Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Клинико - диагностическое значение генетических маркеров и сосудисто-эндотелиального фактора роста при неудачной имплантации плодного яйца у женщин, включенных в программу ЭКО

На правах рукописи

ВОЛКОВА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ И СОСУДИСТО-ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ПРИ НЕУДАЧНОЙ ИМПЛАНТАЦИИ ПЛОДНОГО ЯЙЦА У ЖЕНЩИН, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПРОГРАММУ ЭКО

14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 СЕН 2011

Москва - 2011

4853283

Работа выполнена в Первом Московском государственном медицинском университете имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Аляутдина Ольга Сергеев

академик РАН и РАМН, профессор Пальцев Михаил Александров Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Баев Олег Радомиров

Доктор медицинских наук, профессор Зарубина Елена Николаев

Ведущая организация: ГУЗ «Московский областной науч исследовательский институт акушерства и гинекологии»

Защита состоится « 2011 года в « часов на заседа

диссертационного совета Д 208.040.03 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, дом 8, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49.

Автореферат разослан « / » 2011

года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Шулутко Александр Михайлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Развитие молекулярной медицины позволяет исследовать и анализировать прецизионные механизмы молекулярных взаимодействий, которые происходят в эндометрии с момента оплодотворения и до завершения формирования плаценты. Нормальное течение гестации зависит от состояния ангиогенеза, продукции ангиогенных факторов, контролирующих рост, развитие и регресс сосудов, а также стимулирующих пролиферацию клеток и тканей. Одним из основных активаторов ангиогенеза в органах репродуктивной системы женщин является сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР), который, наряду с индукцией ангиогенеза, повышает сосудистую проницаемость (Бурлев В.А. и др., 2008).

Прогрессирование беременности невозможно без четкого функционирования сложной сосудистой системы, обеспечивающей адекватный обмен между организмами матери и плода. Установлено, что экспрессия СЭФР при беременности осуществляется несколькими компонентами фетоплацентарного комплекса: железистым эпителием, фетальными и материнскими макрофагами, а также цитотрофобластом.

Кроме того, удачно протекающая беременность не может обойтись без тонкого контроля фибринолитической активности. Фибринолиз - процесс, контролируемый ингибитором активатора плазминогена первого типа (РАН). Полиморфизм гена РАН, сопровождающийся повышением уровня РАН в плазме и снижением фибринолитической активности ассоциируется с повышенным риском потери беременности.

Необходимо понимать, что РАН, играющий важную роль в гемостазе, клеточной адгезии и деградации внеклеточного матрикса, изменяет свою активность под влиянием факторов регуляции. Взаиморегуляция различных систем на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях в эндометрии

способствует наступлению и успешному течению беременности. Системные изменения, гормональные, иммунологические перестройки на организменном уровне не редко служат лишь командой локальным исполнителям - клеткам эндометрия. Только в условиях их отлаженного взаимодействия становится возможным процесс оплодотворения и принятия материнским организмом наступившей беременности (Демидова Е.М. и др., 2006).

Следует учитывать, что даже безупречное управление не может гарантировать надежности исполнения, поэтому, отвергнув все известные на сегодняшний день причины потери беременности, мы неизбежно пытаемся оценить функциональную состоятельность в локусе. Одним из главных проявлений локальных нарушений в эндометрии во время беременности является отслойка хориона, которой всегда предшествуют локальные изменения гемостаза.

Выявление маркеров состояния локального гемостаза является важным шагом на пути преодоления необъяснимых на сегодняшний день причин потери беременности. Необходимо учитывать сложные клеточно-молекулярные взаимодействия, которые происходят в эндометрии, их особенности, связанные с наступлением беременности (Пальцев М.А. и др., 2007).

Механизм этих клеточных взаимодействий универсален для всех органов и тканей, однако имеет свои характерные черты, обусловленные вовлечением в реакции уникальных клеток - клеток эмбриона. Не представляется возможным разграничение происходящих в эндометрии процессов на более приоритетные и менее значимые - все реакции протекают каскадно и параллельно, формируя уникальный тонкий молекулярно-клеточный механизм сохранения беременности.

Познание этого механизма и есть ключ к пониманию к такой сложной патологии как потеря беременности. Таким образом, мы можем предположить, что ключевым моментом для физиологического обеспечения функционирования репродуктивной системы женщины и реализации детородной функции является циклический ангиогенез.

Дальнейшее изучение компонентов ангиогенеза позволит разработать новые методы специфической коррекции данной патологии репродуктивной системы женщины.

Цель исследования: Оценить роль некоторых генетических и паракринных факторов при неудачных попытках ЭКО и ПЭ, разработка комплексного подхода к тактике ведения женщин, включенных в программу ЭКО и ПЭ, а также ведение женщин с неудачами ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Задачи исследования:

1. Определить значение генетических маркеров, сосудисто-эндотелиального фактора роста в процессе имплантации.

2. Провести патоморфологическую оценку состояния эндометрия.

3. На основании клинико-лабораторного анализа провести комплексную оценку клинической эффективности и прогностической значимости различных клинико-лабораторных методов диагностики.

4. Разработать и обосновать тактику комплексного подхода к ведению больных с данной патологией.

