Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Клинико-диагностическое значение определения антител к глутатионпероксидазе у больных системной склеродермией с использованием иммобилизированной гранулированной формы фермента

На правах рукописи

МОСКВИТИНА

Ольга Викторовна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЕ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГРАНУЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ ФЕРМЕНТА

(14.00.39 - ревматология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград 2009

003464945

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук «НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН» и ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Зборовская Ирина Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Чижов Петр Александрович

доктор медицинских наук, профессор Заводовский Борис Валерьевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский Государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится «_» _2009 г. в_часов на заседании

Специализированного Совета Д 208.008.02 Волгоградского медицинского университета по адресу: 400066, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

профессор А.Р. Бабаева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

ССД является относительно редкой патологией с первичной заболеваемостью 2,7 -12 случаев на 1 ООО ООО населения в год, тем не менее, трудно переоценить ее социально-экономическое значение. Преимущественное поражение лиц трудоспособного периода жизни, высокий процент инвалидизации обуславливают большие экономические потери, включающие высокую стоимость диагностики и лечения, выключение больных из сферы производства, затраты на социальное обеспечение работающих пациентов и инвалидов (ФоломееваО.М. и соавт., 2004, Jonson S.R. et al., 2006).

За последние десятилетия произошел значительный прогресс в представлениях о ССД: исследованы патогенетические механизмы, детально изучены клиника и эволюция заболевания, разработаны основы диагностики и классификация, создана программа патогенетической терапии с дифференцированным использованием антифиброзных, иммуномодулирующих и сосудистых средств (Гусева Н.Г., 2007).

В числе основных задач, инициированных в 2000 - 2010 гг. под эгидой ВОЗ Всемирной декады по заболеваниям, поражающим двигательный аппарат человека (Bone and jont decade), были названы дальнейшее изучение патогенетических механизмов ревматических заболеваний, совершенствование и внедрение в практику новых методов ранней диагностики и лечения с учетом не только клинической, но и экономической эффективности и целесообразности (Насонова В.А. и соавт., 2001).

Как показали новейшие разработки в иммунодиагностике ревматических заболеваний, иммуноферментные методы анализа (ИФА) с использованием магнитоуправляемых сорбентов на основе антигенов нуклеиновой, липидной и белковой природы в полной мере отвечают указанным требованиям. Неоспоримые преимущества метода заключаются, в первую очередь, в повышении стабильности иммобилизированного биополимера, что делает его устойчивым к различным химическим и физическим воздействиям. Помимо этого, иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, тем самым, повышая чувствительность твердофазных методов анализа. Включение магнитного материала в гранулы дает возможность ускорить и упростить манипуляции на всех

этапах исследования, улучшая качественные характеристики определений и увеличивая число обрабатываемых проб. И, наконец, повторное использование сорбента после регенерации ведет к значительному экономическому эффекту (Гонтарь И.П., 2006).

Гранулированные препараты с магнитными свойствами (ИГАП) уже были использованы для усовершенствования иммунодиагностики ССД и выявление антител к кардиолипину, каталазе, фибронектину и другим биополимерам. Как показали исследования, преимущества метода ИФА с применением ИГАП делают его не только экономичным и легко применимым в практической медицине, но и позволяют решить вопросы ранней диагностики ревматических заболеваний благодаря высокой чувствительности и специфичности (Петрова Н.В., 2001, НаджибИ.В.,2006).

В настоящее время продолжается поиск маркеров системного склероза, позволяющих дифференцировать его с другими диффузными болезнями соединительной ткани (ДБСТ), ревматоидным артритом, псевдосклеродермическими и паранеопластическими синдромами, а также прогнозировать клиническую форму и течение заболевания. В этом свете представляют интерес результаты исследования роли активных форм кислорода (АФК) в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Предполагается, что основное значение свободных радикалов при данной патологии связано с их способностью повреждать белки, липиды, ДНК, придавая им свойства аутоантигенов и провоцируя выработку антител. Достигается это значительным усилением выработки активных форм кислорода (перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.), которые приводят к деполимеризации гиапуроновой кислоты, окисляют белки, вызывают перекисное окисление липидов, стимулируют высвобождение протеолитических ферментов и вазоактивных аминов. Считают, что именно АФК ответственны за процессы инактивирования и трансформации ферментов, угнетения функциональной активности иммунокомпетентных клеток (Зборовская И.А., 2005, "Пк1у М. et а!., 2006).

Естественным препятствием патологическому воздействию АФК на собственные ткани является мощная антиоксидантная система (АОС) организма, включающая в себя ферментные и неферментные звенья. Основными энзимными компонентами АОС считают глутатионпероксидазу, супероксиддисмутазу, глутатионредуктазу,

каталазу и церулоплазмин. Они способны нейтрализовать высокоактивные супероксидные анионы, перекись водорода, гидроперекиси жирных кислот, предотвращая накопление особо токсичных вторичных продуктов перекисного окисления липидов.

В клинической практике использование прямых определений АФК, гидроперекисей и других продуктов свободнорадикапьных реакций в биологических жидкостях затруднено из-за технических сложностей. Однако об интенсивности свободнорадикальных процессов можно судить по состоянию и напряженности реакций антиоксидантной защиты. В качестве одной из причин функциональной недостаточности энзимов-антиоксидантов при аутоиммунных заболеваниях считают образование антител к ним (Сущук Е.А., 2002, Зборовская И.А., 2005).

Из всей группы ферментов АОС наименее изученным объектом иммунного ответа при ССД является глутатионпероксидаза (ГП). В связи с этим, представляется актуальным исследовать закономерности антителообразования к глутатионпероксидазе при системной склеродермии, используя иммобилизированную форму фермента. Высокая чувствительность модифицированной методики ИФА дает возможность усовершенствовать способы диагностики системного склероза, выяснить отдельные механизмы патогенеза данного заболевания и обозначить перспективы патогенетической терапии.

Цель работы

Целью настоящего исследования являлось усовершенствование иммунологической диагностики и оценки эффективности лечения системной склеродермии с помощью иммобилизированной формы глугатионпероксидазы.

Основные задачи исследования

1. Получить иммобилизированную форму глутатион-пероксидазы, изучить ее физико-химические свойства;

2. Адаптировать иммуноферментный метод анализа с использованием иммобилизированной глутатионпероксидазы к изучению образования антител к этому ферменту;

3. Изучить активность глутатионпероксидазы и содержание антител к этому ферменту у больных системной склеродермией и здоровых лиц. Исследовать данные показатели и корреляционные

связи между ними у больных ССД в зависимости от активности, стадии, длительности, характера течения заболевания и висцеральных поражений;

4. Изучить динамику антителообразования к глутатион-пероксидазе в процессе стационарного лечения.

Научная новизна работы

Впервые для диагностики ССД созданы и применены в варианте иммуноферментного метода анализа иммобилизированные препараты глутатионпероксидазы. В ходе работы в сыворотках крови больных ССД обнаружены антитела к глутатионпероксидазе. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотке крове здоровых лиц. Выявлена достоверная корреляция между содержанием антител к ГП и активностью патологического процесса. Установлено, что поражение сердечно-сосудистой системы и легких при ССД сопровождается максимальными значениями исследуемых антител. Выявлены обратные корреляционные связи между активностью ГП и антителами к ней. Определена способность исследованных показателей к изменению под влиянием проводимой терапии, что обеспечивает возможность оценки ее эффективности.

