Автореферат и диссертация по медицине (14.01.22) на тему:Клинико-диагностическое значение определения антител к эластину и эластазе у больных системной склеродермией с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента

На правах рукописи

005059462

АВЕТИСОВА Элина Рафаэловна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭЛАСТИНУ И ЭЛАСТАЗЕ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЫ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА

14.01.22 Ревматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 ПАИ 2013

Волгоград — 2013

005059462

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии» Российской академии медицинских наук и Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования' «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Гонтарь Илья Петрович

Официальные оппоненты: Ребров Андрей Петрович

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского»

Министерства здравоохранения Российской Федерации, зав. кафедрой госпитальной терапии

Чижов Петр Александрович

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Ярославская медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, зав. кафедрой факультетской терапии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « 4» 2013 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.008.08 при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (40013!, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Автореферат разослан «_» апреля 2013 г.

Ученый секретарь— диссертационного^

^^^агницкая Ольга Валерьевна

Аюуальность проблемы

Генерализованный прогрессирующий фиброз, являющийся нозологической особенностью системной склеродермии (ССД), определяет неблагоприятный прогноз, а преимущественное поражение лиц трудоспособного возраста обусловливает серьезные экономические потери вследствие заболевания. Ранняя диагностика ССД позволяет не только повысить эффективность лечения и сократить его сроки, но и реализовать принцип комплексности и дифференциации, наиболее актуальные в начальной стадии заболевания [Гусева Н.Г., 2007]. Совершенствование методов ранней диагностики и дифференциальной диагностики ревматических заболеваний является сегодня приоритетным направлением ревматологической науки. В качестве основополагающих критериев подобных разработок позиционируются не только клиническая, но и экономическая эффективность и целесообразность [Насонова В.А., 2001].

Этим требованиям в полной мере соответствуют модификации имму-ноферментного метода анализа (ИФА) с использованием иммобилизированных гранулированных препаратов (ИГАП) с магнитными свойствами. Наряду с технической доступностью метод отличает высокая чувствительность и экономичность, что достигается повышенной стабильностью иммоби-лизированного биополимера и возможностью регенерации сорбента [Гонтарь И.П., 2006, Зборовский А.Б., 2001].

Актуальность изучения эластина в качестве антигена определяется большой распространенностью его в органах и тканях. Эласгазы, в свою очередь, представляют интерес не только в качестве основных участников катаболизма эластина, но и как медиаторы воспалительных процессов [Hayakawa Т. а!., 1995]. Равновесие в системе «эластин - эластаза» определяет физиологическое функционирование органов и тканей, содержащих эластические волокна Нарушение обмена эластина, появление измененных растворимых изоформ с последующим запуском механизмов аутоиммунитета может обусловливать причастность изучаемого биополимера к патогенезу полиорганной патологии при системном склерозе.

Антителообразование к эластину и эластазе при ССД представляет собой не вполне изученную проблему. Проведенные в этом направлении исследования единичны и не содержат анализа изучаемых аутоантител в зависимости от характера

течения, активности и клинических форм заболевания [Gminski J. et aL, 1990, 1996, Zhao M.H. et al., 1998., Lyons R. et al„ 2005]. Исследование диагностически-прогностического значения уровня антител к эластину и эласгазе и возможных корреляционных связей между этими показателями у больных ССД представляет собой перспективное направление, способное повысить качество диагностики ревматических заболеваний и пролить свет на отдельные механизмы их патогенеза.

Цель исследования

Целью настоящего исследования являлось усовершенствование иммунологической диагностики системной склеродермии с помощью иммобилизированных форм эластина и эластазы.

Основные задачи исследования

1. Применяя иммобилизированные формы эластина и эластазы, изучить распространенность и концентрацию антител к эластину и эласгазе в сыворотках крови здоровых лиц, больных системной склеродермией, а также контрольной группы, состоящей из пациентов с синдромом Рейно, системными васкулитами, ревматоидным артритом и системной красной волчанкой.

2. Выполнить поиск статистических взаимосвязей между клиническими особенностями системной склеродермии и содержанием антител к эластину и эласгазе.

3. Изучить статистическую взаимосвязь между концентрацией антител к эластину и концентрацией антител к эласгазе у больных системной склеродермией и пациентов контрольной группы.

4. Оценить эффективность использования антител к эластину и эластазе для дифференцирования системной склеродермии от других аутоиммунных ревматических заболеваний.

Научная новизна

Впервые для диагностики ССД созданы и применены в варианте иммуноферментного метода анализа иммобилизированные препараты эластина и эластазы, подобраны оптимальные концентрации антигенов и определены условия проведения ИФА с использованием ИГАП.

Показано, что уровень антител к эластину и эластазе достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотках крови здоровых лиц и лиц контрольной группы. Выявлена корреляция между уровнем антител к эластину и эластазе и степенью активности и характером течения ССД. Установлено, что

максимальные значения исследуемых антител наблюдаются при поражении суставов, легких и сердечно-сосудистой системы.