5. Определить принципы профилактики у женщин, включенных в программу ЭКОиПЭ.

6. Изучить принципы коррекции данной патологии.

7. Определить частоту наступления беременности в исследуемых группах и их исход.

Научная новизна работы: Впервые в отечественной практике проведена оценка уровня концентрации генетических маркеров и сосудисто-эндотелиального фактора роста в сыворотке крови у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Впервые в алгоритм обследования и подготовки пациенток к проведению программы ЭКО и ПЭ включено биохимическое исследование маркеров дисфункции эндотелия.

Впервые разработано патогенетическое обоснование медикаментозной терапии при неудачных попытках ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Оценена эффективность программы ЭКО и ПЭ у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые в отечественной практике проведена оценка уровня концентрации генетических маркеров и сосудисто-эндотелиального фактора роста в сыворотке крови у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе. В алгоритм обследования и подготовки пациенток при проведении программы ЭКО и ПЭ включено исследование маркеров дисфункции эндотелия. Нами впервые изучена оценка уровня концентрации генетических маркеров и сосудисто-эндотелиального фактора роста в сыворотке крови у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе. Оценена эффективность программы ЭКО и ПЭ у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Реализация полученных результатов. Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы отделения вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия Клиники акушерства и гинекологии им. В. Ф. Снегирева, в учебном процессе на кафедре акушерства и гинекологии № 1 лечебного факультета ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции отделения вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия и на заседании кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета Первого МГМУ им. И. М. Сеченова 15 июня 2011 года, протокол №23. Диссертация рекомендована к защите.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы, из них 3 статьи опубликованы в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования РФ.

Личное участие автора в выполнении работы. Выбор методов исследования, их планирование, проведение инструментальных методов, выполнение расчетов, статистическая обработка полученных данных, а также оформление диссертационного исследования и автореферата выполнены автором самостоятельно.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 132 страницах компьютерного текста, содержит 5 таблиц и 17 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 119 источников, из них 18 отечественных.

Положения, выносимые на защиту.

1. В программе подготовки к ЭКО и ПЭ, а также у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе, необходимо смотреть в сыворотке крови маркеры локального гемостаза (СЭФР, Гомоцистеин, Эндотелии, Ингибитор активатора плазминогена первого типа, Тканевой активатор плазминогена).

Повышенное содержание маркеров локального гемостаза в сыворотке крови могут рассматриваться, как маркеры неудачной имплантации плодного яйца.

2. В алгоритм обследования и подготовки к программе ЭКО и ПЭ целесообразно включать аспирационную биопсию эндометрия, в отличие от гистероскопии, так как данная процедура менее травматичная для эндометрия, безболезненная и может выполняться в амбулаторных условиях.

3. При своевременной коррекции нарушений состояния локального гемостаза в репродуктивной системе у пациенток с неудачными попытками ЭКО и ПЭ путем применения патогенетически обоснованной терапии (гормональной, фолатами, антикоагулянтами), повышенная концентрация маркеров локального гемостаза в сыворотке крови понижается и эффективность программы ЭКО и ПЭ при этом возрастает.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика больных, объем и методы исследования.

Диссертационная работа выполнена на кафедре акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета 1 МГМУ им. И. М. Сеченова в период с 2008 по 2011 год.

В процессе работы были обследованы 86 женщин в возрасте от 28 до 43 лет (средний возраст 35,5 ± 4,6 года) с неудачами ЭКО и ПЭ в анамнезе, обратившихся в отделение вспомогательных репродуктивных технологий Клиники акушерства и гинекологии им. В. Ф. Снегирева с целью лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ. Эти пациентки составили следующие клинические группы: I группа (л=44) - пациентки с бесплодием неясного генеза, из них у 34 бесплодие I (у 21 □ неудачи ЭКО и ПЭ) и у 10 бесплодие II и неудачи ЭКО и ПЭ. II группа (п=21) - беременные после программы ЭКО и ПЭ, 24 из них - с неудачами ЭКО и ПЭ в анамнезе. III группа («=15) - здоровые небеременные женщины.

Всем пациенткам проводилось ультразвуковое исследование органов малого таза, обследование на половые инфекции, определение гормонального статуса, иммунологическое обследование, определение состояния системы гемостаза, молекулярно-генетический анализ факторов риска тромбофилии, генетическое (определение кариотипа супругов), а также в сыворотке крови женщин, определялись дополнительные маркеры локального гемостаза с 20-го по 24-й день менструального цикла: - Сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР), Гомоцистеин, Эндотелии, Ингибитор активатора плазминогена первого типа (PAI-1), Тканевой активатор плазминогена (t-PA) с помощью иммуноферментного метода набором коммерческих реактивов фирмы eBioscience Human (Австрия).

Критериями включения пациенток в исследование были: ненарушенный менструальный цикл, проходимые маточные трубы, матка без каких - либо патологий, безуспешные попытки ЭКО и ПЭ в анамнезе, отсутствие мужского фактора бесплодия.

Противопоказанием к применению метода ЭКО и ПЭ были: гиперпластические процессы и новообразования органов репродуктивной системы, пороки развития матки, препятствующие наступлению беременности, а также психические и соматические заболевания.

