Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Клинико-диагностическое значение определения антител к церулоплазмину у больных ревматоидным артритом с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами

На правах рукописи

4 :,:А? П

Петрова Наталья Валентиновна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЦЕРУЛОПЛАЗМИНУ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ГРАНУЛИРОВАННЫХ АНТИГЕНЫХ ПРЕПАРАТОВ С МАГНИТНЫМИ СВОЙСТВАМИ

14.00.39 - ревматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград 2002

Работа выполнена в НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и Волгоградской медицинской академии

академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор А.Б. Зборовский

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник И.П. Гонтарь

доктор медицинских наук, профессор В.Ф. Мартемьянов

доктор медицинских наук, главный терапевт комитета здравоохранения Администрации г.Волгограда Б. А. Лемперт

Ведущее учреждение: Ярославская государственная медицинская академия.

Защита состоится " " февраля 2002 г. в ^ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.02. Волгоградской медицинской академии по адресу: 400066, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградской медицинской академии.

Автореферат разослан " ^ " января 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор медицинских наук А. Р. Бабаева

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

/V//. /20.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Ревматоидный артрит (РА) - одно из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний суставов, отличающееся склонность к неуклонному прогрессированию, что существенным образом ухудшает не только качество жизни больного и членов его семьи, но и снижает трудовые возможности общества, приводя к значительным экономическим потерям.

Хроническое прогрессирующее, нередко инвалидизирующее течение РА ставит перед врачами задачу возможно более ранней диагностики его, когда терапия наиболее эффективна. Однако распознавание РА на ранней стадии представляет значительные трудности. Большинство исследователей отмечают многообразие клинических проявлений этого страдания. По настоящее время не найдено и строго специфичного для РА лабораторного теста. Только сочетание многих клинических и лабораторных признаков может оказать помощь в диагностике этого заболевания. Поэтому и сейчас продолжается поиск методов, позволяющих дифференцировать РА среди множества воспалительных и дегенеративных болезней опорно-двигательного аппарата.

В последнее время значительно возрос интерес к исследованию роли реакций свободнорадикального окисления в развитии РА. Образующиеся при этом заболевании в больших количествах иммунные комплексы стимулируют хемотаксис нейтрофилов и реакции фагоцитоза. Процесс фагоцитоза сопровождается активацией метаболизма этих клеток, высвобождением большого числа активных форм кислорода (АФК), которые могут оказывать патогенное воздействие на биомолекулы и структуры клетки непосредственно либо инициируя процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), приводя к повреждению самих нейтрофилов с последующим выходом лизосомальных ферментов, деградации коллагена, гиалуроновой кислоты и к повреждению соединительной ткани.

Сдерживающим фактором по отношению к лавинообразному процессу свободнорадикального окисления является система антиокислительной защиты, включающая в себя ферменты-антиоксиданты и вещества неферментной природы. При патологических состояниях нарушается равновесие между образованием АФК и их нейтрализацией. Одним из важных звеньев системы антирадикальной защиты и основным внеклеточным антиоксидантом является церулоплазмин (ЦП) -медьсодержащий альфа2-гликопротеид плазмы крови, обладающий мультиферментными свойствами. Показатели активности различных ферментов антиоксидантной системы при РА исследовались многими авторами (И.А.Зборовская, 1995, В.Ф.Мартемьянов, 1993). Особый интерес

представляет выявление факторов, вызывающих снижение или увеличение содержания энзимов различных метаболических путей, а также патогенетическое значение таких изменений.

Учитывая характерные иммунологические нарушения при РА и участие АФК и ПОЛ в патогенезе этого заболевания, можно предположить, что функциональная несостоятельность ферментов антиоксидантной системы, в том числе и церулоплазмина, обусловлена как гиперпродукцией антител к ним, так и влиянием окислительных процессов и метаболических нарушений. В доступной нам литературе данных о содержании антител к ЦП у больных РА обнаружено не было.

Таким образом, определение антител к церулоплазмину и выяснение их влияния на активность этого фермента у больных РА с позиций диагностики активности, клинического варианта и формы патологического процесса, изучения отдельных звеньев патогенеза заболевания, возможности коррекции нарушений антиоксидантного статуса и контроля за эффективностью проводимой терапии представляет собой актуальную задачу.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является улучшение качества иммунологической диагностики РА и контроля за эффективностью терапии с помощью иммобилизированных гранулированных препаратов (ИГАП) с магнитными свойствами на основе церулоплазмина.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить иммобилизированную форму церулоплазмина, изучить ее физико-химические свойства.

2. Адаптировать иммуноферментный метод исследования с использованием иммобилизированной формы ЦП к определению специфических антител.

3. Изучить содержание антител к ЦП у больных РА в зависимости от активности, характера течения, клинико-анатомической формы и серологического варианта заболевания.

4. Исследовать содержание ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП у больных РА в зависимости от клинических особенностей заболевания и уровня антител к ЦП.

5. Изучить возможность использования определения уровня антител к ЦП в качестве критерия эффективности проводимой терапии у больных РА.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые для иммунодиагностики РА была создана и применена в иммуноферментном методе исследования иммобилизированная гранулированная форма церулоплазмина с оптимальной концентрацией антигена. Определены соответствующие условия иммобилизации фермента, позволяющие сохранить его биологические функции.

В ходе работы в сыворотках больных РА выявлены антитела к ЦП. Показано, что их уровень у больных РА достоверно отличается от здоровых лиц и больных остеоартрозом. Выявлена зависимость количества антител к изучаемому ферменту от активности, характера течения, клинико-анатомической формы и серологического варианта заболевания. Обнаружена достоверная обратная корреляция между содержанием антител к ЦП и количеством эритроцитов, гемоглобина.

Проведена комплексная оценка трех показателей: ферментативной активности, количества ЦП и содержания антител к нему у больных РА и здоровых лиц.

Одновременное применение иммуноферментного и биохимического методов исследования позволило провести количественное определение как суммарного (иммунореактивного) ЦП, так и той части белка, которая обладает ферментативной активностью, обнаружить определенную долю биохимически неактивного ЦП, которая возрастала с увеличением активности заболевания, и выявить возможные причины угнетения оксидазной активности ЦП.

Получено, что максимальное содержание антител к ЦП отмечается у больных с высокой степенью активности, быстропрогрессирующим течением, суставно-висцеральной формой и серопозитивным вариантом РА. Установлена возможность использования определяемого показателя в качестве критерия эффективности проводимой терапии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Использование иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами на основе церулоплазмина позволит повысить качество иммунологической диагностики РА, особенно на ранних стадиях заболевания, что имеет важное значение для своевременной, адекватной терапии больных. Определение антител к церулоплазмину может быть использовано в качестве дополнительного теста в комплексной диагностике РА для характеристики активности, течения, формы заболевания, серологического варианта, прогноза, а также критерия эффективности проводимой терапии.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСИТСЯ ПОЛОЖЕНИЕ о возможности использования определения антител к ЦП с помощью иммуноферментного метода анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами в качестве дополнительного теста для диагностики степени активности, характера течения, формы, серологического варианта РА, оценки эффективности проводимой терапии.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Методы определения антител к ЦП с помощью иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами,

биохимической активности ЦП, количества ЦП с помощью иммунофермеитиого анализа в сыворотке крови больных ревматоидным артритом внедрены в Муниципальном медицинском учреждении «Клиническая больница скорой медицинской помощи № 25» г. Волгограда.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из которых одна - в зарубежной литературе.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на симпозиуме ЕиЬАЯ (Прага, Чешская республика, 2001г.), юбилейной конференции, посвященной 70-летию ассоциации ревматологов России и 40-летию Института Ревматологии РАМН (Москва, 1998 г.), на V и VII Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998 и 2000 гг.), юбилейной конференции, посвященной 15-летию НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН (Волгоград, 2000 г.), ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградской медицинской академии.

ОБЬЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами, 10 рисунками, 4 выписками из истории болезни. Указатель литературы содержит 304 источника, в том числе 201 отечественный и 103 иностранных.

КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ

Под нашим наблюдением находилось 108 больных РА, 34 больных ОА и 30 практически здоровых лиц в возрасте от 19 до 48 лет (17 мужчин и 13 женщин).

Больные ревматоидным артритом

Под наблюдением находилось 108 больных с достоверным диагнозом РА, из которых 82 женщины (75,9%) и 26 мужчин (24,1%). Средний возраст больных - 53,1±1,27 лет. Распределение больных РА по полу и возрасту представлено в таблице 1.

Средняя длительность заболевания у больных составила 6,85±0,87 лет; причем у 61 (56,48 %) из них продолжительность ревматоидного процесса была до 5 лет, у 18 (16,67 %) - 5-10 лет, у 29 (26,85 %) - более 10 лет.

