Автореферат и диссертация по медицине (14.01.22) на тему:Клинико-диагностическое значение определения антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе у больных системной склеродермией с использованием иммобилизированных форм ферментов

На правах рукописи

ЕМЕЛЬЯНОВ Николай Николаевич

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЕ И СУПЕРОКСИДЦИСМУТАЗЕ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ФОРМ ФЕРМЕНТОВ

(14.01.22 - ревматология)

1 О НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград 2011

4859147

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической и экспериментальной ревматологии РАМН, Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор И.А. Зборовская

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор П.А. Чижов

доктор медицинских наук Б.А. Лемперт

ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ

Зашита состоится «_» _2011 г. в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208,008.02 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г.Волгоград, пл.Павших борцов, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета д.м.н., профессор

А.Р.Бабаева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Системная склеродермия (прогрессирующий системный склероз) -прогрессирующее полисиндромное заболевание с характерными изменениями кожи, опорно-двигательного аппарата, внутренних органов (легких, сердца, пищеварительного тракта, почек) и распространенными вазоспастическими нарушениями по типу синдрома Рейно, в основе которых лежат поражение соединительной ткани с преобладанием фиброза и сосудистая патология по типу облитерирующего эндартериолита.

Преимущественное поражение лиц трудоспособного возраста при данном заболевании, высокий процент инвалидизации порождают большие экономические потери, включающие высокую стоимость диагностики и лечения, исключение больных из сферы производства, затраты на социальное обеспечение работающих пациентов и инвалидов (Фоломеева О.М. и соавт., 2004, Лшоп ЭЛ. ег а!., 2006).

В настоящее время исследованы патогенетические механизмы системной склеродермии (ССД), детально изучены клиника и эволюция заболевания, разработаны основы диагностики и классификация, создана программа патогенетической терапии с дифференцированным использованием антифиброзных,

иммуномодулирующих и сосудистых средств (Гусева Н.Г., 2007).

Все же прогноз при данной патологии зачастую неблагоприятный. Согласно имеющейся статистике, 40% больных с острым и подострым течением погибает в течение первых 5 лет заболевания, 70% - в течение 10 лет (Эрдес Ш. и соавт., 2003, Гусева Н.Г.,2007). В связи с этим, актуальными задачами для клиницистов являются своевременная постановка диагноза, назначение адекватной терапии и объективная оценка ее эффективности. Все это даст возможность модифицировать болезнь и повлиять на ее исход.

Как показали новейшие разработки в иммунодиагностике ревматических заболеваний, иммуноферментные методы анализа (ИФА) с использованием магнитоуправляемых сорбентов на основе антигенов нуклеиновой, липидной и белковой природы значительно облегчают задачи ревматолога. Неоспоримые преимущества метода заключаются, в первую очередь, в повышении стабильности иммобилизированного биополимера. Помимо этого, иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-

активной зоне, повышая чувствительность твердофазных методов анализа. Включение магнитного материала в гранулы дает возможность ускорить манипуляции на всех этапах исследования, улучшая качественные характеристики определений и увеличивая число обрабатываемых проб. И, наконец, повторное использование сорбента после регенерации ведет к значительному экономическому эффекту (Гонтарь И.П., 2006).

В настоящее время продолжается поиск маркеров системного склероза В этом свете представляют интерес результаты исследования роли активных форм кислорода (АФК) в патогенезе ССД. Основное значение свободных радикалов при данной патологии связано с их способностью повреждать белки, липиды, ДНК, придавая им свойства аутоантигенов и провоцируя выработку антител (AT). Достигается это усилением выработки АФК (перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.), которые, в свою очередь, приводят к деполимеризации гиалуроновой кислоты, окисляют белки, вызывают перекисное окисление липидов, стимулируют высвобождение протеолитических ферментов и вазоактивных аминов. Считают, что именно АФК ответственны за процессы инактивирования и трансформации ферментов, угнетения функциональной активности иммунокомпетентных клеток (Зборовская И.А., 2005, Tikly М. et al., 2006).

Естественным препятствием патологическому воздействию АФК на собственные ткани является антиоксидантная система (АОС) организма, включающая в себя ферментные и неферментные звенья. Основными энзимными компонентами АОС считают глутатионпероксидазу (ГП), супероксиддисмутазу (СОД), глутатионредукгазу (ГР), каталазу (КАТ) и церулоплазмин (ЦП). Они нейтрализуют высокоактивные супероксидные анионы, перекись водорода, гидроперекиси жирных кислот, предотвращая накопление особо токсичных вторичных продуктов перекисного окисления липидов.

Согласно данным ряда авторов, при ревматической патологии наблюдается накопление вторичных токсических продуктов свободнорадикальных реакций вследствие дисбаланса между продукцией и утилизацией АФК. В качестве одной из причин функциональной недостаточности энзимов-антиоксидантов при аутоиммунных заболеваниях считают образование антител к ним (Сущук Е.А., 2002, Зборовская И.А., 2005).

Иммобилизированные магнитосорбенты на основе КАТ, ГП и ЦП уже были использованы для усовершенствования

иммунодиагностики ССД, что позволяет решать вопросы ранней диагностики заболевания благодаря высокой чувствительности и специфичности данного метода ИФА (Петрова Н.В., 2001, МосквитинаО.В., 2009).

Из всей группы ферментов АОС наименее изученным объектом иммунного ответа при ССД являются ГР и СОД. В связи с этим, представляется актуальным исследовать закономерности антителообразования к ГР и СОД при системной склеродермии, используя иммобилизированную форму ферментов. Высокая чувствительность модифицированной методики ИФА дает возможность усовершенствовать способы диагностики системного склероза, выяснить отдельные механизмы патогенеза данного заболевания и обозначить перспективы патогенетической терапии.

Цель работы

Целью настоящего исследования являлось усовершенствование иммунологической диагностики и оценки эффективности лечения системной склеродермии с помощью иммобилизированных форм супероксидцисмутазы и глутатионредукгазы.

Основные задачи исследования

1.Получить иммобилизированные формы супероксиддисмутазы и глутатионредукгазы, изучить их физико-химические свойства;

2.Адаптирова,п, иммуноферментный метод анализа с использованием иммобилизированных супероксиддисмутазы и глутатионредукгазы к изучению образования антител к этим ферментам;

3.Изучить активность супфоксиддисмутазы и глутатионредукгазы и содержание антител к этим ферментам у больных системной склеродермией и здоровых лиц. Исследовать данные показатели и корреляционные связи между ними у больных ССД в зависимости от активности, стадии, длительности, характера течения заболевания и висцеральных поражений;

4.Изучить динамику антителообразования к супероксиддисмутазе и глутатионредуктазе в процессе стационарного лечения.

Научная новизна работы

Впервые для диагностики ССД созданы и применены в варианте иммуноферментного метода анализа иммобилизированные препараты

супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы. В ходе работы в сыворотках крови больных ССД обнаружены АТ к СОД и ГР. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотке крови здоровых лиц. Выявлена достоверная корреляция между содержанием АТ к ГР и СОД и активностью патологического процесса Установлено, что поражение сердечно-сосудистой системы и легких при ССД сопровождается максимальными значениями исследуемых антител. Выявлены обратные корреляционные связи между активностью ГР и СОД и антителами к ним. Определена способность исследованных показателей к изменению под влиянием проводимой терапии, что обеспечивает возможность оценки ее эффективности.