Всем пациенткам проводили стандартное обследование, необходимое для включения в программу ЭКО и ПЭ.

Всем пациенткам проводилась «Pipell» - биопсия эндометрия на 5-8-й и 20-24-й день менструального цикла.

Статистическая обработка данных. Обработка данных велась с помощью программы Statistica for Windows 7.0. Все количественные и качественные показатели описывались общепринятыми методами (среднее значение, стандартное отклонение, медиана, 95% доверительные интервалы, частоты (%). Анализ количественных данных производился с помощью t-критерия Стьюдента или Манна-Уитни (для показателей, не удовлетворяющих закону нормального распределения), сравнение качественных признаков осуществлялось с помощью критерия Хи-квадрат или точного критерия Фишера для малых выборок. Связь между показателями анализировали с помощью корреляционного анализа Пирсона или Спирмена. Статистически значимыми различия считались при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе работы были обследованы 86 женщин в возрасте от 28 до 43 лет (средний возраст 35,5 ± 4,6 года) с неудачами ЭКО и ПЭ в анамнезе, обратившихся в отделение вспомогательных репродуктивных технологий Клиники акушерства и гинекологии им. В. Ф. Снегирева с целью лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ. Эти пациентки составили следующие клинические группы: I группа (и=44) - пациентки с бесплодием неясного генеза, из них у 34 бесплодие I (у 21 О неудачи ЭКО и ПЭ) и у 10 бесплодие II и неудачи ЭКО и ПЭ. II группа (и=27) - беременные после программы ЭКО и ПЭ, 24 из них - с

9

неудачами ЭКО и ПЭ в анамнезе. III группа (и=15) - здоровые небеременные женщины.

I группа II группа III группа

Рис. 1 Данные, приведенные выше показывают, что особых возрастных различий между группами пациенток не существует. Возраст не влияет на количество неудачных попыток ЭКО и ПЭ.

Частота первичного и вторичного бесплодия у женщин, исследуемых групп

□ бесплодие! ПбесплодиеИ

Рис.2 Данные показывают, что частота первичного бесплодия у женщин, включенных в исследование составляет 77% и преобладает над вторичным бесплодием, которое составляет 23% (р>0,05).

Среднее количество попыток ЭКО и ПЭ в исследуемых группах

01 попытка ЭКО

02 и более попыток ЭКО

30%

89%

11%

1 группа

2 группа

Рис.3 На рисунке показано, что среднее количество попыток ЭКО и ПЭ в исследуемых группа различий не имеет (р>0,05).

Длительность бесплодия у пациенток 1 и 2 группы с ранее безуспешными попытками ЭКО и ПЭ колебалась от 5 до 14 лет.

Далее учитывались особенности становления менструальной функции.

У всех пациенток был регулярный менструальный цикл, время наступления менархе соответствовал 12-14 годам и не отличался от популяционных данных, в среднем составил 13,1+0,5лет, также была отмечена нормальная длительность менструации от 2 до 7 дней.

Анализ особенностей менструального цикла 71 пациентки с бесплодием и безуспешными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе показал, что своевременное менархе имели все обследованные женщины (р>0,05).

Нормальную длительность менструации также отметили все женщины (р>0,05).

В III группе («=15) - здоровые небеременные женщины, также отмечали регулярный менструальный цикл.

Далее учитывался характер перенесенных заболеваний у женщин, включенных в программу исследования.

Были выявлены следующие соматические заболевания - заболевания ЖКТ (27%), заболевания сердечно-сосудистой системы (23%), заболевания дыхательной системы (8%) и урогенитальные заболевания (34%) и др.

Гинекологические заболевания перенесли почти 80% женщин исследуемых групп (р>0,05) - статистически значимых различий между группами не выявлено.

Наиболее частыми ИППП являлись - урогенитальный хламидиоз, генитальный герпес и микоплазмоз.

Завершая анализ анамнестических данных женщин, включенных в программу исследования от 28 до 43 лет, средний возраст (35,5 ± 4,6) года, при длительности бесплодия от 5 до 14 лет, можно сделать вывод, что у каждой второй женщины был отягощенный соматический и/или гинекологический анамнез.

Результаты комплексного клинико-лабораторного обследования.

Всем пациенткам проводилось стандартное обследование, необходимое для включения в программу ЭКО и ПЭ.

При объективном осмотре молочных желез установлено их умеренное развитие у всех изучаемых женщин, соответствовавшее 3-5степеням по Таппег.

При осмотре увеличение щитовидной железы 1-2 степени выявлено у 3% пациенток.

Результаты УЗИ подтвердили наличие диффузного зоба 1-2 степени у этих больных.

Узловые образования в щитовидной железе отсутствовали у всех пациенток, включенных в исследование.

Все женщины были обследованы на ИППП. Скрининг проводили с помощью микроскопии влагалищных мазков и забора цервикального материала для диагностики ИППП. При выявлении ИППП назначали соответствующее лечение.