Инвалидность по данному заболеванию имели 37% от общего числа больных, среди них преобладали лица наиболее социально-активного возраста (56,3% больных с инвалидностью были в возрасте до 55 лет).

Таблица 1

Распределение больных РА по полу и возрасту.

Возраст Мужчины Женщины Всего

до 30 3(11,5%) 7 (8,5 %) 39,8 (9,3 %)

31-40 4(15,4%) 16(19,5%) 20(18,5%)

41-50 5(19,2%) 14 (17,1 %) 19(17,6%)

51-60 10 (38,5 %) 21 (25,6%) 31 (28,7%)

свыше 60 4(15,4%) 24 (29,3 %) 28 (25,9 %)

Всего 26(100%) 82 (100%) 108(100%)

По степени активности РА больные распределились следующим образом: минимальную степень активности (I) имели 19 человек (17,6%), среднюю (II) - 76 (70,4%), максимальную (III) - 13 (12%).

Степень поражения суставов определялась рентгенологически с выделением стадий по О^етЬгоскег: I стадия заболевания выявлена у 29 человек (26,9%), II стадия - у 48 (44,4%), III стадия - у 25 (23,1%), IV стадия - у 6 (5,6%) больных РА.

У большинства обследованных больных (87 человек - 80,56%) РА протекал по типу полиартрита с преимущественным поражением проксимальных межфаланговых, пястно- и плюснефаланговых суставов кистей и стоп, лучезапястных, голеностопных, локтевых и коленных суставов. У остальных пациентов (21 человек - 19,44%) имел место моно-олигоартрит.

Нарушение функции суставов обнаружено у 107 больных (99,07%). У 18 пациентов отмечалась функциональная недостаточность суставов (ФНС) I степени, у 76 - ФНС II и у 13 - ФНС III.

Медленно прогрессирующее течение диагностировано у 71 больного (65,74%), быстропрогрессирующее у 37 (34,26%). В первой группе мужчины составили 26,76%, женщины - 73,24%, во второй - 18,92% и 81,08% соответственно.

Поражение организма при РА не ограничивается суставами, в патологический процесс часто вовлекаются различные внутренние органы, что значительно утяжеляет течение болезни. В группе больных, находившихся под нашим наблюдением у 77 (71,3%) пациентов диагностирована суставная форма заболевания, а у 31 (28,7%) - суставно-висцеральная.

Среди больных РА с висцеральными проявлениями мы выделили группу пациентов с различными типами поражения печени: 1) ревматоидное поражение печени (гепатит) и амилоидоз с поражением печени, 2) сопутствующие воспалительные заболевания - хронический гепатит, жировая дистрофия печени и т.д., 3) лекарственное поражение печени, 4)

смешанные поражения (различные сочетания первых трех). Вне зависимости от того, какие из этих причин вызывают повреждение печени, происходит разрушение гепатоцитов и выход в циркулирующую кровь определенных количеств ЦП, полноценного (нормального) или измененного, способного активировать антителообразование к нему. Поэтому в данную группу мы объединили больных, имеющих те или иные клинико-лабораторные признаки поражения печени (увеличение печени, изменение осадочных проб, повышение активности АлАТ, АсАТ, билирубина, ультразвуковые изменения в паренхиме печени).

При определении ревматоидного фактора (реакция латекс-агглютинации) у 75 (69,4%) больных РА был выявлен серопозитивный РА, а у 33 (30,6%) больных - серонегативный РА.

Изменения иммунологических показателей характеризовались повышением СОЭ, снижением уровня сывороточного альбумина, повышением уровня основных классов иммуноглобулинов, С-реактивного белка, титра антинуклеарного фактора.

Больные остеоартрозом

Под наблюдением находилось 34 больных ОА, из них 24 женщины (70,59%) и 10 мужчин (29,41%) в возрасте от 25 до 66 лет. Распределение больных О А по возрастным группам было следующим: в возрасте от 21 до 30 лет- 1 мужчина (2,94%), от 31 до 40 - 5 человек (14,71%) (2 мужчины и 3 женщины), от 41 до 50 - 12 (35,29%) (2 мужчины и 10 женщин), от 51 до 60 -10 (29,41%) (4 мужчины и 6 женщин), свыше 60 лет- 6 (17,65%) (2 мужчин и 4 женщины).

В группе больных ОА лица трудоспособного возраста (до 50 лет) составили 52,94%. Трое больных ОА (8,82%) имели инвалидность по основному заболеванию, причем двое из них находились в социально-активном возрасте (до 55 лет).

При рентгенологическом исследовании суставов согласно критериям Н.С.Косинской I стадия О А установлена у 14 (41,18%) больных, II стадия - у 16 (47,06%), III стадия - у 4 (11,76%).

При изучении функциональной недостаточности суставов было обнаружено, что ФНС 0 отмечалась у 4 (11,8%) больных ОА, ФНС I - у 15 (44,1%), ФНС II - у 12 (35,3%), ФНС III - у 3 (8,8%) больных. У 19 больных (55,9%) определялись явления синовита (мужчин - 3, женщин - 16).

Быстропрогрессирующее течение заболевания отмечено у 7 (20,59%) больных ОА, медленнопрогрессирующее и без заметного прогрессирования -у 27 человек (79,41%).

Узелковая форма заболевания (узелки Гебердена, Бушара) была выявлена у 9 больных ОА (26,47%), безузелковая - у 25 (73,53%). В 91,18% случаев (31 человек) был диагностирован первичный ОА, в 8,82% (3 человека) - вторичный.

В большинстве случаев заболевание протекало по типу полиостеоартроза - 24 человека (70,6%). Поражение суставов по типу моно-олигоартроза выявлено у 10 больных (29,4%). Наиболее часто у больных наблюдалось поражение коленных суставов - у 29 человек (85,3%), голеностопных суставов - у 21 (61,7%), плечевых суставов - у 13 (38,2%) и суставов кистей-у 12 (35,3%).

Ведущими жалобами у наблюдавшихся нами больных ОА были боли в суставах появляющиеся или усиливающиеся после физической нагрузки и уменьшающиеся в состоянии покоя (100%), ограничение активных движений в суставах (82,3%), болезненность при пальпации суставов и околосуставных тканей (76,5%), боль в суставах в покое (35,3%), причем в группе больных с явлениями синовита все жалобы более выражены.

Всем больным проводилось комплексное лечение, включающее нестероидные противовоспалительные препараты, средства, улучшающие микроциркуляцию, воздействующие на общий и местный метаболизм. Небольшое количество больных (11,8%) получали хондропротекторы. Часть больных (20,6%), как правило с явлениями синовита, получали параартикулярно или внутрисуставно инъекции кеналога, дипроспана. Кроме указанной медикаментозной терапии, большинство больных ОА получали массаж, ФТЛ и ЛФК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Антитела к ЦП определяли иммуноферментным методом с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами (И.П.Гонтарь, 1991). В качестве антигена использовался коммерческий препарат "Церулоплазмин диагностический очищенный жидкий человеческий" серия 1 К 118 производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (Санкт-Петербург, Россия). В ЕЫБА-тесте использовался фермент в разведении 10 мкг/мл.

Для получения иммобилизированной формы ЦП использовали раствор с концентрацией 100 мкг/мл. Учитывая достаточную относительную молекулярную массу, иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в модификации И.П.Гонтаря и соавт. (1991) в потоке газообразного азота с включением в структуру гранул магнитного материала. Магнитосорбенты имели правильную сферическую форму с размером частиц от 10 до 100 мкм. При иммобилизации достигается стабилизация фиксируемых белков, т.е. повышается устойчивость к внешним воздействиям с сохранением их биологических свойств. Фиксация в полиакриламидном геле значительного количества антигенов способствует повышению чувствительности метода, а включение магнитного материала позволяет ускорить и упростить ряд операций ИФА.

Регенерацию ИГАП проводили 0,1М глицин-НС1 буфером (рН 2,0), после чего гранулы отмывали забуференным физиологическим раствором

(ЗФР) до нейтральных значений рН.

"Чистые" антитела к ЦП получали с помощью соответствующего антигенного иммуносорбента по методу И.П.Гонтаря и соавт. (1990). Источником специфических иммуноглобулинов служили сыворотки больных РА с заранее определенным высоким титром AT (экстинкция>0,15). После инкубации антигенного иммуносорбента и растворимой формы фермента с полученными AT был проведен анализ изменения активности энзима.

Определение количества ЦП (т.е. иммунореактивного ЦП) проводили иммуноферментным методом по И.С.Кузьминой и сотр. (1991) с использованием коммерческого иммуноферментный диагностикума производства НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН (г.Москва) ФС 42-420ВС-93 серия №12.

