Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Клинико-диагностическое значение определения антител к фибронектину у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбен

На правах рукописи

КОЧНЕВА Любовь Ивановна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АНТИТЕЛ К ФИБРОНЕКТИНУ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ И СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЫ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА

(14.00.39 - Ревматология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград - 2005

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и Волгоградском государственном медицинском

университете

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор И.А. Зборовская

Научный консультант: кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник И. П. Гонтарь

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н И. Коршунов

доктор медицинских наук Б.В.Заводовский

Ведущая организация: Оренбургская государственная

медицинская академия.

Защита состоится <s£a » u+QMJZ 2005 г. ъУ^ часов на заседании Специализированного Совета Д 208.008.02 Волгоградского государственного медицинского университета по адресу 400066, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан « <9 » 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

А.Р. Бабаева

G684

i¡ ir m

Актуальность проблемы

Ревматические заболевания (РЗ) на протяжении вот уже нескольких десятков лет являются объектом пристального внимания большого количества ученых и клиницистов. Повышенный интерес к этой патологии не случаен По данным статистики, заболеваемость болезнями костно-мышечной системы в России увеличилась за последние 10 лет на 41% и составляет в настоящее время 32-34 случая на 100 ООО населения. Следует отметить, что в Южном федеральном округе этот показатель наиболее высокий - 38 случаев на 100 000 населения, поэтому проблема особенно актуальна в нашем регионе (Фоломеева О.М. и др., 2002, 2003, 2004).

Системная красная волчанка (СКВ) и системная склеродермия (ССД) являются самыми распространенными патологиями в группе системных поражений соединительной ткани (СПСТ) Заболеваемость СКВ в развитых странах находится в диапазоне от 1,8 до 27,1 случаев на 100 000 населения с большими различиями в разных популяциях (Hochberg MC., 1990). Есть данные, что за последние 40-50 лет этот показатель увеличился почти втрое, и тенденция к росту сохраняется (Uramoto K.M., 1999).

В отличие от СКВ, ССД продолжает оставаться довольно редкой патологией: 0,37 - 1,2 случая на 100 000 населения (Mayes M.D., 1998). Данные о динамике заболеваемости ССД за последние годы противоречивы: есть сообщения, как о росте этих показателей, так и о некотором их снижении, что требует дальнейшего детального изучения (Фоломеева О.М. и др., 2002)

Продолжительность жизни больных хроническими РЗ значительно ниже среднепопуляционной, хотя нельзя игнорировать достигнутые в этом направлении определенные успехи. Применение практически всего арсенала существующих в медицине противовоспалительных и цитотоксических препаратов позволило существенно улучшить прогноз жизни больных СКВ. Если до 1970 г. продолжительность жизни только 40% больных СКВ превышала 5 лет, то в настоящее время 5-летняя выживаемость достигает 70-90% (Клюквина Н.Г. и др., 2002) По данным аутопсий в Москве летальность от СКВ за 2002 год составила 12,7% среди всех РЗ, ставших причиной смерти (Эрдес Ш. и др., 2003).

При ССД прогноз остается менее благоприятным: 40% больных (в основном с острым и подострым течением) погибает в течение первых 5 лет, 70% - в течение 10 лет. В то же время при хроническом течении заболевания выживаемость сохраняется приблизительно на одном уровне на протяжении 10-15 лет и составляет 84-88 % (Mayes M.D., 1998).

Социально-экономические последствия СКВ и ССД трудно переоценить Средний возраст больных СКВ к началу заболевания составляет 27,1±11,8, к моменту p^ivnqa ця у|НР?пмЛнпгть - 34±10,4

(Фоломеева О.М. и др., 2001). Очевидно, что наряду с прямыми затратами, такими как дорогостоящая диагностика, пожизненное медикаментозное лечение, систематическое лабораторное и инструментальное обследование с целью коррекции терапии, существенный вес имеют непрямые затраты- снижение и утрата трудоспособности, нередко - преждевременная смерть, вторичное бесплодие и т.д.

В числе основных задач инициированной под эгидой ВОЗ Всемирной декады по заболеваниям, поражающим двигательный аппарат человека (2000-2010 гг), были названы дальнейшее изучение патогенетических механизмов ревматических заболеваний, совершенствование и внедрение в практику новых методов ранней диагностики и лечения с учетом не только клинической, но и экономической эффективности и целесообразности (Насонова В.А. и др., 2001).

Как показали новейшие разработки в диагностике ССД и СКВ, иммуноферментные методы анализа (ИФА) с использованием иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами на основе антигенов нуклеиновой, липидной и белковой природы (ИГАП) в полной мере отвечают указанным требованиям. Неоспоримые преимущества метода заключаются, в первую очередь, в повышении стабильности иммобилизированного биополимера, а также возможности регенерировать сорбент, что ведет к значительному экономическому эффекту Кроме того, иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, что повышает чувствительность твердофазных методов анализа Включение магнитного материала в гранулы дает возможность ускорить и упростить манипуляции на всех этапах исследования, улучшая качественные характеристики определений и увеличивая число обрабатываемых проб. Указанные преимущества делают этот метод экономичным и легко применимым в практической медицине (Гонтарь И.П. и др., 2002, Ефременко В.И., 1996).

Гранулированные препараты с магнитными свойствами уже были использованы для усовершенствования иммунодиагностики СКВ и ССД и выявления антител (АТ) к ДНК, РНК, кардиолипину, каталазе, церулоплазмину и другим биополимерам В ряде случаев специфические антитела обнаруживались на начальных стадиях заболевания, что позволило решить вопросы ранней диагностики (Маслакова Л.А., 1999, Сущук Е.А., 2002, Язид Аль Раави,2002).

Антителообразование к фибронекгину (ФН) при РЗ представляет собой малоизученную проблему. Выбор этого высокомолекулярного гликопротеида в качестве объекта исследования не случаен. Благодаря многообразию свойств, ФН принимает участие во многих жизненно важных процессах, таких как фагоцитоз, гемостаз, модулирование

проницаемости сосудистой стенки, формирование внеклеточного соединительнотканного матрикса (Ковалев В М. и др , 1989, Atta M.S. et al., 1995). Предполагается, что при СПСТ нарушение функций ФН с развитием патологических реакций может быть обусловлено антителообразованием к нему. В связи с этим, использование иммобилизированной формы ФН в иммунодиагностике СКВ и ССД представляется весьма актуальной задачей, направленной на улучшение качества диагностики этих заболеваний и обозначающей перспективы изучения отдельных механизмов их патогенеза.

Цель работы

Целью настоящего исследования являлось усовершенствование иммунологической диагностики и оценки эффективности лечения системной красной волчанки и системной склеродермии путем определения антител к фибронекгину с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента.

Основные задачи исследования

1 Получить иммобилизированную форму фибронекгина, изучить ее физико-химические свойства.

2 Применить иммобилизированную форму фибронекгина в иммуноферментном методе анализа для выявления антител к нему.

3. Определить возможность неспецифического взаимодействия фибронектина с иммуноглобулинами крови.

4. На основе иммуноанализа изучить содержание фибронектина и антител к нему в сыворотке крови здоровых лиц и больных системной красной волчанкой и системной склеродермией в зависимости от активности, стадии и клинических проявлений заболевания.

5. Провести оценку влияния терапии на динамику уровня антител к фибронектину у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией.

Научная новизна работы

Впервые для иммунодиагностики СКВ и ССД разработан вариант иммуноферментного анализа с применением иммобилизированной гранулированной формы ФН и подобраны оптимальные условия его постановки Для оценки активности патологического процесса впервые применено комплексное исследование с определением количества общего ФН плазмы крови и антител к нему.

В ходе работы в сыворотках крови больных СКВ и ССД обнаружены АТ к ФН. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных АТ в сыворотке крови здоровых лиц. Установлено, что поражение нервной системы при ССД, почек при СКВ и сердечно-сосудистой системы при обоих заболеваниях сопровождается максимальными значениями исследуемых АТ Выявлено, что количество плазменного ФН и уровень АТ к нему у больных СКВ и ССД коррелируют с активностью патологического процесса. Определена способность исследованных показателей к изменению под влиянием проводимой терапии, что обеспечивает возможность оценки ее эффективности

Практическая ценность

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня АТ к ФН на основе иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами. Выявление АТ к ФН в предложенной модификации ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики СКВ и ССД, оценки активности патологического процесса и прогнозирования клинических форм заболевания. АТ к ФН обнаруживаются на ранних стадиях заболевания и могут быть использованы для своевременной диагностики СКВ и ССД. Динамика изученных показателей дает возможность судить об эффективности проводимой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

На защиту выносится положение о возможности определения антител к ФН с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами у больных СКВ и ССД. Исследование антител к ФН может быть использовано в качестве дополнительных тестов для диагностики СКВ и ССД, выделения клинических вариантов заболеваний, а в комплексе с определением количества общего ФН плазмы крови - для уточнения степени активности патологического процесса. Динамика этих показателей может служить для оценки эффективности проводимой терапии.

