИАФ в качестве интегрального показателя состояния естественной противомикробной резисгенгаости организма приБЦЖ- вакцинации (Кагшин и др, 1992)

Характерными являлись также специфические изменения ФАЛ, оцениваемые по унифицированному показателю ИСФ Первое достоверное повышение иццекса специфического фагоцитоза наблюдали на 7 день, а прогрессивное его нарастание происходило с 10-х по 21-е супси (табл 3), увеличиваясь 10-кратно по отношению к невакцинированным животным (10,70±5,60, против 1,16±0,02 - контроле) Затем, хотя и имелось неуклонное снижение индекса, тем не менее, даже на 85 супси, он еще в 4 раза достоверно был выше, чем у контрольных животных (3,94±0,65 и 1ДО±ОД9-соответственно)

Сравнивая оба вида фагоцитарных реакций, следует заметить, что в первом случае ФАЛ, хотя и возрастала в начальные сроки, но оставалась на более низком уровне, вплоть до 28 суток, уступая в 5-6 раз активности специфически активированного фагоцитоза, и заканчивалась в начале фазы фиброза. Более выраженная специфически активированная ФАЛ, очевидно, связана с тем, что, несмотря на завершение воспалительных реакций в коже, в органах, богатых лимфоцдной тканью, еще продолжается транулемагозный процесс, являющийся источником появления в кровотоке атигенов С згой позиции можно пснягь длительно сохраняющиеся процессы шецифической активации фагоцитоза. Полученные результаты согласуются с данными литературы, указывающими на более раннюю реакцию неспецифического фагоцитоза, происход ящего в период логарифмического размножения вакцинных штаммов МБТ, сменяющегося затем спец ифически активированным фагоцитозом при непосредственном воздействии лимфокинов эффекгорных лимфоцитов В итоге начинается быстрая инактивация микобактериальных антигенов При этом, сенсибилизирующиеся в гранулемагозных очагах лимфоищы, рециркулируют через кровь и лимфу, обеспечивая там самым развитие адаптивного противотуберкулезного иммунитета (Мс Donoudhetal, 1993, Aderem, Underbill, 1999)

Функциональную активность лимфоцитов изучали с использованием двух эритроцитарных диагаостшумов (туб иЗоше)ивьтчислениеминдексов-ИСЛАиИСЮ Первое диагностически

Таблица3

Показатели специфической реактивности у БЦЖ-вакцинированных кроликов в различные сроки наблюдений

Срок наблюдений и показатели (М±т)

Обозначения Исх фон 1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 10 сут 14 сут 21 сут 28 сут 39 сут 53 сут 70 сут 85 сут

ИСФ (0,20-2,00) 1,10± 0,09 1,10± 0,09 0,72± 0,15 1,09± 0,18 2,23± 0,46 ** 5,80± 1,40 */** 3,40± 1,30 * 10,70± 5,60 * 2,26± 1,30 ** 7,65± 3,90 * 8,34± 3,37 * 4,70± 1,10 */** 3,94± 0,65 */**

£ адгезия ЭД аг/ туб (абс кол-во) 11,20* 0,56 13,83± 1,57 20,00± 1,61 */** 45,83± 6,22 */** 59,50± 6,82 * 63,50± 5,56 * 71,50± 3,06 * 69,17± 4,55 * 71,83± 1,74 * 64,60± 6,62 * 49,80± 6,17 * 40,05± 5,51 * 30,20± 4,85 *

X адгезия ЭД аг/ Зонне (абс кол-во) 74,90± 1,78 72,83± 1,77 83,50± 2,35 */** 59,67± 5,13 */** 51,33± 4,34 * 48,50± 2,76 * 39,00± 3,48 * 41,83± 3,30 * 41,33± 1,93 * 49,20± 3,31 * 70,40± 4,24 ** 77,68± 4,56 85,00± 4,86

ИСЛА (0,50-1,50) 0,99± 0,05 1,10± 0,15 1,51± 0,15 * 5,94± 1,11 */** 8,09± 2,08 * 9,17± 1,82 * 11,40± 1,44 * 11,35± 1,68 * 12,59± 0,87 * 9,13± 1,50 * 4,60± 0,84 */** 3,51± 0,69 * 2,40± 0,55

Хадгезиява ЛВППРРсп1кп. <%) - - 0,50± 0,50 9,67± 2,98 */** 18,67± 2,50 */** 23,17± 1,94 * 22,33± 2,42 * 30,00± 4,86 * 26,67± 1,28 * 26,00± 5,52 * 9,60± 1,54 */** 2,60± 0,68 */** 1,40± 0,87 *

ИСРО (0,08-0,60) 0,35± 0,03 0,32± 0,05 0,21± 0,08 1,10± 0,32 */** 2,15± 0,43 * 2,40± 0,54 * 5,19± 1,70 * 5,61± 1,51 * 6,70± 2,96 * 7,13± 2,57 * 0,49± 0,09 ** 0,63± 0,13 * 0,64± 0,21

исст (0,50-3,00) 0,58± 0,08 2,42± 0,71 2,67± 0,61 16,00± 9,84 */** 16,00± 5,37 * 40,00± 10,73 */*# 8,67± 1,61 */** 7,33± 0,67 * 6,67± 0,84 * 5,20± 1,20 * 2,60± 0,60 1,50± 0,32 1,80± 0,58

ЦИК (уел ед ) 1,67± 0,56 3,33± 1,15 3,50± 0,95 7,83± 0,65 */** 11,83± 1,11 */** 14,17± 1,58 * 12,33± 1,69 * 9,50± 0,56 * 8,33± 0,92 * 9,00± 1,38 * 6,40± 1,03 * 5,20± 0,66 * 2,40± 0,68 **

Примечание При обозначении индексов в скобках указаны диапазоны колебаний их нормативных показателей, * — достоверные различия с исходным фоном, ** — достоверные различия с предыдущим сроком (р<0,05)

значимое увеличение ИСЛА отмечали с 3 суг (табл. 3) В дальнейшем (1 и 2 фазы воспаления) процесс специфической адгезии эритроцитов (ФЭБ туб) нарастал и достигал максимума на 28 суши (71,83±1,74), что нашло свое отражение в увеличении значений ИСЛА. В этот период начиная с 5 дая, в крови доминировали ЛВППРР сп. I класса, сопровождаясь высокими показателями ИСЮ (на 39 суг в 20 раз больше исходной величины) Динамика же суммарной адгезии эритроцитов с ЛПС Зонне постоянно снижалась (4133±1,93 -на 28 деть, против 74,9Qtl,78 - в исходном фоне и 82,75± 1,09 - в контроле) Подобную тенденцию в реакциях отмечали вплоть до 53 дня. И даже на стадии рубцевания (70 сутки), показатели ИСЛА и ИСЮ еще были выше установленных нормативных значений.