Практическая ценность

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к СОД и ГР на основе иммобилизированных магнитосорбентов. Выявление АТ к СОД и ГР в предложенной методике ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики ССД, оценки активности патологического процесса и прогнозирования клинического варианта заболевания. Обнаружение АТ к СОД и ГР на начальных сроках заболевания позволяет использовать их определение для ранней диагностики ССД. Динамика изученных показателей дает возможность судить об эффективности проводимой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

На защиту выносится положение о возможности определения антител к СОД и ГР с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммобилизированных магнитосорбентов у больных ССД. Исследование антител к СОД и ГР может быть использовано в качестве дополнительных тестов для диагностики ССД, выделения клинических вариантов заболевания и уточнения степени активности патологического процесса. Динамика этих показателей может служить для оценки эффективности проводимой терапии.

Внедрение в практику

Методы определения антител к СОД и ГР с помощью иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в МУЗ ГКБ №25 г.Волгограда.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 18 печатных работах, из которых 11 - в центральной, 1 - в международной и 6 - в местной печати, в том числе 9 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ (2009 -2011 г.г.); III Национальном конгрессе терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации», Москва 5-7 ноября

2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной ¿медицины», Чита, 2008 г.; IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении», 21-22 апреля

2009 г.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, в которой изложены современные аспекты иммунопатогенеза системной склеродермии, участии в ее развитии активных форм кислорода и антиоксидантной системы; части II - собственных исследований, состоящей из 6 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методики исследования, полученные результаты, их обсуждение, выводы, практические рекомендации и приложения. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 5 рисунками, приведено 2 выписки из историй болезни. Указатель литературы содержит 244 источника, в том числе 97 - отечественных и 147 -зарубежных.

Клиническая характеристика больных

Под наблюдением находилось 40 больных системной склеродермией, соответствовавших критериям включения в обследование: 38 женщин (95,0%) и 2 мужчин (5,0 %) в возрасте от 18 до 65 лет.

Диагноз ставился по критериям Американской ревматологической ассоциации (1980 г.) в соответствии с рабочей классификацией Н.Г.Гусевой (1975 г.).

Из общего числа обследованных - 30 человек (75%) относились к социально активному населению. Средний возраст пациентов -38±3,3 лет - приближен к опубликованным статистическим данным о возрастной группе при ССД, что дает возможность экстраполировать свойства выборочной совокупности на генеральную (рис.1).

Средняя продолжительность болезни в исследуемой группе составила 7,7±4,16 лет. Стаж заболевания до 5 лет отмечался у 17 пациентов (42,5%), 6-10 лет - у 10 (20,0%), 11-15 лет - у 9 (22,5%), свыше 15 лет - у 4 (10,0%). Среди наблюдаемых нами больных инвалидность по данному заболеванию имели 23 человека (57,5%), из них 18 человек - трудоспособного возраста.

Рисунок 1. Распределение больных в зависимости от возраста начала болезни.

По степени активности патологического процесса больные распределились следующим образом: I степень была диагностирована у 16 человек (40,0%), II степень - у 23 человек (57,5%), III степень - у 1 (2,5%) пациента.

У 16 больных (40,0%) течение заболевания расценено как хроническое (медленно прогрессирующее), у 23 (57,5%) - как подострое (умеренно прогрессирующее), у 1 (2,5%) - как острое

(быстро прогрессирующее). Ввиду малого количества больных с острым течением и максимальной активностью, пациенты с острым и подострым течением, II и III степенями активности в дальнейшем будут рассматриваться в одной группе.

При хроническом течении ССД у подавляющего большинства больных (87,5%) наблюдалась низкая активность заболевания. Подострое течение в 78,3% случаев сопровождалось умеренной активностью заболевания. Максимальная степень активности патологического процесса имела место у пациентки с острым течением (рис.2).

Рисунок 2. Зависимость характера течения от активности ССД.

I (начальная) стадия заболевания диагностирована у 10 (25,0%) больных, II (генерализованная) - у 26 (65,0%), III (терминальная) - у 4 (10,0%) пациентов.

Среди пациентов с продолжительностью заболевания менее 5 лет стадия начальных проявлений была диагностирована в 64,7% случаев (11 пациентов), II стадия - у 35,3% больных. У лиц со стажем болезни 6-10 лет это соотношение составило 50,0% (I стадия) против 50,0% (II стадия). При продолжительности заболевания 11-15 лет в 88,9% случаев (8 больных) наблюдалась стадия выраженных изменений (II), у одного пациента- III стадия. В группе больных с более чем 15-летним стажем болезни в 75,0% случаев была диагностирована II стадия (3 больных), а в 25,0% - III (терминальная) стадия заболевания. Приведенные данные демонстрируют

сравнительно быструю генерализацию процесса при ССД с развитием необратимых изменений у некоторых больных уже в первые 5 лет 1 болезни (рис. 3).

□ 1ст. а 11 ст. ЭIII ст.

<5 6-10 11-15 >15

Продолжительность заболевания (лет)

Рисунок 3. Зависимость стадии ССД от длительности заболевания.

Клиническая картина ССД в опытной группе отличалась полиморфностью и полисиндромностью, отражая системный характер заболевания. Однако изменения кожи, являющиеся одним из ведущих диагностических признаков заболевания, определялись у всех обследованных больных. Наиболее частыми проявлениями были маскообразность лица, склеродактилия, гиперпигментация и 1 выпадение волос.

В зависимости от степени распространенности изменений кожи у 27 (67,5%) больных была диагностирована лимитированная форма ССД, у 13 (32,5%) - диффузная. Последняя, как правило, I ассоциировалась с подострым и острым течением заболевания.

Суставной синдром был диагностирован у всех пациентов (100,0%), мышечный - у 2 больных (5,0%), создавая наряду с кожными проявлениями и синдромом Рейно картину характерного I для ССД периферического симптомокомплекса. Поражение опорно-двигательного аппарата включало полиартриты - 19 пациентов (47,5%), полиартралгии - 10 (25,0%), миозиты и миалгии - 16 (40,0%), остеолиз - 3 {1,5%), кальциноз мягких тканей - 3 (7,5%).

Вторым по распространенности проявлений ССД в исследуемой группе был синдром Рейно. Он встречался у 32

пациентов (80,0%), при этом наблюдалась как типичная локализация вазоспастических проявлений (кисти, стопы), так и редкая - губы, кончик языка. Дигитальные ишемические нарушения имели место у 5 больных (12,5%).

Из висцеральной патологии наиболее часто (в 80,0% случаев) наблюдалось поражение ЖКТ в виде эзофагита, гастродуоденита, колита, гипотонии пищевода и кишечника, грыжи пищеводного отверстия диафрагмы. Диагноз во всех случаях был подтвержден данными рентгенологического и/или эндоскопического исследования.

Особое внимание уделялось исследованию сердечно-сосудистой системы, поскольку ее поражение является, по мнению ряда авторов, основной причиной внезапной смерти больных ССД. Кардиальная патология выявлялась у 20 пациентов (50,0%) и была представлена в основном ишемической болезнью сердца (стенокардия напряжения и покоя, острый инфаркт миокарда в анамнезе) - 13 человек. Диагноз стенокардии выставлялся клинически при наличии типических ангинозных приступов, а у ряда пациентов верифицирован пробой с физической нагрузкой (ВЭП, тредмил-тест). В 10,0% случаев при ЭхоКГ-исследовании выявлялось нарушение сократительной способности миокарда (снижение ФВ менее 55% по Тейкхольцу), обусловленное некоронарогенным кардиосклерозом. У 4 человек (20,0%>) обнаруживались явления перикардита в виде утолщения оболочки и наличия небольшого количества жидкости, у 3 человек -пролапс митрального клапана (15,0%).