Практическая ценность Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к эластину и эластазе на основе иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами. Показано, что выявление антител к эластину и эласгазе в предложенной методике ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики и дифференциальной диагностики системной склеродермии, оценки активности и прогнозирования клинического варианта заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту На защиту выносится положение о возможности определения антител к эластину и эластазе с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами у больных ССД. Исследование антител к эластину и эластазе может быть использовано в качестве донолнигельного теста для диагностики и дифференциальной диагност ики системной склеродермии, оценки активности и прогнозирования клинического варианта заболевания.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 11 печатных работах, из которых 6 - в местной печати и 5 - в центральной, в том числе 4 - в изданиях, рецензируемых ВАК. Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и Клинической медицины» ВолГМУ (2009-2011гг.); конференции «Актуальные проблемы современной кардиологии и терапии» - Киров, 2009 г.

Первичная экспертиза диссертации была проведена на совместном заседании Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии» Российской академии медицинских наук и кафедры госпитальной терапии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ.

Внедрение в практику

Методы определения антител к эластину и эластазе с использованием иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в практику работы ГУЗ ГКБ №25 г. Волгограда.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, содержащих обзор литературы, клиническую характеристику исследуемых групп, методы исследования, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы и практические рекомендации. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 10 рисунками, приведено 2 выписки из историй болезни. Указатель литературы содержит 239 источников, в том числе 111 -отечественных и 128-зарубежных.

Методы исследования

Исследование проводили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Международной медицинской ассоциации, принятой в 1996 году, и рекомендациями по этике биомедицинских исследований. Соблюдение требований биоэтики подтверждено результатами экспертизы Регионального этического комитета

Для выполнения поставленных задач были сформированы группа больных с верифицированным диагнозом ССД, а также контрольная группа В состав последней были включены пациенты с ревматическими заболеваниями, наиболее часто вызывающими затруднения при дифференциальной диагностике с ССД. .

Для установления нормальных характеристик изучаемых лабораторных показателей использовали референтную группу, состоящую из 30 практически здоровых лиц - доноров Волгоградской областной станции переливания крови (19 женщин и 11 мужчин в возрасте от 22 до 50 лет), прошедших тщательное медицинское обследование.

В качестве антигенов были использованы коммерческие препараты компании «S1GMA-ALDRICH» (США): препарат эластазы панкреатической из панкреатической железы свиньи (Elastase pancreatic from porcine pancreas, Cat. № El250) и препарат эластина из легкого человека (Elastin from human lung, Cat. № E7152).

Антитела к эластину и эластазе определялись твердофазным иммуноферментным методом с использованием иммобилизированных

гранулированных препаратов (ИГАП). Иммобилизацию производили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азога с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля [Зборовский А.Б., Гонтарь И.П., 2001]. Результаты учитывали на ИФА-ридере Multiskan EX (Thermo Electron Corporation, Шанхай, КНР) при длине волны 450 им. Полученные значения выражали в условных единицах оптической плотности (е.о.п.), которые вычисляли как разность между средним значением оптических плотностей исследуемого образца и средним значением фона.

В ходе измерения использовали найденные нами оптимальные уровни концентрации иммобилизированных эластина (1,5 мкг/мл), эластазы (2,5 мкг/мл) и рабочего разведения сыворотки (1:200).

Результаты статистической обработки представляли в форме: «среднее арифметическое ± среднее квадратическое отклонение» (М±о) либо среднее арифметическое (95% доверительный интервал) (М (95% Ди)).

Количественную оценку эффективности диагностического теста производили путем анализа четырехпольной таблицы и вычисления общепринятых операционных характеристик - чувствительности, специфичности, отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов [Гринхальх Т., 2006, Флетчер Р., 1998]. Перечисленные показатели были представлены в виде значений.

Поиск оптимальных точек разделения между исследуемыми группами осуществляли с помощью непараметрического варианта ROC-анализа с помощью программы SPSS 12.0 for Windows. При нахождении границы между положительными и отрицательными результатами измерения концентрации антител к эластину и эластазе принимали во внимание необходимость преимущественного исключения ошибок I типа. Напротив, при установлении точки разделения между больными ССД и контрольной группой руководствовались необходимостью минимизации ошибок как I, так и II типа. Эффективность дифференцирования ССД от контрольной группы проверяли раздельно для положительных и отрицательных результатов с помощью отношений правдоподобия положительного (LRP) и отрицательного результата (LRN), учитывая зависимость этих показателей от значения точки разделения.

Общую точность отдельного диагностического теста оценивали с помощью площади под непараметрической характеристической кривой (AUC). Достоверность отличия данного показателя от 50% (абсолютной неинформативности) и от 100%

(референтного стандарта) определяли с помощью 95% доверительного интервала. Различие между точностями двух диагностических исследований тестировали посредством сравнения их А11С с помощью г-статистики [КА. ОЬискжвй ,2005].

В случае превышения точки разделения 0,104 е.о.п. для антител к эластину и 0,113 е.о.п. для антител к эластазе значения оптической плотности считали отражающими концентрацию изучаемых антител, в противном случае результат считали отрицательным.