Следовательно, стимулирующий эффект адгезии лимфоцитов в наибольшей степени проявляется в период формирования гранулемы, снижаясь по мере инакшвации микроорганизмов и аншгенов БЦЖ. Именно в это время макрофага становятся наиболее активированными в отношении вакцинных штаммов микробактерий туберкулеза (Хоменко, 1996, Ниш, Ernst, 2000) Увеличение со временем общего пула специфически реагирующих лимфоцитов с нарастанием ЛВППРР туб I класса свидетельствует как об активации функциональной способности этих эффекторных клеток, так и, опосредованно, об усиленном развитии иммунных реакций, индуцированных введением БЦЖ. Подтверждением тому служили установленные корреляционные зависимости между средними значениями ИСЮ и величиной суммарной адгезии специфических объектов на мемфанах ЛВППРР туб I класса (г = 0,89, р<0,001), а также между динамикой средних значений ИСЮ и показателями ИСЛА (г = 0,86, р<0,001) Все это свидетельствовало о становлении адэшивнош противотуберкулезного иммунитета, а наличие ЛВППРР туб I класса и диагностических результатов ИСЛА и ИСЮ считали характерным признаком вакцинального процесса

Немаловажное значение для оценки эффективности иммунизирующего влияния БЦЖ на организм имеет исследование анпиепообразования, анализ которого проводили с учетом индекса специфическою сдвига титра антител. В соответствии с показателями ИССТ, признаки развили гуморального иммунного ответа отмечали с 5 суг после иммунизации Максимальных значений ивдекс достигал на 10 суг, увеличиваясь в 13 раз, по сравнению с верхней границей установленной нормы, равной 3,0 (табл. 3), и в 20 раз - относительно контроля. На 17 сутки происходило второе, но менее выраженное повышение ИССГ (не отражено в табл.) Затем до 53 дня отметали постепенное уменьшение содержания противотуберкулезных аншюл, происходившее на фоне повышения тигров противошигешкзных антител с параллельным снижением величины ИССГ Изучение классов иммуноглобулинов в РНГА с использованием 2 МЭ показывает, что титр ПШАТ во все сроки был обусловлен наличием IgM. Специфические же ашигела класса М циркулировали, в основном, до 21 дня, заменяясь затем IgC С этого времени и до конца сроков наблюдений выявляли только антитела класса G, обладающие, как известно, более сильными опсонизирующими свойствами Подтверждением тому являлось наличие прямых достоверных корреляционных зависимостей между динамикой значений ИССТ и ИСФ, а также между индивидуальными показателями тигров ГГГАТ и ФЧ с ФЭБ туб (от г = 0,59 до г = 0,86) в период с 39 по 70 супси развития вакцинального процесса

Связывание ангагенов образующимися антителами закономерно проявляется изменением содержания циркулирующих иммунных комплексов Уже с 5 суток их концешрапия быстро увеличивалась и достигала максимумана 10 день (в 8,5 раз больше исходного фона, табл. 3) В это же время, как указывалось выше, максимально нарастал ИССТ Параллельно усиливалась активность фагоцитоза, о чем свидетельствовало наличие прямых корреляционных связей между концентрацией ЦИК и ИСФ (г = 0,68, р<0,05), а также ИССТ и ЦИК (г = 0,81, р<0,01) С контр 3 недели снижалось содержание ЦИК Одновременно с этим устанавливалась корреляционно-зависимая связь между ЦИК и системой комплемента на фоне повышения уровня Эти классические опсонины при совместном действии, вероятно, способствуют активации фагоцитов в пролиферативную фазу воспаления и прогрессивному исчезновению го крови циркулирующих иммунных комплексов к концу сроков исследования (85 сутки) с параллельным устойчивым развитем клегочно-опосредованного иммунного ответа.

Таким образом, можно констатировать, что при БЦЖ-вакцинащти механизмы естественной резистешности организма имеют такое же большое значение в формировании противотуберкулезной защиты организма, что и реакции адаптивного иммунного ответа. Как считает ШЗ Медуницын (2004), врожденная устойчивость является основой для развитая приобретенного иммунитета.

Апробированные в условиях эксперимента методы исследования показателей специфической реактивности организма, были использованы для оценки состояния поствакцинального иммунитета у детей. Результаты клинических наблюдений показали, что через год после БЦЖ-вакцинапии между величиной кожного рубчика и выраженностью чувствительности к туберкулину еще имеется положительная корреляционная зависимость (г=0,46, р<0,05) Однако в последующем эти взаимоотношения нарушаются. Так, у детей 2 группы (2-3 года) реакция на туберкулин в 26,6% случаев являлась либо отрипэтелыюй, либо сомнительной, а величина рубчика у каждого пятого ребенка (20%) не превышала 2-3 мм (при нсрме 5-8 мм) В 34 года (3 группа) зги показатели достигали уже 51,9% и 24%, соответственно, а у 13,8% детей прививочный рубчик отсутствовал вообще Достоверное со временем увеличение процента туберкулинонегативных с параллельным снижением туберкулинопозипавных реакций и непостоянство проявления кожного знака вызывали во многих случаях большие затруднения в оценке состоянии адаптивного противотуберкулезного иммунитета у детей Подтверждением тому служат и данные литературы, указывающие на то, что протекция от туберкулеза не зависит от поствакцинального туберт^шинового статуса пациентов (СоггвТоск, 1988, Ете, 1989,1994)