Оценка состояния гипоталамо-гипофизно-яичниковой системы проведена всем пациенткам: Концентрация Е2 в плазме крови составляла 211+24,8 (168-321) пмоль/л и указывала на достаточную эстрогенную насыщенность организма у всех обследованных женщин.Уровень прогестерона в середину лютеиновой фазы цикла составлял 45,1+2,7 (16,4-54,7) нмоль/л и указывал на сохранение процесса овуляции у всех обследованных женщин. Базальный уровень пролактина в плазме крови у всех пациенток соответствовал нормативным показателям и составлял в среднем 327+18,7 (184-421)мМе/л. Концентрация гонадотропинов в плазме крови в первую фазу менструального цикла также не отличалась от нормативных показателей и составила в среднем: ЛГ-5,7+0,9 (4.1-9,2) МЕ/л, ФСГ-5,4+0,7 (3,68,7) МЕ/л. Оценку андрогенного статуса проводили по изучению концентраций тестостерона и ДЭА-С в плазме крови, средние значения которых составили 1,3+0,2 (1,1-2,4) нмоль/л. и 4,9+0,6 (1,4-6,7) нмоль/л соответственно.

Тиреоидный статус изучен у всех пациенток. Уровень ТТГ составлял в среднем 1,7+0,2 (1,5-2,2) мМЕ/л., уровень Т4св.-111+2,9 (106-119) нмоль/л. Гормональные показатели указывали на сохранение функции щитовидной железы у всех обследованных женщин.

Результаты оценки функционального состояния гипоталамо-гипофизно-яичниковой системы свидетельствовали о наличии овуляторного менструального цикла у всех женщин, включенных в исследование, что было подтверждено соответствующим уровнем прогестерона в середину лютеиновой фазы.

У всех женщин были сохранены пролактинсекретирующая и гонадотропная функция гипофиза, функция щитовидной железы, а также показатели андрогенного статуса. Имеющиеся колебания средних значений концентраций ЛГ, ФСГ, Е2, Прл., СТГ, Т, К, ТТГ и Т4 у пациенток группы сравнения не имели

13

принципиального отличия от показателей основной группы и находились в пределах доверительных интервалов, характерных для здоровых женщин.

Средние значения содержания гормонов в сыворотке крови в раннюю фолликулиновую фазу

Таблица 1

ГОРМОНЫ НОРМА ОСНОВНАЯ ГРУППА (п=71) ГРУППА СРАВНЕНИЯ (п=15)

ЛГ (МЕ/л) 4,0-9,0 6,7+0,9 7,3+0,3

ФСГ(МЕ/л) 3,5-6,0 5,4+0,7 5,9+0,2

Е2 (пмоль/л) 100-400 211+24,8 187,4+10,0

Прл (мМЕ/л) 120-500 327+18,7 217,5+15,9

СТГ(мМЕ/л) 0,15-5,0 1,9+0,5 1,7+0,2

Т (нмоль/л) 1,5-2,5 1,3+0,2 1,8+0,1

К (нмоль/л) 200-400 312+12,0 283,0+9,0

ТТГ (мМЕ/л) 1,5-2,5 1,7+0,2 1,7±0,1

Т4 (нмоль/л) 100-120 111,0+2,9 111,3+1-1

р>0,05 статистически значимых различий не выявлено между группами

Таким образом, значимых различий между пациентками основной и конторольной группы по клинико-анамнестическим данным, акушерско-гинекологическому анамнезу, функциональному состоянию репродуктивной системы и эндокринному статусу выявлено не было.

УЗИ органов малого таза проведено всем пациенткам с бесплодием и безуспешными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

У всех пациенток группы сравнения (п=15) по данным эхографии органов малого таза внутриматочная патология не была выявлена.

Патологические изменения полости матки и эндометрия выявлены при трансвагинальной эхографии у 57 (80,0%) из 71 женщины.

Результаты, полученные у 71 женщины основной группы, приведены в таблице

Таблица 2

Заключение Число пациенток (п=71) Абсолютное число %

Хронический эндометрит 4 5,0

Полип эндометрия 9 12,0

Внутренний генитальный эндометриоз 11 15,0

Гиперплазия эндометрия 26 36,0

Внутриматочные синехии 7 9,0

Всего патологические изменения обнаружены 57 80,0

УЗИ признаки, характерные для хронического эндометрита обнаружены в 5,0% случаев (4 больных), полипа эндометрия - в 12,0% (9 женщин), внутренний генитальный эндометриоз - 15,0% (11 женщин), гиперплазия эндометрия - 36,0 (26 женщин), внутриматочные синехии - 9,0% (7 женщин).

Таким образом, результаты УЗИ указали на подозрение на внутриматочную патологию у 80,0% пациенток основной 1руппы, в числе которых превалировали гиперплазия эндометрия (36,0%) и внутренний генитальный эндометриоз (15,0%).

Полученные результаты обосновывали необходимость включения в алгоритм обследования данного контингента больных аспирационную биопсию эндометрия с последующим патоморфологическим исследованием эндометрия.

В проведенном исследовании участвовали все пациентки, включенные в исследование.

По данным «Pipell» биопсии и патоморфологического заключения серьезных изменений эндометрия, препятствующих процессу имплантации не выявлено.

Всем пациенткам в программе подготовки к ЭКО И ПЭ в сыворотке крови женщин, определялись дополнительные маркеры локального гемостаза с 20-го по 24-й день менструального цикла: Сосудисто - эндотелиальный фактор роста (СЭФР); Гомоцистеин; Эндотелии; Ингибитор активации плазминогена первого типа (PAI-I); Тканевой активатор плазминоген (t-PA).