Внедрение в практику

Методы определения количества иммунореактивного ФН и антител к ФН с помощью иммобилизированных антигенных препаратов с

магнитными свойствами внедрены в МУЗ ГКБ №25 г. Волгограда и МУЗ ГБ №1 им. С.З Фишера г. Волжского.

Публикации

Основные положения диссертации изложены в 12 печатных работах, из которых 4 - в центральной и 8 - в местной печати

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на XI Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004 г.), конференции «Актуальные вопросы практической и теоретической ревматологии» (Звенигород, 2004 г.), ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых ВолГМУ (2002-2005 гг.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, представленной 2 главами, в которых изложены современные аспекты иммунопатогенеза системной красной волчанки и системной склеродермии, а также обобщенные сведения о биологическом значении фибронектина и участии его в патогенезе ревматических заболеваний, части II -собственных исследований, состоящей из 7 глав, содержащих клиническую характеристику больных, методики исследования, полученные результаты, их обсуждение, выводы, практические рекомендации и приложения. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей и 12 рисунками, приведено 5 выписок из историй болезни. Указатель литературы содержит 295 источника, в том числе 112 - на русском языке и 183 - на иностранном.

Клиническая характеристика больных

Под нашим наблюдением находилось 123 человека Основную группу составляли 53 больных СКВ и 34 больных ССД В контрольную группу были включены 36 практически здоровых лиц в возрасте от 18 до 56 лет (24 женщины и 12 мужчин), прошедших тщательное медицинское обследование.

В группу больных ССД вошли 32 женщины (94,12%) и 2 мужчин (5,88%) в возрасте от 17 до 65 лет. Диагностика, определение степени активности, характера течения и стадии заболевания проводились в соответствии с классификацией, предложенной Н.Г.Гусевой (1975 г.).

5

В исследуемой группе преобладали лица трудоспособного возраста (70,58% моложе 55 лет). Инвалидность по основному заболеванию имели 22 человека (64,71%), из них 13 человек относились к социально-активному населению. Средний возраст пациентов на начало заболевания составил 39,47±11,94 лет.

Распределение больных ССД в зависимости от течения, активности и стадии заболевания представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение больных в зависимости от активности, течения и стадии

ССД

Клинические показатели Количество больных %

Активность I 18 52,94

II 16 47,06

Течение подострое 12 35,29

хроническое 22 64,71

I 11 32,35

Стадия II 21 61,77

III 2 5,88

У 55,56% пациентов со стажем болезни менее 5 лет имела место I стадия, у 44,44% - II стадия заболевания. При продолжительности болезни 10-15 лет у всех больных была диагностирована стадия выраженных изменений (II). В группе с более чем 15-летним стажем ССД в 28,57% случаев наблюдалась III (терминальная) стадия заболевания. Приведенные данные демонстрируют сравнительно быструю генерализацию процесса с развитием необратимых изменений у некоторых больных уже в первые 5 лет болезни.

Клинические проявления ССД в опытной группе отличались гетерогенностью, однако изменения кожи определялись у всех обследованных больных. Практически так же часто - в 97,06% случаев -встречался синдром Рейно. Поражение костно-мышечной системы было диагностировано у 23 больных (67,65%) и включало артриты, артралгии и миалгии. Контрактуры суставов имели место у 2 пациентов.

Вовлечение в патологический процесс желудочно-кишечного тракта наблюдалось в половине случаев и характеризовалось свойственными для ССД явлениями эзофагита, гастродуоденита, колита и гипотонией пищевода.

Группу с поражением сердца (14 человек) составили, в основном, пациенты с клиникой стенокардии напряжения и покоя или острым инфарктом миокарда (ОИМ) в анамнезе - 7 человек (20,59%). Кардиосклероз со снижением сократительной способности миокарда (по данным ЭхоКГ) и нарушениями ритма в виде блокады ножек пучка Гиса

и экстрасистолии диагностировался в 8,82% случаев У 2 пациентов выявлялся экссудативный перикардит.

Поражение нервной системы отмечалось у 12 пациентов и включало явления церебрального васкулита - у 9 больных (26,47%) и полиневрита - у 3 (8,82%) Церебральные проявления были документированы неврологом при осмотре и/или специальном обследовании Имевшиеся в анамнезе острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) или транзиторные ишемические атаки (ТИА), связанные по времени с обострением основного заболевания, мы также расценили как проявления васкулита данной локализации

Легочные проявления (интерстициальный фиброз и легочная гипертензия) встречались в 29,41% случаев Еще реже - у 7 больных (20,59%) - наблюдалось поражение почек, проявлявшееся про-теинурией и азотемией

В таблице 2 показана зависимость основных лабораторных показателей больных ССД на момент поступления от степени активности патологического процесса.

Таблица 2.

Сравнение лабораторных показателей больных ССД с различной степенью активности заболевания

Показатель Норма* Активность

Минимальная (I) Умеренная (II)

Количество 3,7-5,1 10"/л 4,1±1,4 3,6+1,2

эритроцитов

Гемоглобин 115-164 г/л 128,5+19,6 119,1±17,5

Количество 4-9-109 /л 5,2±2,9 7,8±4,1

лейкоцитов

СОЭ# 2-15 мм/ч 9,8±2,4 23,41±5,2

Фибриноген 2-4 г/л 3,32±0,31 3,89+0,97

Протеинурия <0,02 г/л 0,001 ±0,0008 0,019±0,005

Креатинин сыворотки 15-98ммоль/л 71,31±14,22 89,76±16,72

Общий белок 62-83г/л 78,13±11,57 71,97±9,46

сыворотки

ЦИК# <4 усл.ед 3,32±1,14 5,25+2,11

* Нормальные показатели даны согласно практическим рекомендациям, приведенным в соответствующих руководствах

#-достоверные различия между группами.

Как видно из приведенных данных, при низкой активности ССД не наблюдалось существенных лабораторных сдвигов, а умеренная активность сопровождалась лишь незначительным повышением острофазовых критериев (СОЭ, циркулирующих иммунных комплексов).

Все больные ССД, находившиеся под нашим наблюдением, получали комплексную медикаментозную терапию, включавшую противовоспалительные препараты, антисклеротические средства, ангиопротекторы, метаболиты. Глюкокортикостероиды принимали 11 больных (32,35%). Плазмаферез назначался 9 пациентам. Средний койко-день составил 22,14±5,71.

Среди больных СКВ было 52 женщины (98,11%) и 1 мужчина (1,89%) в возрасте от 17 до 69 лет Диагноз ставился на основании тщательного клинико-лабораторного обследования больных и верифицировался по критериям американского общества ревматологов, пересмотренным в 1997 году (Hochberg М.С., 1997).

В исследуемой группе преобладали лица трудоспособного возраста (90,57% в возрасте до 55 лет). Инвалидность по основному заболеванию имели 42 человека, что составило 79,25% от общего числа пациентов, 38 из них относились к социально-активному населению. Средний возраст больных на начало заболевания составил 28,39±10,06 лет.

Активность и течение СКВ определялась по клиническим и лабораторным критериям, предложенным В.А.Насоновой (1972 г.), в соответствии с рабочей классификацией клинических вариантов течения СКВ. Кроме того, для повышения достоверности получаемых результатов при оценке активности заболевания применялись индексы Systemic Lupus Activity Measure (SLAM) и Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI), рекомендованные к использованию при проведении исследований и клинических испытаний у больных СКВ (Isenberg D., 1999, Wluka А.Е., 1997).

При оценке активности СКВ по критериям В.А. Насоновой (1972 г.) были получены следующие результаты: у 10 пациентов (18,87%) имела место минимальная активность заболевания, у 32 (60,38%) - умеренная и у 11 (20,75%) - высокая. При этом острое течение сопровождалось высокой активностью патологического процесса, а при хроническом течении преобладала минимальная и умеренная активность заболевания (табл.3).