Практическая ценность

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к ГП на основе иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами. Выявление антител к ГП в предложенной методике ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики ССД, оценки активности патологического процесса и прогнозирования клинического варианта заболевания. Обнаружение антител к ГП на начальных сроках заболевания позволяет использовать их определение для ранней диагностики ССД. Динамика изученных показателей дает возможность судить об эффективности проводимой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

На защиту выносится положение о возможности определения антител к ГП с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами у больных ССД. Исследование антител к ГП может быть

использовано в качестве дополнительных тестов для диагностики ССД, выделения клинических вариантов заболевания и уточнения степени активности патологического процесса. Динамика этих показателей может служить для оценки эффективности проводимой терапии.

Внедрение в практику

Методы определения антител к ГП с помощью иммобили-зированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в МУЗ ГКБ № 25 г.Волгограда.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах, из которых4- в центральной и 2 - в местной печати.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ (2007 г.), II Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения -2007», XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, в которой изложены современные аспекты иммунопатогенеза системной склеродермии, участии в ее развитии активных форм кислорода и антиоксидантной системы; части II - собственных исследований, состоящей из 6 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методики исследования, полученные результаты, их обсуждение, выводы, практические рекомендации и приложения. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 7 рисунками, приведено две выписки из историй болезни. Указатель литературы содержит 253 источника, в том числе в 95 отечественных и в 158 зарубежных.

Клиническая характеристика больных

Под наблюдением находилось 47 больных системной склеродермией, 45 женщин (94,12%) и 2 мужчин (5,88%) в возрасте от 18 до 65 лет. Диагноз ставился по критериям Американской ревматологической ассоциации (1980 г.) в соответствии с рабочей классификацией Н.Г. Гусевой (1975 г.).

Из числа всех обследованных 35 человек (74,5%) относились к социально активному населению. Средний возраст пациентов -42,2±14,2 лет - приближен к опубликованным статистическим данным о возрастной медиане заболеваемости ССД, что дает возможность экстраполировать свойства выборочной совокупности на генеральную.

Средняя продолжительность болезни в исследуемой группе составила 9,0±3,8 лет. Стаж заболевания до 5 лет отмечался у 22 пациентов (46,8%), 6-10 лет - у 10 (21,3%), 11-15 лет - у 5 (10,6%) и более15лет-у11 (23,4%).

Средний возраст пациентов на начало заболевания составил 33,1 ±13,9 лет. "Пик" заболеваемости пришелся на возрастной период от 30 до 50 лет, когда практически половина больных опытной группы отметили первые признаки болезни (рис.1).

Среди наблюдаемых нами больных инвалидность по данному заболеванию имели 27 человек, из них 18 человек (66,7%) -трудоспособного возраста.

14 12 10 8 6 4 2 О

до 20 лет 21-30 лет 31-40 лет 41-50 лет старше 50 лет Рисунок 1. Кривая возраста начала болезни.

По степени активности патологического процесса больные распределились следующим образом: I степень была диагностирована у 24 человек (51,1%), II степень - у 22 человек (46,8%), Шстепень-у1 (2,1%) пациента.

У 20 больных (42,6%) течение заболевания расценено как хроническое (медленно прогрессирующее), у 26 (55,3%) - как подострое (умеренно прогрессирующее), у 1 (2,1%) - как острое

(быстро прогрессирующее). Ввиду малого количества больных с острым течением и максимальной активностью пациенты с острым и подострым течением, II и 111 степенями активности в дальнейшем будут рассматриваться в одной группе.

При хроническом течении ССД у подавляющего большинства больных (90%) наблюдалась низкая активность заболевания (рис. 2).

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

'ШЖ

■

Й&ЙЙ; KiKSffi

Ж.'.::::.'.::

iiiiififtftiJ

□ III Щ]П

□ I

хроническое подострое острое

Рисунок 2. Зависимость характера течения от активности ССД.

Подострое течение в 76,9% случаев сопровождалось умеренной активностью заболевания. Максимальная степень активности патологического процесса имела место у пациентки с острым течением.

Стадия начальных изменений в исследуемой группе была диагностирована у 19 пациентов (40,4%), стадия генерализации процесса - у 26 больных (55,3%), поздняя (терминальная) стадия - у 2 больных (4,2%).

Среди пациентов с продолжительностью заболевания менее 5 лет стадия начальных проявлений была диагностирована в 66,7% случаев, II стадия - у 33,3% больных. У лиц со стажем болезни 6-10 лет это соотношение составило 50% (I стадия) против 50% (II стадия). При продолжительности заболевания 11 - 15 лет в 100% случаев наблюдалась стадия выраженных изменений (II). В группе больных с более чем 15-летним стажем болезни в 83,3% случаев была диагностирована II стадия, а в 16,7% - III (терминальная) стадия заболевания (рис. 3).

Продолжительность заболевания (лет)

Рисунок 3. Зависимость стадии ССД от длительности заболевания.

Приведенные данные демонстрируют сравнительно быструю генерализацию процесса при ССД с развитием необратимых изменений у некоторых больных уже в первые 5 лет болезни.

Клиническая картина ССД в опытной группе отличалась полиморфностью и полисиндромностью, отражая системный характер заболевания. Однако изменения кожи, являющиеся одним из ведущих диагностических признаков заболевания, определялись у всех обследованных больных. Наиболее частыми проявлениями были маскообразность лица, склеродактилия, гиперпигментация и выпадение волос.

В зависимости от степени распространенности изменений кожи у 34 (72,3%) больных была диагностирована лимитированная форма ССД, у 13 (27,7%) - диффузная. У 40 (85,1%) пациентов выявлялось одновременное поражение слизистых оболочек в виде атрофического и субатрофического ринита, фарингита.

Вторым по распространенности проявлением ССД в исследуемой группе был синдром Рейно. Он встречался у 44 пациентов (93,6%). Дигитапьные ишемические нарушения имели место у 5 больных (10,6%).

Суставной и мышечный синдромы были диагностированы у 34 больных (72,3%), создавая наряду с кожными проявлениями и синдромом Рейно картину характерного для ССД периферического

симптомокомплекса. Поражение опорно-двигательного аппарата включало полиартриты - 19 пациентов (40,4%), полиартралгии - 11 (32,4%), миозиты и миалгии - 16 (34,0%), остеолиз - 2 (4,3%), кальциноз мягких тканей - 3(6,4%).

Из висцеральной патологии наиболее часто (в 59,6 % случаев) наблюдалось поражение ЖКТ в виде эзофагита, гастродуоденита, колита, гипотонии пищевода и кишечника, грыжи пищеводного отверстия диафрагмы. Диагноз во всех случаях был подтвержден данными рентгенологического и/или эндоскопического исследования.

Кардиальная патология выявлялась у 21 человек опытной группы (44,7%) и была представлена в основном ишемической болезнью сердца (стенокардия напряжения и покоя, острый инфаркт миокарда в анамнезе) - 13 человек. В 10,6% случаев при ЭхоКГ-исследовании выявлялось нарушение сократительной способности миокарда (снижение ФВ менее 55% по Тейкхольцу), обусловленное некоронарогенным кардиосклерозом. У 4 человек (8,5%) обнаруживались явления перикардита в виде утолщения оболочки и наличия небольшого количества жидкости, у 3 человек - пролапс митрального клапана.