Измерение оксидазной активности ЦП (т.е. содержания ферментативно-активного ЦП) по методу H.A.Ravin в модификации Э.В.Тена основано на фотометрировании окрашенных продуктов, образующихся в результате окисления парафенилендиамина, при 440 нм. Пересчет результатов, выраженных в единицах оптической плотности, в единицы концентрации производили по калибровочной кривой, построенной по данным зависимости оксидазной активности от концентрации ЦП в серии его растворов. В качестве стандарта использовали упомянутый выше "Церулоплазмин диагностический очищенный жидкий человеческий".

С диагностической целью, а также для оценки корреляции с изучаемыми показателями был проведен целый ряд иммунологических проб, позволяющих охарактеризовать иммунный статус больных РА. Методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини определяли различные классы иммуноглобулинов: A, G, М; АНФ исследовался по Кунсу (Г.Фримель, 1987). РФ выявляли с помощью теста латекс агглютинации. ЦИК определяли методом преципитации с полиэтиленгликолем 6000 по Haskova в модификации Б.А.Лемперта (1988).

Эффективность лечения больных оценивалась с помощью одинаковых клинико-лабораторных и иммунобиохимических показателей: общая выраженность боли, суставной индекс, суставной счет, число припухших суставов, индекс припухлости, функциональный индекс Ли, продолжительность утренней скованности, РФ, СОЭ, ЦИК, содержание иммуноглобулинов классов A, G и М. На основании динамики рассмотренных критериев, в конце курса терапии оценивался суммарный эффект лечения по 4 градациям: "значительное улучшение", "улучшение", "без перемен", и "ухудшение".

Обработка полученных результатов проводилась с использованием программных пакетов "STATISTICА 6.0" и "STATGRAPHICS 3.0".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение иммунобиохимических свойств ИГАП на основе церулоплазмина

Результат взаимодействия антител с ферментами, по данным литературы, может быть различным: они могут ингибировать ферментативную активность полностью или частично или не изменять ее (А.Г.Бородин, 1999, ЭЛ.Кукк, 1995, S.V.Griffin, 1999). Предполагая, что антитела к ЦП вызывают ингибирование его ферментативной активности, мы провели in vitro опыт по изучению взаимодействия иммобилизированной и растворимой форм фермента с полученными предварительно антителами к ЦП.

Таблица 2

Сравнительная характеристика активности иммобилизированной и

растворимой форм ЦП после взаимодействия с антителами.

Форма фермента Активность фермента

взаимодействие с антителами взаимодействие с сывороткой доноров взаимодействие с физ. раствором

Иммобилизированная 526±29 682+27 812+31

Растворимая 423+32 604±29 819+33

Активность иммобилизированной формы ЦП уменьшилась на 35,2% по сравнению с контролем; выявлены статистически достоверные различия с физиологическим раствором (р<0,001) и донорами (р<0,001).

Уменьшение активности растворимой формы ЦП после взаимодействия со специфическими АТ составило 48,4%; различия с контрольной группой и донорами достоверны (р<0,001). Параллельно методом ИФА были исследованы сыворотки больных РА (п=30) на наличие антител к ЦП после взаимодействия со специфическим магнитосорбентом. Исходная концентрация антител к ЦП (0,171±0,026) уменьшилась в 2,7 раза (0,063±0,09).

Таким образом, взаимодействие фермента со специфическими антителами сопровождается определенным снижением активности ЦП вследствие возможного изменения пространственной конфигурации молекулы фермента под влиянием присоединенной крупной белковой молекулы, которой является антитело, уменьшения подвижности сближенных в пространстве аминокислотных остатков, образующих активный центр, и нарушения индуцированного взаимодействия фермента и субстрата (А.Ш.Бышевский, О.А.Терсенов, 1994).

Исследование возможности регенерации и повторного использования

ИГАП на основе ЦП показало, что процедура регенерации ИГАП с использованием 0,1М глицин-НС1 буфера с рН 2,0 происходит без потери ими иммунохимических свойств. Изменение сорбционной ёмкости ИГАП после регенерациии не выявило достоверного снижения иммунохимической активности магнитосорбента (р>0,05).

Таким образом, ИГАП могут эффективно регенерироваться без потери ими иммунохимических свойств, что позволяет неоднократно использовать ИГАП в методах иммуноанализа.

Оксидазная активность, количество церулоплазмина и содержание антител к нему в контрольных группах и у больных РА

Здоровые лица. По данным ИФА средний уровень антител к ЦП в донорских сыворотках составил 0,020±0,006. Уровень нормальных показателей специфических антител, определяемый как М±2ст, включает значения экстинкции в интервале от 0 до 0,086. Среднее значение оксидазной активности и количества ЦП у здоровых лиц составило 716±26,3 и 921 ±32 нг/мл соответственно. Разница в содержании ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП у доноров равна 28,6%.

Достоверной зависимости активности, количества ЦП, содержания антител к нему от возраста и пола не выявлено. Отмечена лишь незначительная тенденция увеличения всех изучаемых показателей в старшей возрастной группе, а также среди лиц женского пола.

Больные ОА. При исследовании крови во всей группе больных ОА у 17,6% из них обнаружен повышенный уровень антител к ЦП. Содержание специфических антител, активность и количество ЦП у больных ОА достоверно отличается от уровня таковых в группе здоровых людей (р<0,05; р<0,01; р<0,001 соответственно) (см. таб. 3). Разница между активностью и количеством ЦП составила 31,2%.

Таблица 3

Оксидазная активность, количество ЦП и уровень антител к нему у больных остеоартрозом.___1___

Контингент обследуемых N Антитела к ЦП Активность ЦП Количество ЦП

Здоровые 30 0,020+0,006 716+26,3 921±32,0

Вся группа больных О А 34 0,048+0,009 889±41,5 1166+58,7

Больные ОА с синовитом 19 0,056±0,012 941+45,2 1250±62,7

Больные ОА без синовита 15 0,038+0,011 804±50,3 1039+68,3

Среди больных ОА с синовитом превышающий норму уровень антител к ЦП обнаружен в 42,1% случаев. У этой группы больных найдены достоверные различия в количестве изучаемых антител по сравнению с

донорами (р<0,01), а также в содержании ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП (р<0,001). Разность между этими двумя показателями оказалась равной 32,8%.

Уровень AT к ЦП, цифры активности и количества данного фермента у больных ОА без синовита не отличались статистически от показателей здоровых лиц. Превышение содержания иммунореактивного ЦП по сравнению с ферментативно-активнным - 29,2%.

Статистически достоверной зависимости содержания AT к ЦП у больных ОА от наличия или отсутствия синовита не выявлено, отмечалась лишь тенденция к увеличению количества антител к ЦП при наличии синовита.

При сравнении содержания антител к ЦП в общей группе больных ОА и у больных РА с I степенью активности процесса получены достоверные различия (р<0,01), причем статистически значимых различий по активности и количеству ЦП в этих клинических группах не было.

Таким образом, содержание антител к ЦП может служить дополнительным критерием при дифференциальной диагностике остеоартроза и начальных стадий РА с маловыраженной клинической симптоматикой.

Больные РА. В процессе исследований выявлено достоверное повышение содержания антител к ЦП, активности и количества ЦП у больных РА по сравнению с донорами (р<0,001). В группе обследованных больных в 73,1% случаев (у 79 человек) определялись повышенные значения антител к ЦП. Выявлена корреляционная связь между уровнем антител к ЦП с одной стороны и со следующими лабораторными показателями с другой: содержанием С-реактивного белка (г=0,56, р<0,01), серомукоида (г=0,38, р<0,05), сиаловых кислот (г=0,34, р<0,05), скоростью оседания эритроцитов (г=0,43, р<0,05), уровнем гемоглобина крови (г=-0,39, р<0,05), лейкоцитов крови (г=0,38, р<0,05), ЦИК (г=0,47, р<0,01), IgG (г=0,75, р<0,01), IgM (г=0,52, р<0,05), оксидазной активностью ЦП (г=0,82, р<0,001).

При поступлении в стационар повышенный уровень антител к ЦП отмечался у 13 (68,4%) больных с I степенью активности, у 56 (73,7%) больных со II степенью и у 10 (76,9%) больных с III степенью активности РА. Следует отметить, что уже при минимальной активности патологического процесса обнаружено достоверное повышение уровня антител к ЦП (р<0,001), активности и количества изучаемого фермента (р<0,001) по сравнению со здоровыми лицами а также разности в содержании ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП до 35,4%.