Среднее значение индекса SLAM у больных исследуемой группы составило 10,91 ± 7,06 (диапазон значений от 1 до 28), для индекса SLEDAI 7,58 ± 6,07 (диапазон от 0 до 26)

Анализ связи между разными способами определения активности выявил тесную корреляцию между оценками, полученными при использовании шкал SLAM и SLEDAI (двухсторонний коэффициент корреляции Пирсона г=0,704, р<0,0005) и менее тесную, но высоко достоверную корреляцию между оценками по критериям В.А Насоновой и шкалами SLAM (двухсторонний коэффициент ранговой корреляции Спирмена г=0,563, р<0,0005) и SLEDAI (г=0,571, р<0,0005).

Таблица 3.

Взаимосвязь течения и активности СКВ (по критериям Насоновой В.А.)

Активность СКВ

Течение СКВ Минимальная Умеренная Высокая Всего

Острое - - 4 4

Подострое 6 24 7 37

Хроническое 4 8 - 12

Всего 10 32 11 53

Из клинических проявлений наиболее часто (у 67,92% больных) встречалось поражение кожи. Типичные изменения в виде "бабочки" выявлялись у 10 пациентов, а с учетом анамнестических данных частота признака составила 58,49% от общего числа обследованных. Дискоидные очаги обнаруживались у 13, васкулиты (крапивница, капилляриты, сетчатое ливедо) - у 18 больных. Редким проявлением было наличие афт на слизистых рта.

Суставной синдром имел место у 58,49% больных и проявлялся, в основном, артралгиями, реже - в виде артритов. Вовлечение в воспалительный процесс мышц отмечалось у 27 пациентов (50,94%)

Экссудативный перикардит был самым частым проявлением поражения сердечно-сосудистой системы - по данным ЭхоКГ он диагностировался у 32,08% больных. Реже наблюдались перемежающаяся хромота (24,53 %), тромбоз вен нижних конечностей (11,19%), артериальная гипертензия (13,21%), вторичная ишемия миокарда (9,43%), миокардит (3,77%).

Нервная система вовлекалась в патологический процесс более чем у половины больных, при этом в 87,1% случаев выявлялась цереброваскулярная недостаточность. Полинейропатия диагностирована у 2 человек.

Волчаночная нефропатия наблюдалась в 45,28% случаев, в основном, у больных с острым и подострым течением заболевания. Относительно редкими проявлениями были экссудативный плеврит и пневмонит они встречались у 15,09% от общего числа больных

В таблице 4 представлена сравнительная характеристика основных лабораторных показателей больных СКВ с различной активностью заболевания

Таблица 4.

Сравнение лабораторных показателей больных СКВ с различной степенью активности заболевания

Показатель Норма* Активность

Минимальная Умеренная Высокая

Количество эритроцитов 3,7-5,1 10^/л 3,89±0,73 3,67±0,41 3,2±0,49

Гемоглобин 115-164 г/л 120,74±12,42 109,46±9,85 107,39±7,85

Количество тромбоцитов 200-400 10а/л 268,22±36,43 221,42±43,79 208,41±31,5

Количество лейкоцитов 4-9 10а/л 7,41 ±2,19 5,22 ±2,87 4,65±0,97

Количество лимфоцитов 1500-3000 10а 1961,71±216,4 1601,63+465,7 1384,39±104,3

СОЭ# 2-15 мм/ч 19,28±7,41 34,91 ±8,14 47,93±11,83

Эритроцит-урия 0 клеток в поле зрения 0,013±0,001 2,21±0,17 2,08±0,09

Протеинурия 20,02 г/л 0,0041 ±0,0018 0,0251 ±0,013 0,1937±0,173

Мочевина сыворотки 2,9-8,3 ммоль/л 5,3±1,23 5,61±1,84 8,64±1,79

Креатинин сыворотки # 15-98ммоль/л 89,34±21,08 91,78±46,12 191,56+56,22

Общий белок сыворотки 62-83г/л 74,75±6,83 69,81±5,97 61,84±7,19

ЦИК# ¿4 уел ед 2,04±1,83 4,12±2,73 7,59±2,14

АТ к нДНК # 20,1е о.п 0,100±0,013 0,104±0,011 0,108±0,02

АНФ отрицательный -/+ ++ ++/+++

* Нормальные показатели даны согласно практическим рекомендациям, приведенным в соответствующих руководствах

#-достоверные различия между группами.

Приведенные данные показывают, что минимальная активность СКВ сопровождается незначительными лабораторными сдвигами, а при умеренной активности заболевания претерпевают изменения лишь часть показателей, при этом наибольшей чувствительностью обладают иммунологические тесты.

Несмотря на то, что высокая активность заболевания вызывает выраженные лабораторные сдвиги, только комплексное исследование с применением как можно большего количества клинических и

лабораторных критериев может дать точную оценку степени активности патологического процесса, поскольку достоверные различия между группами выявляются лишь по ряду показателей.

Обследованные нами больные СКВ получали противовоспалительную, иммуносупрессивную и симптоматическую терапию Все пациенты принимали глюкокортикостероиды системного действия, 5 потребовалось проведение пульс-терапии. 10 пациентам в дополнение к ГКС были назначены цитостатики-иммунодепрессанты Плазмаферез применялся у 17 больных Средний койко-день составил 32,09±16,58.

Материалы и методы исследований

В качестве антигена был использован препарат «Фибронекгин плазменный очищенный лиофильно высушенный человеческий», производства «Sigma», США (Cat. № F 2006). Антитела к ФН определялись твердофазным иммуноферментным методом с использованием ИГАП. Иммобилизацию ФН проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля (Гонтарь И.П и др., 1990) Результаты учитывали на многоканальном спектрофотометре АС-8К (Белоруссия) при длине волны 492 нм. Полученные значения выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.) и считали положительными при превышении величин экстинции, найденных для здоровых лиц, на два средних квадратических отклонения.

Во избежание получения ложноположительных результатов, обусловленных взаимодействием клеточного домена ФН с Fc-фрагментами IgG, определяли величину поправки на неспецифическое связывание. Для этого методом высаливания сульфатом аммония выделяли из исследуемых сывороток IgG и подвергали его папиновому гидролизу (Скоупс Р.,1985, Калинин и др., 1971). Фракционирование Fc-и Fab-фрэгментов проводили с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе ступенчатым элюированием (Остерман Л.А., 1985). Каждый из фрагментов впоследствии подвергали ИФА.

Содержание ФН в плазме крови определяли имуноферментным методом при помощи набора реагентов производства «НВО Иммунотех» (Москва, Россия) Количественную оценку проводили на автоматическом многоканальном спектрофотометре при длине волны 450 нм. Используя значения экстинции в калибровочных пробах, строили кривую зависимости оптической плотности от концентрации ФН, по которой определяли уровень ФН в опытных образцах.

Обработка данных проводилась с помощью программного пакета «STATISTICA FOR WINDOWS», а также по оригинальным программам с использованием формул, приведенных в соответствующих руководствах (Зайцев В М. и др., 2003).

Результаты исследования и их обсуждение

Количество ФН и антител к нему у здоровых лиц

Наличие в структуре ФН двух функционально активных центров -коллагенового и клеточного - определяет неоднозначность взаимодействий его молекулы с иммуноглобулинами крови. В исследовании Atta М S et al., 1994 г., было показано, что AT к ФН при ревматических заболеваниях образуются к его фрагменту с молекулярной массой 30 кД, включающему коллагеновый домен, однако возможно неспецифическое связывание клеточного домена молекулы ФН с Fc-фрагментами иммуноглобулинов. Во избежание получения ложно-положительных результатов нами была изучена количественная сторона этого взаимодействия и рассчитана поправка на неспецифическое связывание.

Значения экстинции с Fc-фрагментами IgG составили от 1,6 до 15% от результатов, полученных при исследовании сывороток этих же больных, содержащих не фрагментированный IgG (табл 5)

Таблица 5.