Легочные проявления (базальный пневмофиброз, адгезивный плеврит, легочная гипертензия) встречались в 51,1% случаев. У 10 человек (27%) поражение легких было бессимптомным и выявлялось при рентгенологическом обследовании, иногда предшествуя кожным проявлениям и синдрому Рейно.

Поражение нервной системы отмечалось у 12 пациентов (25,5%) и включало явления церебрального васкулита - у 8 больных (17,0%) и сенсорной невропатии - у 4 больных (8,5%).

У 9 больных (42,3%) наблюдалось поражение почек, проявлявшееся умеренной лабораторной и клинической симптоматикой (олигурия, протеинурия, изменения мочевого осадка). Преходящая азотемия наблюдалась у 2 пациентов.

Из общих проявлений наиболее часто наблюдалась потеря массы тела. В период генерализации процесса данный симптом встречался у 23 больных.

В таблице 1 показана зависимость основных лабораторных показателей, определяемых у больных ССД, от степени активности заболевания.

Сравнение лабораторных показателей больных ССД с различной степенью активности заболевания

Показатель Норма* Активность

Минимальная (I) Умеренная (II)

Количество эритроцитов 3,7-5,1 -101г/л 4,2±1,8 3,4±1,2

Гемоглобин 115-164 г/л 126,4±18,7 116,1±16,4

Количество лейкоцитов 4-9 -Ю'/л 5,8±2,7 6,1±3,4

СОЭ# 2-15 мм/ч 10,1±7,6 26,5±11,5

Серомукоиды 0,22-0,28г/л 0,23±0,09 0,29±0,05

Г-шобулины 12,8 -19,0% 18,1±7,4 19,6±4,1

Аг-глобулины 5,1-9,2% 7,8±4,9 9,3±3,5

Фибриноген 2-4 г/л 3,41±0,28 4,1±0,84

Протеинурия <0,02 г/л 0,001±0,0007 0,018±0,004

Креатинин сыворотки 15-98ммоль/л 78,3±18,4 92,5±15,9

Общий белок сыворотки 62-83г/л 76,2±12,6 74,3±9,5

ЦИК# <4 усл.ед. 3,48±1,9 5,82±3,1

АНФ Отр. +/- +

Примечание

* Нормальные показатели даны согласно практическим рекомендациям, приведенным в соответствующих руководствах [28,70].

# -достоверные различия между группами.

Все больные ССД, находившиеся под нашим наблюдением, получали комплексную медикаментозную терапию, включавшую антифиброзные средства, противовоспалительные препараты, ангиопротекторы, иммунодепрессанты, метаболиты. Широко применялась экстракорпоральная, локальная, реабилитационная и симптоматическая терапия.

Базисную антифиброзную терапию D-пеницилламином в дозах 125 - 750 мг/сут. получали 23 человека (49%).

Глкжокортикостероиды системного действия в дозах 2,5 - 40 мг/сут принимали 25 (53,2%) больных, в основном с II (III) степенью

активности заболевания. Во всех случаях учитывались рекомендации EULAR по применению системной глюкокортикоидной терапии при ревматических заболеваниях (Jakods Y. et al., 2007)

Из НПВС, назначенных 34 больным (72,3%), предпочтение отдавалось селективным ингибиторам ЦОГ-2 (нимесулид, мелоксикам), несколько реже назначались кетопрофен и диклофенак.

В качестве патогенетических средств, влияющих на систему микроциркуляции, использовали блокаторы кальциевых каналов (нифедипин, амлодипин) и ингибиторы АПФ (каптоприл, энапаприл, периндоприл, лизиноприл), обладающие к тому же нефропротек-тивным действием. Дозы препаратов подбирались индивидуально в зависимости от уровня АД и переносимости.

В систему комплексного лечения больных ССД включали также ЛФК, массаж и локальную терапию. ФТЛ получали 35 больных (53,2%). Плазмаферез назначался 15 пациентам (31,9%).

Медиана продолжительности госпитализации составила 21,9±5,9 дней (диапазон от 14 до 40 дней).

Материалы и методы исследований

В качестве антигена использовался препарат глутатион-пероксидазы производства НПО "РЕАХИМ" серия 186-68 с активностью 380 ЕД/мг и концентрацией белка 94,5 мг/мл. Антитела к ГП определялись твердофазным иммуноферментным методом с использованием ИГАП. Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля (Гонтарь И.П. с соавт., 2002 г.). Результаты учитывали на многоканальном спектрофотометре АС-8К (Белоруссия) при длине волны 492 нм. Полученные значения выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.). Наличие антител считалось положительным при превышении величин экстинции на 2 стандартных отклонения от средних значений контрольной группы.

Определение активности ГП в плазме крови производили спектрофотометрическим методом по Flohe L., Ganzler W.A, 1984 г. При расчете активности фермента использовали рекомендации B.C. Асатиани. За единицу активности ГП принято количество фермента, которое при t=+37С за 1 час окисляет 1 мкМ GSH.

Обработка полученных результатов проводилась с использованием программных пакетов «STATGRAPHICS 3,0» И «STATISTICA 6,0», а также по оригинальным программам с использованием формул, приведенных в соответствующих руководствах (Зайцев В.М. и др., 2003 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность ГП и уровень антител к ней у здоровых лиц

Среднее значение активности ГП в контрольной группе составило 0,150±0,083 ЕД/мл, амплитуда колебаний - 0,087 - 0,198 ЕД/мл. Зависимости показателей активности изучаемого фермента от пола и возраста выявлено не было (р>0,05).

Средняя концентрация антител к ГП в сыворотках крови здоровых лиц составила 0,0450,003 е.о.п. Уровень нормальных показателей определяли ^ак сумму среднего и двух среднеквадратических отклонений (X + 2а). Исходя из этого, значения экстинции 0,0785 в ЕУЗА-тесте с использованием ИГАП были приняты за верхнюю границу нормы.

Активность ГП и уровень антител к ней у больных ССД

У 47 больных ССД, обследованных нами, активность ГП в плазме крови при поступлении на стационарное лечение колебалась от 0,034 до 0,195 ЕД/мл и составила в среднем 0,082±0,006 ЕД/мл, т.е. была достоверно ниже аналогичного показателя у здоровых лиц (р<0,05).

Содержание сывороточных антител к ГП у больных ССД варьировало в пределах от 0,056 до 0,139 е.о.п. Медиана значения составила 0,097е.о.п., что достоверно превышало данный показатель в контрольной группе (р<0,001). Антитела к ГП выявлены у 17 больных (36,1%).

Влияние специфических антител к ГП на ее активность было показано нами при анализе активности фермента у больных ССД с наличием АТ к ГП и без АТ к ГП. У больных с наличием антител к ГП отмечено заметное снижение активности ГП (0,049±0,005 ЕД/мл, р<0,01), в то время как при их отсутствии оно было статистически незначимым (0,128±0,006 ЕД/мл, р>0,05).

Был проведен анализ показателей активности ГП в плазме крови и содержания антител к ней у больных с различной степенью активности патологического процесса. Результаты представлены в таблице 2.