У больных РА со И степенью активности выявлено достоверное увеличение содержания исследуемых антител, активности и количества ЦП (р<0,001) по сравнению со здоровыми лицами, а также с больными с I степенью активности РА (р<0,01; р<0,05; р<0,001 соответственно). Разность

между содержанием ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП составила 51,6%.

При III степени активности РА по сравнению со II обнаружено достоверное возрастание уровня антител к ЦП (р<0,05) и активности фермента (р<0,05), недостоверное увеличение количества ЦП и снижение доли биохимически неактивного ЦП до 31,2%, которая все же превышает таковую у доноров (см. таб. 4).

Т.е. с увеличением активности заболевания происходит возрастание уровня определяемых антител, активности ЦП, его количества и доли биохимически неактивного фермента. Если у здоровых людей неактивный ЦП в основном представлен фракцией белка, лишенного ионов меди (апо-ЦП) и поэтому не обладающего оксидазной активностью (В.Б.Васильев, А.М.Качурин, 1996), то у больных РА одной из причин возрастания разницы в содержании ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП может являться блокировка части имеющегося в организме ЦП антителами к нему.

Таблица 4

Оксидазная активность, количество ЦП и уровень антител к нему у больных РА с различной степенью активности._

Контингент обследуемых N Антитела к ЦП (М±ш) Активность ЦП (М+ш) Количество ЦП (М±т)

Здоровые 30 0,020±0,006 716+26,3 921 ±32,0

поступление

Больные с I степенью активности 19 0,098±0,011 954+48,1 1292+73,4

Больные со II степенью активности 76 0,138±0,007 1163±39,6 1763±69,3

Больные с III степенью активности 13 0,182+0,015 1368±80,5 1794± 102,8

выписка

Больные с I степенью активности 19 0,058±0,010 745±33,6 986+57,8

Больные со II степенью активности 76 0,116±0,008 992±36,4 1447±67,5

Больные с III степенью активности 13 0,139+0,018 1172+49,1 1513±82,4

Результат взаимодействия антител с ферментами может быть различным: они могут ингибировать ферментативную активность полностью или частично или не изменять ее в зависимости от того, совпадают ли антигенные детерминанты с активным центром фермента или расположены за его пределами. Конкуренция антифермента и субстрата за активный центр

- не единственный механизм ингибирования ферментативной активности. Установлено, что в присутствии субстрата происходит формирование и стабилизация оптимальной формы активного центра фермента -индуцируемая адаптация энзима. Крупная белковая молекула, которой является антитело, при соединении с антигеном-ферментом может уменьшать подвижность определенных группировок фермента, нарушая индуцированное взаимодействие энзима и субстрата (А.Ш.Бышевский, О.А.Терсенов, 1994, М.Диксон, Э.Уэбб, 1982).

Молекула фермента может обладать несколькими детерминантными группировками. Так, получено 14 типов моноклональных антител против молекулы ЦП, что говорит о существовании не меньшего количества антигенных группировок у этого фермента (Б.ШуатЩа, К.Но, 1994), взаимодействие с каждой из которых может приводить к различной степени снижения оксидазной активности ЦП.

Среди возможных причин увеличения доли биохимически неактивного ЦП при РА следует также назвать окислительную модификацию этого белка. В условиях хронического воспаления генерируются значительные количества АФК, что приводит не только к активации ПОЛ, но и к изменению первичной, вторичной и третичной структур белковых молекул. Окисление серосодержащих, ароматических и других аминокислотных остатков приводит к изменениям ферментативной активности и структуры белка, а также его иммунологических свойств (Е.Е.Дубинина, 1993).

Подтверждена роль ЦП как физиологического ингибитора миелопероксидазы - фермента, содержащегося в азурофильных гранулах нейтрофилов, активация которого приводит к повышенной продукции кислородных радикалов этими клетками. Связывание ЦП с миелопероксидазой приводит к ингибированию ферментативной активности последней (А.А.РаН, М.\\^кеБ, 1995). Вероятно, и сам ЦП в результате такого взаимодействия претерпевает конформационные изменения, отражающиеся на его ферментативной активности.

Метаболические нарушения при РА, присутствие высоких концентраций ионов металлов в очаге воспаления и в плазме крови, сдвиг рН среды в кислую сторону, также обладают ингибирующим действием на активность ЦП.

При максимальной активности ревматоидного процесса не происходит существенного увеличения общего количества ЦП по сравнению с этим показателем при II степени активности РА, кроме того, снижается содержание неактивного ЦП. Все это может свидетельствовать о напряженности адаптивных процессов, а, возможно, и их пределе.

По окончании курса стационарного лечения по сравнению с исходными данными происходило достоверное снижение активности и количества ЦП (при I степени активности РА р<0,001 и р<0,01 соответственно, при II степени - р<0,01 для обоих показателей, при III степени - р<0,05).

Содержание антител к ЦП отличается замедленной динамикой, особенно у больных с выраженной активностью патологического процесса, что отражает серьезные нарушения в иммунной системе, полностью не купирующиеся за 30-40-дневный курс стационарного лечения. Так, при I и II степенях активности РА обнаружено достоверное снижение уровня определяемых антител (р<0,05) и недостоверное - при III степени, причем количество больных РА с повышенным уровнем антител снизилось при минимальной активности до 42,1%, при средней - до 50,0%, при максимальной - до 61,5%, а содержание биохимически неактивного ЦП - до 32,3%, 42,9% и 27,9% соответственно.

Особый интерес представляла группа больных с I степенью активности ревматоидного процесса, так как диагностика малосимптомных форм РА затруднительна. Проведенные сравнительные исследования информативности общепринятых лабораторных тестов и содержания антител к ЦП при минимальной активности РА свидетельствуют о большей диагностической значимости изучаемого показателя (см. таб. 5).

Таблица 5

Информативность лабораторных показателей у больных РА с I степенью

активности процесса (п=19).

Показатели Нормальные значения Частота выявляемое™ патологических изменений, %

соэ 2-15 мм/час 31,6

С-реактивный белок 0 47,4

Серомукоид <0,18 г/л 10,5

ЦИК 0-4 ед 47,4

РФ отрицательный 26,5

АНФ отрицательный 21,1

Лейкоциты <9,0 х 109 5,3

Гемоглобин 120-140 г/л 5,3

18 А 1,8-2,2 г/л 10,5

^ 10-12 г/л 42,1

1,0-1,2 г/л 10,5

Активность ЦП 689,7-742,3 нг/мл 42,1

Количество ЦП 889-953 нг/мл 47,4

Антитела к ЦП 0-0,086 68,4

Из приведенных в таблице данных видно, что у больных с низкой степенью активности РА и маловыраженными клиническими проявлениями заболевания повышенное содержание антител к ЦП выявляется чаще, чем

изменения традиционных лабораторных показателей.

В ходе работы выявлена достоверная зависимость между количеством антител к ЦП, содержанием ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП и клинико-анатомической формой заболевания. Повышенные значения антител к ЦП у больных с суставной формой заболевания обнаружены в 71,4% случаев (55 человек), а у больных с суставно-висцеральной формой - в 87,1% (27 человек). При поступлении в стационар у больных РА с наличием висцеритов выявлены достоверно более высокие значения уровня специфических антител (р<0,01), активности и количества ЦП (р<0,01), чем у больных с суставной формой заболевания. Получены достоверные различия по всем трем показателям у больных РА с суставными проявлениями и донорами (р<0,001) (см. таб. 6).

Таблица 6

Оксидазная активность, количество ЦП и уровень антител к нему у больных РА с различной формой заболевания.___

Контингент обследуемых N Антитела к ЦП (М±т) Активность ЦП (М+т) Количество ЦП (М+т)

Здоровые 30 0,020±0,006 716±26,3 921+32,0

поступление

Суставная форма 77 0,104±0,013 1041+52,8 1416+72,1

Суставно-висцеральная 31 0,178+0,019 1293±70,4 1776±96,2

выписка

Суставная форма 77 0,062±0,012 823±49,7 1090+67,4

Суставно-висцеральная 31 0,135+0,016 1077±64,2 1473±88,3

Перед выпиской у больных суставной формой РА отмечается достоверное, по сравнению с поступлением, снижение уровня антител к ЦП (р<0,05), активности и количества фермента (р<0,01), причем показатели активности и количества ЦП в этой группе больных в сравнении с таковыми у практически здоровых лиц отличались недостоверно (р>0,05), в то время как значения антител к ЦП имели такие различия.

У больных РА с висцеральными проявлениями обнаружено статистически значимое уменьшение активности и количества ЦП (р<0,05) и тенденция к снижению уровня изучаемых антител. Однако, несмотря на имеющееся клинико-лабораторное улучшение, изучаемые показатели были достоверно выше, чем в группе доноров (р<0,001).