По мнению большинства исследователей, главным критерием в оценке состоятельности БЦЖ- вакцинации является уровень формирования в организме клеточно - опосредованного иммунитета (КОИ) (Медуницын, 2004, ОалпепЬещ 1994, Ашгайта & а!, 2007) При этом развтпие КОИ неизменно сопровождается реакциями специфически активированного фагоцитоза, опосредуемыми антигенспецифичными цигокинами (Перельман, 2004, КаирасЬ, Каийшпп, 2001) Оценку фагоцитоза, как и в эксперименте, проводили по ИСФ, характеризующимся большей информативностью Как показали исследования, у детей 1 группы в 93,7% случаев был выявлен эффект специфической стимуляции фагоцитарных реакций. ИСФ достигал 7,13±1,51 (табл.4), что в

Таблица 4

Сравнительная характеристика показателей специфической реактивности у БЦЖ-вакцинированных

детей различных возрастных групп

Группы, ИСФ Общая суммарная адгезия ВАЛ ИСЛА ИСРО Процентное содержание иссг

возраст детей (0,60-1,50) ФЭБтуб ФЭБЗонне (0,40-1,80) (025-2,00) ЛВППРР 1уб1 кя. ЛНППРР туб Л кл. ЛВППРР Зонне I кп ЛНППРР ЗоннеП кп (0254,00)

1 группа (1-2годе) 7,13± 1,51 99,50± 4,22 18,381: 2,07 5,07± 0,51 6,7а 1,15 30,89± 2,55 57,56Ь 3,78 1,59а: 0,41 9,96± 2,05 1,41± 0,22

2 группа (2-3 юде) 3,61± 0,77 * 95,87± 2,75 22,53± 2,25 4,27± 034 9,49* 1,73 34,53± 1,95 50Д1± 2,57 2,19± 0,62 13,07± 2,01 1,03± 0,14

3 группа (34 года) 3,50ь 0,77 * 78,83± 3,73 41,4&ь 4,88 */** 2,97± 0,40 */** 2,03± 0,47 14,13± 2,03 */** 55,35± 3,78 6,56± 1,05 */** 23,961: 3,12 */** 0,98± 0,16

4группа (6,5-7лег) 1,05± 0,05 66,50± 2,91 66,10± 2,62 */**/*** 1,02± 0,07 1,01± 0,11 14,63± 1,59 */** 33,91± 2,02 16,10* 2,23 ну**/*** 35,36± 3,96 */**/*** 1,05± 0,16

Примечание. * - достоверно отличается от показателей детей 1 группы;

** -д0стовер10слшиаигеяс1гп(жазатепейде1ей21руппь1, *** - досговерноошмаегсяотпоказаашейд

При обозначении индексов в скобках указаны диапазоны колебаний их нормативных значений, показатели представлены в виде Шт.

4,7 раза оказалось выше контрольной величины (1,50) Во 2 группе показатель индекса в 3,4 раза превосходил среднее значение 4 группы и в 2,4 был больше 1,50 Однако у 20% детей специфические изменения ФАЛ отсутствовали Через 3-4 года после вакцинации у основной массы детей (62%) значения интегрального показателя ИСФ уже не выходили за пределы установленной нормативной границы (0,60-1,50) При этом проведенный корреляционный анализ зависимости мещ^у величиною кожного знака, пробой Манту и ИСФ, не выявил каких-либо закономерностей. Более того, выраженный специфически активированный фагоцитоз определяли как при положительной, так и отрицательной чувствительности к туберкулину Поскольку единственной фермой реакции фагоцитирующих клеток была стимуляция поглощения ФЭБ туб, при одновременном угнетении фагопщоза ФЭБ Зонне, то ИСФ свидетельствовал не только о процессе специфической активации фагопщоза, опосредуемого шттигенспепифичными цитокинами (РагшпсЫ. & а!, 1991, 8а1§ате, 1991) и опсонинами крови, но и косвенно отражал напряженность развивающегося поствакицнального иммунитета, особенно в первые 2-3 года после введения БЦЖ.

При оценке функциональной активности лимфоцитов у детей 1 группы величина ИСЛА в 100% случаев возрастала за счет повышения адгезии ФЭБ с туберкулезным антигеном при одновременном резком снижении того же процесса с ЛПС Зонне Суммарный средний показатель адгезированных специфических объектов (99,50*4,22) оказался в 5,4 раза выше, чем неспецифических (18,3$Н2,07) ИСТА при этом достигал значений 5,07±0,51, против 1,02±0,07 - в контроле (табл. 4) Среди лимфоцитов доминировали ВАЛ I и I классов (30,9% и 57,6% соответственно) В связи с этим высокие значения имея и ИСТО (6,76Н,15, прошв 1,0Н0Д 1 у детей группы сравнения) Пределы его колебаний у детей 1-2 лет составляли от 2,0 до 21,27 Те же закономерности в лимфоцитарной адгезивной способности отмечали и у детей 2-й группы. Оценивая вакцинальный статус 31 ребенка 1 и 2 возрастных групп, следует отметить, что у 23 детей при тубфкулинопозитивных результатах пробы Манту, одновременно выявляли высокие значения ИСЛА, ИСТО и содержания ЛВППРР сп. I класса. Остальные 8 детей с утраченной или сомнительной чувствительностью к туберкулину имели диагностически значимые величины обоих индексов Следовательно, анализ степени выраженности поствакцинальной аллергии по пробе Манту с 2 ТЕ ГТПД-Л не в полной мере отражает состояния КОИ. Как справедливо считает АГордон (2000), туберкулиновые пробы констатируют лишь состояние аллергии, но не степень резистентности к патогену

В третьей возрастной группе детей имелись свои особенности реагирования лимфопщов В частности, отмечалось достоверное снижение функциональной активности эффекторных клеток, по отношению к специфически сенсибилизированным эрщрощпам, при од новременном достоверном повышении адгезии ФЭБ Зонне (табл. 4) Несмотря на то, что ИСЛА был еще выше, чем в 4 группе, тем не менее, в общей динамике развитая вакцинального процесса значение индекса неуклонно падало и к 3-4 годам становилось в 1,7 раза меньше такового, в сравнении с малышами первых двух лег жизни (р<0,05) Цри этом у 41% детей третьей группы (у 12 из 29) индивидуальные величины ИСЛА соответствовали уже контрольным показателям (0,40-1,80) с диапазоном колебаний от 0,51 до 1,79 При этом резко сократилась не только доля иммунных ВАЛ I класса (в 2-2,4 раза, р<0,001, табл. 4), но достоверно возросло и процентное содержание специфических ВАЛ П класса.