Клиническая характеристика исследуемых групп

Под наблюдением находились 42 больных ССД (11 мужчин и 31 женщина в возрасте от 22 до 72 лет) и 40 больных другими ревматическими заболеваниями: системной красной волчанкой (10), ревматоидным артритом (22), синдромом Рейно (3), системными васкулитами (10).

Среди больных ССД инвалидность по основному заболеванию имели 24 человека (57,1%), из них 111 группу инвалидности - 15 человек (35,7% от общего числа больных), II группу - 9 человек (21,4%). Причем, преобладали лица наиболее социально-активного возраста (58,3% в возрасте до 55 лет).

Диффузная форма ССД была диагностирована у 18 пациентов (42,9%), лимитированная - у 24 (57,1%).

Минимальная активность заболевания выявлена у 16 человек (38,1%). умеренная - у 22 (52,4 %), высокая - у 4 (9,5%) пациентов.

При оценке течения ССД по классификации Н.Г Гусевой были получе-ны следующие результаты: у 2 пациентов (4,8%) имело место острое (быстро прогрессирующее) течение ССД, у 15 (35,7%) - подострое (умеренно про-гресссирующее) и у 25 (59,5%) - хроническое (медленно прогрессирующее) течение.

Медиана продолжительности болезни в наблюдаемой группе составила 9,2±7,4 лет (диапазон от 2 до 27 лег). 7 пациентов (16,7%) имели стаж заболевания менее 5 лет, 10 (23,8%) - 6 -10 лет, 12 (28,6%) -11 -15 лет, 8 (19,1%) -16 - 20 лет, 5 (11,9%) более 20 лет.

Оценка этапа и динамики болезни проводилась с выделением стадии ССД по Гусевой Н.Г. (2007 г.). В результате у 5 пациентов (11,9%) была диагностирована начальная стадия (I) с преимущественным поражением опорно-двигателыюго аппарата и синдромом Рейно, у 29 (69,1%) - стадия генерализации (II) с характерным комплексом периферических и висцеральных проявлений и у 8

(19,1%) - поздняя (терминальная) стадия с явлениями полиорганной недостаточности и далеко зашедшими фиброзно-склеротическими, дистрофическими и сосудисто-некротическими изменениями.

Выделение клинического варианта ССД включало детальную характеристику кожного синдрома, сосудистых проявлений, поражения опорно-двигательного аппарата. Анализ висцеральной патологии проводился отдельно для каждой системы на основании критериев Мес^ег Т. (1999г.) в модификации Гусевой Н.Г., Невской Т.А. (2006г.).

Изменения кожи, являющиеся ведущим диагностическим признаком заболевания, имели место у всех больных. У 27 человек (64,3%) выявлялась стадия плотного отека, у 10 (23,8%) - индурации, у 1 (2,4%) - стадия атрофии. Поражение слизистых оболочек в виде атрофического и субатрофического ринита, фарингита выявлялось у 31 (73,8%) пациентов.

В торым по распространенности проявлением ССД в исследуемой группе был синдром Рейно (95,2% пациентов). Дигитальные ишемические нарушения имели место у 5 больных (11.9%).

Суставно-мышечные изменения были представлены артритами и/или теносиновитами - 42,8%, миалгиями и мышечной слабостью - 33,3%. Кальцииноз мягких тканей был диагностирован рентгенологически у 3 пациентов.

Поражение легких было самым распространенным висцеральным проявлением в группе больных ССД и включало в себя базальный пневмофиброз -20 (47,6%), легочную гипертензию - 11 (26,2%) и адгезивный плеврит - 7 (16,7%). Среди пациентов с длительностью заболевания более 10 лет процент легочной патологии достигал 96%.

При рентгенологическом и/или эндоскопическом обследовании патология ЖКТ (эзофагит, гастродуоденит, гипотония пищевода и кишечника, грыжа пищеводного отверстия диафрагмы) в различных сочетаниях выяв-лялась у 24 (57,1%) больных.

Кардиологический диагноз был сформулирован у 20 больных (47,6%) и представлял собой ишемическую болезнь сердца, некоронарогенный кардиосклероз и перикардит. Патология сердечно-сосудистой системы при ССД диагностировалась путем сбора жатоб, предъявляемых пациентом, анамнеза, а также дополнительных методов обследования, обязательными из которых были ЭКГ и ЭхоКГ. Среди ЭКГ-признаков наиболее часто выявлялись нарушения ритма и проводимости. ЭхоКГ-

признаки включали в себя гипертрофию левого желудочка, кальциноз фиброзного кольца аортального клапана, фиброз створок аортального и митрального клапанов, систолическую и диас-толическую дисфункцию левого желудочка, расслоение листков перикарда.

Поражение почек наблюдалось у 6 больных и проявлялось в основном умеренной лабораторной и клинической симптоматикой, соответствующие I степени тяжести почечной патологии (4 пациента). Более тяжелые нарушения (креатинин > 180 мкмоль/л) - диагностированы у 2 больных.

Синдром Шегрена выявлялся у 7,1% пациентов опытной группы.