Легочные проявления (базальный пневмофиброз, адгезивный плеврит, легочная гипертензия) встречались в 90,0% случаев (36 пациентов). У 10 человек (25,0%) поражение легких было бессимптомным и выявлялось при рентгенологическом обследовании, иногда предшествуя кожным проявлениям и синдрому Рейно. У остальных пациентов отмечалась скудность симптоматики на начальной стадии заболевания и манифестирование легочного синдрома в стадии генерализации процесса, а в ряде случаев - в терминальной стадии.

Поражение нервной системы отмечалось у 12 пациентов (30,0%) и включало явления церебрального васкулита - у 8 больных (66,7%) и сенсорной невропатии (чаще в рамках полиневритического синдрома) - у 4 больных (33,3%). Церебральные проявления были документированы неврологом при осмотре и/или специальном обследовании (РЭГ). Имевшиеся в анамнезе ОНМК или ТИА,

связанные по времени с обострением основного заболевания, были расценены нами как проявления васкулита данной локализации.

Таблица 1.

Параметры основных лабораторных показателей у больных ССД

Показатель значения Количество больных %

Количество эритроцитов <3,5-10"/л 5 12,5

Гемоглобин <155 г/л 5 12,5

соэ >20 мм/ч 14 35,0

АНФ + 28 70,0

Серомукоиды >0,28г/л 3 7,5

ЦИК >4 усл.ед. 23 57,5

АТ к Sel -70 + 16 40,0

Общий белок сыворотки <62г/л 12 30,0

у-глобулины >19,0% 8 20,0

С-реактивный белок + 7 17,5

а2.глобулины >9,2% 2 5,0

Фибриноген >4 г/л 2 5,0

• Нормальные показатели даны согласно практическим

рекомендациям, приведенным в соответствующих руководствах.

Из общих проявлений наиболее часто наблюдалась потеря массы тела. В период генерализации процесса данный симптом встречался у 24 больных.

Базисную терапию Б-пеницилламином в дозах 125 - 750 мг/сут. получали 21 человек (52,5%). Глюкокортикостероиды системного действия в дозах 2,5 - 40 мг/сут. принимали 27 (67,5%) больных, в основном со II и III степенями активности заболевания. Во всех случаях учитывались рекомендации ЕиЬАЛ по применению системной глюкокортикоидной терапии при ревматических заболеваниях.

Из нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), назначенных 36 больным (90,0%), предпочтение отдавалось селективным ингибиторам ЦОГ-2 (нимесулид, мелоксикам), несколько реже назначались кетопрофен и диклофенак.

В качестве патогенетических средств, влияющих на систему микроциркуляции, использовали блокаторы кальциевых каналов (нифедипин, амлодипин) и ингибиторы АПФ (каптоприл, эналаприл, периндоприл, лизиноприл), обладающие к тому же нефропротективным действием. Дозы препаратов подбирались индивидуально в зависимости от уровня АД и переносимости.

В систему комплексного лечения больных ССД включали также ЛФК, массаж и локальную терапию (аппликации с 50-70% раствором диметисульфоксида, ультразвук, лазер). Все больные проходили курс лечения в отделении гипербарической оксигенации МУЗ ГКБ № 25. Использовался бароаппарат «ОКА-МТ», РД (рабочее давление) = 1,3 атмосфер в 1 минуту, продолжительность процедуры 50 минут, количество сеансов 10.

В исследуемой группе ФТЛ получали 23 больных (57,5%).

Плазмаферез назначался 15 пациентам (37,5%). Средняя продолжительность госпитализации составила 21,9±5,9 дней (диапазон от 14 до 40 дней).

Эффект от проводимой терапии оценивался по динамике кожного синдрома (уменьшение индурации); сутавно-мышечного (увеличение объема движений); сосудистого (уменьшение синдрома Рейно, улучшение трофики); регрессии висцеральных проявлений.

Материалы и методы исследований

В качестве антигена при определении АТ к СОД использовали коммерческий препарат СОД из эритроцитов человека производства НПО «Биопрепарат» с активностью 30 Ед/мг, при определении АТ к ГР — препарат производства НПК «Спутник» с активностью 340 Ед/мг. Активность СОД определяли по методу С. Чевари и соавт. (1993), активность ГР - по методу Нозо(1а и Ыакашига, описанному М.А. Шифриным (1977).

АТ к СОД и ГР определялись твердофазным иммуноферментным методом с использованием ИГАП. Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля (Гонтарь И.П. с соавт., 2002 г.).

Результаты учитывали на многоканальном спектрофотометре АС-8К (Белоруссия) при длине волны 492 нм. Полученные значения выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.). Наличие антител считалось положительным при превышении величин экстинции на 2 стандартных отклонения от средних значений контрольной группы.

Обработка полученных результатов проводилась с использованием программных пакетов «STATGRAPHICS 3,0», «Excel 5,0», «STATISTICA 6,0», а также по оригинальным программам с использованием формул, приведенных в соответствующих руководствах (Зайцев В.М. и др., 2003 г.).

Результаты исследования и их обсуждение

Активность ГР и СОД и уровень антител к ним у здоровых

лиц

Уровень AT к ГР и СОД в сыворотке крови исследовали методом ИФА с использованием ИГАП (Гонтарь И.П. и соавт., 2002 г.) у 30 практически здоровых людей - доноров отделения переливания крови городской клинической больницы скорой медицинской помощи №25 (ГКБСМП), г. Волгограда. Уровень нормальных показателей антител, определяемый как сумма среднего и двух среднеквадратических отклонения (М ± 28), составил по данным ИФА: к СОД - 0,076±0,004 е.о.п.; к ГР - 0,080±0,004 е.о. п.

Показатели, превышающие эти значения на величину 2 стандартных отклонений, были приняты за верхнюю границу нормы: для AT к СОД — 0,114 е.о.п., для AT к ГР — 0,124 е.о.п.

Общая активность СОД в группе здоровых составила 38,2 ± 1,2 ME, амплитуда колебаний величины активности - 25,1-51,3 ME, общая активность ГР -114,3 ± 3,7 ME, а амплитуда - 73,6-155,0 ME.

Активность ГР и СОД и уровень антител к ним у больных

ССД

У 40 больных ССД, обследованных нами, выявлена средняя активность СОД 22,7±2,6, активность ГР 76,3+3,3, а также достоверное повышение количества антител к ферментам у больных ССД по сравнению со здоровыми (AT к СОД 0,130 ± 0,007, р < 0,001; AT к ГР 0,144 ± 0,01, р < 0,001). Между антителами к СОД и ГР отмечена прямая корреляционная зависимость (р=0,040).

Процент повышенных значений АТ к СОД в группе обследованных больных ССД составил 87,5% (35 человек), АТ к ГР 80% (32 больных), при этом достоверного различия активности ферментов и концентраций антител к ним в зависимости от возраста и пола выявлено не было. Недостаточная ферментативная активность ГР и СОД при ССД может быть обусловлена следующими причинами: снижением количества их плазменной и эритроцитарной формь1 и/или ингибицией фермента под влиянием экзогенных и эндогенных факторов. Известно, что самым мощным эндогенным фактором, приводящим к угнетению ферментной активности, является образование специфических аутоантител. Их подавляющее действие осуществляется путем изменения конформации молекулы ГР и СОД и непосредственной блокады их активных центров, участвующих в реакциях взаимодействия со свободными радикалами. Очевидно, что в условиях аутоагрессии, имеющей место при аутоиммунных заболеваниях, даже повышение синтеза ферментов не может компенсировать их функциональной недостаточности.