Результаты ИФА с сыворотками больных СКВ и ССД и Рс-фрагментами 1дС, выделенного из этих сывороток

№ Ds Результат ИФА, е о.п %

с сывороткой с Fc-фрагментом IgG

1. СКВ 0,138 0,02 15,0

2 сед 0,129 0,013 10,1

3. сед 0,127 0,009 6,0

4 СКВ 0,144 0,002 1,6

5 СКВ 0,133 0,022 15,0

6 сед 0,126 0,011 8,7

7 ССД 0,127 0,014 11,0

8 СКВ 0,142 0,015 10,6

9 СКВ 0,139 0,01 7,0

10 ССД 0,125 0,017 13,6

11 СКВ 0,142 0,008 5,6

12 СКВ 0,135 0,013 9,6

13 ССД 0,128 0,016 12,5

14 СКВ 0,131 0,012 9,2

При постановке ИФА с РаЬ-фрагментами 1дС показатели оптической плотности были сопоставимы с таковыми в контрольных пробах. Таким образом, при определении уровня АТ к ФН мы учитывали, что до 15% результата в ИФА может приходиться на неспецифическое связывание ФН с сывороточными иммуноглобулинами

По результатам ИФА с использованием ИГАП медиана оптической плотности для АТ к ФН у здоровых лиц составила 0,028±0,0024. К полученным значениям была применена поправка на неспецифическое связывание и, исходя из этого, рассчитана верхняя граница нормальных показателей содержания АТ к ФН, определяемая как М+2а - 0,062 е.о.п.

Средние значения концентрации общего ФН плазмы крови у лиц контрольной группы (ИФА) составили 351,04±65,11 мкг/мл: у мужчин -451,54±35,12 мкг/мл, у женщин - 328,38±23,42 мкг/мл, что соответствует имеющимся литературным данным о содержании ФН в плазме крови (180 - 720 мкг/мл у мужчин и 150 -540 мкг/мл у женщин).

Количество ФН и антител к нему у больных ССД

У обследованных нами 34 больных ССД количество плазменного ФН колебалось от 300 до 810 мкг/мл и составило в среднем 475,31+56,18 мкг/мл, что существенно не отличалось от данного показателя у здоровых лиц (рис 1) Значения ФН плазмы, превышающие нормальные, обнаружены у 7 человек (20,6%) Достоверных различий между концентрацией фибронекгина у больных ССД с различной активностью, характером течения, клиническими проявлениями и стадией заболевания выявлено не было (р>0,05)

Повышенный уровень антител к ФН был выявлен у 11 (32,35%) больных ССД. Медиана исследуемого показателя составила 0,075 е.о.п., что достоверно выше значений, найденных для здоровых лиц (р<0,05). Различия в содержании сывороточных АТ к ФН в зависимости от пола и возраста были недостоверны (р>0,05). Проведение корреляционного анализа позволило выявить положительные связи между уровнем АТ к ФН и СОЭ (г=0,28, р<0,03), АТ к ФН и уровнем циркулирующих иммунных комплексов (г=0,43, р<0,05).

Статистически значимые различия в уровнях антител были выявлены при сравнении групп больных ССД с минимальной и умеренной степенями активности и контрольной группой, при этом содержание сывороточных АТ к ФН при низкой активности ССД достоверно превышал показатели доноров (р<0,05), а при умеренной активности - показатели здоровых лиц (р<0,02) и больных с низкой активностью патологического процесса (р<0,05)

Достаточно убедительным являлось снижение концентрации сывороточных АТ на фоне лечения в группе со II степенью активности заболевания (табл.6).

Таблица 6

Количество ФН и АТ к ФН у больных ССД в зависимости от активности патологического процесса

Активность Количество больных Время обследования Количество ФН,мкг/мл АТ к ФН, е о п

1 18 До лечения 449,11±47,32 0,065+0,009*#

После лечения 420,43±24,08 0,063±0,008*

II 16 До лечения 499,64+38,19 0,089±0,012*#

После лечения 474,31±34,26 0,056±0,01"

Примечание * - достоверные различия с группой доноров,

# - достоверные различия между клиническими группами, "-достоверные различия между показателями до и после лечения

Хроническое течение ССД не сопровождалось статистически значимым изменением концентрации исследуемых антител по сравнению с контрольной группой (р>0,05), в то время как уровень АТ к ФН у больных с подострым течением значительно превосходил показатели доноров (р<0,02) и больных с хроническим вариантом течения (р<0,05) Динамическое исследование содержания АТ к ФН в этой группе позволило установить, что к концу пребывания больных в стационаре происходило достоверное снижение концентрации исследуемых АТ (р<0,03) (табл.7).

Таблица 7

Количество ФН и АТ к ФН у больных ССД в зависимости от характера течения заболевания

Течение Количество больных Время обследования Количество ФН, мкг/мл АТ к ФН, е о п

Хроническое 12 До лечения 412,26±34,22 0,061±0,005#

После лечения 388,15+46,14 0,056+0,003

Подострое 22 До лечения 502,03±54,11 0,089+0,008*#

После лечения 421,21±26,13 0,058+0,007"

Примечание * - достоверные различия с группой доноров,

# - достоверные различия между клиническими группами, "-достоверные различия между показателями до и после лечения

У больных ССД со стадией клинических проявлений (II) удалось выявить статистически достоверное повышение концентрации сывороточных АТ к ФН по отношению не только к донорам (р<0,03), но и к больным с начальной и терминальной стадиями заболевания (р<0,05) (табл.8).

Таблица 8

Количество ФН и АТ к ФН у больных ССД в зависимости от стадии развития заболевания

Стадия ССД Количество больных Время обследования Количество ФН,мкг/мл АТ к ФН, е.о п

1 11 До лечения 345,26±36,15 0,051±0,009

После лечения 356,12±36,15 0,050±0,005

II 21 До лечения 507,33±46,71 0,083±0,006*#

После лечения 364,26±28,42 0,063±0,004*"

III 2 До лечения 472,46±17,19 0,052±0,012

После лечения 435,31 ±21,21 0,049±0,006

Примечание * - достоверные различия с группой доноров,

# - достоверные различия между клиническими группами; "-достоверные различия между показателями до и после лечения

"Нормализация" уровня исследуемых АТ у больных с III стадией ССД может иметь следующее объяснение: госпитализация обеих пациенток была вызвана нарастающей полиорганной недостаточностью, при этом активность заболевания на момент обследования была минимальной Учитывая выявленную взаимосвязь между активностью патологического процесса и содержанием АТ к ФН (табл.6), подобный результат представляется обоснованным.

Как известно, ведущими звеньями патогенеза ССД являются нарушения микроциркуляции и поражение микроваскулярных структур по типу облитерирующего эндартериолита Свойственные болезни вазоспастические реакции в сочетании с поражением микрососудов лежат в основе развития легочной гипертензии, острой скперо-дермической нефропатии, ишемических изменений миокарда и ЦНС, определяя в значительной степени ее прогноз. Нами было выявлено, что наиболее высокий уровень АТ к ФН отмечался у пациентов ССД с поражением нервной и сердечно-сосудистой систем (табл. 9), при этом он статистически достоверно превосходил не только показатели

доноров (р<0,001), но и больных с другими висцеральными поражениями (р<0,05).

Таблица 9

Количество ФН и АТ к ФН у больных ССД с различными клиническими проявлениями

Клинические показатели п Время обследования Концентрация ФН, мкг/мл АТ к ФН, е о п

Синдром Рейно 33 До лечения 452,16±59,47 0,074+0,009*

После лечения 431,38±41,27 0,065±0,007*

Поражение ЖКТ 17 До лечения 421,34±52,76 0,071±0,008*

После лечения 359,38141,71 0,061+0,011

Поражение сердца 14 До лечения 416,35±34,28 0,105±0,014*#

После лечения 397,43±34,18 0,089+0,009*

Поражение почек 7 До лечения 495,61 ±41,68 0,061±0,008

После лечения 456,38±22,67 0,058±0,006

Поражение легких 10 До лечения 594,34±21,17 0,068±0,01*

После лечения 458,34±19,54 0,062±0,007

Поражение костно- мышечной системы 23 До лечения 398,44±51,31 0,072±0,009*

После лечения 385,61 ±31,47 0,063±0,006*

Поражение нервной системы 12 До лечения 406,38±42,41 0,119+0,011*#

После лечения 439,45±62,74 0,071±0,009*"

Примечание * - достоверные различия с группой доноров;

# - достоверные различия между клиническими группами; "-достоверные различия между показателями до и после лечения.

Можно предположить, что в качестве дополнительного фактора сосудистого повреждения у этих пациентов выступает отложение ФН-содержащих иммунных комплексов в эндотелии сосудов сердца и головного мозга (МаеИпвз К е1 а1., 2002). Наиболее характерным проявлением их взаимодействия является рост пролиферативной способности эндотелия и секреция молекул адгезии. Развивающееся в результате этого снижение реологических свойств крови и повышение тромбообразования может способствовать возникновению клиники церебрального васкулита и коронариита. Возможно, не последнюю роль в развитии ишемических повреждений играет ослабление антитром-ботических функций ФН, связанное с конформационными изменениями молекулы и блокадой его активных центров антителами