Одновременно с этим увеличилось число ВАЛ Зонне I и П классов (р<0,01) Произошло также и резкое изменение «структуры» различных видов АСЛ, отражением чего явилось значительное снижение показателей ИСТО относительно данных, полученных у первых д вух групп детей (р<0,01 и р<Ю,001, соответственно, табл. 4) Вместе с тем, обращала на себя внимание критическая разница (в 35 раз) между минимальным и максимальным индивидуальными значениями этого индекса, составляющая 0,23-8,10 Кроме того, следует ошепль, что у детей этой группы доминировали ЛНППРР сп П класса - с разрозненным расположением ФЭБ туб Так, количество адгезированных объектов на мембранах ЛНППРР ш П класса оказалось достоверно больше (61,92*3,89, р<0,001), чем среднее число ФЭБ туб в ЛВППРР ш I класса (17,61±5,01) Это неизбежно привело к тому, что у детей 3 группы средняя величина ИСРО уже, фактически, совпадала с его контрольным показателем (от 0,25 до 2,00) Следовательно, характер течения вакцинального процесса к 3^1 годам после введения БЦЖ, не только менял «профиль» эффекторных клеток, но и влиял на их способность к адгезии специфических объектов

При иццивцдуальной оценке специфических лимфощпарных реакций у 29 детей 3 группы выявлялась достаточно «пестрая» картина. В частности, по характеру адгезивной способности клеток и расположению на их мембране объектов адгезии четко выделилось три типа реагирования этих эффекторных клеток. Первый характеризовался одновременным увеличением показателей ИСЛА (>1,80) и ИСЮ (>2,00) Подобный вариант, ранее обозначенный нами как «вакцинальный», был обнаружен лишь у 27,6% детей. При этом показатели обоих индексов достоверно не отличались от таковых у вакцинированных декй 1 и 2 возрастных групп (р>0,05), но значительно превышали результаты ИСЛА и ИСТО, полученные у детей перед календарной ревакцинацией (р<0,001) Кроме того у таких детей, как правило, была выражена реакция Машу, а среди лимфоищов, в среднем, в 30% случаев определяли ЛВППРР сп 1 класса При втором типе показатели ИСЛА (0,40-1,80) и ИСТО (<2,00) соответствовали установленным нормативным д иапазонам колебания. Такой тип реагирования был определен в 41,4% случаев Средние значения индексов, выявленных у этих детей, оказались многократно ниже результатов ИСА и ИСЮ, рассчитанных у малышей первых двух групп (р<0,001), и практически совпадали с таковыми у детей группы сравнения. В этом случае в крови доминировали уже неспецифически активированные лимфоцит, чаще ЛНППРР Зонне II кл, а реакция Машу была либо отрицательной, либо сомнительной. Все это больше свидетельствовало об «угасшем» поствакцинальном иммунитете В этом случае, последующие 3-4 года ожидания регламентированного календарного срока ревакцинации неизбежно делает таких детей особо уязвимыми, создавая реальную угрозу их тубинфицирования в условиях «широкой диссеминации» МБТ среди населения. Поэтому в случае «угасания» иммунных реакций и юрт отсутствии медицинских противопоказаний, по-видимому, целесообразно ставить вопрос о более раннем введении бустер-доз вакцины БЦЖ этим детям.

Наконец, третий тип сопровождался повышением только показателя ИСЛА (>1,80) три нормальном ИСЮ (<2,00). Разнонаправленное изменение этих индексов не «укладывалось» ни в один из представленных ранее типов реакций Подобный вариант реагирования обнаруживался у 31% детей и условно был назван как «неопределенный» При этом ИСЛА был достоверно больше, чем у детей 4 группы (р<0,001) и соответствовал значениям индекса иммушкомпрометпированных детей в первые три года после прививки БЦЖ, тогда как ИСЮ три этом типе оказался в 123 раза

меньше, чем у малышей 1 группы, атакжев 17,2 раза ниже результата ИСТО у детей 2группы и даже в 1,8 раза меньше такового перед повторным введением бустер-доз вакцины БЦЖ. Вместе с тем у них выявлялась полярная чувствительность к туберьдщину (от отрицательной до средней интенсивности), а в крови преобладали ЛН1111РР сп Л класса (80,5%) с диффузным расположением объектов на их мембранах. Очевиден факт, что при сохраненной повышенной адгезивной способности лимфоцитов, вероятно, нарушался другой процесс - текучесть билипвдного слоя клеток, тормозящий агрегацию паперн-распознающих рецепторов Кроме того, у этой части детей ИСФ (6,66¿1,73) был достоверно выше, чем у детей с «угасшими» иммунными реакциями (1,11±0,08), а в анамнезе заболеваний у них чаще всего отмечали аллергические реакции и ОРЗ (до 3-4 раз в год) На наш взгляд, подобные показатели специфической реактивности следует считать «исключением из правил», а такие дети подлежат особому вниманию на предмет исключения инфицирования их МБТ