Практически половина из обследованных больных ССД - 20 человек (47,6%) - принимали ГКС системного действия. Цитостатические препараты в качестве монотерапии и в дополнение к ГКС принимали 14,3% больных. Антифиброзная терапия была назначена 15 больным (35,7%). В качестве пато-генетических и симптоматических средств использовали НПВС, блокаторы кальциевых каналов и ингибиторы АПФ, дезагреганты, ангиопротекторы, метаболиты, диуретики, блокаторы протоновой помпы и средства, улучшающие моторику ЖКТ. В систему комплексного лечения больных ССД включали также лечебную физкультур)1, массаж и физиотерапевтическое лечение.

Медиана продолжительности госпитализации составила 32 дня (диапазон от 15 до 59 дней).

Результаты собственных исследований и их обсуждение Содержание антител к эластину

При исследовании крови лиц референтной группы на наличие антител к эластину распределение оптической плотности соответствовало нормальному типу. Среднее значение оптической плотности составило для группы 0,039 ± 0,063 е.о.п. Верхняя граница нормальных значений, рассчитанная как М+За, составила 0,131 е.о.п. Частота выявления антител для группы в целом - 17,5%. Среднее значение антител к эластину у лиц контрольной группы составило 0,083±0,042е.о.п., 95% ДИ: 0,070-0,094 е.о.п. Статистически значимых изменений в зависимости ог пола и возраста выявлено не было.

Антитела к эластину были выявлены у 16 (38,1%) больных основной группы, составляя в среднем 0,125±0,068 е.о.п., 95% ДИ - 0,116-0,134 е.о.п. Отмечены статистически значимые различия между исследуемыми показателями при ССД и в группе контроля (р=0,040).

Таблица I. Взаимосвязь между активностью ССД иуровнем антител к эластину

Степень Общее Частота Антитела к эластину, е.о.п.

активности число выявления До лечения, После лечения,

ССД наблюде антител к М • М

ний, п эластину, «(%) т т

I степень 16 5(31,3%) 0,099 0,008 0,097 0,006

II степень 22 8 (36,4%) 0.121 0,007 0,120 0,006

III степень 4 3 (75,0%) 0,138 0,004 0,121 0,004

Нами была проанализирована взаимосвязь между уровнем антител к эластину и активностью ССД на различных этапах лечения. Как видно из приведенных в таблице 1 данных, повышение уровня антител к эластину выявлено у 31,3% больных ССД с I степенью активности патологического процесса, 36,4% со II степенью активности и у 75,0% с максимальной степенью активности заболевания. При анализе значений исследуемых антител были выявлены статистически значимее различия между группами больных ССД с разной степенью активности заболевания (р=0,022), при этом отмечалось повышение уровня антител по мере ее возрастания.

Динамика изучаемых показателей в процессе лечения показала достоверно меньшее значение уровня антител к эластину при III степени активности ССД по сравнению с прочими пациентами (р=0,031). В остальных группах наметилась тенденция к нормализации уровня исследуемых антител, но различия между показателями до и после лечения были недостоверны.

Как видно из таблицы 2, повышение уровня антител к эластину наблюдалось у 100% больных с острым течением заболевания, 46,7% - с под острым течением и 28,0% - с хроническим. Средняя концентрация антител к эластину в группах с различным течением ССД достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,001), и разница между показателями антител к эласгину Уровень антител к эластину в группах с хроническим и подострым течением, как в начале лечения, так и перед

11

выпиской из стационара колебался в небольших пределах с тенденцией к снижению, что не обусловило достоверных различий. В группе с острым (быстро прогрессирующим) течением разница показателей в указанные периоды была статистически значима (р=0,028), но и после лечения уровень антител выше, чем в группе контроля.

Таблица 2. Взаимосвязь между характером течения ССД и уровнем антител к эластину

Характер Общее Частота Антитела к эластину, е.о.п.

течения число выявления До лечения, После лечения,

ССД наблюде антител к М М

ний, п эластину, «(%) т т

Хроническое течение 25 7 (28,0%) 0,115 0,009 0,114 0,005

Подосгрое течение 15 7 (46,7%) 0,132 0,006 0,129 0,007

Острое течение 2 2 (100,0%) 0,148 0,005 0,121 0,005

Проведен анализ взаимосвязи между встречаемостью того или иного клинического признака у больных ССД с наличием антител к эластину и при их отсутствии. Большинство клинических проявлений встречалось приблизительно в равных соотношениях у пациентов с наличием и отсутствием антител к эластину. Статистически значимые различия обнаружены лишь для поражения суставов и базатьного пневмосклероза (р<0,001).

В таблице 3 представлены описательные характеристики групп больных ССД, имеющих различные клинические признаки заболевания, с указанием уровня значимости различия с группой больных ССД без соответствующего проявления.

Таблица 3. Уровень антител к эластину в зависимости от наличия клинико-иммунологических проявлений у больных ССД

Количе Концентрация антител к эластину, е.о.п.

