Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Преждевременный разрыв плодных оболочек у беременных с недифференцированной дисплазией соединительной ткани. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза

На правах рукописи

САННИКОВА Майя Викторовна

Преждевременный разрыв плодных оболочек у беременных с недифференцированной дисплазией соединительной ткани. Молекулярно-генетические аспекты патогенеза

14.01.01. - акушерство и гинекология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г з май ш

005060404

Москва - 2013

005060404

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Кан Наталья Енкыновна

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН Сухих Геннадий Тихонович

Официальные оппоненты:

Баев Олег Радомирович - доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научный Центр Акушерства Гинекологии и Перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ, руководитель родильного отделения

Серова Ольга Федоровна - доктор медицинских наук, профессор, ГУЗ Московский Областной Перинатальный Центр, главный врач Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «11» июня 2013 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.125.01 при Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова по адресу: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ. Автореферат разослан «08» мая 2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук

Калинина Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Современная демографическая ситуация в РФ требует разработки комплекса мер направленных на улучшение здоровья женщин и детей. Одним из возможных путей решения поставленных задач является совершенствование тактики ведения беременных, профилактика и лечение осложнений беременности и родов, приводящие к снижению частоты перинатальных и акушерских осложнений. Принимая во внимание высокую частоту преждевременных родов, аномалий родовой деятельности у рожениц, гнойно-септических осложнений у родильниц (O.P. Баев, 2012; О.Ф. Серова, 2000; V. Berghella, 2010) и новорожденных, ассоциированных с преждевременным разрывом плодных оболочек (R. Мепоп, 2010; S. Mi Lee, 2010), актуальным является проведение исследований, направленных на изучение этиологии, патогенеза данного осложнения беременности (А. Caughey, 2008; M.N. Yudin, 2009; V. Berghella, 2010; L. Marcellin, 2012). Распространенность ПРПО колеблется от 3 до 51% (И.А. Козловская, 2009; П.В.Козлов, 2010; В.М. Сидельникова, 2010; F.C. Barros, 2006; R. Мепоп, 2008; G. Rey, 2008; Е.М. Joyce, 2009; V. Berghella, 2010; G.C. Di Renzo, 2011). Одним из наиболее хорошо изученных факторов патогенеза ПРПО является инфекционно-воспалительный (R. Мепоп, 2010; В. Mercer, 2012), в то же время большое влияние на механизмы разрыва могут оказывать генетически детерминированные структурные и функциональные особенности СТ, доминирующей в плодных оболочках (Г.И. Нечаева, 2007; К. Benirschke, 2006; H. Wang, 2008; Е.А. Anum, 2009). Так, при нДСТ, частота которой у женщин репродуктивного возраста в популяции достигает 26-80% (А.Г. Беленький, 2001; Э.В. Земцовский 2000; А.И. Мартынов, 1996; Р.Н. Byers, 1989;), отмечается значительное, до 40%, увеличение ПРПО (М.Ю. Смирнова, 2006). В работах (Е.А. Anum, 2009) показан ряд полиморфизмов генов, которые могут быть предикторами ПР в результате ПРПО при дДСТ.

В ряде работ изучена ассоциация полиморфизмов генов, определяющих структурно-функциональную организацию и ремоделирование СТ (COL Ia2, ММР1,13,8, TIMP2, END 1), процессы воспаления (IL6) с ПРПО (S. Fortunato, 2003; G. Rey, 2008; H. Wang, 2008; R. Romero, 2010). Однако, несмотря на большое количество исследований, посвященных данной проблеме, оптимальные методы профилактики и лечения ПРПО не разработаны (J.R.J.r. Woods, 2001; A.M. Siega-Riz, 2003; S. Casanueva, 2005; J.A. Spinnato, 2008; T.A. Manuck, 2009; П.В. Козлов, 2010; G.C. Di Renzo, 2011; L. Marcellin, 2012; B. Mercer, 2012; G. Bilic, 2010).

Принимая во внимание вышеуказанное, актуальным представляется изучение данной проблемы, с определением вклада нДСТ, предрасполагающей к нарушению архитектоники СТ, направленное на поиск новых звеньев патогенеза и генетических предикторов преждевременного разрыва.

Цель исследования

Оптимизация тактики ведения беременных с недифференцированной дисплазией соединительной ткани и преждевременным разрывом плодных оболочек на основании выявления клинико-анамнестических, морфологических и молекулярно-генетических предикторов.

Задачи исследования

1. Изучить анамнез, соматическое и репродуктивное здоровье беременных с нДСТ и преждевременным разрывом плодных оболочек при доношенном и недоношенном сроке беременности.

2. Установить особенности течения беременности, родов, послеродового периода у беременных с нДСТ и преждевременным разрывом плодных оболочек, с анализом течения раннего неонатального периода при доношенном и недоношенном сроке беременности.