Как указывалось ранее, не менее значимым признаком развивающегося иммунитета при БЦЖ-вакцинации является анппелообразование У детей 1-й группы средние значения противотуберкулезных аншгея составляли 1,51±0,05 (l°gio-), а противошигеллезные антитела имели значения 1,54±0,08 В результате ИССГ оказался равным 1,41 ±0,22 (табл. 4) Подобную тенденцию в содержании ГГГАТ, ПШАТ и контрольные значения индекса выявляли и у детей 2,3 и 4 групп. В то же время следует отметить, что у 10 (62,5%) из 16 малышей через 1-2 года после вакцинации в крови определяли только IgG В последующие 2-3 года специфические антитела этого класса содержались уже у 73,3% детей Однако у детей 3-4 лег в 38% случае» все еще имелись оба класса иммуноглобулинов Возможно, это свидетельствовало о том, что, более чем у 1/3 из них закономерный процесс переключения синтеза антител с М на G по каким-то причинам тормозился, хотя, согласно данным литературы, к этому возрасту в норме (Медунипын, 2004) и, при условии адекватно развивающегося поствакцинального иммунитета с доминированием ТЫ-поляризованнго ответа (VIjaya Lakshmr et al, 2005, Naoe M. et aL, 2007), в крови, практически, должны циркулировать IgG Как показал анализ, одаовременное наличие обоих классов arrimen чаще всего регистрировали у детей П группы здоровья, в анамнезе которых были отмечены аллергические реакции и ОРЗ (3-4 раза в год) Более того, лимфопщарные реакции у них не соответствовали «вакцинальному» типу реагирования. В таких случаях адапгавный иммунитет, очевидно, с самого начала мог развиваться по ТЬ2-типу, когда антигены микобакгерий и «фенстгипические проявления генотипа примированного хозяина» вызывают развигае реакций не по клеточному, а гуморальному nym(Rjmagnam, 1991,Biaun,Cauflien, 1992, Jseman, 2000)

Таким образом, использование классических методов оценки посгвакцинального иммунитета в сочетании с комплексом оригинальных иммунологических методов, основанных на анализе функциональной активности эффекгорных клеток крови, позволяет сделал, заключение о снижении уровня противотуберкулезной зашщы у детей к 3-4 годам за долго до их календарной ревакцинации, что является одним из факторов риска, обусловливающем высокие показатели заболеваемости туберкулезом детей в возрастной группе 4-5 лег

выводы

1 Эпидемическая ситуация по туберкулезу на территории Пермского края продолжает оставаться неблагополучной Рост заболеваемости сопровождается увеличением смертности, показатель которой к 2005 году увеличился в 2 раза, по сравнению с предшествующим десятилетием, и достиг максимального значения 24,5 на 100 ООО населения.

2. Охмена в 2000 г на территории Пермского края региональной тактики ревакцинации детей с сомнительной реакцией Машу и переход на 1-крагное введение бустер-доз вакцины ЕЦЖ привели к снижению объемов профилактических прививок в 2,9 раза и обусловили достоверный рост заболеваемости, смертности и летальности Выявлена сильная обратная корреляционная зависимость между заболеваемостью туберкулезом и объемом профилактических прививок. Коэффициент корреляции составил - 0,73, коэффициент регрессии -0,76, коэффициент детерминации 53,3%.

3 Становление адаптивного противотуберкулезного иммунитета у неполовозрелых животных после БЦЖ-вакцинапии характеризуется фазными изменениями прививочной кожной реакции, сопровождающейся циклическими изменениями содержания лейкоцитов, активацией нешепифических и специфических гуморальных факторов защипы с постепенным нарастанием и доминированием функциональной аюивносш эффекторньтх клеток крови

4 Исследование функциональной акшвности лимфоцитов крови на основании расчета индексов специфической лимфоцитарной адгезии (ИСЛА) и специфического расположения объектов на мембране лимфоцитов (ИСРО) может быть использовано в качестве интегрального показателя напряженности и длительности сохранения поствакцинальнош иммунитета. Характерным признаком адаптивной противотуберкулезной защиты являются одновременное увеличение показателей индексов выше установленных контрольных величин ИСЛА > 1,80, ИСЮ - 2,00 и более.

5 У большинства практически здоровых детей в первые 3 года после их БЦЖ-вакцинации имеются выраженные реакции клеточного иммунитета с высокой функциональной активностью эффекторных клеток крови (фашнигов и лимфоцитов) и специфические антитела, преимущественно класса О, свидетельствующие о развтпии механизмов противотуберкулезной зашщы организма. Однако у детей ЗА лег в 41,4 % случаев происходит угасание адаптивного црививочного иммунитета. Все показатели их иммунной реактивности, включающие индекс специфического фагоцитоза (ИСФ), индекс специфической лимфоцитарной адгезии (ИСЛА), индекс специфического расположения объектов на мембране лимфоцитов (ИСРО) достоверно не отличаются от контрольных величин этих индексов Через 6,5-7легужеу100% детей поствакцинальный иммунитет полностью утрачивается

6 В системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом дат оценки напряженности и длительности сохранения поствакцинального иммунитета у привитых детей, наряду с проведением традиционного анализа состояния прививочного кожного рубчика и чувствительности к туберкулину по пробе Машу, целесообразно использование предлагаемого комплекса методов исследования функциональной активности эффекторньтх клеток крови, более объективно отражающих уровень противотуберкулезной зашиты организма

ПРАКТИЧСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Иммунизацию детей БЦЖ-вакциной следует рассматривать в качестве одной из основных мер профилактики туберкулеза в современных условиях

2. Угасание клеточных и гуморальных факторов противотуберкулезной зашщы к 34 годам жизни детей свидетельствует о необходимости отнесения их в группу риска та тубинфицированию и требует эпидемиологической настороженности педиатров с целью своевременной диагностики состояния поствакцинального иммунитета

3 Предлагаемые нетрадиционные иммунологические методы исследования, в дополнение к анализу кожного знака и реакции Машу, могут быть использованы для оценки напряженности и длительности сохранения поствакцинального противотуберкулезного иммунитета в системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом, как на организменном, так и популяционном уровнях