Число больных с повышенными значениями антител к ЦП снизилось при суставной форме до 53,2% (41 человек), при суставно-висцеральной - до 58,1% (18 человек), а разница между активностью и количеством ЦП - с 36% до 32,4% и с 37,4% до 36,8% соответственно.

Среди больных РА с висцеритами мы выделили группу больных с поражением печени, у которых антитела к ЦП выявлялись в 100% случаев. Показатели активности и количества ЦП у этих пациентов имели более низкие значения в сравнении со всей группой больных с висцеритами, причем по содержанию иммунореактивного ЦП имелись достоверные различия (р<0,05) (см. таб. 7). Высокий уровень изучаемых антител сочетался с относительно небольшим количеством биохимически неактивного ЦП (30,8%). Обнаруженные особенности, вероятно, отражают процесс разрушения гепатоцитов на различных этапах синтеза ЦП, выхода его в кровеносное русло, активного антителообразования к данному ферменту, блокирования значительной доли ЦП антителами к нему и уменьшения содержания апо-ЦП из-за истощения резервных возможностей организма в плане стинтеза этого белка.

Таблица 7

Оксидазная активность, количество ЦП и уровень антител к нему у больных РА с поражением печени._

Контингент обследуемых N Антитела к ЦП (М±т) Активность ЦП (М±т) Количество ЦП (М±т)

Здоровые 30 0,020±0,006 716±26,3 921±32,0

Больные с поражением печени при поступлении 14 0,189+0,031 1118±67,2 1462±90,8

Больные с поражением печени при выписке 14 0,141+0,025 953+56,9 1240±85,3

В процессе лечения происходило снижение уровня антител к ЦП, содержания ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП по сравнению с поступлением, однако это уменьшение было недостоверным (см. таб. 7). Изучаемые показатели у данной группы больных при выписке имели достоверные различия с донорами (р<0,001). Содержание неактивного в ферментативном отношении ЦП снизилось до 30,1%, а доля больных с повышенным уровнем антител к ЦП до 92,9% (13 человек).

У больных РА выявлена обратная корреляционная связь между уровнем антител к ЦП и количеством эритроцитов в крови (г= -0,32, р<0,05), содержанием гемоглобина (г= -0,39, р<0,05). Все больные РА были разделены в зависимости от уровня гемоглобина и количества эритроцитов на три группы: 1) без анемии (70 человек); 2) с анемией, НЬ<115 г/л (25 человек); 3) с выраженной анемией, НЬ<90 г/л (13 человек). У больных 1 и 2 групп найдены достоверные отличия по уровню антител, содержанию ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП (р<0,05). Изучаемые показатели в 3 группе были выше, чем во 2, но эти различия недостоверны (см. таб. 8).

Таблица 8

Оксидазная активность, количество ЦП и уровень антител к нему у больных РА с различным содержанием гемоглобина. __

Контингент обследуемых N Антитела к ЦП (М+ш) Активность ЦП (М+т) Количество ЦП (М+ш)

Здоровые 30 0,020±0,006 716±26,3 921±32,0

Больные без анемии 70 0,120+0,010 1021146,7 1405+59,2

Больные с НЬ < 120 г/л 25 0,158+0,013 1198±62,6 1640±71,3

Больные с НЬ < 90 г/л 13 0,171+0,020 1326±77,2 1766± 103,7

По литературным данным, основной причиной анемии при РА является хронический воспалительный процесс, и выраженность анемии коррелирует не столько с длительностью болезни, сколько со степенью ее клинической активности. Гипоферремия вызвана не уменьшением общего количества железа в организме, а его задержкой в макрофагальной системе, которая при активном ревматоидном процессе отличается признаками гиперплазии и повышенной функции (Я.А.Сигидин, Н.Г.Гусева, М.М.Иванова, 1994). Эти данные согласуются с нашими исследованиями. Истинная железодефицитная анемия при РА чаще всего обусловлена увеличенной потерей крови через желудочно-кишечный тракт вследствие раздражающего или эрозирующего влияния глюкокортикоидов (ГК) и нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП).

Таким образом, при наличии внесуставных проявлений РА отмечается более высокий уровень антител к ЦП, причем у больных с поражением печени определяются наивысшие значения этого показателя. Выраженность анемии при РА коррелирует с уровнем антител к ЦП, активностью и количеством изучаемого фермента и отражает тяжесть заболевания.

На иммунологические и ферментативные показатели оказывают влияние не только активность РА и его клинико-анатомическая форма, но и характер течения заболевания. Повышенные уровни антител к ЦП обнаружены у 49 (69,0%) больных с медленно прогрессирующим течением РА и у 28 (75,7%) - с быстропрогрессирующим. При поступлении в стационар у больных с медленно прогрессирующим течением РА уровень антител к ЦП, активность и количество этого белка были значительно выше, чем в контрольной группе (р<0,001; р<0,01; р<0,001 соответственно) (см. таб. 9). Разница в содержании ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП составила 36,2%.

За время лечения у больных этой группы происходило достоверное снижение содержания антител, активности и количества ЦП по сравнению с первым определением (р<0,05; р<0,01; р<0,01), различия с донорами по

Таблица 9

Оксидазная активность, количество ЦП и уровень антител к нему у больных РА с различным характером течения заболевания.__

Контингент обследуемых N Антитела к ЦП (М±ш) Активность ЦП (М+ш) Количество ЦП (М±т)

Здоровые 30 0,020±0,006 716+26,3 921±32,0

поступление

Больные с медленно прогрессирующим течением 71 0,109+0,012 1038+62,5 1414±82,5

Больные с быстро прогрессирующим течением 37 0,168+0,021 1275+86,4 1759+109,2

выписка

Больные с медленно прогрессирующим течением 71 0,069+0,013 779+51,3 1031+94,1

Больные с быстро прогрессирующим течением 37 0,114±0,018 1052161,2 1448±104,51

активности и количеству были недостоверны, а по уровню антител к ЦП -достоверны (р<0,05). Число больных с повышенными значениями антител к ЦП снизилось до 50,7% (46 человек), а содержание биохимически неактивного ЦП - до 32,3%.

При поступлении на лечение у пациентов с быстропрогрессирующим течением РА выявлены более высокие значения уровня антител к ЦП (р<0,01), активности (р<0,01) и количества ЦП (р<0,01) (см. таб. 9), чем у больных с медленно прогрессирующим течением заболевания. Содержание биохимически неактивного ЦП, оказалось равным 38,1%.

При исследовании динамики показателей на фоне проводимой терапии обнаружено достоверное снижение активности и количества ЦП (р<0,05) и тенденция к снижению уровня исследуемых антител по сравнению с первым определением. Изучаемые показатели при выписке были достоверно выше, чем в группе доноров (р<0,001) (см. таб. 9). Число больных с повышенными значениями антител к ЦП снизилось до 54,1% (20 человек), а разница между активностью и количеством ЦП - до 37,6%.

Определить скорость прогрессирования и характер дальнейшего течения заболевания у каждого конкретного больного практически невозможно. Однако существует ряд факторов, которые позволяют на "вероятностной" основе дать предположительную характеристику проспективного течения РА. Это касается совершенно различных особенностей болезни и личности больного, таких как пол больных, начало заболевания в пожилом возрасте, титр РФ, наличие внесуставных проявлений, характер первичного поражения суставов, наличие осложнений,

эффективность терапии, особенно базисной, и прочих, которые следует оценивать не изолированно, а в сочетании друг с другом (Я.А.Сигидин, Н.Г.Гусева, М.М.Иванова, 1994). Мы обнаружили еще один критерий различия характера течения РА, который в совокупности с перечисленными позволит определить общую тенденцию болезни.

Показатели уровня антител к ЦП и содержания изучаемого фермента достоверно зависели от клинического варианта РА. Повышенный уровень антител к ЦП обнаружен у 21 (63,6%) больного с серонегативным и у 65 (86,7%) пациентов с серопозитивным вариантом заболевания. Выявлены достоверные различия уровня антител к ЦП, активности и общего содержания ЦП при серонегативном РА по сравнению с серопозитивным вариантом (р<0,05; р<0,01 и р<0,01 соответственно) и донорами (р<0,001) (см. таб.10).