С целью изучения влияния различных видов терапии на динамику исследуемых показателей, а также для повышения достоверности результатов нами были отобраны больные со II стадией, подострым течением и умеренной активностью ССД, имевшие сходные клинико-лабораторные характеристики. В зависимости от вида проводимой терапии мы сформировали из них три группы I группа (4 человека) -получали основные виды терапии (антифиброзирующие и сосудистые препараты, ФТЛ), II группа (5 человек) - помимо основной терапии принимали ГКС; III группа (6 человек) - основная терапия была дополнена экстракорпоральными методами (плазмаферез)

Таблица 10

Количество ФН и AT к ФН у больных ССД в зависимости от вида проводимой терапии

Терапия п Время обследования Концентрация ФН, мкг/мл АТ к ФН, е о п

1 4 До лечения 393,48±31,82 0,064+0,008*#

После лечения 375,67+38,57 0,063±0,007*

II 5 До лечения 436,39±52,21 0,084±0,009*#

После лечения 456,33±29,51 0,063+0,006*"

III 6 До лечения 584,14±31,27 0,11 ±0,012*#

После лечения 419,45±64,71 0,076+0,009*"

Примечание * - достоверные различия с группой доноров,

# - достоверные различия между клиническими группами, "-достоверные различия между показателями до и после лечения

В I группе больных, несмотря на изначально невысокий уровень АТ, не произошло достоверного его уменьшения спустя три недели (р>0,05). Более выраженный эффект наблюдался у больных, принимавших ГКС В этой группе наблюдалась отчетливая тенденция к уменьшению количества АТ к ФН (р<0,05). У больных III группы на фоне клинического улучшения произошло достоверное снижение уровня АТ к ФН (р<0,02), однако и здесь он не достиг показателей здоровых лиц (табл. 10). Полученные результаты свидетельствуют об определенных преимуществах включения в комплексное лечение больных ССД глюкокортикостероидных препаратов и плазмафереза, приводящих к значимому снижению интенсивности антителогенеза и уменьшению активности заболевания.

Количество ФН и антител к нему у больных СКВ

У 53 больных СКВ, обследованных нами, содержание общего ФН плазмы варьировало в диапазоне от 370 до 810 мкг/мл и составило в среднем 654,38±43,52 мкг/мл, т.е. было достоверно выше аналогичного показателя у здоровых лиц (р<0,02) (рис.1). Концентрация плазменного ФН, превышающая нормальные значения, выявлялась у 33 больных СКВ (62,26%) Достоверного различия между количеством ФН плазмы крови у больных СКВ разного возраста и пола выявлено не было (р>0,05).

Рис. 1. Концентрация ФН плазмы крови у больных СКВ и ССД

Антитела к ФН были обнаружены у 41,6% больных СКВ. Их уровень (0,113 е.о.п.) достоверно превышал аналогичный показатель в группе доноров (р<0,01). Проведение корреляционного анализа позволило выявить положительные связи между уровнем AT к ФН и СОЭ (r=0,25, р<0,05), AT к ФН и ЦИК (г=0,47, р<0,05).

В группах с разной степенью активности концентрация AT к ФН была достоверно выше аналогичного показателя у доноров (р<0,05) (табл.11). Различия между содержанием исследуемых AT у пациентов с низкой, умеренной и высокой степенями активности, оцененных по «

шкалам SLEDAI, SLAM и с использованием критериев Насоновой В.А., были достаточно убедительными (р<0,05).

Рост титров исследуемых антител с повышением активности СКВ, скорее всего, имеет в основе последовательную поликлональную В-клеточную активацию и является частью генерализованного процесса гиперпродукции аутоантител. В связи с этим AT к ФН можно рассматривать как своеобразный серологический маркер активности СКВ и использовать их в качестве дополнительных индикаторов тяжести патологического процесса.

Таблица 11

Количество антител к ФН у больных СКВ в зависимости от активности патологического процесса

Активность п Время Количество ФН, AT к ФН,

обследования мкг/мл еоп.

По критериям

Насоновой В А.

Низкая 10 До лечения 628,34±31,27* 0,069+0,011*#

После 609,64±29,32* 0,058±0,012

Умеренная 32 лечения 632,31±41,81* 0,118±0,012*#

До лечения 614,46±32,75* 0,061±0,012"

Высокая 11 После 797,38±59,46*# 0,129±0,020*#

лечения 689,19±49,42* 0,076±0,014*"

До лечения

После

лечения

По шкале SLAM

Низкая 5 До лечения 598,33±19,82* 0,079±0,010*#

После 564,29±28,25* 0,061 ±0,012

Умеренная 21 лечения 603,65±42,62* 0,113±0,012*#

До лечения 578,35±23,28* 0,065±0,018*"

Высокая 27 После 781,32±46,19*# 0,138±0,021*#

лечения 674,52±67,82* 0,064±0,017*"

До лечения

После

лечения

По шкале SLEDAI

Низкая 14 До лечения 613,52±21,64* 0,074±0,016*#

После 592,18±35,34* 0,062±0,015

Умеренная 19 лечения 625,35±41,73* 0,107±0,012*#

До лечения 583,16±45, 32* 0,063±0,018*"

Высокая 20 После 786,36±36,84*# 0,132±0,019*#

лечения 711,51124,59* 0,071±0,011*"

До лечения

После

лечения

Примечание * - достоверные различия с группой доноров,

# - достоверные различия между клиническими группами, "-достоверные различия между показателями до и после лечения

Анализ соотношения активности и количества ФН показал статистически достоверные различия только для высокой степени активности заболевания (р<0,05) (табл.11)

Обнаружена корреляция между концентрацией иммунореактивного ФН и уровнем АТ к нему при максимальной активности СКВ (г=0,292, р=0,028), что может быть объяснено включением механизма обратной связи, стимулирующего образование большего количества ФН в ответ на гиперпродукцию специфических аутоантител Однако это не компенсирует возникший дефицит биологически активного ФН, поскольку при наличии его эндогенных ингибиторов - аутоантител -даже повышение синтеза гликопротеина не предотвращает последствий его функциональной недостаточности.

У больных СКВ с хроническим течением заболевания уровень сывороточных АТ к ФН был выше, чем в контрольной группе (р<0,05), а с подострым течением убедительно превосходил показатели больных с хроническим вариантом течения СКВ (р<0,05). Острое течение заболевания характеризовалось значительным повышением уровня специфических АТ к ФН по сравнению с группой доноров (р<0,001). Различия с аналогичными показателями в группах с хроническим и подострым течением также были достоверными (р<0,05). В большинстве случаев концентрация исследуемых антител перед выпиской снижалась почти вдвое (табл. 12).

Таблица 12

Количество ФН и АТ к ФН у больных СКВ в зависимости от характера течения заболевания

Течение Кол-во больных Время обследования Количество ФН, мкг/мл АТ к ФН, е о.п

Хроническое 12 До лечения 542,46±31,25* 0,072±0,009*#

После лечения 518,18±26,74 0,068±0,007*

Подострое 37 До лечения 568,03±54,11* 0,105+0,011*#

После лечения 597,41 ±21,17* 0,062+0,009"

Острое 4 До лечения 791,24+36,53*# 0,132±0,011*#

После лечения 611,29+46,83*" 0,063±0,008*"

Примечание' * - достоверные различия с группой доноров;

# - достоверные различия между клиническими группами; "-достоверные различия между показателями до и после лечения

Удалось установить, что при СКВ, в отличие от ССД, максимальные значения плазменного ФН наблюдаются при высокой активности и остром течении патологического процесса, причем они

достоверно выше аналогичных показателей в группе доноров и других рассматриваемых клинических группах (р<0,05). Найденные различия в содержании ФН отражают особенности патогенеза каждого заболевания Так, при системном склерозе ФН участвует, в первую очередь, в развитии локальных склеротических процессов в коже и органах, поэтому повышение уровня общего ФН плазмы незакономерно; при СКВ он выступает как медиатор воспаления и опсонин, что обуславливает его гиперпродукцию и рост концентрации в плазме