Концентрация антител к ГП у больных с различной степенью активности ССД при поступлении на стационарное лечение была достоверно выше уровня аналогичного показателя у доноров (р<0,05). Имела место отчетливая тенденция к росту содержания аутоантител с повышением активности патологического процесса, что обусловило статистически достоверную разницу между подгруппами больных с минимальной и умеренно-максимальной степенью активности заболевания (р<0,05).

Активность ГП в плазме крови и содержание антител к ГП у больных с различной степенью активности ССД.

Группа Показатель Активность ССД

Низкая M (s) Умеренная и высокая M (s)

Все больные ССД (п=47) Активность ГП, ЕД/мл До лечения 0,121 (0,006) 0,061 *# (0,003)

После лечения 0,137 (0,004) 0,112А (0,007)

Антитела к ГП, е.о.п. До лечения 0,084* (0,003) 0,112*# (0,004)

После лечения 0,058A (0,009) 0,083*А (0,006)

Больные ССД с АТ кГП (п=17) Активность ГП, ЕД/мл До лечения 0,056* (0,009) 0,041* (0,005)

После лечения 0,098*A (0,006) 0,084*А (0,007)

Больные ССД без АТ к ГП (п=30) Активность ГП, ЕД/мл До лечения 0,134 (0,005) 0,126 (0,008)

После лечения 0,137 (0,008) 0,129 (0,007)

Примечание:

* -достоверные различия с группой доноров;

# -достоверные различия между клиническими группами;

Л -достоверные различия между показателями до и после лечения.

Сравнивая показатели крови больных с низкой активностью ССД при выписке из стационара с аналогичными показателями здоровых лиц, выявлено, что активность плазменной ГП в обеих группах практически не имеет достоверных различий. У больных с умеренной и высокой активностью заболевания в завершение курса лечения выявлено статистически значимое повышение активности ГП по сравнению с исходным уровнем (р < 0,05).

Анализ активности ГП и содержания антител к ней у больных с различным характером течения ССД представлен в таблице 3.

Как видно из таблицы, при поступлении в стационар у всех больных ССД, независимо от характера течения заболевания, отмечалось уменьшение активности ГП в плазме крови (р<0,05). Повышение сывороточных антител к ферменту также наблюдалось во всех группах (р<0,05), но было более выражено при подостром и остром течении заболевания, однако достоверных различий в показателях между рассматриваемыми категориями пациентов найдено не было. Как было показано ранее, наличие антител к ГП ассоциировалось с более выраженным снижением активности фермента (р<0,01).

По окончании курса лечения наблюдалось некоторое повышение активности ГП в плазме крови и снижение содержания аутоантител. В группе больных с хроническим течением заболевания концентрация исследуемых антител перед выпиской достигла нормальных значений, а при остром и подостром течении сохранялась достоверная разница с группой доноров, что обусловлено преобладанием среди них пациентов с умеренной и максимальной активностью заболевания.

У больных с антителами к ГП отмечалась более низкая активность ГП относительно исходных значений, атакже по сравнению с отрицательными по АТ к ГП пациентами. Статистически достоверной разницы между содержанием антител к ГП у больных ССД в зависимости от характера течения заболевания по окончании лечения выявлено не было.

Нами было проанализировано возможное влияние стадии заболевания на активность ГП и содержание антител к ней у больных ССД. Уровень антител к ГП в представленных группах, как в начале лечения, так и перед выпиской из стационара колебался в небольших пределах, что не обусловило статистически достоверных различий. В то же время у больных с терминальной стадией активность ГП была ниже, чем в остальных группах (таб.4).

Активность ГП в плазме крови и содержание антител к ГП у больных с различным характером течения ССД

Характер течения заболевания

Группа Показатель Хроническое M (s) Подострое и острое M (s)

Все Активность До 0,107* 0,088*

больные ГП, ЕД/мл лечения (0,006) (0,004)

ССД После 0,120 0,123А

(п=47) лечения (0,006) (0,009)

Антитела к До 0,086* 0,109*

ГП, е.о.п. лечения (0,004) (0,005)

После 0,069 0,084*л

лечения (0,008) (0,009)

Больные Активность До 0,052* 0,047*

ССД с AT ГП, ЕД/мл лечения (0,005) (0,006)

к ГП После 0,083* 0,076*

(п=17) лечения (0,009) (0,007)

Больные Активность До 0,131 0,129

ССД без ГП, ЕД/мл лечения (0,004) (0,008)

АТкГП После 0,139 0,130

(п=30) лечения (0,009) (0,007)

Примечание:

* -достоверные различия с группой доноров;

# -достоверные различия между клиническими группами;

Л -достоверные различия между показателями до и после лечения.

На закономерность подобных результатов указывалось ранее, при исследовании активности широкого спектра ферментов АОС при РЗ (Зборовская И.А., 1995). Снижение активности энзимов свидетельствует о резком угнетении буферной емкости антиоксидантной защиты и явном ослаблении резистентности организма больных, что характерно для терминальной стадии заболевания. При этом наблюдается интенсификация процессов ПОЛ, что выявляется по повышенному содержанию малонового диальдегида (МДА). Таким образом, депрессия активности

ферментов-антиоксидантов по мере увеличения продолжительности болезни и перехода болезни в завершающую стадию, вполне обоснованна: длительно текущий аутоиммунный воспалительный процесс, сопровождаясь хроническим стрессом, приводит к истощению продукции и индукции энзимов, и как следствие к снижению их активности.

Особый интерес представляют результаты исследования содержания антител к ГП у пациентов, имевших продолжительность заболевания менее 1 года: они обнаруживались у обоих пациентов этой группы. Данный факт свидетельствует о том, что антитела к ГП появляются на начальных стадиях болезни и могут, таким образом, служить в качестве раннего диагностического признака.

Таблица4.

Активность ГП в плазме крови и содержание антител к ГП у больных ССД в зависимости от стадии заболевания

Стадия заболевания

Группа Показатель I II III

М(в) М(8) М(э)

Все Активность До лечения 0,096* 0,072* 0,068*

больные ГП, ЕД/мл (0,008) (0,005) (0,004)

ССД После 0,124 0,092* 0,094

(п=47) лечения (0,007) (0,008) (0,004)

Антитела к До лечения 0,094* 0,099* 0,106*

ГП, е.о.п. (0,005) (0,005) (0,007)

После 0,065 0,059 0,084*

лечения (0,009) (0,006) (0,003)

Больные с Активность До лечения 0,059* 0,051* 0,039*

АТкГП ГП, ЕД/мл (0,004) (0,005) (0,006)

(п=17) После 0,081* 0,088* 0,069*

лечения (0,006) (0,004) (0,006)

Больные Активность До лечения 0,131 0,127 0,122

без АТ к ГП, ЕД/мл (0,008) (0,004) (0,007)

ГП После 0,136 0,128 0,134

(п=30) лечения (0,005) (0,007) (0,006)

Примечание:*-достоверные различия с группой доноров.