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Елькин И Ф, Касимова Т В, Коломойцев В Ф, Самоделкин Е И, Фокина JLA Особенности оценки противомикробной зашщы на различных этапах инфекционного процесса// Материалы науч сессии ПГМА Пермь - 2001 - С 76 2. Касимова Т В, Фокина JLA, Санакоева ЛИ Эффект взаимодействия туберкулезного антигена с сывороткой крови кроликов, вакцинированных БЦЖ. Там же - С 77 3. Санакоева ЛИ, Фокина ЛА Закономерности синтеза специфических антител при вакцинации БЦЖ в эксперименте//Материалы V Междунар науч конф , «Здоровье семьи - XXI век» Пермь-Мармарис. - 2001 - С 115 4. Фокина ЛА, Ширшев СБ, Санакоева ЛИ, Тендрякова СИ Комплексная оценка напряженности прашвотуберкупезного иммунитета при экспериментальном БЦЖ-вакцинальном процессе//Иммунологая Урала. Пермь. - 2002. - № 1 (2) -С. 19 5. Фокина ЛА, Ширшев СБ, Санакоева ЛИ Интегральная оценка напряженности гуморального иммунного ответа при БЦЖ-вакцинации в экшерименге//Пермский мед журнал, -2003 -№3-4 -С. 132-137 6. Санакоева ЛИ, Корюкина ИЛ, Черешнев В А, Фокина ЛА Применение метода диагностического определения специфической фагоцитарной реакции у детей при вакцинации БЦЖ и туберкулезной инфекции (Методические рекомендации)// Пермь - 2006 -28 с. 7. Черешнев В А, Санакоева ЛИ, Фокина ЛА, Сафонова ГМ Интегральная оценка напряженности противотуберкулезного иммунитета в экспериментальной модели БЦЖ-вакиинального процессам/Иммунология. - 2006 - № 2 - С 84-88 8. Фокина ЛА, Горовиц Э С, Фельдбпюм ИВ, Санакоева ЛИ Использование специфической фагоцитарной реакции клеток тфови для оценки напряженности адаптивного иммунного ответа при БЦЖ-вакцинации//Сб науч работ «Естествознание и гуманизм» Томск - 2006 - т 3 - № 4 - С 51-52 9. Фокина ЛА, Фельдблюм ИВ, Девяпков МЮ, Горовиц ЭС Эпидемиологическая оценка заболеваемости туберкулезом в Пермском крае// Материалы IX съезда Всерос науч - практич об-ва эпид, микробиол и паразитологов М -2007 - С 47 10. Санакоева ЛИ, Фокина ЛА Патент на изобретшие № 2302634 «Способ иммунодиагностики тубертдщезной инфекции» Бюлл. «Изобретения. Полезные модели» -2007 -№19

Фокина Лариса Анатольевна

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ НОВЫХ ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА И КОНТРОЛЯ ЗА ТУБЕРКУЛЕЗОМ

Автореферат

Подписано в печать 17 08 2007 Формат 60X90/16 Набор компьютерный Тираж 70 экз Уел печ л 1,0 Заказ № 87-к/2007

Отпечатано в типографии ИД «Пресстайм» Адрес 614025, г Пермь, ул Героев Хасана, 105

Актуальность проблемы. В настоящее время туберкулез по-прежнему остается чрезвычайно важной международной и национальной проблемой [6, 12, 64, 107, 138]. По оценке ВОЗ, в период 2000-2020 гг. около 2 млрд людей будет инфицировано микобакгериями туберкулеза (МБТ); при этом 200 млн чел. заболеет и 35 млн погибнет. Глобальный нозоареал свидетельствует о наличии колоссального резервуара микобакгериальной инфекции, что обусловливает широкую диссеминацию возбудителя в популяции и создает дополнительный риск инфицирования взрослых и детей [14, 46, 108, 158]. Эпидемическая ситуация усугубляется увеличением числа осгропрогрессирующих деструктивных форм туберкулеза, сопровождаясь выраженной корреляцией с нарастанием смертности населения, включая детей [5, 48, 71, 203, 229]. Кроме того, распространение лекарслтенно-устойчивого туберкулеза, по мнению многих исследователей, в последние годы принимает характер мировой пандемии и способно дестабилизировать общество [127, 197, 207,229]. Вмешательство человека в молекулярную биологию и физиологию МБТ привело к «селекции генетических мутантов», их адаптации, позволившей выживать микроорганизмам и приспосабливаться к традиционным методам лечения, что в конечном итоге опасно неконтролируемым ростом заболеваемости [14].

Неблагоприятные тенденции в сложившейся эпидемической ситуации по туберкулезу отмечаются и в России [5, 6, 59, 64, 95]. Причинами широкомасштабного распространения этого заболевания являются резко возросшие миграционные процессы, социально-экономические проблемы, недостаточное финансирование общественного здравоохранения, ухудшение экологической обстановки, а также хронический психоэмоциональный стресс, ставший постоянным спутником населения мегаполисов. Все это в «конденсированном виде» неизбежно влияет на иммунную реактивность организма, изменяя его сопротивляемость инфекциям [6,19,86,138,233]. По результатам проведенного Центральным НИИ туберкулеза РАМН эпидемиологического анализа, наряду с другими регионами России, Пермский край отнесен к территориям с неблагополучной эпидемической ситуацией по туберкулезу [72].