3. Изучить морфологические и иммуногистохимические особенности тканей плодных оболочек при преждевременном разрыве с определением содержания ММР-2, ММР-9, EMMPRIN, COL 4, LAMC, VEGF, IL-8, ILIO, TLR 4.

4. Исследовать роль полиморфизмов генов, определяющих гомеостаз соединительной ткани: COL3, LAMC, ММР2, ММРЗ, ММР9, ESR1, EMMPRIN, IL6, IL8, ILIO, ILlß, VEGF, - в развитии преждевременного разрыва плодных оболочек.

5. Разработать алгоритм ведения пациенток с нДСТ и высоким риском ПРПО на основании морфологических, иммуногистохимических критериев, анализа полиморфизма генов.

Научная новизна

Впервые проблема ПРПО изучена с позиций нДСТ, выявлены значимые факторы риска развития ПРПО на различных сроках беременности, разработана шкала оценки риска ПРПО при недоношенном сроке беременности. Определены морфологические и иммуногистохимические особенности плодных оболочек при ПРПО. Впервые получены убедительные данные о роли EMMPRIN в патогенезе ПРПО, который является ключевым механизмом в регуляции гомеостаза ЭЦМ плодных оболочек. Доказано, что молекулярно-генетическим предиктором ПРПО независимо от срока беременности является полиморфизм гена ММР9 -1562 ОТ [rs3918242] матери. Впервые показана генетическая предрасположенность к ПРПО на недоношенном сроке: полиморфизм гена EMMPRIN -1153(3800) ОТ [rs4919857] плода, - и определены функциональные характеристики гаплотипов гена ESR1 плода: маркером протективного ганлотипа является генотип А/А -351 гена ESR1, а маркером гаплотипа риска - генотип С/С -397 гена ESR1. Полученные результаты подчеркивают значительный вклад плода в процессы родов и ПРПО.

Практическая значимость Определены клиническо-анамнестические (курение, «нервный стресс», медицинский аборт) и молекулярно-генетические (полиморфизмы ММР9 -1562 С>Т, ЕБШ -397 Т>С (Руи11) и -3510А (ХЬа1)) предикторы развития ПРПО при доношенном сроке беременности. Разработана оригинальная формула прогнозирования ПРПО на недоношенном сроке беременности. Определен молекулярно-генетический предиктор (полиморфизм гена ЕММРЯПчГ -1153(3800) С>Т) развития ПРПО при недоношенном сроке беременности. Сочетанный анализ генотипа А/А -351 гена Е8Ш (маркер протективного гаплотипа) и генотипа С/С -397 гена Е5Я1 (маркер гаплотипа риска) может быть использован для определения риска ПРПО при анализе генотипов матери и отца. Предложен алгоритм мероприятий по снижению риска ПРПО на основании выделения группы высокого риска ПРПО на этапе планирования и различных сроках беременности.

Положения, выносимые на защиту

1. Частота ПРПО при нДСТ составляет 45,2%. При этом наиболее значимыми факторами риска при доношенном сроке беременности являются клинико-анамнестические: курение до и на ранних сроках беременности, «нервный стресс», наличие медицинского аборта в анамнезе, - и осложнения беременности в виде угрозы прерывания в первом триместре. При недоношенном сроке беременности важное значение имеют клинические проявления нДСТ: астенический тип конституции, пролапс митрального клапана с регургитацией, сколиоз, плоскостопие, варикозное расширение вен нижних конечностей, хронический гастрит.

2. Морфологические и иммуногистохимические особенности плодных оболочек, свидетельствующие о нарушении архитектоники и регуляции гомеостаза ЭЦМ при преждевременном разрыве, в виде повышенного содержания ММР-2 в мезенхимальных клетках и ММР-9 в амниотическом

эпителии плодных оболочек, следует рассматривать как проявление дезорганизации соединительной ткани. Преобладание содержания ЕММРЯГЫ в амниотическом эпителии и синцитиотрофобласте при ПРПО может рассматриваться как одно из звеньев патогенеза ПРПО. 3. Установлена генетическая предрасположенность к развитию преждевременного разрыва плодных оболочек, ассоциированная с полиморфизмом генов, контролирующих гомеостаз соединительной ткани. При этом существенную роль наряду с генотипом матери (полиморфизм гена ММР9 -1562 С>Т) играет генотип плода (полиморфизм гена ЕММРЯШ -1153(3800) ОТ; полиморфизмы гена Е8Ш -397 Т>С (Руи11) и -35Ю>А (ХЬа1)).