Исследование механизмов поражения тех или иных органов при аутоиммунных заболеваниях показало, что зачастую оно связано с избирательным действием аутоантител или иммунокомплексным воспалением. Диагностика поражения того или иного органа на доклиническом этапе несомненно является чрезвычайно важным направлением современных исследований, т.к. коррекция начинающихся нарушений дает возможность предотвратить дальнейшее развитие органной патологии, что, несомненно, положительно отразится на качестве жизни больного и на ее прогнозе. Так, по мнению ряда авторов, крайне редкое развитие в настоящее время острой склеродермической нефропатии - грозного и прогностически неблагоприятного проявления ССД, обусловлено превентивным эффектом современной фармакотерапии ф-пеницилламин, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента).

Изучение активности ГП в плазме крови больных ССД с различными клиническими проявлениями выявило достоверное снижение данного показателя во всех рассматриваемых группах (табл.5). Минимальные значения выявлялись у больных с поражением сердца и легких, обуславливая достоверные различия между представленными клиническими группами (р<0,05). В этих же группах отмечался наиболее высокий уровень антител к ГП, превосходя аналогичные показатели больных с другими висцеральными проявлениями (р<0,001). Действительно, из 17 положительных по АТ к ГП больных у 15 выявлялась кардиапьная патология по типу ИБС или некоронарогенного кардиосклероза, а у 16-поражение легких.

Динамическое наблюдение за уровнем антител к ГП показало, что значимое снижение исследуемого показателя происходило в половине рассматриваемых групп: у больных с поражением костно-мышечной системы, легких и сердца (р<0,05), в ряде случаев достигая нормальных значений.

По мнению ряда авторов, поражение сердечно-сосудистой системы является основной причиной внезапной смерти больных ССД. При этом на первый план выступают нарушения, не связанные с иммунноопосредованными механизмами повреждения тканей и органов. Речь идет о раннем атеросклеротическом поражении сосудов. Аутоиммунное воспаление рассматривается как один из основных факторов риска развития раннего атеросклероза и связанных с ним кардиоваскулярных заболеваний (Невская Т.А. и соавт., 2007; Шабанова Т.А. и соавт., 2007). В качестве механизма интенсификации атеросклеротического процесса при коллагенозах

называют накопление продуктов перекисного окисления: гидроперекисей липидов и окисленных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). В атероскперотических бляшках обнаруживаются модифицированные гидроперекисями липидов белки, являющиеся антигенными эпитопами и мишенями для антител к окисленным ЛПНП. В этих условиях дефекты функционирования АОС являются важным механизмом, способствующим прогрессированию атероскперо-тического процесса.

Таблица 5.

Активность ГП в плазме крови и содержание антител к ГП у больных ССД в зависимости от клинических проявлений заболевания

Группы п До лечения После лечения

Активность ГП, ЕД/мл AT к ГП, е.о.п. Активность ГП, ЕД/мл АТкГП, е.о.п.

Поражение кожи 47 0,110* (0,002) 0,080* (0,004) 0,113 (0,005) 0,066 (0,008)

Поражение костно-мышечной системы 34 0,100* (0,005) 0,084* (0,004) 0,115 (0,008) 0,034 л (0,009)

Поражение почек 7 0,098* (0,007) 0,081* (0,005) 0,126 (0,007) 0,084* (0,006)

Поражение сердца 21 0,063*# (0,006) 0,120*# (0,004) 0,129 л (0,003) 0,084* А (0,008)

Поражение легких 24 0,065 *# (0,004) 0,117*# (0,008) 0,128л (0,005) 0,066 л (0,007)

Синдром Рейно 44 0,103* (0,008) 0,080* (0,006) 0,118 (0,005) 0,074 (0,004)

Поражение ЖКТ 28 0,113* (0,006) 0,085* (0,004) 0,121 (0,006) 0,079 (0,007)

Поражение нервной системы 12 0,104* (0,008) 0,083* (0,007) 0,117 (0,009) 0,069 (0,004)

Примечание:

*-достоверные различия с группой доноров; #-достоверные различия между клиническими группами; Л -достоверные различия между показателями до и после лечения.

Известно, что снижение активности ГП сопряжено с повышенным риском возникновения сердечно-сосудистых заболеваний (именно с этим связывают рост ИБС в селендефицитных зонах). Обнаруженные нами закономерности позволяют предположить, что антитела к ГП, подавляя ее антиоксидантную активность, являются еще одним фактором в цепи развития атероскперотического процесса.

Другой путь влияния ГП на развитие ишемических процессов -участие в обмене эйкозаноидов, являющихся ключевым звеном эндотелиальной дисфункции. Есть данные, что ГП регулирует синтез эйкозаноидов: под ее влиянием повышается продукция простацикпинов, и, напротив, при дефиците фермента происходит сдвиг в сторону тромбоксанов. Очевидно, что эндотелиальная дисфункция является главным механизмом ишемической болезни сердца у больных ССД (вгиоэ в. е1 а1., 2007). В пользу васкулопатии свидетельствует относительно молодой возраст пациентов: средний возраст среди наблюдаемых нами в группе с ишемическим поражением сердца составил 43,7±5,9 лет.

Учитывая выявленные закономерности антителообразования к ГП у этих больных, можно сделать вывод, что среди известных сегодня механизмов участия ГП в патогенезе ишемии не последнюю роль играют иммунные.

Повышение уровня антител к ГП, сопровождающееся снижением ее ферментативной активности, выявленное в группе пациентов с поражением легких, позволило предположить о возможном их участии в развитии указанной патологии. Как известно, патогенез фиброзирующего альвеолита и интерстициального фиброза -основных составляющих легочной патологии при ССД - связан с иммунными нарушениями, усилением свободнорадикальных реакций и процессов фиброгенеза. Важное значение имеет повышение на территории легочного интерстиция функциональной активности клеток: альвеолярных макрофагов, фибробластов, лимфоцитов. Показано, что альвеолярные макрофаги имеют ведущее значение для развития межклеточных нарушений вследствие синтеза различных цитокинов (фактор некроза опухолей, факторы роста) и свободных радикалов. В группе больных с высокими показателями функциональной активности альвеолярных макрофагов чаще отмечается быстро прогрессирующее течение болезни. При этом варианте менее чем за год формируется "сотовое легкое", что проявляется тяжелой дыхательной недостаточностью, развитием

легочного сердца. Кроме того, поражение легких по типу фиброзирующего альвеолита при ДБСТ сопряжено с высоким риском развития бронхоальвеолярного рака (до 17% случаев) (Корнев Б. и соавт.,2000).

Использование определения антител к ГП в качестве предиктора развития угрожающих жизни осложнений со стороны легких при ССД позволяет обоснованно и дифференцированно подходить к назначению дорогостоящих методов диагностики (компьютерная томография, МРТ) и своевременно производить коррекцию начинающихся нарушений, используя тактику "агрессивной" терапии.

Другая немаловажная проблема, которая была включена нами в задачи исследования - объективизация оценки эффективности проводимой терапии. Сегодня контроль лечения включает в себя стандартный набор клинико-лабораторных тестов, характеризующих, в основном активность патологического процесса (показатели острой фазы) и мониторинг уровня отдельных классов антител (анти-ДНК, антифосфолипидные антитела (АФЛ), антинуклеарный фактор (АНФ)).