Таблица 2

Активность СОД и ГР и содержание АТ к ним в сыворотке крови здоровых и больных ССД в зависимости от активности

процесса

Активность АТк сод, е.о.п. (Mira) Активность АТ к ГР,

Группа п СОД, Ед/мл ГР, Ед/мл е.о.п.

(М±т) (М±ш) (М±ш)

Здоровые доноры 30 38,2±1,2 0,070± 0,004 114,3±3,7 0,080± 0,004

Больные ССД, I степень активности 16 25,1+3,2 0,150± 0,003 88,2±3,9 0,130+ 0,004

II—III степень 24 20,2±2,7 0,210± 64,3±3,2 0,180±

активности 0,003 0,003

В литературе отсутствует описание механизмов приобретения ферментами свойств аутоантигенов, однако предполагается, что

конформационное изменение молекулы фермента может происходить в результате взаимодействия с АФК и вторичными продуктами свободнорадикальных процессов. Это приводит к экспрессии скрытых антигенных эпитопов ГР и СОД, вследствие чего они и получают свойства аутоантигенов.

Был проведен анализ показателей активности ГР и СОД и содержания антител к ним у больных ССД с различной степенью активности патологического процесса. Как видно из таблицы 2, в группе больных ССД отмечалось уменьшение активности СОД и ГР в крови по сравнению со здоровыми лицами.

У больных с низкой активностью ССД снижение данных показателей было незначительным (р=0,068 и р=0,072 соответственно), в то время как при умеренной и высокой активности заболевания различия между опытной и контрольной группами были статистически достоверными (р=0,013 и р=0,024 соответственно).

Концентрация антител к ГР и СОД у больных с различной степенью активности ССД была достоверно выше уровня аналогичного показателя у доноров (р=0,043 и р=0,037 соответственно). Имела место отчетливая тенденция к росту содержания аутоантител и снижению количества ферментов в крови больных с повышением активности патологического процесса (рис 4), что обусловило статистически достоверную разницу между подгруппами больных с минимальной и умеренно-максимальной степенью активности заболевания (р=0,039 и р=0,044).

Уровень АТ к ГР и СОД у больных с умеренной активностью патологического процесса был достоверно выше, чем у доноров (р=0,016 и р=0,008 соответственно) и у больных с минимальной степенью активности болезни (р=0,035 и р=0,026 соответственно). Достаточно убедительным являлось снижение концентрации сывороточных АТ к ГР и СОД на фоне лечения (р=0,041 и р=0,047 соответственно), что, вероятно, обусловлено более частым назначением глюкокортикостероидов и плазмафереза больным со II степенью активности заболевания.

0,4 -| 0,35 -

АТ к ГР АТ к СОД ГР СОД

Рисунок 4. Активность ГР и СОД и антител к ним у больных | ССД с различной степенью активности заболевания.

I

[ Измерение активности ГР и СОД у больных ССД перед

выпиской из стационара показало на фоне общего клинико-лабораторного улучшения положительную динамику в виде ! повышения активности исследуемых ферментов. Очевидно, это | связано с наблюдаемым у большинства больных снижением ( активности патологического процесса в ответ на проводимую иммуносупрессивную терапию, при этом отмечалось статистически значимое уменьшение концентрации специфических аутоантител.

Таблица 3.

Активность ГР в плазме крови и содержание антител к ней у больных с различным характером течения ССД

Течение п Время обследования Активность ГР, Ед/мг (М±ш) АТ к ГР, е.о.п. (М+т)

Хрони ческое 16 До лечения 110,513,7 0,130*±0,011

После лечения 113,8±2,9 0,095±0,060

Подост рое и острое 24 До лечения 71,2*±2,8 0,174*#±0,118

После лечения 94,1±1,8 0,118+0,009

Примечание: * - достоверные различия с группой доноров; # - достоверные различия между клиническими группами;

Анализ активности ГР и СОД в крови и содержания антител к ним у больных с различным характером течения ССД представлен в таблицах 3 и 4.

Как видно из таблиц, при поступлении в стационар у всех больных ССД, независимо от характера течения заболевания, отмечалось уменьшение активности ГР и СОД в крови (р=0,024 и р=0,030 соответственно). Повышение сывороточных АТ к ферментам также наблюдалось во всех группах (р=0,042 и р=0,037 соответственно), но было более выражено при подостром и остром течении заболевания, однако достоверных различий в показателях между рассматриваемыми категориями пациентов найдено не было.

Как было показано ранее, наличие АТ к ГР и СОД ассоциировалось с более выраженным снижением активности фермента (р=0,023 и р=0,035 соответственно).

По окончании курса лечения наблюдалось некоторое повышение активности ГР и СОД в крови и снижение содержания аутоантител. В группе больных с хроническим течением заболевания концентрация исследуемых антител перед выпиской достигла нормальных значений, а при остром и подостром течении сохранялась достоверная разница с группой доноров, что обусловлено преобладанием среди них пациентов с умеренной и максимальной активностью заболевания.

Таблица 4.

Активность СОД в плазме крови и содержание антител к ней

Течение Время Активность АТ к СОД, е.о.п.

п обследования СОД, Ед/мг (М±т) (М±т)

Хроническое До лечения 32,4±1,2 0,160±0,006

16 После лечения 36,1+1,7 0,082±0,050

Подост- До лечения 22,7*±2,7 0,179*±0,180

рое и 24 После 28,4±2,2 ОД 10±0,070

острое лечения

Примечание: * - достоверные различия с группой доноров

Нами было проанализировано возможное влияние стадии заболевания на активность ГР и СОД и содержание антител к ним у больных ССД. Различия исходных значений АТ к СОД и АТ к ГР в зависимости от стадии ССД приведены в таблице 5. После проведенного лечения у больных ССД отмечалось снижение концентрации сывороточных АТ к ГР и АТ к СОД (р=0,012 и р=0,034 соответственно).

Таблица 5.

Содержание антител к ГР и СОД у больных ССД в зависимости от __стадии заболевания

Показатель I стадия II стадия III стадия

Количество больных 10 26 4

АТ к ГР, е.о.п. (М±т) 0,125±0,022* 0,160±0,017 t 0,320±0,026f *

АТ к СОД, е.о.п. (М±т) 0,111+0,013# 0,129+0,008 t 0,206±0,013* #

Примечание:* - р=0,040;т - р=0,031; * - р<0,001;1 - р=0,019

Отдельно был проведен анализ содержания исследуемых АТ у пациентов, имевших продолжительность заболевания менее 1 года. АТ к ГР и СОД в сыворотке крови были обнаружены нами у обоих пациентов этой группы. Данный факт свидетельствует о том, что АТ к изучаемым показателям появляются на начальных стадиях болезни и могут, таким образом, служить в качестве раннего диагностического признака.

Достоверных изменений активности ГР и СОД на различных стадиях ССД выявлено не было.

Изучение активности ГР и СОД в крови больных ССД с различными клиническими проявлениями выявило достоверное снижение данного показателя во всех рассматриваемых группах (табл.6). Минимальные значения активности как ГР, так и СОД выявлялись у больных с поражением сердца и легких, обуславливая достоверные различия между представленными клиническими группами (р=0,029 и р=0,36 соответственно). Значимое повышение

их активности в процессе лечения наблюдалось у больных с кардиальной патологией (р=0,041, р=0,034 соответственно).

Таблица 6.

Содержание антител к СОД и ГР у больных ССД в зависимости от

клинических проявлений заболевания

До лечения После лечения

Группы п АТ к СОД, АТ к ГР, АТ к СОД, АТ к ГР,

е.о.п. е.о.п. е.о.п. е.о.п.