Орган (система) или ство \ftSD

клинический признак, паци Больные с Больные без проявления

ептов наличием

(п) проявления

Артрит/теносиновит 18 0,153±0,072# 0,117±0,076#

Базальный пневмосклероз 20 0,149±0,074л 0,108±0,087л

Примечание: # р = 0,004;л р = 0,003

Так как эластические волокна в большом количестве содержатся в связках и легочной ткани, аутоиммунный процесс, затрагивающий эластин, проявляется соответствующей симптоматикой. Включение аутоиммунных механизмов с индукцией синтеза антител к эластину, вероятно, является одним из факторов развития воспалительных изменений в связках и синовии. Характерно, что из пациентов опытной группы, положительных по антителам к эластину, большинство имели не просто артралгии, а тендиниты и стойкие синовиты. Очевидно, что при отсутствии адекватной терапии, возникшие вследствие аутоиммунизации, нарушения обмена эластина стимулируют антителообразование к нему, создавая "порочный круг".

Отличительными признаками склеродермического процесса в легких являются воспалительный процесс в атьвеолах, утолщение мембраны и/или структурные изменения микроциркуляторного русла, приводящие к развитию интерстициального заболевания легких или легочной артериальной гипертензии. Временная и причинно-следственная взаимосвязь факторов, участвующих в интерстициальном фиброзе до конца не ясна Анализируя полученные в нашем исследовании результаты, можно предположить участие антител к эластину в процессах ремоделирования легочной паренхимы. По-видимому, в развитие интерстициального заболевания легких при ССД определенный вклад вносят процессы дезорганизации и деградации эластина, приводящие к снижению эластичности легочного каркаса и усугублению процессов фиброзообразования.

Интерстициальное заболевание легких является частым осложнением ССД, приводящим к снижению качества жизни, что делает особенно актуальной диагностику раннего вовлечения легких в патологический процесс. Известно, что рентгенография легких в начатьной стадии фиброзирующего альвеолита бывает недостаточно информативна и обладает низкой чувствительностью. Разработка новых, высокочувствительных маркеров легочного ремоделирования, выявляемых на ранних стадиях ССД, является актуальным направлением научных изысканий. В

связи с этим, механизм участия антител к эластину в развитии патологии легких при ССД требует дальнейшего изучения.

Содержание антител к эластазе

Исследование сывороток крови здоровых лиц на наличие антител к эластазе показало, что распределение оптической плотности данного показателя у лиц референтной группы соответствует нормальному типу. Не харак-терных для нормального распределения частот, которые могли быть обусловлены наличием специфических антител, выявить в данной группе не удалось.

Среднее значение оптической плотности составило для группы здоровых лиц 0,095 е.о.п., 95% ДИ 0,090-0,100 е.о.п. Верхняя граница нормальных значений, рассчитанная как М+За, составила 0,112 е.о.п. Среднее значение антител к эластазе улиц контрольной группы составило 0,103±0.037е.о.п., 95% ДИ: 0,089-0,110 е.о.п.

Частота обнаружения антител к эластазе для группы в целом составила 20,0% (8 человек). Не было выявлено статистически значимых изменений изучаемого показателя в зависимости от пола и возраста.

Из 42 находившихся под нашим наблюдением больных ССД антитела к эластазе были обнаружены у 52,4% (22 человека). Среднее их значение составило 0,143±0,071 е.о.п., 95% ДИ для М - 0,138-0,159 е.о.п. Отмечены статистически значимые различия в исследуемом показателе у больных ССД по сравнению с лицами контрольной группы (р=0,038).

При сравнении групп больных ССД с различной степенью активности патологического процесса и референтной группы методом дисперсионного анализа были выявлены статистически значимые различия для антател к эластазе (р<0,001).

Концентрация антител к эластазе на различных этапах лечения и частота их выявления в зависимости от степени активности заболевания представлены в таблице 4.

Таблица 4. Взаимосвязь между активностью ССД и уровнем антител к

эластазе

Степень Общее Частота Антитела к эластазе, е.о.п.

активности число выявления До лечения. После лечения.

ССД наблю антител к М М

дений, п эластазе. т т

«(%)

I степень 16 6(37,5%) 0,119 0,116

0,006 0,005

13 (59,1%) 0,141 0,134

II степень 22

0,006 0,007

III степень 3 (75,0%) 0,168 0,161

4

0,005 0,006

Повышение уровня антител к эластазе выявлено у 37,5% больных ССД с I степенью активности патологического процесса (6 человек), 59,1% со II степенью (13 человек) и у 75.0% с максимальной степенью активности (3 человека). Концентрация антител к эластазе у больных ССД при поступлении в стационар была достоверно выше уровня аналогичного показателя в контрольной группе. Статистически значимые различия (р=0,042) выявлены и между группами больных ССД с различной степенью активности заболевания. Анализ динамики антител к эластазе в процессе лечения не показал статистически достоверных изменений изучаемого показателя.

Повышение уровня антител к эластазе наблюдалось у 2 (100%) больных с острым течением заболевания, 9 (46,7%) - с подострым течением и 11 (28,0%) - с хроническим. При анализе количествишых показателей выявлено," что средняя концентрация антител к эластазе в каждой из групп превышает рассчитанную границу нормы, а также средние значения АТ к эластазе в группе контроля. Разница между уровнем исследуемых антител в группах с различным течением ССД была статистически достоверной.