На рисунке видно, что у женщин основной группы (п=71) данные показатели были выше нормы, по сравнению с контрольной группой (п=15).

а неудачи Эко в анамнезе О без неудач ЭКО

100 80 ео

%

40 20 0

СЭФР >42 Гомоцистеин>14 Эндотелии <8 PAI-1 >40 t-PA <5

Рис.4 Выявлены различия между группами (р<0,05 критерий Хи-квадрат)

неудачи Эко в анамнезе В без неудач ЭКО

СЭФР >42 Гомоцистеин>14 Эндотелии <8 PAI-1 >40 t-PA <5

Таблица 3

Параметры Неудачи ЭКО Без неудач ЭКО

СЭФР пг/мл 102,4±36,9* 57,6±7

Гомоцистеин мкмоль/л 16,5±3,7* 11,9±8

Эндотелии фмоль/мл 6,37±2,9* 10,1±9

РАН нг/мл 46,3±7,2* 35,8±4,1

1-РА нг/мл 4,18±1,3* 9,7±2,6

* р<0,05 по сравнению с контрольной группой

Согласно, вышеизложенным данным при исследовании маркеров локального гемостаза достоверно установлено, что у женщин, имеющих в анамнезе одну и более неудачных попыток ЭКО и ПЭ, концентрация маркеров локального гемостаза значительно выше нормы, по сравнению с контрольной группой. Также были выявлены статистически значимые различия между средними показателями: у женщин с исходами беременности (104,2±47,1); у небеременных и (50,0±24,5); у беременных (р<0,001). Рис.5

Корреляция: г = -0,5893 | Х.95% доверит. |

Кроме того, была выявлена умеренная положительная корреляция между СЭФР и Эндотелином (г=0,37 р<0,05) Рис.6

Корреляция: г« 0.37688 1^495% доверит. |

Эндотелии

Также, была выявлена умеренная отрицательная корреляция между РА1-1 и Эндотелином (г=-0,37 р<0,05) Рис.7

И выявлена умеренная положительная корреляция между ЬРА и Эндотелином (г=0,60 р<0,05) Рис.8

Корреляция: г = 0.60437 | ^-ч95% дсвер^

Кроме того, была выявлена умеренная положительная корреляция между Гомоцистеином и РА1-1 (г=0,33 р<0,05) Рис.9

Корреляция: г = 0,32985 |Х95% доверий

РАН

Также, была выявлена умеренная отрицательная корреляция между РА1-1 и 1-РА (г=-0,47р<0,05) Рис.10

Эффективность программы ЭКО и ПЭ у пациенток была рассчитана по количеству наступивших беременностей из расчета на одну попытку.

Частота наступления беременности у женщин оценивалась в первом цикле ЭКО и ПЭ, проведенном непосредственно после исследования маркеров локального гемостаза и патоморфологического исследования биоптатов эндометрия.

При оценке наступивших беременностей обращает на себя внимание высокая частота наступления беременности у пациенток после исследования маркеров локального гемостаза и патоморфологического исследования биоптатов эндометрия.

Провели факторный анализ, рассчитав относительные риски и их доверительные интервалы и выявили значимые относительные риски, у которых нижняя граница 95% д.и. была более 1,0, что расценивается как значительные.

Таблица 4

Без беремен. п=44 Из 1 группы Наличие беремен. п=27 27 из 2 группы Р ОР и 95% доверит, интервал

СЭФР >42 нг/мл 25 58,1 7 18,4 0,000 1 6,15 (2,22 -17,05)

Гомоцистеин >14 мкмоль/л 18 41,9 8 21,1 0,041 0 2,70(1,01 -7,25)

Эндотелии <8 фмоль/мл 21 48,8 9 23,7 0,016 6 3,08(1,18-8,01)

РАМ >40 нг/мл 27 62,8 11 28,9 0,001 7 4,14(1,63- 10,55)

1-РА <5 нг/мл 17 39,5 6 15,8 0,014 7 3,49(1,20-10,11)

Анализ исследования маркеров локального гемостаза показал, что риск не забеременеть в 6,2 раза выше у тех, у кого СЭФР выше нормы, в 4,1 раза выше у тех, у кого РАН выше нормы, в 3,5 раза выше у тех, у кого 1-РА выше нормы, в 3,1 раза выше у тех, у кого Эндотелии выше нормы и в 2,7 раза выше у тех, у кого Гомоцистеин выше нормы.

Анализ исходов наступивших беременностей показал, что исследования маркеров локального гемостаза и патоморфологического исследования биоптатов эндометрия в программе подготовки к ЭКО и ПЭ, позволяют увеличить эффективность программы ЭКО и ПЭ в 1,8 раз и добиться наступления беременности.

Таким образом, высокий уровень параметров может способствовать неудачной имплантации плодного яйца и являться ранним маркером неудач ЭКО и ПЭ.

Основываясь на результатах обследования, был составлен алгоритм ведения этих пациенток.