Таблица 10

Оксидазная активность, количество ЦП и уровень антител к нему у больных РА с различным серологическим вариантом заболевания._

Контингент обследуемых N Антитела к ЦП (М±т) Активность ЦП (М+т) Количество ЦП (М1ш)

Здоровые 30 0,020+0,006 716126,3 921132,0

поступление

Больные с серонегативным РА 33 0,110±0,013 1016158,1 1373+68,5

Больные с серопозитивным РА 75 0,17310,015 1288160,3 1783+70,6

выписка

Больные с серонегативным РА 33 0,071±0,011 786151,4 1034164,8

Больные с серопозитивным РА 75 0,13210,014 1102+54,6 1505167,2

По данным литературы, существуют глубокие различия серологических вариантов РА, касающиеся клинической картины, течения, рентгенологических проявлений, морфологии, реакции на терапию, генетической предрасположенности. Ряд авторов отмечают высокое содержание иммуноглобулинов, аутоантител и активированных В-клеток в синовиальной жидкости, синовиальной ткани и периферической крови больных серопозитивным РА, в то время как серонегативный вариант течения сопровождается гиперактивацией Т-клеточного звена иммунитета (С.Ф.Кирикова, В.С.Ширинский, 1993). Полученные нами результаты достоверности различий между этими вариантами заболеваний по уровню определяемых антител, содержанию ЦП не только подтверждают данные

литературы, но и, наряду с другими тестами, дополняют иммунологические и этимологические диагностические признаки серопозитивного РА.

Исследование зависимости активности, количества ЦП и уровня антител к нему у больных РА от продолжительности болезни, рентгенологической стадии поражения суставов и степени ФНС не выявило достоверных различий.

С целью изучения влияния различных видов проводимой в условиях стационара терапии на уровень антител к ЦП нами были подобраны четыре группы больных со II степенью активности патологического процесса и сопоставимыми клинико-лабораторными данными, которым проводилось следующее лечение: 1) НПВП в сочетании с местным введением ГК (внутрисуставно, периартикулярно) - 19 человек; 2) НПВП в сочетании с системным введением ГК (15-40 мг/с) - 15 человек; 3) НПВП в сочетании с плазмаферезом - 12 человек; 4) НПВП в сочетании с базисной терапией (метотрексат, делагил) - 18 человек.

Изменение содержания антител к ЦП и фермента у больных исследуемых групп в зависимости от вида проводимой терапии представлено в таблице 11.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что наиболее выраженная положительная динамика изученных показателей наблюдалась при применении 2 и 4 лечебных комплексов. Так, у больных, принимавших НПВП в сочетании с базисной терапией отмечено значительное улучшение клинического состояния, проявившееся в достоверном изменении 9 исследуемых параметров: общей выраженности суставных болей (р<0,001), суставного индекса (р<0,01), суставного счета (р<0,001), числа припухших суставов (р<0,01), функционального индекса Ли (р<0,05), продолжительности утренней скованности (р<0,001), СОЭ (р<0,01), ЦИК (р<0,01) и ^М (р<0,05). Отмечена достоверная положительная динамика в отношении уровня антител к ЦП, активности и количества данного фермента (р<0,001). Однако эти показатели не достигли значений практически здоровых лиц (р<0,001). До начала лечения повышенные значения антител к ЦП определялись у 83,3% больных (15 человек), по окончании курса терапии - у 44,4% (8 человек). Содержание биохимически неактивного ЦП снизилось с 51,1% до 47,4%. При сравнении динамики показателей у больных данной группы выявлены достоверные различия по уровню антител к ЦП с пациентами 1 группы (р<0,01), 2 группы (р<0,05) и 3 группы (р<0,05). Статистически значимых различий в содержании ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП по окончании курса лечения у больных разных групп не наблюдалось, отмечена лишь более выраженная динамика активности и количества ЦП у больных, получавших НПВП в комплексе с базисными средствами.

Назначение 2 лечебного комплекса привело к достоверным изменениям при выписке из стационара по 8 параметрам: общей выраженности

Таблица 11

Динамика клинико-лабораторных показателей у больных РА со II степенью активности в зависимости от вида проводимой терапии._

Показатели НПВП+ГК местно N=19 НПВП+ГК системно N=15 НПВП+ плазмаферез N=12 НПВП+базисные средства N=18

поступление выписка поступление выписка поступление выписка поступление выписка

Общая выраженность суставных болей 2,3710,21 1,61±0,17 2,5310,27 1,3910,15 2,3110,27 1,5610,18 2,6410,24 1,3610,12

Суставной индекс 21,03±1,8 15,04+1,6 22,73±2,4 15,4612,1 21,8612,5 14,7312,3 23,5112,1 14,8111,7

Суставной счет 14,911,5 10,911,3 18,511,9 11,511,6 15,411,8 10,5+1,4 19,1+1,6 11,111,5

Число припухших суставов 9,24±1,0 6,38±0,9 10,08±1,3 6,6911,3 9,46±1,5 6,911,3 10,1911,1 6,0111,0

Индекс припухлости 14,02±1,3 10,9411,2 15,67±1,6 10,4311,5 13,811,8 11,1811,6 15,1211,4 11,4211,2

Функциональный индекс Ли 12,51+1,5 9,26+1,2 14,98±1,9 8,9811,6 14,3711,9 9,1211,5 15,6211,6 11,0911,3

Продолжительность утренней скованности 2,3610,15 , 1,58±0,12 2,4310,18 1,5110,17 2,2810,2 . 1,3710,18 2,6110,17 1,6810,15

СОЭ (мм/ч) 30,4±2,8 20,3±2,3 37,513,1 22,512,7 32,1±3,2 18,912,8 33,812,9 19,312,2

ЦИК (ед.) б,73±0,6 6,52±0,5 5,6210,6 3,83±0,4 б,13±0,7 4,2310,5 6,4±0,4 4,4910,5

^А (г/л) 2,12±0,09 2,07±0,08 2,01+0,08 1,9210,09 1,8±0,12 2,0310,1 1,9610,1 2,2Ю,11

Ы О (г/л) 12,610,9 12,1±1,1 10,710,9 11,211,1 11,811,3 10,711,0 12,411,0 11,610,8

М (г/л) 1,56+0,9 1,3410,7 1,6810,09 1,4310,1 1,2010,7 1,0510,8 1,6510,1 1,3710,09

Активность ЦП 1138158,7 975±51,4 1185155,2 942,147,0 1120152,6 968142,5 1207153,5 902143,7

Количество ЦП 1681 ±85,2 1423±79,4 1755181,4 1356176,1 1623173,8 1382167,1 1824179,3 1315175,8

Антитела к ЦП 0,12710,013 0,098±0,010 0,14210,012 0,10310,011 0,13310,010 0,10510,009 0,14710,011 0,07110,008

суставных болей (р<0,001), суставному индексу (р<0,05), суставному счету (р<0,01), индексу припухлости (р<0,05), функциональному индексу Ли (р<0,05), продолжительности утренней скованности (р<0,001), СОЭ (р<0,01) и ЦИК (р<0,05). Кроме того, произошло снижение уровня специфических антител (р<0,05), активности и количества ЦП (р<0,01). Отмечено уменьшение содержания биохимически неактивного ЦП - с 48,1% до 43,9% и доли больных с повышенными значениями антител к ЦП с 80% (12 человек) до 53,3% (8 человек).

Таким образом, при анализе эффективности различных сочетаний лечебных мероприятий наиболее выраженные изменения как уровня антител к ЦП, так и традиционных клинических и лабораторных показателей наблюдалось в группе больных, получавших комбинацию НПВП с базисными средствами, что говорит о существовании параллелизма между динамикой изучаемых антител и клиническим состоянием пациентов.

Одновременное применение иммуноферментного и биохимического методов позволило провести количественное определение как суммарного (иммунореактивного) ЦП, так и той части белка, которая обладает оксидазной активностью. У больных РА увеличивается содержание биохимически неактивного ЦП по сравнению с донорами. Выработка антител к ЦП, окислительная модификация этого фермента и прямое ингибирующее действие АФК, взаимодействие с миелопероксидазой, метаболические нарушения, сдвиг рН в кислую сторону, присутствие высоких концентраций металлов в очагах воспаления и плазме крови являются возможными причинами угнетения оксидазной активности ЦП, приводящей к недостаточности внеклеточной антиоксидантной защиты при ревматоидном артрите.

Выявление высокого уровня антител к ЦП и значительного содержания биохимически неактивного ЦП, по-видимому, могут служить показанием к назначению антиоксидантной терапии - внутрисуставному и внутривенному введению экзогенного человеческого церулоплазмина.

Определение антител к ЦП может служить не только показателем активности, клинико-анатомической формы, характера течения, клинического варианта РА, но и дополнительным критерием эффективности проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Применение иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов на основе церулоплазмина в иммуноферментном анализе позволило впервые выявить специфические антитела у больных РА и усовершенствовать иммунодиагностику данного заболевания.

2. Антитела к церулоплазмину вызывают снижение его оксидазной активности вследствие нарушения индуцированного взаимодействия энзима и субстрата.

3. У больных РА повышено содержание биохимически неактивного церулоплазмина по сравнению с донорами, этот показатель возрастает с увеличением активности патологического процесса.