В процессе лечения наблюдалась тенденция к снижению уровня анти-тел к эластазе в группах с хроническим и подострым течением, но динамика показателей не была статистически достоверной. В группе с острым (быстро прогрессирующим) течением разница показателей изучаемых антител до и после лечения была статистически значимой (р=0,041).

Анализ частоты и концентрации антител к эластазе у больных ССД в зависимости от стадии и продолжительности заболевания был проведен с целью изучения возможных патогенетических механизмов прогрессирования фиброзообразования и микроциркуляторных нарушений.

Результаты о содержании антител к эластазе в зависимости от стадии склеродермического процесса и продолжительности болезни представлены в таблице 5.

Приведенные данные не демонстрируют достоверных отличий между изучаемыми показателями на разных стадиях ССД, однако следует отметить, что в группе больных с начальной стадией заболевания выявлен достаточно высокий процент пациентов, позитивных по антителам к эластазе (60%). Схожий результат получен в подгруппе ССД с продолжительностью заболевания менее 5 лет. Ввиду малой численности данных подгрупп преобладание не было достоверным, хотя подобная закономерность делает перспективным дальнейшее исследование антителообразования к эластазе, как возможного иммунологического маркера ранней ССД

При анализе статистической взаимосвязи продолжительности болезни и возраста дебюта заболевания с наличием антител к эластазе у больных ССД достоверной корреляции обнаружить не удалось (р=0,03 5).

Таблица 5. Взаимосвязь стадии ССД и уровня антител к эластазе

Стадия Общее Частота Антитела к эластазе, е.о.п.

ССД число выявления До лечения, После лечения,

наблюде антител к М М

ний, п эластазе, п (%) т т

I стадия 5 3 (60,0%) 0,147 0,009 0,124 0,008

II стадия 29 15(51,7%) 0,142 0,003 0,118 0,004

III стадия 8 4 (50,0%) 0,142 0,005 0,118 0,007

Частота выявления и уровень антител к эластазе были пранатизированы также в зависимости от формы ССД и наличия или отсутствия того или иного клинико-лабораторного синдрома У больных ССД была показана статистически значимая взаимосвязь между наличием поражения ЖКТ и распространенностью антител к эластазе (р=0,044). С иными вариантами поражения органов достоверной ассоциации найдено не было.

Большинство клинических проявлений встречалось в относительно равных соотношениях у пациентов с наличием антител к эластазе и отрицательных по данному признаку. Статистически значимое различие с негативной по антителам к эластазе группой больных ССД было отмечено лишь при наличии поражения сердца (р<0,001).

Анализ уровня изучаемых ан тител в зависимости от наличия поражения того или иного органа (системы) показал, что достоверное их повышение наблюдается во всех рассматриваемых группах, превышая медиану значений исследуемого показателя в контрольной группе (р<0,001).

Наиболее высокие уровни исследуемых антител, статистически достоверно превосходящие данные показатели в группах с другими клинико-лабораторными признаками, отмечались у пациентов с сердечно-сосудистой патологией (р<0,01).

Аутоиммунное воспаление при системных ревматических заболеваниях в настоящее время рассматривается как один из факторов риска развития раннего атеросклероза и связанных с ним кардиоваскулярных осложнений. Взаимосвязь между аутоиммунным воспалением и атеросклеротическим поражением сосудистой стенки при ССД до конца не ясна. Среди возможных механизмов иммунного атеросклероза называют прямое нроатерогенное действие антител, стимуляцию ими синтеза молекул адгезии и цитокинов, захват окисленных ЛПНП, индукцию каскада сериновьк протеиназ коагуляционной системы. Широкая субстратная специфичность нейтрофильной эластазы предполагает ее участие в указанных процессах, а антителообразование к ней, вероятно, является одним из стимулирующих факторов развития сосудистого воспаления и гиперкоагуляции.

Согласно литературным данным, у 50-60% пациентов ССД помимо поражения микроциркуляторного русла, наблюдается патология сосудов среднего калибра. Среди наблюдавшихся нами больных, позитивных по антителам к эластазе, основными клиническими проявлениями были ИБС и атеро-склероз аорты. Это свидетельствует не только о комбинации различных механизмов в развитии аутоиммунных васкулопатий - эндотелиальной дисфункции, повышенного тромбообразования и раннего атерогенеза, но и об определенной роли специфических аутоантител, вызывающих нарушение структуры и эластичности сосудистой стенки. Способствуя возникновению и усугублению всех выше названных механизмов, антитела к эластазе являются своеобразным предиктором развития сосудистой патологии при ССД.

Нами была произведена количественная оценка диагностической эффективности изучаемых антител при дифференцировании ССД от заболеваний, составивших контрольную группу.

Характеристическая кривая концентрации антител к эластазе ограничивала на ROC-графике площадь (AUC), равную 0,676 (95%ДИ 0,604 - 0,748); отличие AUC от 0,5 было статистически значимым (р < 0,001).

Ддя антител к эластину AUC составила 0,572 (95%ДИ 0,505 - 0,639), при этом р было равно 0,047.

Рисунок 1. Характеристические кривые исследуемых диагностических тестов при ССД.