Таблица 5

Алгоритм обследования и ведения пациенток с неудачами ЭКО и ПЭ

Стандартное обследование в программе подготовки к ЭКО и ПЭ и определение концентрации генетических маркеров в сыворотке крови

Уровень СЭФР, Гомоцистеина, РА1-1> нормы, Эндотелина, 1РА< нормы Уровень СЭФР, Гомоцистеина, РА1-1, Эндотелина, 1РА в пределах нормы

Назначение фолиевой кислоты по (0,5-1,0 мг) 3 раза в день за 3 мес до программы ЭКО и ПЭ и до 14-й нед беременности; Назначение низкомолекулярного гепарина (клексан, фраксипарин п/к 17502500 МЕ в сут) за 2 мес до программы ЭКО и ПЭ и до 8-й нед беременности; Назначение витамина В12 (цианкоболамин) в/м за 2 мес в течение 10 дней по 1,0 мл до программы ЭКО и ПЭ и до 5 нед беременности 2 раза в нед. Стандартная подготовка к программе ЭКО и ПЭ

На фоне проведенной терапии у женщин с неудачами ЭКО и ПЭ в анамнезе у 27 (38%) женщин наступила беременность.

Таким образом, применение данного алгоритма обследования и ведения пациенток с неудачными попытками ЭКО и ПЭ, позволяют не только повысить ее эффективность, но и своевременно прогнозировать ее неудачи.

ВЫВОДЫ

1. Генетические маркеры гемостаза (СЭФР, Гомоцистеин, Эндотелии, РАН, N РА) позволяют определить на начальном этапе неудачную имплантацию плодного яйца. Повышение и/или снижение концентрации генетических маркеров гемостаза (СЭФР, Гомоцистеин, Эндотелии, РАМ, 1-РА) можно рассматривать, как маркеры неудачной имплантации плодного яйца.

2. У пациенток с одной и более неудачными попытками ЭКО в анамнезе отмечается резкое повышение и/или снижение концентрации молекулярных маркеров гемостаза.

3. Установлено существование статистически достоверной связи между наличием патологии молекулярных маркеров гемостаза и количеством безуспешных попыток ЭКО.

4. Проведение аспирационной биопсии эндометрия целесообразно на этапе подготовки к программе ВРТ, особенно при наличии одной и более неудачных попыток ЭКО и ПЭ.

5. У пациенток при исследовании генетических маркеров гемостаза показано, что риск не наступления беременности в 6,2 раза выше у тех, у кого СЭФР выше

нормы, в 4,1 раза выше у тех, у кого РА1-1 выше нормы, в 3,5 раза выше у тех, у кого 1-РА выше нормы, в 3,1 раза выше у тех, у кого Эндотелии выше нормы и в 2,7 раза выше у тех, у кого Гомоцистеин выше нормы.

6. Установлено, при опенке наступивших беременностей, обращает на себ внимание высокая частота наступления беременности у пациенток поел исследования генетических маркеров гемостаза, их нормализации, коррекции патоморфологического исследования биоптатов эндометрия.

7. Анализ исходов наступивших беременностей показал, что исследовани маркеров локального гемостаза и патоморфологического исследования биоптато эндометрия в программе подготовки к ЭКО, позволяют увеличить эффективност программы ЭКО в 1,8 раз и добиться наступления беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациенток с повышенным содержанием маркеров локального гемостаза при значениях показателей:СЭФР более 42,6 пг/мл; Гомоцистеина, выше 1 мкмоль/л; Эндотелина менее 8 фмоль/мл; Ингибитора активации плазминоген первого типа РАН более 40 нг/мл; Тканевого активатора плазминогена ЬРА мене 5 нг/мл, следует относить к группе высокого риска по развитию неудачно имплантации плодного яйца.

2. Алгоритм диагностики нарушений состояния репродуктивной системы

пациенток, имеющих одну и более неудачных попыток ЭКО и ПЭ в анамнез

должен включать: сбор данных анамнеза, учет жалоб, количество неудачны

24

попыток ЭКО и ПЭ; гинекологический осмотр; исследование гормонального фона; исследование генетических маркеров гемостаза; аспирационную биопсию эндометрия; эхографию органов малого таза с цветовым допплеровским картированием и допплерометрией маточных артерий; УЗИ органов малого таза; консультации смежных специалистов по показаниям.

3. Необходимым условием коррекции нарушений состояния репродуктивной системы у пациенток с неудачными попытками ЭКО и ПЭ является предварительное достижение клинико-биохимической картины нормы маркеров локального гемостаза, с применением патогенетически, обоснованной терапии (гормональной, антикоагулянтами, антиоксидантами, фолатами).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Л.В. Волкова, О.С. Аляутдина, М.А. Пальцев, Е.М. Пальцева «Оценка состояния сосудистого эндотелия при различных акушерских патологиях» //«Врач», 2011, №5, с.86-87.

2. Л.В. Волкова, О.С. Аляутдина «Клинико-диагностическое значение сосудисто-эндотелиальнош фактора роста при неудачных попытках ЭКО» //«Акушерство и гинекология», 2011, № 4, с. 126-129.

3. Л.В. Волкова, О.С. Аляутдина, М.А. Пальцев, Е.М. Пальцева «Роль ангиогенеза в регуляции женской репродуктивной системы» //«Врач», 2011, № 6, с.30-32.