4. Уровень антител к церулоплазмину у больных РА зависит от активности, характера течения, клинико-анатомической формы и клинического варианта заболевания.

5. Наиболее высокие значения антител к церулоплазмину выявлены у больных РА с III степенью активности, быстропрогрессирующим течением, суставно-висцеральной формой и серопозитивным вариантом заболевания. Высокие уровни антител к церулоплазмину коррелируют с наличием у больных РА поражения печени и выраженностью анемии.

6. Динамика антител к церулоплазмину, наблюдаемая на фоне проводимого лечения, позволяет использовать данный показатель в качестве дополнительного критерия эффективности терапии больных РА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты на основе церулоплазмина рекомендуется использовать в диагностических целях для выявления специфических антител у больных РА иммуноферментным методом исследования.

2. Средние показатели уровня антител к церулоплазмину в крови здоровых лиц, определяемые как М±ш, равны 0,020+0,006 е.о.п.

3. Для определения степени активности РА рекомендуется использовать показатели уровня антител к церулоплазмину, при этом I степени активности соответствуют значения экстинкции в диапазоне 90-119 е.о.п., II степени активности - 120-159 е.о.п. и III степени - 160 е.о.п. и выше.

4. Выявление уровня антител к церулоплазмину у больных РА выше 0,150 е.о.п. при отсутствии его отчетливого снижения в течение 4 недель стационарного лечения может свидетельствовать о наличии внесуставных поражений и быстропрогрессирующем течении заболевания.

5. Для определения содержания ферментативно-активного церулоплазмина рекомендуется использовать биохимический метод H.A.Ravin в модифицикации Э.В.Тена с обязательным применением в качестве стандарта диагностического человеческого церулоплазмина. Средние показатели содержания ферментативно-активного церулоплазмина в крови здоровых лиц, определяемые как М±т, равны 716±26,3 нг/мл.

6. В процессе стационарного лечения больных РА рекомендуется использовать определение антител к церулоплазмину в качестве критерия эффективности проводимой терапии.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Пивные дрожжи: возможность применения в комплексном лечении больных ревматическими заболеваниями // Юбилейная конференция, посвященная 70-летию ассоциации ревматологов России и 40-летию института ревматологии РАМН. Тезисы докладов. - Москва, 1998. -С. 14. (соавт. Гонтарь И.П., Казанкова Л.Я., Емельянова О.И., Сущук Е.А., Зотина М.В., Маслакова Л.А., Красильников А.Н., Емельянов Н.И.).

2. Применение пивных дрожжей в комплексном лечении больных ревматоидным артритом // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва, 1998. - С.359-360. (соавт. Казанкова Л.Я., Фофанова H.A., Деревянко Л.И., Александров A.B., Боброва Л.Н., Сущук Е.А., Маслакова Л.А., Кочнева Л.И., Зборовский А.Б.).

3. Определение антител к церулоплазмину у больных ревматоидным артритом с помощью магнитосорбентов // Актуальные проблемы современной ревматологии. Тезисы докладов научной конференции. — Волгоград, 1999. - С.76. (соавт. Гонтарь И.П., Сычева Г.Ф., Александров A.B.).

4. Возможность применения иммобилизированных магнитосорбентов для определения антител к каталазе и церулоплазмину у больных ревматоидным артритом // Материалы конференции студентов и молодых ученых BMA. - Волгоград, 1999. - С.34. (соавт. Зотина М.В., Александров A.B.).

5. Взаимосвязь иммунных и энзимологических факторов при ревматоидном артрите // VI Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва, 1999. - С.399-400. (соавт. Гонтарь И.П., Зборовская И.А., Александров A.B., Сычева Г.Ф., Емельянова О.И., Зотина М.В., Сущук Е.А., Зборовский А.Б.).

6. Подбор оптимальных условий определения антител к церулоплазмину при системной красной волчанке и ревматоидном артрите // Материалы юбилейной конференции, посвященной 15-летию НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН. - Волгоград, 2000. — С. 126127. (соавт. Гонтарь И.П., Сущук Е.А., Красильников А.Н., Сычева Г.Ф.).

7. Динамика некоторых показателей состояния антиоксидантной системы у больных ревматоидным артритом в зависимости от висцеральных поражений. Материалы юбилейной конференции, посвященной 15-летию НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН. -Волгоград, 2000. - С.108. (соавт. Красильников А.Н., Емельянова О.И., Сычева Г.Ф., Новикова О.В., Гонтарь И.П.).

8. Энзиматическая активность антиоксиданта церулоплазмина и определение антител к нему при ревматоидном артрите // Материалы

юбилейной конференции, посвященной 15-летию НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН. - Волгоград, 2000. - С.79. (соавт. Зборовский А.Б., Александров A.B., Гонтарь И.П.).

9. Необходимость проведения мониторинга иммунологических показателей у больных ревматическими заболеваниями // Материалы юбилейной конференции, посвященной 15-летию НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН. - Волгоград, 2000. - С.68-69. (соавт. Гонтарь И.П., Александров A.B., Сычева Г.Ф., Зотина М.В., Сущук Е.А., Маслакова JI.A., Емельянова О.И.).

10. Комплексный подход к изучению церулоплазмина у больных ревматоидным артритом // Материалы 58-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 65-летию BMA. - Волгоград, 2000. - Т. 56. - Вып. 2. - с.69. (соавт. Александров A.B., Зотина М.В.).

11. Антитела к коллагену I, II, III при ювенильном ревматоидном артрите // VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов. - Москва, 10-14 апреля 2000 г. - С.239. (соавт. Гонтарь И.П., Новикова О.В., Александров A.B., Маслакова JI.A., Емельянов Н.И., Чернова С.И., Зборовский А.Б.).

12. Показатели иммунного ответа к церулоплазмину в диагностике ревматических заболеваний // Научно-практическая ревматология. -

2000. -№4. - С.38. (соавт. Гонтарь И.П., Сущук Е.А., Зборовский А.Б.).

13. Изучение взаимосвязи этимологических и иммунных механизмов в развитии ревматоидного артрита, системной красной волчанки и системной склеродермии // Материалы научно-практической конференции "Актуальные проблемы внутренней патологии", посвященной 80-летию со дня рождения профессора П.Д.Синицына. -Челябинск, 2001. - С.154-158. (соавт. Гонтарь И.П., Александров A.B., Зотина М.В., Сущук Е.А., Язид Аль Раави, Красильников А.Н., Зборовская И.А.).

14. Гуморальный иммунный ответ к церулоплазмину у больных ревматоидным артритом // Материалы Пироговской межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых. Вестник Российского Государственного медицинского университета. — Москва,

2001. - №2 (12). - С.31. (соавт. Сычева Г.Ф., Гонтарь И.П.).

15. Антителогенез к ферментам антиоксидантной системы у больных ревматоидным артритом // Научно-практическая ревматология: Тезисы III Съезда ревматологов России. - Рязань, 2001. - №3. - С.27. (соавт. Гонтарь И.П., Александров A.B., Зотина М.В., Сычева Г.Ф., Язид Аль Раави, Красильников А.Н., Зборовская И.А.)

16. Определение ферментативно-активного. иммунореактивного церулоплазмина и антител к нему у больных ревматоидным артритом // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных

работ. - Волгоград, 2001. - С.51-53. (соавт. Гонтарь И.П., Зборовская И.А., Сущук Е.А., Красильников А.Н., Трубенко Ю.А., Мызгин В.Н.).

17. Integrative approach to study of immune response to ceruloplasmin in rheumatic diseases // Annals of Rheumatic Diseases: Abstract of European League Against Rheumatism Congress. - Czech Republic, 2001. - Vol. 60. -Supp. 1. - P. 100. (Sushchuk E.A., Gontar I.P., Zborovsky A.B.).

Подписано в печать 5.01.02 г. Тираж 100 экз. Бумага офсетная №1 Отпечатано на Kyocera FS-680 400066, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Ревматоидный артрит - одно из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний суставов, частота которого в популяции достигает 1% (129,156).

Характерным для РА является склонность к неуклонному прогрессировашио и хронизации, что существенным образом ухудшает не только качество жизни больного и членов его семьи, но и снижает трудовые возможности общества, приводя к значительным экономическим потерям. Кроме того, высокая социальная значимость заболевания обусловлена его широкой распространенностью и значительным ежегодным приростом новых случаев, поражением людей работоспособного возраста, ранней ин-валидизацией больных за счет прогрессирующей деструкции суставов и тяжелых висцеральных поражений (134,102,73).