Одним из приоритетных методов борьбы с туберкулезной инфекцией является вакцинация [4, 7, 52, 53, 60, 89, 97]. Вместе с тем специфическая профилактика является нерешенной задачей современного здравоохранения. Спорным остается вопрос о значимости иммунизации в предупреждении развития туберкулеза Одни исследователи считают, что влияние вакцшопрофилактики на показатели эпидемического процесса незначительно и нет причин для массового использования вакцины БЦЖ [51, 215]. Большинство же ангаров отстаивают необходимость сохранения традиционных подходов к организации и проведению специфической профилактики заболевания [3,4,8,54,105,109,200]. Так или иначе, вакцина БЦЖ широко используется и по сей день, выдержав испытание временем. Ее безвредность, специфичность, иммуногенносгь проверена и доказана практикой [53]. При этом существует научно обоснованное мнение, что использование профилактических прививок позволяет смещать «фетальный» ТЪ2-поляризованный иммунный ответ на различные антигены у детей раннего возраста в направлении «взрослого» Thl-ответа с выработкой интерферона-}» и интерлейкина-2 (ИЛ - IL), ИЛ-12, являющихся активаторами эффекторных лимфоцитов и макрофагов, которые обеспечивают устойчивость организма к возбудителю туберкулеза [105, 183, 191, 239]. Наиболее сложной задачей в этом вопросе остается способ контроля напряженности и длительности сохранения адаптивных реакций, обеспечивающих формирование протективных механизмов против вирулентных микобактерий. К сожалению, в современных условиях в системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом отсутствуют объективные унифицированные критерии оценки состояния поствакцинального иммунитета. Единственными показателями индивидуальной и популяционной состоятельности проведенной вакцинации остаются размер кожного знака и туберкулиновые пробы [30, 186]. Однако они, по мнению ряда исследователей, не отражают истинной невосприимчивости к туберкулезу — особенно в случаях отсутствующего рубчика и отрицательной пробы Манту, - а в отдаленные сроки после введения БЦЖ при анализе вакцинального статуса ребенка вообще утрачивают свое значение [54,129,186]. Наряду с этим недостаточно изучена динамика развития защитных реакций с позиций формирования специфического ответа, особенно у детей до периода их первой календарной ревакцинации. Необходимость подобных исследований основывается, с одной стороны, на признании «туберкулеза иммунным заболеванием» [23, 39, 40], а с другой - на том, что недостаточно развитая противоинфекционная резистентность детского организма не только выполняет триггерную функцию, но и является фактором риска, поддерживающим заболеваемость. В свете вышеизложенного актуальным остается поиск и апробация новых, информативных, доступных для широкого практического применения методов контроля за длительностью и напряженностью поствакцинального противотуберкулезного иммунитета как на организменном,таки популяционном уровнях.

Цель исследования — разработка новых методических подходов к оценке поствакцинальнош противотуберкулезного иммунитета у детей в системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом.

Основные задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ состояния привитости населения Пермского края в период действия региональной тактики специфической профилактики туберкулеза (19941999 гг.) и после ее отмены (2000-2005 гг.).

2. Изучить многолетнюю динамику основных показателей, характеризующих эпидемическую ситуацию по туберкулезу на территории Пермского края за 1984-2005 гг., а также определить значимость вакцинопрофилакшки в предупреждении заболеваемости на современном этапе.

3. В условиях эксперимента установить основные закономерности развития адаптивных реакций поствакцинального иммунитета.

4. В различные сроки после БЦЖ-вакцинации детей провести комплексный анализ функциональной активности эффекторных клеток крови и специфических гуморальных факторов защиты организма с целью определения степени напряженности и длительности сохранения адаптивного прививочного противотуберкулезного иммунитета

5. Разработать рекомендации по использованию предлагаемых методов исследования специфической реактивности организма для оценки состояния поствакцинального иммунитета у детей в системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом.

Научная новизна исследований.

Впервые на территории Пермского края в условиях естественного эпидемиологического эксперимента (отмены тактики ревакцинации детей с сомнительной реакцией Манту и регламентированного однократного введения бустер-доз БЦЖ в 7 или 14 лет) была установлена зависимость роста показателей заболеваемости туберкулезом от снижения объемов вакцинопрофилактики.

Впервые для оценки поствакцинального противотуберкулезного иммунитета в эксперименте и клинике использован комплекс оригинальных малоинвазивных иммунологических методов, позволивших регистрировать функциональную активность эффекгорных клеток крови.

В условиях искусственного «моделирования» вакцинального процесса на неполовозрелых животных были изучены закономерности развития специфических и неспецифических адаптивных клеточных и гуморальных реакций на различных этапах воспалительных изменений тканей в зоне введения БЦЖ-вакцины.

Впервые проведен комплексный динамический анализ вакцинального статуса детей в первые 4 года после прививки. Установлены параметры «естественного фона» специфической реактивности у детей 6,5-7-летнего возраста с утраченной чувствительностью к туберкулину перед регламентированной календарной их ревакцинацией. При этом подтвержденная универсальность относительных унифицированных показателей позволила разработать принципиально новый методический подход к определению состояния адаптивной противотуберкулезной защиты у детей различных возрастных групп на основе количественной оценки иммунного ответа наБЦЖ-вакцинацию.

Впервые на основании использованных оригинальных иммунологических методов исследования показано, что угасание поствакцинального иммунитета у 41,4% детей Ъ-А- лет происходит задолго до календарной ревакцинации, обусловливая возможность дальнейшего их инфицирования МБТ и заболевания.

Теоретическое и практическое значение работы.

Установленные закономерности развития специфических и неспецифических адаптивных реакций организма при экспериментальной БЦЖ-вакцинации, а также данные клинических наблюдений могут служить основой для дальнейшего изучения механизмов формирования прививочного противотуберкулезного иммунитета.

Применение оригинальных иммунологических методов исследования функциональной активности клеток крови (фагоцитов и лимфоцитов), а также процессов антител ообразования в комплексе с традиционно используемыми критериями анализа эффективности БЦЖ-вакцинации детей позволяет повысить объективность оценки состояния их противотуберкулезной защиты в различные сроки после иммунизации.

Полученные результаты могут быть внедрены в систему эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом в части обеспечения мониторинга напряженности поствакцинального популяционнош иммунитета и совершенствования экстренной специфической профилактики контактных лиц в эпидемических очагах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Снижение объемов профилактических прививок после отмены региональной тактики специфической профилактики туберкулеза явилось одним из факторов риска осложнения эпидемической ситуации на территории Пермского края.

2. Для БЦЖ-вакцинального процесса у неполовозрелых кроликов, наряду с фазностью изменений кожного прививочного знака, а также неспецифических и специфических гуморальных факторов защиты, характерно постепенное нарастание активности и доминирование клеточных иммунных реакций.