4. Подана заявка в РОСПАТЕНТ № 2010147283 от 19.11.2010 года, о выдач патента РФ на изобретение «Способ определения готовности системы гемостаза женщин, включенных в программу Экстракорпорального оплодотворения переноса эмбриона», авторы изобретения: Л.В. Волкова, О.С. Аляутдина, М.А Пальцев, Е.М. Пальцева.

Подписано в печать: 25.08.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 783 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.nj

Актуальность темы

Развитие молекулярной медицины позволяет исследовать и анализировать прецизионные механизмы молекулярных, взаимодействий, которые происходят в эндометрии с момента оплодотворения и до завершения формирования плаценты.

Нормальное течение гестации зависит от состояния ангиогенеза, продукции ангиогенных факторов, контролирующих рост, развитие и регресс сосудов, а также стимулирующих пролиферацию клеток и тканей.

Одним из основных активаторов ангиогенеза в органах репродуктивной системы женщин является сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР), который, наряду с индукцией ангиогенеза, повышает сосудистую проницаемость [3,11].

Прогрессирование беременноЬти невозможно без четкого функционирования сложной сосудистой системы, обеспечивающей адекватный обмен между организмами матери и плода.

Установлено, что экспрессия СЭФР при беременности осуществляется несколькими компонентами фетоплацентарного комплекса: железистым эпителием, ' фетальными и материнскими макрофагами, а также цитотрофобластом.

Кроме того, удачно протекающая беременность не может обойтись без

I » тонкого контроля фибринолитической активности.

Фибринолиз - процесс, контролируемый ингибитором активатора плазминогена первого типа (РА1-1).

Полиморфизм гена РА1-1, сопровождающийся повышением уровня РА1-1 в плазме и снижением фибринолитической активности ассоциируется с повышенным риском потери беременности.

Необходимо понимать, что РА1-1, играющий важную роль в гемостазе, клеточной адгезии и деградации внеклеточного матрикса, изменяет свою активность под влиянием факторов регуляции [4,27]. У

Взаиморегуляция различных систем на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях в эндометрии способствует наступлению и успешному течению беременности.

Системные изменения, гормональные, иммунологические перестройки на организменном уровне' не редко служат лишь командой локальным исполнителям - клеткам эндометрия.

Только в условиях их отлаженного взаимодействия становится возможным процесс оплодотворения и принятия, материнским организмом наступившей беременности.

Следует учитывать, что даже безупречное управление не может гарантировать надежности исполнения, поэтому, отвергнув все известные на сегодняшний день причины потери беременности, мы неизбежно пытаемся оценить функциональную состоятельность в локусе [4,9,11].

Одним из главных, проявлений, локальных нарушений в эндометрии во время беременности является отслойка хориона, которой всегда предшествуют локальные изменения гемостаза.

Выявление маркеров состояния локального гемостаза является важным шагом на пути преодоления необъяснимых на сегодняшний день причин потери беременности.

Необходимо учитывать сложные клеточно-молекулярные взаимодействия, которые происходят в эндометрии, их особенности, связанные с наступлением беременности;

Механизм этих клеточных взаимодействий универсален для всех органов и тканей, однако имеет свои характерные черты, обусловленные вовлечением в реакции уникальных клеток - клеток эмбриона.

Не представляется возможным разграничение происходящих в эндометрии процессов на более приоритетные и менее значимые - все реакции протекают каскадно и параллельно, формируя уникальный тонкий молекулярно-клеточный механизм сохранения беременности [4,8].

Познание этого механизма и есть ключ к пониманию к такой сложной патологии как потеря беременности.

Таким образом, мы можем предположить, что ключевым моментом для физиологического обеспечения функционирования репродуктивной системы женщины и реализации детородной функции является циклический ангиогенез.

Дальнейшее изучение компонентов ангиогенеза позволит разработать новые методы специфической коррекции данной патологии репродуктивной системы женщины.

Цель исследования

Целью настоящей работы является оценка роли некоторых генетических и паракринных факторов при неудачных попытках ЭКО и ПЭ, разработка комплексного подхода к тактике ведения женщин, включенных в программу ЭКО и ПЭ, а также ведение женщин с неудачами ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Задачи исследования

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить значение генетических маркеров, сосудисто-эндотелиального фактора роста в процессе имплантации.

2. Провести патоморфологическую оценку состояния эндометрия.

3. На основании клинико-лабораторного анализа провести комплексную оценку клинической эффективности и прогностической значимости различных клинико-лабораторных методов диагностики.

4. Разработать и обосновать тактику комплексного подхода к ведению больных с данной патологией.

5. Определить принципы профилактики у женщин, включенных в программу ЭКО и ПЭ.

6. Изучить принципы коррекции данной патологии.

7. Определить частоту наступления беременности в исследуемых группах и их исход.

Научная новизна

1. Впервые в отечественной практике проведена оценка уровня концентрации генетических маркеров и сосудисто-эндотелиального фактора роста в сыворотке крови у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

2. Впервые в алгоритм обследования и подготовки пациенток проведению программы ЭКО и ПЭ включено биохимическое исследование маркеров дисфункции эндотелия.

3. Впервые разработано патогенетическое обоснование медикаментозной терапии при неудачных попытках ЭКО и ПЭ в анамнезе.