Неуклонно прогрессирующий характер РА ставит перед врачами задачу возможно более ранней диагностики его, когда терапия наиболее эффективна. Однако распознавание РА на ранней стадии представляет значительные трудности. Большинство исследователей отмечают многообразие клинических проявлений этого страдания. По настоящее время не найдено и строго специфичного для РА лабораторного теста. Только сочетание многих клинических и лабораторных признаков может оказать помощь в диагностике этого заболевания (192,21). Поэтому и сейчас продолжается поиск методов, позволяющих дифференцировать РА среди множества воспалительных и дегенеративных болезней опорно-двигательного аппарата.

В последнее время значительно возрос интерес к исследованию роли реакций свободнорадикального окисления в развитии патологического процесса при РА. Образующиеся при этом заболевании в больших количествах иммунные комплексы стимулируют хемотаксис нейтрофилов и реакции фагоцитоза (16,17). Процесс фагоцитоза сопровождается активацией метаболизма этих клеток, высвобождением большого числа активных радикалов кислорода, которые могут оказывать патогенное воздействие на биомолекулы и структуры клетки непосредственно либо инициируя процессы перекисного окисления липидов, приводя к повреждению самих нейтрофилов с последующим выходом лизосомальных ферментов, деградации коллагена, гиалуроновой кислоты и к повреждению соединительной ткани (112,143,116,138, 165,133,137,114,9).

Сдерживающим фактором по отношению к лавинообразному процессу свободнорадикального окисления является система ангиокислительной защиты, включающая в себя ферменты-антиоксиданты и вещества неферментной природы. При патологических состояниях нарушается равновесие между образованием АФК и их нейтрализацией. Одним из важных звеньев системы антирадикальной защиты и основным внеклеточным антиоксидантом является церулоплазмин. Показатели активности различных ферментов антиоксидантной системы при РА исследовались многими авторами (75,111,128,9,126,138,122). Особый интерес представляет выявление факторов, вызывающих снижение или увеличение содержания энзимов различных метаболических путей, а также патогенетическое значение таких изменений.

Учитывая характерные иммунологические нарушения при РА (88,197) и участие АФК и ПОЛ в патогенезе этого заболевания (126,138,122), можно предположить, что функциональная несостоятельность ферментов антиоксидантной системы, в том числе и церулоплазмина, обусловлена как гиперпродукцией антител к этим ферментам, так и влиянием окислительных процессов и метаболических нарушений.

Определение антител к церулоплазмину и выяснение их влияния на активность этого фермента у больных РА как с позиций диагностики активности и формы патологического процесса, изучения отдельных звеньев патогенеза заболевания, так и возможности коррекции нарушений антиоксидантного статуса, контроля за эффективностью проводимой терапии представляет собой актуальную задачу.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью настоящего исследования является улучшение качества иммунологической диагностики РА и контроля за эффективностью терапии с помощью иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами на основе церулоплазмина.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить иммобилизированную форму церулоплазмина, изучить ее физико-химические свойства.

2. Адаптировать иммуноферментный метод исследования с использованием иммобилизированной формы ЦП к определению специфических антител.

3. Изучить содержание антител к ЦП у больных РА в зависимости от активности, характера течения, клинико-анатомической формы и серологического варианта заболевания.

4. Исследовать содержание ферментативно-активного и иммунореактивного ЦП у больных РА в зависимости от клинических особенностей заболевания и уровня антител к ЦП.

5. Изучить возможность использования определения уровня антител к ЦП в качестве критерия эффективности проводимой терапии у больных РА.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Впервые для иммунодиагностики РА была создана и применена в иммуноферментном методе исследования иммобилизированная гранулированная форма церулоплазмина с оптимальной концентрацией антигена. Определены соответствующие условия иммобилизации фермента, позволяющие сохранить его биологические функции.

В ходе работы в сыворотках больных РА выявлены антитела к ЦП. Показано, что их уровень у больных РА достоверно отличается от здоровых лиц и больных остеоартрозом. Выявлена зависимость количества антител к изучаемому ферменту от активности, характера течения, клинико-анатомической формы и серологического варианта заболевания. Обнаружена достоверная обратная корреляция между содержанием антител к ЦП и количеством эритроцитов, гемоглобина, а также прямая корреляция с поражением печени у больных РА.

Проведена комплексная оценка трех показателей: ферментативной активности, количества ЦП и содержания антител к нему у больных РА и здоровых лиц.

Одновременное применение иммуноферментного и биохимического методов исследования позволило провести количественное определение как суммарного (иммунореактивного) ЦП, так и той части белка, которая обладает ферментативной активностью, обнаружить определенную долю биохимически неактивного ЦП, которая возрастала с увеличением активности заболевания, и выявить возможные причины угнетения оксидазной активности ЦП.

Получено, что максимальное содержание антител к ЦП отмечается у больных с высокой степенью активности, быстропрогрессирующим течением, суставно-висце-ральной формой и серопозитивным вариантом РА. Установлена возможность использования определяемого показателя в качестве критерия эффективности проводимой терапии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Использование иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами на основе церулоплазмина позволит повысить качество иммунологической диагностики РА, особенно на ранних стадиях заболевания, что имеет важное значение для своевременной, адекватной терапии больных. Определение антител к церулоплаз-мину может быть использовано в качестве дополнительного теста в комплексной диагностике РА для характеристики активности, течения, формы заболевания, серологического варианта, прогноза, а также критерия эффективности проводимой терапии.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ Метод определения антител к ЦП в сыворотке крови больных ревматоидным артритом с помощью иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрен в Муниципальном медицинском учреждении «Клиническая больница скорой медицинской помощи № 25» г. Волгограда.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ Возможность использования определения антител к ЦП с помощью иммунофер-ментного метода анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами в качестве дополнительного теста для диагностики степени активности, характера течения, формы, серологического варианта РА, оценки эффективности проводимой терапии.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из которых одна - в зарубежной литературе.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были представлены на симпозиуме EULAR (Прага, Чешская республика, 2001г.), юбилейной конференции, посвященной 70-летию ассоциации ревматологов России и 40-летию Института Ревматологии РАМН (Москва, 1998 г.), на V и VII Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998 и

2000 гг.), юбилейной конференции, посвященной 15-летию НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН (Волгоград, 2000 г.), ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградской медицинской академии.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами, 10 рисунками, 4 выписками из истории болезни. Указатель литературы содержит 304 источника, в том числе 201 отечественный и 103 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Применение иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов на основе церулоплазмина в иммуноферментном анализе позволило впервые выявить специфические антитела у больных РА и усовершенствовать иммунодиагностику данного заболевания.

2. Антитела к церулоплазмину вызывают снижение его оксидазной активности вследствие нарушения индуцированного взаимодействия энзима и субстрата.

3. У больных РА повышено содержание биохимически неактивного церулоплазмина по сравнению с донорами, этот показатель возрастает с увеличением активности патологического процесса.

4. Уровень антител к церулоплазмину у больных РА зависит от активности, характера течения, клинико-анатомической формы и клинического варианта заболевания.

5. Наиболее высокие значения антител к церулоплазмину выявлены у больных РА с III степенью активности, быстропрогресснрующим течением, суставно-висцеральной формой и серопозитивным вариантом заболевания. Высокие уровни антител к церулоплазмину коррелируют с наличием у больных РА поражения печени и выраженностью анемии.

6. Динамика антител к церулоплазмину, наблюдаемая на фоне проводимого лечения, позволяет использовать данный показатель в качестве дополнительного критерия эффективности терапии больных РА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты на основе церулоплазмина рекомендуется использовать в диагностических целях для выявления специфических антител у больных РА иммуноферментным методом исследования.

2. Средние показатели уровня антител к церулоплазмину в крови здоровых лиц, определяемые как М±т, равны 0,020±0,006 е.о.п.

3. Для определения степени активности РА рекомендуется использовать показатели уровня антител к церулоплазмину, при этом I степени активности соответствуют значения экстинкции в диапазоне 90-119 е.о.п., II степени активности -120-159 е.о.п. и III степени -160 е.о.п. и выше.

4. Выявление уровня антител к церулоплазмину у больных РА выше 0,150 е.о.п. при отсутствии его отчетливого снижения в течение 4 недель стационарного лечения может свидетельствовать о наличии внесуставных поражений и быстропрогрессирующем течении заболевания.

5. Для определения содержания ферментативно-активного церулоплазмина рекомендуется использовать биохимический метод H.A.Ravin в модифицикации Э.В.Тена с обязательным применением в качестве стандарта диагностического человеческого церулоплазмина. Средние показатели содержания ферментативно-активного церулоплазмина в крови здоровых лиц, определяемые как М±ш, равны 716±26,3 нг/мл.

6. В процессе стационарного лечения больных РА рекомендуется использовать определение антител к церулоплазмину в качестве критерия эффективности проводимой терапии.