М(ш) М(т) М (т) М(т)

Поражение кожи 40 0,110* 0,154* 0,103 0,112

(0,02) (0,024) (0,005) (0,028)

Поражение 40 0,106* 0,104* 0,098 0,084 л

костно- (0,015) (0,004) (0,08) (0,009)

мышечнои

системы

Поражение 20 0,134*# 0,120*# 0,129 л 0,100* л

сердца (0,003) (0,004) (0,003) (0,004)

Поражение 36 0,129*# 0,117*# 0,128л 0,076 л

легких (0,004) (0,008) (0,005) (0,007)

Синдром Рейно 32 0,151* 0,083* 0,118 0,074

(0,019) (0,02) (0,035) (0,004)

Поражение ЖКТ 32 0,103* 0,085* 0,094 0,078

(0,006) (0,014) (0,006) (0, 07)

Поражение 12 0,104* 0,09* 0,085 0,069

нервной системы (0,028) (0,006) (0,09) (0,004)

Примечание: * - достоверные различия с группой доноров;

# - достоверные различия между клиническими группами; А - достоверные различия между показателями до и после лечения.

Анализ содержания АТ к ГР и СОД у больных ССД с поражением различных органов и систем показал, что достоверное повышение их концентрации наблюдается во всех клинических группах (р=0,032 и р=0,025 соответственно). Наиболее высокий уровень исследуемых антител отмечался у пациентов с поражением сердца и легких, при этом он статистически достоверно превосходил аналогичные показатели больных с другими висцеральными проявлениями (р<0,001). Действительно, кардиальная патология по

типу ИБС или некоронарогенного кардиосклероза выявлялась у 17 положительных по АТ к ГР и у 15 - положительных по АТ к СОД больных, поражение легких - у 16 пациентов, позитивных по АТ к ГР и у 20 пациентов; позитивных по АТ к СОД.

Динамическое наблюдение за уровнем антител показало, что значимое снижение исследуемых показателей происходило в половине рассматриваемых групп: у больных с поражением костно-мышечной системы, легких и сердца (р=0,048), в ряде случаев достигая нормальных значений.

Известно, что снижение активности ГР и СОД сопряжено с повышенным риском возникновения сердечно-сосудистых заболеваний (именно с этим связывают рост ИБС в селендефицитных зонах). Обнаруженные нами закономерности позволяют предположить, что АТ к ГР и СОД, подавляя их антиоксидантную активность, являются еще одним фактором в цепи развития атеросклеротического процесса.

Есть данные, что ГР и СОД регулируют синтез эйкозаноидов: под их влиянием повышается продукция простациклинов, и, напротив, при дефиците ферментов происходит сдвиг в сторону тромбоксанов. Учитывая выявленные закономерности антителообразования к ГР и СОД у этих больных, можно сделать вывод, что среди известных сегодня механизмов участия ГР и СОД в патогенезе ишемии не последнюю роль играют иммунные.

Повышение уровня АТ к ГР и СОД, сопровождающееся снижением их ферментативной активности, выявленное в группе пациентов с поражением легких, позволило предположить о возможном их участии в развитии указанной патологии. Как известно, патогенез фиброзирующего альвеолита и интерстициального фиброза - основных составляющих легочной патологии при ССД - связан с иммунными нарушениями, усилением свободнорадикальных реакций и процессов фиброгенеза. Использование определения АТ к ГР и СОД в качестве предиктора развития угрожающих жизни осложнений со стороны легких при ССД позволяет обоснованно и дифференцированно подходить к назначению дорогостоящих методов диагностики (компьютерная томография, МРТ) и своевременно производить коррекцию начинающихся нарушений, используя тактику "агрессивной" терапии.

Другая немаловажная проблема, которая была включена нами в задачи исследования - объективизация оценки эффективности проводимой терапии. Сегодня контроль лечения включает в себя стандартный набор клинико-лабораторных тестов, характеризующих, в основном активность патологического процесса (показатели острой фазы) и мониторинг уровня отдельных классов антител (анти-ДНК, антифосфолипидные антитела (АФЛ), антинуклеарный фактор (АНФ).

В этом свете особый интерес представляет оценка влияния проводимой терапии на динамику АТ к ГР и СОД и их активность. Для повышения достоверности полученных результатов нами были отобраны больные с подострым течением и умеренной активностью заболевания, имевшие сходные клинико-лабораторные показатели.

Таблица 7.

Активность ГР и СОД и АТ к ним у больных ССД в зависимости ___ от вида проводимой терапии__

Терапе втичес кие груп пы п Время обследов ания Активность ГР, ЕД/мл (М±ш) Активность СОД, ЕД/мл (М±т) АТкГР, е.о.п (М±т) АТ к СОД, е.о.п. (М+т)

I 10 До лечения 64,2+1,18* 20,2±1,2* 0,175+0,008 0,185+0,00 7

После лечения 84,1 ±0,69 25,4±0,9 0,105±0,010 0,10±0,004

II 6 До лечения 63,8±1,8 19,8±1,1 0,188±0,010 0,215±0,01 0*

После лечения 79,7±0,33 22,5+0,9 0,081±0,007 0,10±0,010

III 4 До лечения 61,1±0,43 16,8±2,0 0,18910,008 * 0,224+0,01 8

После лечения 71,9±0,38 20,7±0,5 0,095±0,005 0,096+0,00 8

Примечание: * - достоверные различия с группой доноров;

Эта достаточно однородная выборка была разделена на три группы в зависимости от вида проводимой терапии. В I группе (10

человек) - получали антифиброзную терапию (D-пеницилламин) в комбинации с сосудистыми препаратами; во II группе (6 человек) помимо основной терапии пациенты получали ГКС per os; в III группе (4 человека) основное лечение дополнялось методами экстракорпоральной терапии (плазмаферез). Результаты изучения активности ГР и СОД и содержания аутоантител к ним в зависимости от вида проводимой терапии представлены в таблице 7.

Во всех группах произошло уменьшение количества AT к ГР и СОД к моменту выписки из стационара, но достоверное снижение наблюдалось у больных, получавших ГКС системного действия (р=0,042 и р=0,038 соответственно), и особенно у принимавших процедуры плазмафереза (р=0,083 и р=0,074 соответственно). Процент повышенных значений антител к СОД, ГР до лечения составлял 75% и 70% соответственно, а при выписке - 38,0 %, 36,7 %. Уровень антител при выписке остается выше, чем у здоровых лиц (р=0,041 и р=0,039 соответственно).

Полученные результаты свидетельствуют о преимуществах включения в комплексное лечение больных ССД глюкокортикостероидных препаратов и экстракорпоральных методов, приводящих к быстрому значимому снижению интенсивности антителогенеза и уменьшению активности патологического процесса.

При этом необходимо оценивать риск развития осложнений, достигающий, по данным ряда авторов, 10-20%. Наиболее частыми из них являются тромбозы, кровотечения, гемолиз, цитратная гипокальциемия, иммунодефицитные состояния. Так, отмечена более высокая частота бактериальных и вирусных инфекций при сочетании плазмафереза и пульс-терапии ГКС и/или цитостатиками по сравнению с монотерапией указанными препаратами. Кроме того, эффект от плазмафереза наступает быстро, но часто носит кратковременный характер, в то время как прием иммуносупрессивных препаратов приводит к более стойкому подавлению поликлональной В-клеточной активации и гиперпродукции аутоантител. Базисная терапия способствует замедлению прогрессирования заболевания и препятствует фиброзообразованию, существенно не изменяя интенсивность иммунного ответа. Таким образом, экстракорпоральные методы являются элементом комплексного лечения ССД и не могут служить альтернативой противовоспалительной и базисной терапии, но должны применяться в случае необходимости быстрого подавления

аутоиммунной активности.