При анализе массива значений чувствительности и специфичности с помощью ЛОС-анализа было выявлено, что для антител к эластину максимальное значение ЬЯР и минимальное значаще ЫШ наблюдались при экстинкции 0,104 е.о.п., соответствующей точке разделения отрицательных результатов. Для антител к эластазе, напротив, максимальное значение 1ЛР отмечалось для концентрации антител 0,188 е.о.п., которая существенно превышала точку разделения отрицательных результатов.

Таким образом, весь спектр значений антител к эластину был разделен на два клинических интервала, а антител к эластазе - на три. Максимальную

100

100

диагностическую ценность демонстрировал интервал концентраций антител к эластазе от 0,188 е.о.п. и выше. Такой результат теста был высокоспецифичен для ССД и существенно повышал постгестовую вероятность этого заболевания (LRP 11,43), однако встречался менее чем у 30% пациентов (чувствительность 28,24%).

Выявление концентраций антител к эластазе менее 0,188 е.о.п. не было диагностически значимым ввиду невысокой чувствительности и значительной распространенности слабоположительных результатов в контрольной группе (17.50%). Исследование антител к эластину при ССД также продемон-стрировало низкую диагностическую эффективность.

Сопоставляя значения операционных характеристик, получяшые нами для антител к эластину и эластазе, и значения общепринятых лабораторных маркеров ССД - антител к центромерам и антигену Scl-70 (табл.6), можно заключить, что выявление антител к эластазе в высокой концентрации (свыше 0,188 е.о.п.) характеризуется значениями чувствительности (28,57%). специфичности (97,50%) и LRP (11,43), близкими к существующим тестам. Следовательно, определение антител к эластазе в перспективе может быть использовано для верификации диагноза ССД наравне с антицентромерными антителами и антителами к Scl-70. Тем не менее, следует изучить более широкий спектр склеродермоподобных заболеваний и состояний для более точного определения диагностической ценности антител к эластазе.

Таблица 6. Основные операционные характеристики общепринятых маркеров ССД [Reveille et ai, 2003]

Маркер Чувствительность, % Специфичность, % LRP LRN

Антицентромерные антитела 31,0 97,0 12,5 0,7

Ahth-ScI-70 26,0 99,5 52,0 1,5

В настоящее время в патогенезе ССД ведущая роль отводится концепции «иммунного фиброза», поэтому иммунологическим методам придается особое значение в диагностике этого заболевания. Повышение чувствительности и специфичности иммунологических методов диагностики ССД а также совершенствование технических аспектов постановки реакций является важным методическим напраагением современной ревматологии.

Для выявления антител к эластину и эластазе в сыворотках крови больных ССД нами был выбран иммуноферментный метод анализа с использованием гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами. Применение иммобилизированных биополимеров дает этому высокоспециифичному и чувствительному методу ряд неоспоримых преимуществ. Механическая прочность, устойчивость сорбентов к различным физико-химическим и биологическим воздействиям, возможность их неоднократного применения после проведения регенерации позволяет добиться значительного экономического эффекта.

Таким образом, в результате проведенных исследований были разработаны и применены в варианте твердофазного иммуноферментного анализа иммобилизированные гранулированные препараты с магнитными свойствами на основе эластина и эластазы. С их помощью нам удалось продемонстрировать определенную диагностическую ценность исследования антител к системе эластин - эластаза при ССД. Обобщение и систематизация накопленных знаний об антителообразовании к биополимерам экстрацеллюлярного мат-рикса и ферментам, участвующим в их катаболизме, создает основу для разработок иммуноферментного теста на основе ИГАП, способного регистри-ровать минимальные отклонения в содержании специфических антител к большинству известных антигенов. Это, несомненно, станет подспорьем в ди-апюстике и дифференциальной диагностике аутоиммунных ревматических заболеваний, и что немаловажно, прольет свет на общие механизмы их патогенеза.

Выводы

1. Распространенность антител к эластину в сыворотке крови больных системной склеродермией (38,1%) статистически значимо превышала частоту данных антител в контрольной группе, состоявшей из пациентов с другими аутоиммунными ревматическими заболеваниями (17,5%). Концентрация сывороточных антител к эластину у больных системной склеродермией также была достоверно больше, чем в контрольной группе. У здоровых лиц антитела к эластину обнаружены не были.

2. Антитела к эластазе в груше больных системной склеродермией обнаруживались значительно чаще, чем у пациентов контрольной группы (52,4% и 20,0%, соответственно). Концентрация антител к эластазе при системной склеродермии также была статистически значимо выше по сравнению с другими аутоиммунными ревматическими заболеваниями. У здоровых лиц антитела к

эластазе обнаружены не были.

3. При системной склеродермии наличие антител к эластину ассоциируется с поражением суставов и легочной паренхимы, а наличие антител к эластазе - с поражением сердца. В контрольной группе статистически значимых ассоциаций со спектром поражения органов вьмвлено не было.

4. Выявлена статистически значимая прямая тесная корреляционная зависимость между концентрациями антител к эластину и антител к эластазе у больных системной склеродермией. В контрольной группе также имела место менее тесная статистически значимая прямая корреляция между данными показателями.