4. Оценена эффективность программы ЭКО и ПЭ у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Практическая значимость работы

Впервые в отечественной практике проведена оценка уровня концентрации генетических маркеров и сосудисто-эндотелиального фактора роста в сыворотке крови у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

В алгоритм обследования и подготовки пациенток при проведении программы ЭКО и ПЭ включено исследование маркеров дисфункции эндотелия.

Нами впервые изучена оценка уровня концентрации генетических маркеров и сосудисто-эндотелиального фактора роста в сыворотке крови у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Оценена эффективность программы ЭКО и ПЭ у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе.

Положения, выносимые на защиту

1. В программе подготовки к ЭКО и ПЭ, а также у женщин с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе, необходимо смотреть в сыворотке крови маркеры локального гемостаза (СЭФР, Гомоцистеин, Эндотелии, Ингибитор активатора плазминогена первого типа, Тканевой активатор плазминогена).

Повышенное содержание маркеров локального гемостаза в сыворотке крови могут рассматриваться, как маркеры неудачной имплантации плодного яйца.

2. В алгоритм обследования и подготовки к программе ЭКО и ПЭ целесообразно включать аспирационную биопсию эндометрия.

3. При своевременной коррекции нарушений состояния локального гемостаза в репродуктивной системе у пациенток с неудачными попытками ЭКО и ПЭ путем применения патогенетически обоснованной терапии (гормональной, фолатами, антикоагулянтами), повышенная концентрация маркеров локального гемостаза в сыворотке крови понижается и эффективность программы ЭКО и ПЭ при этом возрастает.

Реализация полученных результатов

Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы отделения вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия Клиники акушерства и гинекологии им. В. Ф. Снегирева.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции отделения вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия и на заседании кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета Первого МГМУ им. И. М. Сеченова 15 июня 2011 года.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 132 страницах компьютерного текста, содержит 5 таблиц и 17 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 119 источников, из них 18 отечественных.

выводы

1. Генетические маркеры гемостаза (СЭФР, Гомоцистеин, Эндотелии, РА1-1,1> РА) позволяют определить на начальном этапе неудачную имплантацию плодного яйца. Повышение и/или снижение концентрации генетических маркеров гемостаза (СЭФР, Гомоцистеин, Эндотелии, РА1-1, 1:-РА) можно рассматривать, как маркеры неудачной имплантации плодного яйца.

2. У пациенток с одной и более неудачными попытками ЭКО в анамнезе отмечается резкое повышение и/или снижение концентрации молекулярных маркеров гемостаза.

3. Установлено существование статистически достоверной связи между наличием патологии молекулярных маркеров гемостаза и количеством безуспешных попыток ЭКО.

4. Проведение аспирационной биопсии эндометрия целесообразно на этапе подготовки к программе ВРТ, особенно при наличии одной и более неудачных попыток ЭКО и ПЭ.

5. У пациенток при исследовании генетических маркеров гемостаза показано, что риск не наступления беременности в 6,2 раза выше у тех, у кого СЭФР выше нормы, в 4,1 раза выше у тех, у кого РА1-1 выше нормы, в 3,5 раза выше у тех, у кого 1>РА выше нормы, в 3,1 раза выше у тех, у кого Эндотелии выше нормы и в 2,7 раза выше у тех, у кого Гомоцистеин выше нормы.

6. Установлено, при оценке наступивших беременностей, обращает на себя внимание высокая частота наступления беременности у пациенток после исследования генетических маркеров гемостаза, их нормализации, коррекции и патоморфологического исследования биоптатов эндометрия.

7. Анализ исходов наступивших беременностей показал, что исследования маркеров локального гемостаза и патоморфологического исследования биоптатов эндометрия в программе подготовки к ЭКО, позволяют увеличить эффективность программы ЭКО в 1,8 раз и добиться наступления беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациенток с повышенным содержанием маркеров локального гемостаза и при значениях показателей:СЭФР более 42,6 пг/мл; Гомоцистеина, выше 14 мкмоль/л; Эндотелина менее 8 фмоль/мл; Ингибитора активации плазминогена первого типа PAI-1 более 40 нг/мл; Тканевого активатора плазминогена t-PA менее 5 нг/мл, следует относить к группе высокого риска по развитию неудачной имплантации плодного яйца.

2. Алгоритм диагностики нарушений состояния репродуктивной системы у пациенток, имеющих одну и более неудачных попыток ЭКО и ПЭ в анамнезе должен включать: сбор данных анамнеза, учет жалоб, количество неудачных попыток ЭКО и ПЭ; гинекологический осмотр; исследование гормонального фона; исследование генетических маркеров гемостаза; аспирационную биопсию эндометрия; эхографию органов малого таза с цветовым допплеровским картированием и допплерометрией маточных артерий; УЗИ органов малого таза; консультации смежных специалистов по показаниям.

3. Необходимым условием коррекции нарушений состояния репродуктивной системы у пациенток с неудачными попытками ЭКО и ПЭ является предварительное достижение клинико-биохимической картины нормы маркеров локального гемостаза, с применением патогенетически, обоснованной терапии (гормональной, антикоа1улянтами, антиоксидантами, фолатами).