Поскольку выявленные нами АТ к СОД и ГР у лиц с ССД отсутствовали у доноров, нами проведены количественные оценки эффективности использования антител в качестве критерия диагностической ценности.

Диагностическую ценность изучаемых лабораторных тестов при ССД оценивали методом КОС-анализа, используя в качестве контроля группу больных первичным синдромом Рейно. При выборе оптимальной точки разделения для каждого из тестов руководствовались оптимальными значениями отношений правдоподобия.

Рисунок 5. Характеристические кривые определения уровня антител к СОД и ГР в диагностике ССД.

Поиск точек разделения между исследуемыми группами производили, руководствуясь максимальной суммой значений чувствительности и специфичности. Точкой разделения,

удовлетворяющей этому требованию, для анти-ГР являлось значение 0,507 е.о.п. (при этом чувствительность составила 37,50%, специфичность - 100,00%), а для анти-СОД - 0,695 е.о.п., (чувствительность - 40,00 %, специфичность - 95,00%).

В связи с тем, что иммунные механизмы играют ведущую роль в развитии системных заболеваний соединительной ткани, именно иммунологическим методам придается большое значение в диагностике ССД. Используемые для объективизации диагноза, они позволяют верифицировать заболевание, определить его активность, представить ориентировочный прогноз по течению и выбрать оптимальную терапевтическую тактику. Повышение чувствительности и специфичности иммунологических методов, а также совершенствование технических аспектов постановки реакций является важным методическим направлением современной ревматологии.

Для выявления специфических антител в сыворотках крови больных ССД нами был выбран иммуноферментный метод с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами. ИФА, будучи высокоспецифичным и чувствительным, является наиболее информативным методом в диагностике ревматических заболеваний (РЗ), а применение иммобилизированных биополимеров дает ему целый ряд неоспоримых преимуществ. Сорбенты обладают механической прочностью, устойчивы к экзогенным физико-химическим и биологическим воздействиям, а возможность проведения регенерации позволяет добиться неоднократного их применения, что ведет к значительному экономическому эффекту.

Для совершенствования иммунологической диагностики ССД нами были разработаны и целенаправленно апробированы при выявлении специфических антител у 40 больных ССД и у 30 здоровых лиц иммобилизированные гранулированные антигенные препараты на основе глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы. Унифицированный способ получения полиакриламидных гранул позволил качественно и количественно увеличить сорбционную емкость препарата. Применение метода эмульсионной полимеризации, при котором водорастворимые антигены фиксируются в пространственную решетку полиакриламидного геля методом "механического" включения без образования ковалентных связей, дает возможность сохранить антигены в максимально

нативном состоянии, а иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое "двойной" гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, что значительно повышает чувствительность ИФА. Включение магнитного материала производилось с целью ускорить и упростить ряд операций в твердофазных методах анализа, улучшить качественные характеристики определений и увеличить число обрабатываемых проб, что создает необходимые условия для разработки автоматизированных систем диагностики.

Таким образом, в результате проведенных исследований были разработаны и применены в варианте твердофазного иммуноферментного анализа иммобилизированные гранулированные препараты с магнитными свойствами на основе глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы. С их помощью нам удалось продемонстрировать определенную диагностическую ценность исследования АТ к ГР и СОД при ССД. Систематизация накопленных знаний об антителообразовании к ГР и СОД и другим энзимам этой системы, возможно, позволит в дальнейшем разработать иммуноферментный тест на основе ИГАП, улавливающий минимальные отклонения в содержании специфических антител к большинству ферментов АОС. Это значительно упростит диагностику и дифференциальную диагностику ревматических заболеваний, и прольет свет на общие механизмы их патогенеза.

Коррекция начинающихся нарушений функционирования АОС препаратами, подавляющими окислительные процессы, в совокупности с антифиброзными, сосудистыми препаратами, иммуносупрессивной терапией, плазмаферезом и иммуносорбцией позволит достигать стойкой ремиссии заболевания в более короткие сроки, что приведет к повышению продолжительности и качества жизни больных ССД.

Выводы

1. Применение иммобилизированной формы глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы в непрямом варианте иммуноферментного метода анализа позволило впервые выявить антитела к данным ферментам у больных системной склеродермией.

2. Максимальные значения сывороточных антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе отмечены при высокой активности системной склеродермии. Они наиболее часто

обнаруживаются в терминальной стадии заболевания и при вовлечении в патологический процесс сердечно-сосудистой системы и легких.

3. Снижение показателей ферментативной активности глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы при одновременном повышении уровня антител к ней выявляется у больных системной склеродермией с умеренной и высокой степенью активности патологического процесса, что позволяет использовать этот критерий в комплексной оценке патологического процесса как неблагоприятный прогностичекий фактор.

4. Применение на стационарном этапе лечения больных системной склеродермией иммуносупрессивных препаратов и особенно методов экстракорпоральной терапии (плазмаферез) приводит к значительному снижению уровня антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе.

5. Уровень антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе может служить дополнительным критерием активности системной склеродермии и использоваться для оценки эффективности проводимой терапии наряду с традиционными клинико-лабораторными критериями.

Практические рекомендации

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы рекомендуется использовать для выявления антител к ним у больных ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.

2. При определении антител к глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе иммуноферментным методом за норму следует считать показатели здоровых лиц - менее 0,124 и 0,114 е.о.п. соответственно.

3. Рекомендуется использовать определение уровня антител к ГР и СОД в сыворотке крови как дополнительный лабораторный критерий активности системной склеродермии, а также для диагностики возможного вовлечения в патологический процесс сердца и легких.

4. При системной склеродермии наряду с общепринятыми клинико-лабораторными показателями следует использовать определение уровня антител к ГР и СОД в сыворотке крови в

качестве дополнительного критерия эффективности проводимой терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК

РФ

1. Александров A.B., Гонтарь И.П., Ненашева Н.В., Емельянов H.H., Новикова О.В., Маслакова Л.А., Емельянова О.И.. Проблемы диагностики хронических иммуновоспалительных заболеваний: применение иммунологических исследований для выделения субтипов ревматоидного артрита // Аллергология и иммунология. -2008. - Т.9, №3. - С.333-334.

2. Александров A.B., Алехина И.Ю., Шилова J1.H., Емельянова О.И., Маслова-Сорокина Е.В., Емельянов H.H. Роль аутоантител к ксантиноксидазе в развитии иммунопатологических реакций при воспалительных ревматических заболеваниях // Аллергология и иммунология, 2009, Т. 10, №2. - С.220.

3. Шилова Л.Н., Гонтарь И.П., Зборовская И.А., Новикова О.В., Емельянов H.H. Клинико-патогенетическое значение наличия антител к ферментам антиоксидантной системы при синдроме Рейно // Клиническая медицина - 2010. - №2. - С.43-46.

4. Романов А.И., Шилова Л.Н., Емельянов H.H., Гонтарь И.П. Клинико-иммунологические закономерности при разных патогенетических вариантах синдрома Рейно. // Кремлевская медицина. Клинический вестник. - 2010, №2. - С.88 - 90.

5. Емельянов H.H., Русанова O.A., Парамонова О.В., Гонтарь И.П., Зборовская И.А. Иммуносорбция аутотиреоидных антител как метод лечения хронического аутоиммунного тиреоидита. . // Врач-Аспирант. - 2010, №6.1(43). - С. 122-128.