Нами были обнаружены определенные закономерности поражения тех или иных органов у больных СКВ с наличием АТ к ФН. Максимальный уровень исследуемых АТ наблюдался в группах с поражением почек и сердечно-сосудистой системы, при этом он статистически достоверно превосходил аналогичные показатели больных с другими висцеральными проявлениями (р<0,05) (табл 13)

Таблица 13

Количество ФН и АТ к ФН у больных СКВ с различными клиническими проявлениями

Клинические показатели п Время обследования Концентрация ФН, мкг/мл АТ к ФН, е о п

Поражение кожи 38 До лечения 641,38±42,36* 0,091±0,008*

После лечения 519,31±51,72 0,066±0,01*"

Поражение сердечнососудистой системы 31 До лечения 696,15±36,23* 0,132±0,012*#

После лечения 507,48±39,28 0,082±0,009*"

Поражение почек 24 До лечения 705,64±46,61* 0,139±0,013*#

После лечения 65б,34±28,67* 0,073±0,006*"

Поражение легких 8 До лечения 524,34±21,17 0,090±0,011*

После лечения 518,34±18,51 0,062+0,007"

Поражение костно- мышечной системы 41 До лечения 718,49151,32* 0,089±0,012*

После лечения 685,61 ±31,47* 0,061±0,007"

Поражение нервной системы 31 До лечения 604,39±45,42* 0,098±0,011*

После лечения 639,41 ±62,54* 0,064+0,009*"

Примечание. * - достоверные различия с группой доноров,

# - достоверные различия между клиническими группами, "-достоверные различия между показателями до и после лечения

Возможное участие AT к ФН в развитии волчаночной нефропатии было доказано ранее в исследованиях на животных: иммунизация нативным и денатурированным фибронектином индуцировала почечное повреждение у мышей и кроликов, а инъекция специфических антител крысам вызывала отложение фибронекгинсодержащих иммунных комплексов в мезангии (Atta M.S. et al., 1995) Нами была выявлена достоверная корреляционная зависимость между титрами AT к ФН и значениями ЦИК у пациентов с люпус-нефритом (г=0,28, р=0,024). Это подтверждает предположение, что ФН в составе иммунных комплексов может являться одним из факторов почечного повреждения при СКВ

Сердечно-сосудистые проявления в группе больных СКВ с наличием AT к ФН, как и при системном склерозе, были представлены патологией, обусловленной повышенным тромбообразованием и васкулярной недостаточностью (перемежающаяся хромота, венозный тромбоз, вторичная ишемия миокарда), что в очередной раз свидетельствует об общности патогенеза обоих заболеваний. Механизмы сосудистого повреждения при СКВ, по-видимому, тоже тесно связаны с отложением в эндотелии ФН-содержащих иммунных комплексов и снижением антитромботической функции ФН. Нами установлено, что у трети пациентов с повышенными значениями AT к ФН и клиникой венозных и артериальных тромбозов не выявляются антифосфолипидные AT. Это позволяет предположить, что одной из причин сосудистой патологии, ведущей к ишемическому поражению органов, могут являться иммунные реакции на ФН, а высокий уровень AT к нему у больных с поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, вероятно, отражает тяжесть васкулопатии данной локализации

Для объективизации оценки влияния проводимой терапии на содержание плазменного ФН и AT к нему нами были отобраны больные с подострым течением и умеренной активностью заболевания (по критериям Насоновой В.А., 1972 г.), имевшие сходные лабораторные показатели Применение различных видов терапии у этой категории пациентов позволило разделить их на три группы: I группа (10 человек) -получали ГКС в общепринятых дозировках и симптоматическую терапию, II группа (5 человек) - применялась комбинированная терапия: ГКС + цитостатики; III группа (7 человек) - в дополнение к основному лечению (ГКС) использовались методы экстракорпоральной терапии (плазмаферез).

Во всех группах произошло достоверное уменьшение количества AT к ФН к моменту выписки из стационара (р<0,05). Более выраженный эффект лечения наблюдался у больных, которым была назначена комбинированная терапия (ГКС+цитостатики) (р<0,03), и особенно у принимавших процедуры плазмафереза (р<0,001). Следует отметить, что у этих пациентов произошло практически двукратное снижение уровня аутоантител, однако нормальных значений он достиг лишь в группе с использованием экстракорпоральных методов (табл. 14).

Таблица 14

Количество ФН и АТ к ФН у больных СКВ в зависимости от вида проводимой терапии

Терапия п Время обследования Концентрация ФН, мкг/мл АТ к ФН, е о п

I 10 До лечения 655,12±31,12* 0,096+0,008*

После лечения 648,46±51,36* 0,071 ±0,009*"

II 5 До лечения 651,34±28,67* 0,131±0,011*

После лечения 649,84±51,34* 0,064+0,009*"

III 7 До лечения 614,39±45,16* 0,125±0,012*

После лечения 595,22±48,41* 0,061±0,009"

Примечание: * - достоверные различия с группой доноров,

# - достоверные различия между клиническими группами, достоверные различия меходу показателями до и после лечения

Возможно, данное обстоятельство связано с относительно коротким сроком наблюдения пациентов, ограниченным продолжительностью их пребывания в стационаре. Согласно литературным данным, основанным на длительном наблюдении больных СКВ, применение указанных препаратов в большинстве случаев позволяет поддерживать активность заболевания на минимальном уровне и, в конечном счете, ведет к прекращению выработки аутоантител (Сущук Е.А., 2002 г.).

Применение плазмафереза в комплексном лечении больных СКВ и ССД приводило к быстрому и значительному снижению концентрации АТ к ФН в сыворотках крови, при этом у большинства пациентов СКВ, позитивных в отношении АТ к ФН, наблюдалась нормализация исследуемых показателей. Однако широкое применение экстракорпоральных методов у больных данного профиля не представляется возможным из-за существования серьезных осложнений Показано, что неконтролируемое удаление иммуноглобулинов крови в ряде случаев приводит к иммунодефицитным состояниям, осложняющимся инфекциями, а травматизация форменных элементов крови может вызвать кровотечения вследствие развивающейся тромбоцитопении В связи с этим включение плазмафереза в комплексное лечение больных СКВ и ССД должно производиться индивидуально, с учетом, что предполагаемая польза этой процедуры превысит вред от возможных осложнений.

Сравнительный анализ уровня АТ к ФН у больных СКВ и ССД показал, что, несмотря на изначально более высокие титры и частоту выявления исследуемых АТ при СКВ, они в большей степени подвержены динамическим изменениям в процессе лечения. Возможно, это связано с более широким применением ГКС и иммунодепрессантов у данной категории больных, а также относительно частым использованием экстракорпоральных методов (рис 2).

ССД СКВ

Рис.2. Уровень АТ к ФН у больных СКВ и ССД

Таким образом, в результате проведенных исследований были разработаны и применены в варианте твердофазного иммуноферментного анализа иммобилизированные гранулированные препараты с магнитными свойствами на основе фибронекгина. С их помощью нам удалось продемонстрировать определенную диагностическую ценность исследования количества ФН и антител к нему при СКВ и ССД Применение данных показателей позволяет усовершенствовать иммунологическую диагностику этих заболеваний и открывает дополнительные возможности для оценки динамики их течения и прогноза. Уровень АТ к ФН может быть использован как индикатор эффективности проводимой терапии, что дает возможность осуществлять своевременную её коррекцию

Выводы

1 В сыворотке крови значительной части больных системной красной волчанкой и системной склеродермией обнаружены антитела к фибронекгину. При СКВ процент их выявления выше, чем при ССД.

2 Показано наличие неспецифического взаимодействия клеточного домена молекулы фибронектина с Рс-фрагментом 1дС, составляющее до 15% в ИФА, что необходимо учитывать при интерпретации результатов.

3. При СКВ максимальные значения концентрации АТ к ФН отмечаются при высокой активности патологического процесса, остром течении заболевания и поражении почек, сердца и сосудов. При ССД существенное повышение уровня АТ к ФН наблюдается на стадии развернутых клинических проявлений и при вовлечении в патологический процесс нервной и сердечно-сосудистой систем При подостром течении и умеренной активности ССД содержание антител к ФН выше, чем при хроническом течении и минимальной активности заболевания.

4. При СКВ имеет место повышение содержания плазменного фибронектина, причем максимальные его значения наблюдаются при остром течении и высокой активности заболевания, что позволяет использовать этот критерий в комплексе с определением уровня антител к фибронекгину для объективизации оценки активности патологического процесса.