В этом свете особый интерес представляет оценка влияния проводимой терапии на динамику антител к ГП и ее активность. Для повышения достоверности полученных результатов нами были отобраны больные с подострым течением и умеренной активностью заболевания, имевшие сходные кпинико-лабораторные лабораторные показатели. Эта достаточно однородная выборка была разделена на три группы в зависимости от вида проводимой терапии. В I группе (10 человек) - получали антифиброзную терапию (D-пеницилламин) в комбинации с сосудистыми препаратами; во II группе (4 человек) помимо основной терапии пациенты получали ГКС per os; в III группе (2 человек) основное лечение дополнялось методами экстракорпоральной терапии (плазмаферез).

Результаты изучения активности плазменной ГП и содержания аутоантител к ней в зависимости от вида проводимой терапии представлены в таблице 6.

Отмечена тенденция к повышению активности ГП в плазме крови под влиянием рассматриваемых видов терапии, однако статистически достоверные различия между показателями до и после лечения отмечены лишь в случае использования экстракорпоральных методов (р<0,05).

Во всех группах произошло уменьшение количества антител к ГП к моменту выписки из стационара, но достоверное снижение наблюдалось у больных, получавших ГКС системного действия (р<0,05), и особенно у принимавших процедуры плазмафереза (р<0,01). В результате иммуносупрессивной терапии доля положительных по АТ к ГП пациентов снизилась с 36% до 25%.

Таблица 6.

Активность ГП и АТ к ГП у больных ССД в зависимости от вида проводимой терапии

Группы п До лечения После лечения

Активность ГП, ЕД/мл АТ к ГП, е.о.п. Активность ГП, ЕД/мл АТ к ГП, е.о.п.

I 10 0,070* (0,004) 0,117* (0,005) 0,093 (0,007) 0,084 (0,005)

II 4 0,069* (0,002) 0,108* (0,004) 0,089 (0,006) 0,063 А (0,006)

III 2 0,053* (0,004) 0,124* (0,005) 0,127 л (0,006) 0,083* л (0,007)

Примечание:

* -достоверные различия с группой доноров;

# -достоверные различия между клиническими группами;

Л -достоверные различия между показателями до и после лечения.

Полученные результаты свидетельствуют о преимуществах включения в комплексное лечение больных ССД глюкокортикостероидных препаратов и экстракорпоральных методов, приводящих к быстрому значимому снижению интенсивности антителогенеза и уменьшению активности патологического процесса. Тем не менее, учитывая накопленный опыт применения экстракорпоральных методов, всякий раз необходимо оценивать риск развития осложнений, достигающий, по данным ряда авторов, 10-20%. Наиболее частыми из них являются тромбозы, кровотечения, гемолиз,

цитратная гипокапьциемия, иммунодефицитные состояния. Так, отмечена более высокая частота бактериальных и вирусных инфекций при сочетании плазмафереза и пульс-терапии ГКС и/или цитостатиками по сравнению с монотерапией указанными препаратами. Кроме того, эффект от плазмафереза наступает быстро, но часто носит кратковременный характер, в то время как прием иммуносупрессивных препаратов приводит к более стойкому подавлению поликлональной В-клеточной активации и гиперпродукции аутоантител. Базисная терапия способствует замедлению прогрессирования заболевания и препятствует фиброзообразованию, существенно не изменяя интенсивность иммунного ответа. Таким образом, экстракорпоральные методы являются элементом комплексного лечения ССД и не могут служить альтернативой противовоспалительной и базисной терапии, но должны применяться в случае необходимости быстрого подавления аутоиммунной активности.

Характеристические кривые исследуемых параметров показали удовлетворительные параметры для использования их в качестве диагностических тестов (рис.4). Площадь под кривой (AUC) для активности ГП составила 0,973 (95% ДИ 0,856 - 0,983), для антител к ГП - 0,943 (95%ДИ 0,904 - 1,000). Для обеих переменных отличие кривых от диагонали было статистически значимым (р<0,001).

Поиск точек разделения между исследуемыми группами производили, руководствуясь максимальной суммой значений чувствительности и специфичности. Точкой разделения, удовлетворяющей этому требованию, для активности ГП являлось значение 0,135 Ед/мл (при этом чувствительность составила 85,0%, специфичность - 95,7%), а для анти-ГП - 0,079 е.о.п., (чувствительность-36,1 %, специфичность-100%).

Как уже было отмечено, иммунные механизмы играют ведущую роль в развитии системных заболеваний соединительной ткани, поэтому именно иммунологическим методам придается большое значение в диагностике ССД. Используемые для объективизации диагноза, они позволяют верифицировать заболевание, определить его активность, представить ориентировочный прогноз по течению и выбрать оптимальную терапевтическую тактику. Повышение чувствительности и специфичности иммунологических методов, а также совершенствование технических аспектов постановки реакций является важным методическим направлением современной ревматологии.

1 - специфичность

Рисунок 4. Характеристическая кривая активности ГП в диагностике ССД.

Для выявления специфических антител в сыворотках крови больных ССД нами был выбран иммуноферментный метод с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами. ИФА, будучи высокоспецифичным и чувствительным, является наиболее информативным методом в диагностике ревматических заболеваний (РЗ), а применение иммобилизированных биополимеров дает ему целый ряд неоспоримых преимуществ. Сорбенты обладают механической прочностью, устойчивы к экзогенным физико-химическим и биологическим воздействиям, а возможность проведения регенерации позволяет добиться неоднократного их применения, что ведет к значительному экономическому эффекту.

Для совершенствования иммунологической диагностики ССД нами были разработаны и целенаправленно апробированы при выявлении специфических антител у 47 больных ССД и у 40 здоровых

лиц иммобилизированные гранулированные антигенные препараты на основе глутатионпероксидазы. Унифицированный способ получения полиакриламидных гранул позволил качественно и количественно увеличить сорбционную емкость препарата. Применение метода эмульсионной полимеризации, при котором водорастворимые антигены фиксируются в пространственную решетку полиакриламидного геля методом "механического" включения без образования ковалентных связей, дает возможность сохранить антигены в максимально нативном состоянии, а иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое "двойной" гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, что значительно повышает чувствительность ИФА. Включение магнитного материала производилось с целью ускорить и упростить ряд операций в твердофазных методах анализа, улучшить качественные характеристики определений и увеличить число обрабатываемых проб, что создает необходимые условия для разработки автоматизированных систем диагностики.

Таким образом, в результате проведенных исследований были разработаны и применены в варианте твердофазного иммуно-ферментного анализа иммобилизированные гранулированные препараты с магнитными свойствами на основе глутатионпероксидазы. С их помощью нам удалось продемонстрировать определенную диагностическую ценность исследования антител к ГП при ССД. Систематизация накопленных знаний об антитело-образовании к ГП и другим энзимам этой системы, возможно, позволит в дальнейшем разработать иммуноферментный тест на основе ИГАП, улавливающий минимальные отклонения в содержании специфических антител к большинству ферментов АОС. Это, несомненно, упростит диагностику и дифференциальную диагностику ревматических заболеваний, и что немаловажно, прольет свет на общие механизмы их патогенеза.

Коррекция начинающихся нарушений функционирования АОС препаратами, подавляющих окислительные процессы, в совокупности с антифиброзными, сосудистыми препаратами, иммуносупрессивной терапией, плазмаферезом и иммуносорбцией позволит достигать стойкой ремиссии заболевания в более короткие сроки, что приведет к повышению продолжительности и качества жизни больных ССД.