6. Гонтарь И.П., Сычева Г.Ф., Александров A.B., Шилова Л.Н., Симакова Е.С., Емельянов H.H., Матасова H.A., Маслакова Л.А., Зборовский А.Б. Эмульсионная полимеризация как метод, модифицирующий ферменты с сохранением биологических свойств их наноструктур. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010, №12. - С. 715 - 719.

7. Шилова Л.Н., Гонтарь И.П., Зборовская И.А., Новикова О.В., Емельянов H.H. Взаимосвязь между антителами к ферментам

антиоксидантной системы и поражением сердца у больных системной склеродермией. // Кардиология. - 2010, № 12 (50). -С.64-67.

8. Шилова Л.Н., Емельянов H.H. Оценка кардиоваскулярного риска у больных системной склеродермией. // Профилактическая медицина.-2011 Т. 14, №2. С. 81.

9. Шилова Л.Н., Емельянов H.H. Значение антител к эритроцитарной супероксиддисмутазе в изменении ее активности при системной склеродермии. // Вестник Волгоградского медицинского университета. -2011 № 3. С. 39-41.

Статьи в научных сборниках и журналах

10. Александров A.B., Ненашева Н.В., Емельянов Н.И., Новиков Д.А., Емельянов H.H. Возможность использования иммунологических показателей для выделения клинико-лабораторных вариантов ревматоидного артрита // Материалы III Национального конгресса терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации», Москва 5-7 ноября 2008 г. - М., Издательство «Бионика», 2008. - С.9-10.

11. Александров A.B., Алехина И.Ю., Махачев М.А., Маслова-Сорокина Е.В., Емельянов H.H., Зборовская И.А. Магнитоуправляемые сорбенты на основе иммобилизированных антигенов: новые возможности лабораторной диагностики воспалительных аутоиммунных заболеваний // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», Чита, 2008. - С.163-164.

12. Маслакова Л.А., Емельянов H.H., Москвитина О.В., Красильников А.Н., Шилова Л.Н. Антитела к ферментам антиоксидантной системы как возможные факторы эндогенной регуляции активности энзимов. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН А.Б.Зборовского/. - Вып. XXVI, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2009. с.45-46.

13. Шилова Л.Н., Емельянов H.H., Трубенко Ю.А., Красильников А.Н., Зборовский А.Б. Антитела к аденозиндезаминазе при разных формах склеродермического процесса. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред.

Академика РАМН А.Б.Зборовского/. - Вып. XXVI, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2009. с.92-93.

14. Александров A.B., Алехина И.Ю., Новикова О.В., Емельянов H.H., Гонтарь И.П. Новые возможности использования антигенных нанообъектных систем при диагностике и лечении воспалительных ревматических заболеваний. // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении», 21-22 апреля 2009 г. - Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2009, №1(25), Приложение (часть II). - С.586.

15. Шилова Л.Н., Емельянов H.H., Трубенко Ю.А., Маслакова Л.А., Зборовский А.Б. Клинико-патогенетическая роль антител к ферментам при системной склеродермии. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН А.Б.Зборовского/. - Вып. XXVII, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2010. с.115-116.

16. Александров A.B., Шилова Л.Н., Емельянов H.H., Алехина И.Ю., Новикова О.В., Макарова Т.С., Емельянов Н.И., Курбанова Р.Д., Парамонова О.В., Емельянова О.И. Иммунопатогенетические аспекты современной лабораторной диагностики системной красной волчанки, системной склеродермии и ювенильного ревматоидного артрита // International Journal on Immunorehabilitation, 2010, Т. 12, №2. - С. 150.

17. Емельянов H.H., Шилова Л.Н., Трубенко Ю.А., Маслакова Л.А., Зборовский А.Б. Аутоиммунитет к супероксидцисмутазе и глутатионпероксидазе у больных системной склеродермией. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН А.Б.Зборовского/. -Вып. XXVIII, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2011. с.45-46.

18. Шилова Л.Н., Емельянов H.H., Маслакова Л.А., Гонтарь И.П., Зборовская И.А. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН А.Б.Зборовского/. - Вып. XXVIII, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2011. с.128-129.

Емельянов Николай Николаевич

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЕ И СУПЕРОКСИДЦИСМУТАЗЕ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ФОРМ ФЕРМЕНТОВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 18.08.2011г. Формат 60x84/16. Буи офс. Усл.-печ. л. 1,4. Тираж 110 экз. Заказ 214. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства «Перемена», 400131, г.Волгоград, пр.Лсшша,27

Системная склеродермия (прогрессирующий системный склероз) - прогрессирующее полисиндромное заболевание с характерными изменениями кожи, опорно-двигательного аппарата, внутренних органов (легких, сердца, пищеварительного тракта, почек) и распространенными вазоспастическими нарушениями по типу синдрома Рейно, в основе которых лежат поражение соединительной ткани с преобладанием фиброза и сосудистая патология по типу облитерирующего эндартериолита. Относится к группе системных заболеваний соединительной ткани. [17,23,25,26,81].

Преимущественное поражение лиц трудоспособного возраста, высокий процент инвалидизации порождают большие экономические потери, включающие высокую стоимость диагностики и лечения, выключение больных из сферы производства, затраты на социальное обеспечение работающих пациенi

TOB и инвалидов [34,45,69,84,192,212].

С конца прошлого столетия произошел значительный прогресс в представлениях о системной склеродермии (ССД): исследованы патогенетические механизмы, детально изучены клиника и эволюция заболевания, разработаны основы диагностики и классификация, создана программа патогенетической терапии с дифференцированным использованием антифиброзных, иммуномо-дулирующих и сосудистых средств [23,24,26,71,81,142,171,233].

Все же прогноз при данной патологии остается зачастую неблагоприятным: согласно имеющимся статистическим данным, 40% больных с острым и подострым течением погибает в течение первых 5 лет заболевания, 70% — в течение 10 лет [3,25,51,193]. В связи с этим, актуальными задачами для клиницистов являются своевременная постановка диагноза, назначение адекватной терапии и объективная оценка ее эффективности. Все это даст возможность модифицировать болезнь и повлиять на ее исход.

I i

Как показали новейшие разработки в иммунодиагностике ревматических заболеваний, иммуноферментные методы анализа (ИФА) с использованием магнитоуправляемых сорбентов на основе антигенов нуклеиновой, ли-пидной и белковой природы в полной мере отвечают указанным требованиям. Неоспоримые преимущества метода заключаются, в первую очередь, в повышении стабильности иммобилизированного биополимера, что делает его устойчивым к различным химическим и физическим воздействиям. Помимо этого, иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, тем самым повышая чувствительность твердофазных методов анализа. Включение магнитного материала в гранулы дает возможность ускорить и упростить манипуляции на всех этапах исследования, улучшая качественные характеристики определений и увеличивая число обрабатываемых проб. И, наконец, повторное использование сорбента после регенерации ведет к значительному экономическому эффекту [21,33,39].

Гранулированные препараты с магнитными свойствами уже были использованы для усовершенствования иммунодиагностики- ССД и выявления антител к кардиолипину, каталазе, фибронектину и другим биополимерам. Как показали исследования, преимущества метода ИФА с применением им-мобилизированных гранулированных антигенных препаратов (ИГАП) делают его не только экономичным и легко применимым в практической медицине, но и позволяют решить вопросы ранней диагностики ревматических заболеваний благодаря высокой чувствительности и специфичности [74,88,97].