5. Определение антител к эластазе характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью при дифференцировании системной склеродермии и других аутоиммунных заболеваний, включенных в состав контрольной группы. Специфичность данного исследования значительно возрастает при увеличении концентрации антител к эластазе.

Практические рекомендации

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе эластина и эластазы рекомендуется использовать для выявления антител к ним у больных ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.

2. При определении антител к эластину и эластазе иммуноферментным методом с использованием ИГАП за границы нормы следует считать: 0,104 е.о.п. - для антител к эластину, 0,113 е.о.п. - для антител к эластазе.

3. При вынесении диагностического решения следует использовать следующие значения операционных характеристик определения антител к эластазе: чувствительность 53,38%, специфичность 80,0%, отношение правдоподобия положительного результата 2,62, отношение правдоподобия отрицательного результата 0,60.

4. При выявлении антител к эластазе в высокой концентрации (более 0,188 единиц оптической плотности) специфичность теста увеличивается 'до 97,50%, отношение правдоподобия положительного результата-до 11,43. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Клинико-диагностическое значение определения антнтел к эластину и

эластазе в сыворотке крови больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной склеродермией. / И.П. Гонтарь, Н.В. Ненашева, H.A. Матасова, Э.Р. Аветисова, JI.H. Кочнева, H.A. Зборовская // Кремлевская медицина. Клинический вестник. - 2011 - №2. - С.52 - 56.

2. Антителообразованис к эластину и эластазе у больных диффузными заболеваниями соединительной ткани. / И.П. Гонтарь, Н.В. Ненашева, H.A. Матасова, Э.Р. Аветисова, Л.И. Кочнева, Ö.B. Парамонова. H.A. Зборовская. // Медицинский альманах. - 2012. - №2 (21). - С.79 - 81.

3. Клиническое значение антител к эластину и эластазе при системной склеродермии / Э.Р. Аветисова, О.В. Парамонова, И.П. Гонтарь, А.Б. Зборовский. // Клиническая фармакология и терапия. - 2012. - Т.21. -№4. - С.90-92.

4. Аутоиммунные нарушения в системе пуринового мета-болизма у больных системной склеродермией с висцеральной пато-логией. / JI.H. Шилова, A.B. Александров, Э.Р. Аветисова, О.И. Емельянова, Н.В. Ненашева, Н.И. Емельянов //Труды XI Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» 5-S июля 2011 г., Москва. Российский аллергологический журнал. - 2011. - № 4. - вып.1. - С 426-427.

Статьи в научных сборниках и журналах

1. Антителообразование к системе эластин-элаетаза у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой и системной склеродермией. / Н.В., Ненашева, H.A. Матасова, Л.И. Кочнева, Э.Р. Аветисова, А.Б. Зборовский. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН А.Б.Зборовского/. - Вып. XXVI, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания». - 2009. - С.57-58.

2. Гуморальный ответ на эластин и эластазу у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной склеродермией. / Н.В. Ненашева, H.A. Матасова. Э.Р. Аветисова, Л.И. Кочнева, И.П. Гонтарь. // Материалы конф. «Актуальные проблемы современной кардиологии и терапии». - Киров, 2009. - С. 119-121.

3. Изучение антителогенеза к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной склеродермией. / Н.В.

Ненашева, H.A. Матаеова, Л.И. Кочнева, Э.Р. Аветисова // Материалы 67-й открытой науч-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины»., 22-24 апреля 2009 г. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ. - С 123-124.

4. Образование аутоантител к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом, сисгемной красной волчанкой, системной склеродермией. / Н.В. Ненашева, H.A. Матаеова, Л.И. Кочнева, Э.Р. Аветисова. // Материалы 68-й открытой науч-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины»., 13-15 сентября 2010 г. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ. - С 128129.

5. Аутоиммунитет к эластину и эластазе у больных систем-ной красной волчанкой и системной склеродермией. / H.A. Матаеова, Н.В. Ненашева, Л.И. Кочнева, Э.Р. Аветисова. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН А.Б.Зборовского/. - Вып. XXVII, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2010. - С.64-65.

6. Особенности антителогенеза к эластину и эластазе у больных диффузными заболеваниями соединительной ткани в зависимости от активности воспалительного процесса. / H.A. Матаеова, Э.Р. Аветисова, О.В. Парамонова, О.И. Емельянова, Ю.А. Трубенко И.А. Зборовская. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / под ред. Академика РАМН А.Б.Зборовского/. - Вып. XXVIII, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2011. - С. - 65-66.

7. Клинико-диагностическое значение определения антител к эластину у больных системной склеродермией. / И.П. Гонтарь, Э.Р. Аветисова, О.В. Парамонова, А.Н. Красильников, Н.И. Емельянов, А.Б. Зборовский И Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ /под ред. Академика РАМН А.Б.Зборовского/. - Вып. XXIX, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2012. - С. 20-22.

А В Е Т И С О В А Элина Рафаэловна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭЛАСТИНУ И ЭЛАСТАЗЕ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЫ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 26.04.2013г.Формат 60x84/16. Бум офс. Усл.-печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 155. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства «Перемена», 400131, г.Волгоград, пр-Ленина,27