выводы

1. Применение иммобилизированной формы глутатион-пероксидазы в непрямом варианте иммуноферментного метода анализа позволило впервые выявить антитела к данному ферменту у больных системной склеродермией.

2. Максимальные значения сывороточных антител к глутатионпероксидазе отмечены при высокой активности системной склеродермии. Они наиболее часто обнаруживаются в терминальной стадии заболевания и при вовлечении в патологический процесс сердечно-сосудистой системы и легких.

3. Снижение показателей ферментативной активности глутатионпероксидазы при одновременном повышении уровня антител к ней выявляется у больных системной склеродермией с умеренной и высокой степенью активности патологического процесса, что позволяет использовать этот критерий в комплексной оценке патологического процесса как неблагоприятный прогностичекий фактор.

4. Применение на стационарном этапе лечения больных системной склеродермией иммуносупрессивных препаратов и особенно методов экстракорпоральной терапии (плазмаферез) приводит к значительному снижению уровня антител к глутатионпероксидазе.

5. Уровень антител к глутатионпероксидазе может служить дополнительным критерием активности системной склеродермии и использоваться для оценки эффективности проводимой терапии наряду с традиционными клинико-лабораторными критериями.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе глутатионпероксидазы рекомендуется использовать для выявления антител к ней у больных ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.

2. При определении антител к глутатионпероксидазе иммуноферментным методом за норму следует считать показатели здоровых лиц - менее 0,045 е.о.п, положительным следует считать значение, превышающее 0,082 е.о.п.

3. Рекомендуется использовать определение уровня антител к ГП в сыворотке крови как дополнительный лабораторный критерий активности системной склеродермии, а также для диагностики возможного вовлечения в патологический процесс сердца и легких.

4. При системной склеродермии наряду с общепринятыми клинико-лабораторными показателями следует использовать определение уровня антител к ГП в сыворотке крови в качестве дополнительного критерия эффективности проводимой терапии.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Роль антител к супероксиддисмутазе, глутатионпероксидазе в развитии склеродермического процесса / Соавторы - Романов А.И, Шилова Л.Н., Гонтарь И.П. // Кремлевская медицина. Клинический вестник. - 2007, №4. - С. 54-55.

2. Иммунодиагностика системной склеродермии / Соавторы -Кочнева Л.И., Ненашева Н.В. // II Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007. Тезисы докладов. - Санкт-Петербург, 2007.-С. 52.

3. Клинико-патогенетическое значение антител к ферментам антиоксидантной защиты у больных с системным склерозом / Соавторы - Шилова Л.Н. // Научно-практическая ревматология. -2008. - N22 (Приложение). - С. 48.

4. Роль антител к ферментам антиоксидантной системы в развитии патологии при системной склеродермии / Соавторы -Шилова Л.Н., Красильников А.Н., Зборовская И.А., Гонтарь И.П. // Материалы XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. -2008. - С. 372-373.

5. Клинико-иммунологические закономерности при синдроме Рейно / соавт. - Шилова Л.Н., Маслакова Л.А., Красильников А.Н., Трубенко Ю.А., Емельянова О.И. //Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ. - Волгоград, 2008. -С. 130-131.

6. Общебиологический принцип регулирования энзиматической активности антителами/ соавт. - Гонтарь И.И., Романов А.И., Александров A.B., Маслакова Л.А., Емельянов Н.И., Кочнева Л.И. // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ. - Волгоград, 2008. -С. 20-21.

МОСКВИТИНА Ольга Викторовна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЕ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ГРАНУЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ ФЕРМЕНТА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 12.03.2009. Формат 60x84/16. Тираж 100. Заказ Na 201 п.

Отпечатано с готовых диапозитивов заказчика в ООО "ПК "Панорама-Вельт". 400001, г. Волгоград, ул. КИМ, 6.

Системная склеродермия (ССД) является полисиндромным воспалительным заболеванием, клинические проявления которого варьируют в диапазоне от мягко протекающего недуга с преимущественным поражением кожи, опорно-двигательного аппарата и сосудистой патологии по типу облитерирующей микроангиопатии до тяжелого инвалидизирующего поражения с развитием полиорганной недостаточности [17,23,25,26,81].

ССД является относительно редкой патологией с первичной заболеваемостью 2,7 — 12 случаев на 1 ООО ООО населения в год, тем не менее, трудно переоценить ее социально-экономическое значение. Преимущественное поражение лиц трудоспособного периода жизни, высокий процент инвалидизации обуславливают большие экономические потери, включающие высокую стоимость диагностики и лечения, выключение больных из сферы производства, затраты на социальное обеспечение работающих пациентов и инвалидов [32,33,45,69,84,196,218].

За последние десятилетия произошел значительный прогресс в представлениях о ССД: исследованы патогенетические механизмы, детально изучены клиника и эволюция заболевания, разработаны основы диагностики и классификация, создана программа патогенетической терапии с дифференцированным использованием антифиброзных, иммуномодулирующих и сосудистых средств [23,24,26,71,81,141,174,237].

Несмотря на достигнутые успехи, прогноз при системной склеродермии остается зачастую неблагоприятным: согласно статистике, 40% больных с острым и подострым течением погибает в течение первых 5 лет заболевания, 70% — в течение 10 лет [3,25,51,196]. Исходя из этого, актуальными задачами для клиницистов являются своевременная постановка диагноза, назначение адекватной терапии и объективная оценка ее эффективности. Только выполнение всех трех задач дают возможность модифицировать болезнь и повлиять на ее исход.

В числе основных задач, инициированных в 2000-2010 гг. под эгидой ВОЗ Всемирной декады по заболеваниям, поражающим двигательный аппарат человека (Bone and jont decade), были названы дальнейшее изучение патогенетических механизмов ревматических заболеваний, совершенствование и внедрение в практику новых методов ранней диагностики и лечения с учетом не только клинической, но и экономической эффективности и целесообразности [69,84].

Как показали новейшие разработки в иммунодиагностике ревматических заболеваний, иммуноферментные методы анализа (ИФА) с использованием магнитоуправляемых сорбентов на основе антигенов нуклеиновой, липидной и белковой природы в полной мере отвечают указанным требованиям. Неоспоримые преимущества метода заключаются, в первую очередь, в повышении стабильности иммобилизированного биополимера, что делает его устойчивым к различным химическим и физическим воздействиям. Помимо этого, иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, тем самым повышая чувствительность твердофазных методов анализа. Включение магнитного материала в гранулы дает возможность ускорить и упростить манипуляции на всех этапах исследования, улучшая качественные характеристики определений и увеличивая число обрабатываемых проб. И, наконец, повторное использование сорбента после регенерации ведет к значительному экономическому эффекту [21,31,39].

Гранулированные препараты с магнитными свойствами уже были использованы для усовершенствования иммунодиагностики ССД и выявления антител к кардиолипину, каталазе, фибронектину и другим биополимерам. Как показали исследования, преимущества метода ИФА с применением иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов (ИГАП) делают его не только экономичным и легко применимым в практической медицине, но и позволяют решить вопросы ранней диагностики ревматических заболеваний благодаря высокой чувствительности и специфичности [59,60,74,88,95].