3. В системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом для определения степени напряженности и длительности сохранения у детей поствакцинального иммунитета, наряду с оценкой результатов пробы Манту и определения величины прививочного рубчика, целесообразно исследовать функциональную активность эффегаорных клеток крови и особенности процесса специфического антишлообразования по предлагаемым оригинальньгм иммунологическим методам.

Внедрение в практику. Полученные результата исследования используются в учебном и научном процессах на кафедрах эпидемиологии с курсом гигиены и эпидемиологии ФПК и III 1С, микробиологии, вирусологии и иммунологии, патологической физиологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера Росздрава», а также в Пермском областном противотуберкулезном диспансере «Фтизиопульмонология». Методические рекомендации по фагоцитарной активности клеток крови используются детскими клиническими больницами г. Перми (№ 13 и 15).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на итоговых научных сессиях Пермской государственной медицинской академии им. академика ЕА Вагнера (Пермь) в 1998, 2001, 2002 гг.; V Международной научной конференции «Здоровье семьи - 21 век» (Мармарис) в 2001 г.; П конференции иммунологов Урала (Пермь) в 2002 г., Межвузовской конференции микробиологов (Томск) в 2006 г.; совместных заседаниях кафедр патофизиологии, эпидемиологии, микробиологии и фтизиатрии ГОУ ВПО «ПГМА им. академика Е А Вагнера» Росздрава (Пермь) в 2006 и 2007 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 - в журналах, включенных в список ВАК. Опубликованы методические рекомендации «Применение метода диагностического определения специфической фагоцитарной реакции клеток крови у детей при туберкулезной инфекции и первичной вакцинации БЦЖ», 2006. Получен патент № 2302634 Российской Федерации «Способ иммунодиагностики инфекции, вызванной микобакгериями» (Изобретения. Полезные модели: бюлл. - 2007. - № 19).

Объем и cipyiciypa диссертации. Диссертация изложена на 198 стр. машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы, объем и методы исследования», 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 246 источников цитируемой литературы, в том числе 98 отечественных и 148 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 32 рисунками.

173 ВЫВОДЫ

1. Эпидемическая ситуация по туберкулезу на территории Пермского края продолжает оставаться неблагополучной. Рост заболеваемости сопровождается увеличением смертности, показатель которой к2005 г. увеличился в 2 раза по сравнению с предшествующим десятилетием и достиг максимального значения 24,5 на 100 ООО населения.

2. Огмена в 2000 г. на территории Пермского края региональной тактики ревакцинации детей с сомнительной реакцией Машу и переход на од нократное введение бустер-доз вакцины БЦ>К привели к снижению объемов профилактических прививок в 2,9 раза и обусловили достоверный рост заболеваемости, смертности и легальности. Выявлена сильная обратная корреляционная зависимость между заболеваемостью туберкулезом и объемом профилактических прививок. Коэффициент корреляции составил -0,73, коэффициент регрессии -0,76, коэффициент детерминации 533%.

3. Становление адаптивного противотуберкулезного иммунитета у неполовозрелых животных после БЦЖ-вакцинации характеризуется фазными изменениями прививочной кожной реакции, сопровождающейся циклическими изменениями содержания лейкоцитов, активацией неспецифических и специфических гуморальных факторов защиты с постепенным нарастанием и доминированием функциональной активности эффекгорных клеток крови.

4. Результаты исследований адгезивной способности лимфоцитов крови, полученные на основе определения индексов специфической лимфоцигарной адгезии (ИСЛА) и специфического- расположения объектов на мембране лимфоцитов (ИСТО), могут быть использованы в качестве интегрального показателя напряженности и длительности сохранения i поствакцинального иммунитета. Характерным признаком адаптивной противотуберкулезной защиты следует считать одновременное увеличение показателей индексов- выше установленных контрольных величин: ИСЛА > 1,80; ИСЮ - 2,00 и более, а также наличие специфических высокоактивных лимфоцитов I класса

5. У практически здоровых детей в первые 3 года после БЦ>К-вакцинации сохраняются выраженные реакции клеточного иммунитета, характеризующиеся специфическими изменениями фагоцитарной активности лейкоцитов и высокой адгезивной способностью лимфоцитов крови при наличии в ней специфических антител, преимущественно класса G, свидетельствующих об адекватном развитии механизмов противотуберкулезной защиты организма. У детей 3-4 лет в 41,4 % случаев происходит угасание адаптивного прививочного иммунитета. Все показатели их иммунной реактивности, включающие индекс специфического фагоцитоза, индекс специфической лимфоцитарной адгезии, индекс специфического расположения объектов на мембране лимфоцитов и индекс специфического сдвига тигра антител, свидетельствуют о резком снижении функциональной активности эффекторных клеток крови. Через 6,5-7 лет уже у 100% детей поствакцинальный иммунитет полностью утрачивается.

6. В системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом для оценки напряженности и длительности сохранения поствакцинального иммунитета у привитых детей, наряду с проведением традиционного анализа'состояния прививочного кожного рубчика и чувствительности к туберкулину по пробе Манту, целесообразно использование предлагаемого комплекса' методов исследования функциональной активности эффекторных клеток крови, более объективно отражающих уровень противотуберкулезной защиты организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Иммунизацию детей БЦЖ-вакциной следует рассматривать в,качестве одной'из основных мер профилактики туберкулеза в современных условиях

2. Угасание клеточных и гуморальных факторов противотуберкулезной защиты к 3^4 годам жизни детей свидетельствует о необходимости отнесения их в группу риска по тубинфицированию и требует эпидемиологической настороженности педиатров с целью своевременной диагностики состояния поствакцинального иммунитета

3. Предлагаемые нетрадиционные иммунологические методы исследования, в дополнение к анализу кожного знака иреакцинМанту, могут быть использованы для оценки' напряженности' и длительности сохранения поствакцинального■ противотуберкулезного иммунитета в системе эпидемиологического надзора и контроля за туберкулезом, как на организменном, так и на популяционном уровнях.

175