В настоящее время продолжается поиск маркеров прогрессирующего системного склероза, позволяющих дифференцировать его с другими диффузными болезнями соединительной ткани, ревматоидным артритом, псевдоскле-родермическими и паранеопластическими синдромами, а также прогнозировать клиническую форму и течение заболевания. В этом свете представляют интерес результаты исследования роли активных форм кислорода (АФК) в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Предполагается, что основное значение свободных радикалов при данной патологии связано с их способностью повреждать белки, липиды, ДНК, придавая им свойства аутоантигенов и провоцируя выработку антител. Достигается это значительным усилением выработки активных форм кислорода (перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.), которые приводят к деполимеризации гиалуроно-вой кислоты, окисляют белки, вызывают перекисное окисление липидов, стимулируют высвобождение протеолитических ферментов и вазоактивных аминов. Считается, что именно АФК ответственны за процессы инактивирования и трансформации ферментов, угнетения функциональной активности иммуно-компетентных клеток [37,38,57,158,184].

Естественным препятствием патологическому воздействию активных форм кислорода на собственные ткани является антиоксидантная система организма (АОС), включающая в себя ферментные и неферментные звенья. Основными энзимными компонентами АОС считают глутатионпероксидазу, су-пероксиддисмутазу, глутатионредуктазу, катал азу и церулоплазмин. Они способны нейтрализовать высокоактивные супероксидные анионы, перекись водорода, гидроперекиси жирных кислот, предотвращая накопление особо токсичных вторичных продуктов перекисного окисления липидов [37,38,88,114,1266,1366,149,158].

В клинической практике использование прямых определений АФК, гидроперекисей и других продуктов свободнорадикальных реакций в биологических жидкостях затруднено из-за технических сложностей. Однако об интенсивности свободнорадикальных процессов можно судить по состоянию и напряженности реакций антиоксидантной защиты. Согласно данным ряда авторов, при ревматической патологии наблюдается накопление вторичных токсических продуктов свободнорадикальных реакций вследствие дисбаланса между продукцией и утилизацией АФК. В качестве одной из причин функциональной недостаточности энзимов-антиоксидантов при аутоиммунных заболеваниях считают образование антител к ним [12,37,38,40,74,88,97].

Из всей группы ферментов АОС наименее изученным объектом иммунного ответа при ССД являются глутатионредуктаза (ГР) и супероксиддисмутаза (СОД). В связи с этим, представляется актуальным исследовать закономерности антителообразования к ГР и СОД при системной склеродермии, используя. иммобилизированную форму, ферментов. Высокая чувствительность модифицированной методики ИФА дает возможность усовершенствовать способы диагностики системного склероза, выяснить отдельные механизмы патогенеза данного заболевания и обозначить перспективы патогенетической терапии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования являлось усовершенствование иммунологической диагностики и оценки эффективности лечения системной склеродермии с помощью иммобилизированных форм супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы задачи:

1.Получить иммобилизированные формы супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы, изучить их физико-химические свойства;

2.Адаптировать иммуноферментный метод анализа с использованием иммобилизированных супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы ,к изучению образования антител к этим ферментам;

3.Изучить активность супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы и содержание антител к этим ферментам у больных системной склеродермией и здоровых лиц: Исследовать данные показатели и корреляционные связи между ними у больных ССД в зависимости от активности, стадии, длительности, характера течения заболевания и висцеральных поражений;

4.Изучить динамику антителообразования к супероксиддисмутазе и глутати-онредуктазе в процессе стационарного лечения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые для диагностики ССД созданы и применены в варианте имму-ноферментного метода анализа иммобилизированные препараты супероксид-дисмутазы и глутатионредуктазы. В ходе работы в сыворотках крови больных ССД обнаружены антитела к супероксщщисмутазе и глутатионредуктазе. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотке крови здоровых лиц. Выявлена достоверная корреляция между содержанием антител к ГР и СОД и активностью патологического процесса. Установлено, что поражение сердечно-сосудистой системы и легких при ССД сопровождается максимальными значениями исследуемых антител. Выявлены обратные корреляционные связи между активностью ГР и СОД и антителами к ним. Определена способность исследованных показателей к изменению под влиянием проводимой терапии, что обеспечивает возможность оценки ее эффективности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к СОД и ГР на основе иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами. Выявление антител к СОД и ГР в предложенной методике ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики ССД, оценки активности патологического процесса и прогнозирования клинического варианта заболевания. Обнаружение антител к СОД и ГР на начальных сроках заболевания позволяет использовать их определение для ранней диагностики ССД. Динамика изученных показателей дает возможность судить об эффективности проводимой терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На защиту выносится положение о возможности определения антител к СОД и ГР с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммо-билизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами у больных ССД. Исследование антител к СОД и ГР может быть использовано в качестве дополнительных тестов для диагностики ССД, выделения клинических вариантов заболевания и уточнения степени активности патологического процесса. Динамика этих показателей может служить для оценки эффективности проводимой терапии.

ПУБЛИКАЦИИ

Основные положения диссертации изложены в 18 печатных работах, из которых 11 - в центральной, 1 - в международной и б - в местной печати. Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ (2009 - 2011 г.г.); III Национальном конгрессе терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации», Москва 5-7 ноября 2008 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины», Чита, 2008 г.; IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении», 21-22 апреля 2009 г.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Методы определения антител к СОД и ГР с помощью иммобилизиро-ванных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в МУЗ ГКБ №25 г.Волгограда.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I — обзора литературы, в которой изложены современные аспекты иммунопатогенеза системной склеродермии, участии в ее развитии активных форм кислорода и антиоксидантной системы; части II -собственных исследований, состоящей из 6 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методики исследования, полученные результаты, их обсуждение, выводы, практические рекомендации и приложения. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 5 рисунками, приведено 2 выписки из историй болезни. Указатель литературы содержит 244 источника, в том числе 97 -отечественных и 147 - зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Применение иммобилизированной формы глутатионредуктазы и суперок-сидцисмутазы в непрямом варианте иммуноферментного метода анализа позволило впервые выявить антитела к данным ферментам у больных системной склеродермией.

2. Максимальные значения сывороточных антител к глутатионредуктазе и супероксидцисмутазе отмечены при высокой активности системной склеродермии. Наиболее часто они обнаруживаются при вовлечении в патологический процесс сердечно-сосудистой системы и легких.

3. Снижение показателей ферментативной активности глутатионредуктазы и супероксиддисмутазы при одновременном повышении уровня антител к ним выявляется у больных системной склеродермией с умеренной и высокой степенью активности патологического процесса, что позволяет использовать этот критерий в комплексной оценке патологического процесса как неблагоприятный прогностичекий фактор.

4. Применение на стационарном этапе лечения больных системной склеродермией иммуносупрессивных препаратов и особенно методов экстракорпоральной терапии (плазмаферез) приводит к значительному снижению уровня антител к глутатионредуктазе и супероксидцисмутазе.

5. Уровень антител к глутатионредуктазе и супероксидцисмутазе может служить дополнительным критерием активности системной склеродермии и использоваться для оценки эффективности проводимой терапии наряду с традиционными клинико-лабораторными критериями.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе глутатионредуктазы и су-пероксиддисмутазы рекомендуется использовать для выявления антител к ней у больных ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.

2. При определении антител к глутатионредуктазе и супероксидцисмутазе иммуноферментным методом за норму следует считать показатели здоровых лиц - менее 0,124 и 0,114 е.о.п, соответственно.

3. Рекомендуется использовать определение уровня антител к ГР и СОД в сыворотке крови как дополнительный лабораторный критерий активности системной склеродермии, а также для диагностики возможного вовлечения в патологический процесс сердца и легких.

4. При системной склеродермии наряду с общепринятыми клинико-лабораторными показателями следует использовать определение уровня антител к ГР и СОД в сыворотке крови в качестве дополнительного критерия эффективности проводимой терапии.

100