В настоящее время продолжается поиск маркеров системного склероза, позволяющих дифференцировать ею с другими диффузными болезнями соединительной ткани, ревматоидным артритом, псевдосклеродермическими и паранеопластическими синдромами, а также прогнозировать клиническую форму и течение заболевания. В этом свете представляют интерес результаты исследования роли активных форм кислорода в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Предполагается, что основное значение свободных радикалов при данной патологии связано с их способностью повреждать белки, липиды, ДНК, придавая им свойства аутоантигенов и провоцируя выработку антител. Достигается это значительным усилением выработки активных форм кислорода (перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.), которые приводят к деполимеризации гиалуроновой кислоты, окисляют белки, вызывают перекисное окисление липидов, стимулируют высвобождение протеолитических ферментов и вазоактивных аминов. Считают, что именно активные формы кислорода (АФК) ответственны за процессы инактивирования и трансформации ферментов, угнетения функциональной активности иммунокомпетентных клеток [37,38,57,158,188].

Естественным препятствием патологическому воздействию АФК . на собственные ткани является мощная антиоксидантная система организма (АОС), включающая в себя ферментные и неферментные звенья. Основными энзимными компонентами АОС считают глутатионпероксидазу, супероксидцисмутазу, глутатионредуктазу, каталазу и церулоплазмин. Они способны нейтрализовать высокоактивные супероксидные анионы, перекись водорода, гидроперекиси жирных кислот, предотвращая накопление особо токсичных вторичных продуктов перекисного окисления липидов [37,38,88,112,124,134,148,158].

В клинической практике использование прямых определений АФК, гидроперекисей и других продуктов свободнорадикальных реакций в биологических жидкостях затруднено из-за технических сложностей. Однако об интенсивности свободнорадикальных процессов можно судить по состоянию и напряженности реакций антиоксидантной защиты. Согласно данным ряда авторов, при ревматической патологии наблюдается накопление вторичных токсических продуктов свободнорадикальных реакций вследствие дисбаланса между продукцией и утилизацией АФК. В качестве одной из причин функциональной недостаточности энзимов-антиоксидантов при аутоиммунных заболеваниях считают образование антител к ним [12,37,38,40,74,88,95].

Из всей группы ферментов АОС наименее изученным объектом иммунного ответа при ССД является глутатионпероксидаза (ГП). В связи с этим представляется актуальным исследовать закономерности антителообразования к глутатионпероксидазе при системной склеродермии, используя иммобилизированную форму фермента. Высокая чувствительность модифицированной методики ИФА дает возможность усовершенствовать способы диагностики системного склероза, выяснить отдельные механизмы патогенеза данного заболевания и обозначить перспективы патогенетической терапии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования являлось усовершенствование иммунологической диагностики и оценки эффективности лечения системной склеродермии с помощью иммобилизированной формы глутатионпероксидазы.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: 1 .Получить иммобилизированную форму глутатионпероксидазы, изучить ее физико-химические свойства;

2 .Адаптировать иммуноферментный метод анализа с использованием иммобилизированной глутатионпероксидазы к изучению образования антител к этому ферменту;

3.Изучить активность глутатионпероксидазы и содержание антител к этому ферменту у больных системной склеродермией и здоровых лиц. Исследовать данные показатели и корреляционные связи между ними у больных ССД в зависимости от активности, стадии, длительности, характера течения заболевания и висцеральных поражений;

4.Изучить динамику антителообразования к глутатионпероксидазе в процессе стационарного лечения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые для диагностики ССД созданы и применены в варианте иммуноферментного метода анализа иммобилизированные препараты глутатионпероксидазы. В ходе работы в сыворотках крови больных ССД обнаружены антитела к глутатионпероксидазе. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотке крове здоровых лиц. Выявлена достоверная корреляция меледу содержанием антител к ГП и активностью патологического процесса. Установлено, что поражение сердечно-сосудистой системы и легких при ССД сопровождается максимальными значениями исследуемых антител. Выявлены обратные корреляционные связи между активностью ГП и антителами к ней. Определена способность исследованных показателей к изменению под влиянием проводимой терапии, что обеспечивает возможность оценки ее эффективности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к ГП на основе иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами. Выявление антител к ГП в предложенной методике ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики ССД, оценки активности патологического процесса и прогнозирования клинического варианта заболевания. Обнаружение антител к ГП на начальных сроках заболевания позволяет использовать их определение для ранней диагностики ССД. Динамика изученных показателей дает возможность судить об эффективности проводимой терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На защиту выносится положение о возможности определения антител к ГП с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами у больных ССД. Исследование антител к ГП может быть использовано в качестве дополнительных тестов для диагностики ССД, выделения клинических вариантов заболевания и уточнения степени активности патологического процесса. Динамика этих показателей может служить для оценки эффективности проводимой терапии.

ПУБЛИКАЦИИ

Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах, из которых 4 - в центральной и 2 - в местной печати. Материалы диссертации были представлены на ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ (2008 г.), II Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007 г.), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008 г.).

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Методы определения антител к ГП с помощью иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в МУЗ ГКБ №25 г.Волгограда.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I — обзора литературы, в которой изложены современные аспекты иммунопатогенеза системной склеродермии, участии в ее развитии активных форм кислорода и антиоксидантной системы; части II — собственных исследований, состоящей из 6 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методики исследования, полученные результаты, их обсуждение, выводы, практические рекомендации и приложения. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 7 рисунками, приведено 2 выписки из историй болезни. Указатель литературы содержит 253 источника, в том числе 95 -отечественных и 158 - зарубежных.

выводы

1. Применение иммобилизированной формы глутатионпероксидазы в непрямом варианте иммуноферментного метода анализа позволило впервые выявить антитела к данному ферменту у больных системной склеродермией.

2. Максимальные значения сывороточных антител к глутатионпероксидазе отмечены при высокой активности системной склеродермии. Они наиболее часто обнаруживаются в терминальной стадии заболевания и при вовлечении в патологический процесс сердечно-сосудистой системы и легких.

3. Снижение показателей ферментативной активности глутатионпероксидазы при одновременном повышении уровня антител к ней выявляется у больных системной склеродермией с умеренной и высокой степенью активности патологического процесса, что позволяет использовать этот критерий в комплексной оценке патологического процесса как неблагоприятный прогностичекий фактор.

4. Применение на стационарном этапе лечения больных системной склеродермией иммуносупрессивных препаратов и особенно методов экстракорпоральной терапии (плазмаферез) приводит к значительному снижению уровня антител к глутатионпероксидазе.

5. Уровень антител к глутатионпероксидазе может служить дополнительным критерием активности системной склеродермии и использоваться для оценки эффективности проводимой терапии наряду с традиционными клинико-лабораторными критериями.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе глутатионпероксидазы рекомендуется использовать для выявления антител к ней у больных ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.

2. При определении антител к глутатионпероксидазе иммуноферментным методом за норму следует считать показатели здоровых лиц — менее 0,045 е.о.п, положительным следует считать значение, превышающее 0,082 е.о.п.

3. Рекомендуется использовать определение уровня антител к ГП в сыворотке крови как дополнительный лабораторный критерий активности системной склеродермии, а также для диагностики возможного вовлечения в патологический процесс сердца и легких.

4. При системной склеродермии наряду с общепринятыми клинико-лабораторными показателями следует использовать определение уровня антител к ГП в сыворотке крови в качестве дополнительного критерия эффективности проводимой терапии.

112