5. Применение в комплексном лечении больных СКВ иммуносупрессивных препаратов и особенно методов экстракорпоральной терапии приводит к выраженному снижению уровня антител к фибронекгину. При ССД значительное уменьшение концентрации исследуемых антител наблюдается при использовании глюкокортикостероидов и плазмафереза.

6 Уровень антител к фибронектину может служить дополнительным критерием активности СКВ и ССД и использоваться для оценки эффективности проводимой терапии наряду с традиционными клинико-лабораторными показателями.

Практические рекомендации

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе фибронектина рекомендуется использовать для выявления антител к нему у больных СКВ и ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.

2. При определении антител к ФН иммуноферментным методом за норму следует считать сумму показателей здоровых лиц (М±2о) и величины поправки на неспецифическое связывание Положительным следует считать значение, превышающее 0,062 е.о.п.

3 Рекомендуется использовать определение уровня AT к ФН в сыворотке крови как дополнительный лабораторный критерий активности системной красной волчанки и системной склеродермии, а также для диагностики возможного вовлечения в патологический процесс сердечно-сосудистой, нервной систем и почек.

4 При системной красной волчанке и системной склеродермии наряду с общепринятыми кпинико-лабораторными показателями следует использовать определение уровня AT к ФН в сыворотке крови в качестве дополнительного критерия эффективности проводимой терапии.

Публикации

1. Патогенетическое значение антителогенеза к фибронекгину при ревматических заболеваниях // Актуальные проблемы современной ревматологии / Под ред А.Б. Зборовского, -Волгоград, 2002, - Вып 20, - С.68-69 (соавт. Гонтарь И И , Маслакова Л.А, Кулик C.B., Зотина М.В, Никитин M В, Александров A.B.)

2 Исследование иммунного ответа к ядерным антигенам у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией. И Актуальные проблемы современной ревматологии / Под ред А.Б.Зборовского, - Волгоград, 2002, - Вып.20, - С.122-123 (соавт. Сущук Е А , Александров А В , Маслакова Л А , Язид Аль Раави, Емельянов H И., Сычева Г.Ф , Гонтарь И И., Зборовский А.Б.)

3. Определение антител к фибронекгину у больных ревматическими заболеваниями. // Материалы 61-й открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», 21-25 апреля 2003г., Волгоград, С.96 (соавт. Гонтарь И И, МаслаковаЛ.А.)

4. Клинико-диагностическое значение исследования антител к фибронекгину у больных ревматическими заболеваниями. // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», 19-23 апреля 2004г., Москва, тезисы докладов, С.125 (соавт. Гонтарь И.П., Александров A.B., Красильников А.Н., Шилова Л.Н., Маслакова Л.А., Гонтарь И.И., Зборовская И.А.)

5. Антителообразование к фибронекгину при ревматических заболеваниях. // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области / Под ред В И Петрова, -Волгоград, 2004, - №1, - С 43-44 (соавт. Гонтарь И П., Гонтарь И И., Маслакова Л.А., Сычева ГФ , Зборовская И.А.)

6 Особенности неспецифического взаимодействия фибронектина с иммуноглобулинами крови у больных ревматическими заболеваниями // Материалы 62-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы

экспериментальной и клинической медицины», 19-23 апреля 2004г, Волгоград, С.61 (соавт. Гонтарь И.И., Маслакова Л.А.)

7. Оптимизация иммуноферментного анализа для выявления антител к фибронектину у больных ревматическими заболеваниями. // Тезисы школы молодых ревматологов с конференцией «Актуальные вопросы практической и теоретической ревматологии», 24-26 мая 2004г., Звенигород. - Научно-практическая ревматология. - 2004,- №2, - С. 126 (соавт. Гонтарь И.И., Александров A.B.)

8. Изучение неспецифического взаимодействия фибронекгина с иммуноглобулинами крови у больных ревматическими заболеваниями // Актуальные проблемы современной ревматологии и кардиологии / Под ред. А.Б.Зборовского, -Волгоград, 2004, - Вып.21, - С.53-54 (соавт. Маслакова Л А., Гонтарь И.И., Сычева Г.Ф., Шилова Л.Н., Емельянов Н.И, Гонтарь И.П.)

9 Значение определения антител к фибронектину при ревматических заболеваниях. // Актуальные проблемы современной ревматологии и кардиологии / Под ред А.Б Зборовского, - Волгоград, 2004, -Выл 21, - С.76-77 (соавт Маслакова Л.А., Гонтарь И.И., Никитин М В, Александров A.B., Трубенко Ю.А., Емельянов Н.И, Зборовский А.Б.)

10. Диагностическое и патогенетическое значение антителообразования к фибронектину при системной красной волчанке и системной склеродермии. II Актуальные проблемы современной ревматологии / Под ред. А.Б.Зборовского, -Волгоград, 2005, - Вып.22, - С.80 (соавт. Маслакова Л.А., Гонтарь И.И.).

11 Антителообразование к фибронектину при ревматоидном артрите: кпинико-патогенетические аспекты // Актуальные проблемы современной ревматологии / Под ред. А.Б.Зборовского, -Волгоград, 2005, - Вып.22, - С.30 (соавт Маслакова Л.А., Гонтарь И.И.)

12 Изучение взаимосвязи между уровнем антител к дезоксирибонуклеазе I и некоторыми клинико-иммунологическими показателями при системной красной волчанке. // Материалы XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 12-15 апреля 2005 г, Москва, С.485-486 (соавт Трофименко A.C., Гонтарь И.П., Емельянова О И.)

Научное издание

КОЧНЕВА ЛЮБОВЬ ИВАНОВНА

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ФИБРОНЕКТИНУ У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ И СИСТЕМНОЙ СКЛЕРОДЕРМИЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЫ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА

Автореферат

Подписано к печати 12 05 2005 г Формат 60*84/16. Печать офс Бум офс Гарнитура «Arial» Уел печ л 1,4 Уч-изд л 1,5. Тираж 100 экз Заказ 107

ВГПУ Издательство «Перемена» Типография издательства «Перемена» 400131, Волгоград, пр. им В.И Ленина, 27

pi о02O

РНБ Русский фонд

2006-4 6984

Ревматические заболевания на протяжении вот уже нескольких десятков лет являются объектом пристального внимания большого количества ученых и клиницистов. Повышенный интерес к этой патологии не случаен. По данным статистики, заболеваемость БКМС в России увеличилась за последние 10 лет на 41% и составляет в настоящее время 32-34 случая на 100 ООО населения. При этом в Южном федеральном округе показатель заболеваемости наиболее высокий - 38 случаев на 100 000 населения, поэтому проблема особенно актуальна в нашем регионе (105,104,110).

Системная красная волчанка и системная склеродермия являются самыми распространенными патологиями в группе системных поражений соединительной ткани. Заболеваемость СКВ в развитых странах находится в диапазоне от 1,8 до 27,1 случаев на 100 000 населения с большими различиями в разных популяциях. Есть данные, что за последние 40-50 лет этот показатель увеличился почти втрое, и тенденция к росту сохраняется (272,50,747,179).

В отличие от СКВ, ССД продолжает оставаться довольно редкой патологией: 0,37- 1,2 случая на 100 000 населения. Данные о динамике заболеваемости ССД за последние годы противоречивы: есть сообщения как о росте этих показателей, так и о некотором снижении, что требует дальнейшего детального изучения (104,218,747).

Продолжительность жизни больных хроническими РЗ значительно ниже среднепопуляционной, хотя нельзя игнорировать достигнутые в этом направлении определенные успехи. Применение практически всего арсенала существующих в медицине противовоспалительных и цитотоксических препаратов позволило существенно улучшить прогноз жизни больных СКВ. Если до 1970 г. продолжительность жизни только 40% больных СКВ превышала 5 лет, то в настоящее время 5-летняя выживаемость достигает 70-90% (51,54). По данным аутопсий в Москве летальность от СКВ за 2002 год составила 12,7% среди всех РЗ, ставших причиной смерти (109).

При ССД прогноз остается менее благоприятным: 40% больных (в основном с острым и подострым течением) погибает в течение первых 5 лет, 70% - в течение 10 лет. В то же время при хроническом течении заболевания выживаемость сохраняется приблизительно на одном уровне на протяжении 1015 лет и составляет 84-88 % (51,218,227).

Социально-экономические последствия СКВ и ССД трудно переоценить. Средний возраст больных СКВ к началу заболевания составляет 27,1±11,8, к моменту выхода на инвалидность - 34±10,4 (106). Очевидно, что наряду с прямыми затратами, такими, как дорогостоящая диагностика, пожизненное медикаментозное лечение, систематическое лабораторное и инструментальное обследование с целью коррекции терапии, существенный вес имеют непрямые затраты: снижение и утрата трудоспособности, нередко - преждевременная смерть, вторичное бесплодие и т.д. (40).

В числе основных задач инициированной под эгидой ВОЗ Всемирной декады по заболеваниям, поражающим двигательный аппарат человека (20002010 гг.), были названы дальнейшее изучение патогенетических механизмов ревматических заболеваний, совершенствование и внедрение в практику новых методов ранней диагностики и лечения с учетом не только клинической, но и экономической эффективности и целесообразности (784).

Как показали новейшие разработки в диагностике ССД и СКВ, иммуноферментные методы анализа с использованием иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами на основе антигенов нуклеиновой, липидной и белковой природы в полной мере отвечают указанным требованиям. Неоспоримые преимущества метода заключаются, в первую очередь, в повышении стабильности иммобилизированного биополимера, а также возможности регенерировать сорбент, что ведет к значительному экономическому эффекту. Кроме того, иммобилизация биологически активных веществ в поверхностном слое гранулы создает высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, что повышает чувствительность твердофазных методов анализа. Включение магнитного материала в гранулы дает возможность ускорить и упростить манипуляции на всех этапах исследования, улучшая качественные характеристики определений и увеличивая число обрабатываемых проб. Указанные преимущества делают этот метод экономичным и легко применимым в практической медицине (36,45,20).

Гранулированные препараты с магнитными свойствами уже были использованы для усовершенствования иммунодиагностики СКВ и ССД и и выявления антител к ДНК, РНК, кардиолипину, каталазе, церулоплазмину и другим биополимерам. В ряде случаев специфические антитела обнаруживались на начальных стадиях заболевания, что позволило решить вопросы ранней диагностики (69,98,111).

Антителообразование к ФН при РЗ представляет собой малоизученную проблему. Выбор этого высокомолекулярного гликопротеида в качестве объекта исследования не случаен. Благодаря многообразию свойств, ФН принимает участие во многих жизненно важных процессах, таких как фагоцитоз, гемостаз, модулирование проницаемости сосудистой стенки, формирование внеклеточного соединительнотканного матрикса (55,12,9,118). Предполагается, что при ДБСТ нарушение функций ФН с развитием патологических реакций может быть обусловлено антителообразованием к нему. В связи с этим, использование иммобилизированной формы ФН в иммунодиагностике СКВ и ССД представляется весьма актуальной задачей, направленной на улучшение качества диагностики этих заболеваний и обозначающей перспективы изучения отдельных механизмов их патогенеза.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования являлось усовершенствование иммунологической диагностики и оценки эффективности лечения системной красной волчанки и системной склеродермии путем определения антител к фибронектину с использованием иммобилизированной формы магнито-управляемого сорбента.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить иммобилизированную форму фибронектина, изучить ее физико-химические свойства.

2. Применить иммобилизированную форму фибронектина в иммуноферментном методе анализа для выявления антител к нему.

3. Определить возможность неспецифического взаимодействия фибронектина с иммуноглобулинами крови.

4. На основе иммуноанализа изучить содержание фибронектина и антител к нему в сыворотке крови здоровых лиц и больных системной красной волчанкой и системной склеродермией в зависимости от активности, стадии и клинических проявлений заболевания.

5. Провести оценку влияния терапии на динамику уровня антител к фибронектину у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые для иммунодиагностики СКВ и ССД разработан вариант иммуноферментного анализа с применением иммобилизированной гранулированной формы фибронектина и подобраны оптимальные условия его постановки. Для оценки активности патологического процесса впервые применено комплексное исследование с определением количества общего фибронектина плазмы крови и антител к нему. В ходе работы в сыворотках крови больных СКВ и ССД обнаружены антитела к фибронектину. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных AT в сыворотке крови здоровых лиц. Установлено, что поражение нервной системы при ССД, почек при СКВ и сердечно-сосудистой системы при обоих заболеваниях сопровождается максимальными значениями исследуемых AT. Выявлено, что количество плазменного ФН и уровень антител к нему у больных СКВ и ССД коррелируют с активностью патологического процесса. Определена способность исследованных показателей к изменению под влиянием проводимой терапии, что обеспечивает возможность оценки ее эффективности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к ФН на основе иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами. Выявление антител к ФН в предложенной модификации ИФА может быть использовано в качестве дополнительного теста для диагностики СКВ и ССД, оценки активности патологического процесса и прогнозирования клинических форм заболевания. Динамика изученных показателей дает возможность судить об эффективности проводимой терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На защиту выносится положение о возможности определения антител к ФН с помощью методов иммуноферментного анализа на основе иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами у больных СКВ и ССД. Исследование антител к ФН может быть использовано в качестве дополнительных тестов для диагностики СКВ и ССД, выделения клинических вариантов заболеваний, а в комплексе с определением количества общего ФН плазмы крови - для уточнения степени активности патологического процесса. Динамика этих показателей может служить для оценки эффективности проводимой терапии.

ПУБЛИКАЦИИ

Основные положения диссертации изложены в 12 печатных работах, из которых 4 - в центральной и 8 - в местной печати. Материалы диссертации были представлены на XI Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004 г.), конференции «Актуальные вопросы практической и теоретической ревматологии» (Звенигород, 2004 г.), ежегодных научных конференциях студентов и молодых ученых ВолГМУ (2002-2005 гг.).

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Методы определения количества иммунореактивного ФН и антител к ФН с помощью иммобилизированных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в МУЗ ГКБ №25 г.Волгограда и МУЗ ГБ №1 им. С.З. Фишера г.Волжского.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, представленной 2 главами, в которых

ВЫВОДЫ

1. В сыворотке крови значительной части больных системной красной волчанкой и системной склеродермией обнаружены антитела к фибронектину. При СКВ процент их выявления выше, чем при ССД.

2. Показано наличие неспецифического взаимодействия клеточного домена молекулы фибронектина с Fc-фрагментом IgG, составляющее до 15% в ИФА , что необходимо учитывать при интерпретации результатов.

3. При СКВ максимальные значения концентрации AT к ФН отмечаются при высокой активности патологического процесса, остром течении заболевания и поражении почек, сердца и сосудов. При ССД существенное повышение уровня AT к ФН наблюдается на стадии развернутых клинических проявлений и при вовлечении в патологический процесс нервной и сердечно-сосудистой систем. При подостром течении и умеренной активности ССД содержание антител к ФН выше, чем при хроническом течении и минимальной активности заболевания.

4. При СКВ имеет место повышение содержания плазменного фибронектина, причем максимальные его значения наблюдаются при остром течении и высокой активности заболевания, что позволяет использовать этот критерий в комплексе с определением уровня антител к фибронектину для объективизации оценки активности патологического процесса.

5. Применение в комплексном лечении больных СКВ иммуносупрессивных препаратов и особенно методов экстракорпоральной терапии приводит к выраженному снижению уровня антител к фибронектину. При ССД значительное уменьшение концентрации исследуемых антител наблюдается при использовании глкжокортикостероидов и плазмафереза.

6. Уровень антител к фибронектину может служить дополнительным критерием активности СКВ и ССД и использоваться для оценки эффективности проводимой терапии наряду с традиционными клинико-лабораторными показателями.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные иммобилизированные гранулированные антигенные препараты с магнитными свойствами на основе фибронектина рекомендуется использовать для выявления антител к нему у больных СКВ и ССД в разработанном варианте иммуноферментного анализа.

2. При определении антител к ФН иммуноферментным методом за норму следует считать сумму показателей здоровых лиц (М±2а) и величины поправки на неспецифическое связывание. Положительным следует считать значение, превышающее 0,062 е.о.п.

3. Рекомендуется использовать определение уровня AT к ФН в сыворотке крови как дополнительный лабораторный критерий активности системной красной волчанки и системной склеродермии, а также для диагностики возможного вовлечения в патологический процесс сердечно-сосудистой, нервной систем и почек.

4. При системной красной волчанке и системной склеродермии наряду с общепринятыми клинико-лабораторными показателями следует использовать определение уровня AT к ФН в сыворотке крови в качестве дополнительного критерия эффективности проводимой терапии.