Личный вклад автора Автор принимала непосредственное участие в выборе направления исследования, постановке задач, клиническом обследовании и лечении пациенток, в сборе биологического материала. Диссертантом проведен анализ медицинской документации, статистическая обработка и научное обобщение полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 2 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация работы Основные положения работы представлены на V Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая помощь - в эпицентре женского здоровья» 2013г (г. Москва) и VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых 2013г (г. Москва), III региональном научном форуме «Мать и дитя»

2009г (г. Саратов), X юбилейном Всероссийском форуме «Мать и дитя» 2009 (г. Москва).

Обсуждение диссертации состоялось на межклинической конференции акушерского обсервационного отделения ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства Здравоохранения РФ 5 марта 2013 года; заседании апробационной комиссии при Ученом Совете Д.208.125.01. ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства Здравоохранения РФ 15 апреля 2013 года.

Внедрение результатов работы

Результаты проведённого исследования внедрены в практическую деятельность акушерского обсервационного отделения ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. По результатам исследования опубликовано 10 научных работ, в том числе 5 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, определённых ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 188 страницах компьютерного текста. Работа состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций, приложений и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 50 рисунками. Библиографический указатель включает 153 работы цитируемых авторов, из них на русском языке - 35, на иностранных языках - 118.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Для решения поставленных задач было обследовано 196 пациенток, наблюдавшихся и родоразрешенных в ФБГУ «НЦ АГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России с 2009 по 2012 гг (три полных года), проведен

анализ течения беременности, родов, послеродового периода и раннего неонатального периода детей.

Критерии включения в исследование: возраст от 18 до 45 лет, преждевременный разрыв плодных оболочек, срок беременности 22-41 неделя, наличие информированного согласия. ПРПО определяли как излитие околоплодных вод не менее чем за два часа до начала регулярной родовой деятельности. Подтверждение диагноза проводилось на основании наличия плацентарного al-микроглобулина (тест AmniSure - AmniSure International LLC, Cambridge, M) (L.M. Cousins, 2005).

Критерии исключения: тяжелая вирусная и/или бактериальная инфекция во время данной беременности (для доношенного срока), тяжелая экстрагенитальная патология матери, дДСТ, артефициальный ПРПО, для группы контроля - оперативные роды (кесарево сечение) с началом операции до наступления регулярной родовой деятельности.

На первом этапе все пациентки были разделены на 3 группы в зависимости от наличия разрыва оболочек и срока беременности. I группу составили 82 роженицы, роды которых осложнились ПРПО на доношенном сроке беременности, II - 97 рожениц без ПРПО. В III группу было включено 17 беременных с недоношенным сроком и ПРПО. Для увеличения мощности исследования при сравнении III группы с I и II был применен метод «подбора пар» (1:2), формирующими критериями для которого были возраст и национальность пациенток.

На втором этапе были проведены морфологическое и ИГХ исследование ткани плаценты плодных оболочек в двух зонах: зоне разрыва и параплацентарной.

На III этапе у пациенток всех групп и их новорожденных были изучены полиморфизмы генов COL3, LAMC, ММР2, ММРЗ, ММР9, EMMPRIN, VEGF, IL6, ILIO, IL8, IL lß, ESR1. Для генотипирования матерей исследовалась венозная кровь, новорожденных - пуповинная кровь. В ходе

работы были использованы общеклинические (клинико-анамнестические, лабораторные), специальные (УЗИ, допплерометрия, КТГ), морфологические, иммуногистохимические, молекулярно-генетические и статистические методы исследования.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью свободно распространяемых программных продуктов WINPEPI версии 9.7 (J.H. Abramson, 2004), Statistica версии 8 и IBM SPSS Statistics 19 for Windows. Использовались непараметрические тесты: точный тест Фишера для малых выборок, U тест Манна-Уитни при сравнении двух независимых выборок. Для определения корреляции между переменными рассчитывался ранговый коэффициент корреляции по Спирмену. При оценке достоверности выявленных различий между средними значениями выборок и достоверности выявленной корреляции рассчитывалась вероятность ошибки р. Для определения статистической значимости различий частот аллелей и генотипов в группах применялся критерий у2. Оценка эффективности моделей проводилась с помощью ROC-анализа, при этом рассчитывалась площадь под характеристической кривой (AUC). Для установления точки cutoff проводился пересмотр значений шкалы оценки от максимального до минимального. Для каждого значения проводилось определение чувствительности и специфичности. Критерием выбора порога отсечения выбрано требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели. Для определения влияния группы факторов на риск возникновения ПРПО проводился многофакторный анализ с помощью бинарной логистической регрессии. Для построения канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) при анализе вклада генотипов матери и плода в риск развития ПРПО был выполнен дискриминантный анализ. Анализ неравновесности сцепления проводился с помощью свободно-распространяемого продукта Haploview версии 4.2 (J. С. Barrett, 2005).

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе, каждой пациентке, включенной в исследование, было проведено определение степени выраженности нДСТ с использованием таблицы Кадуриной Т.Н.. У подавляющего большинства имелись проявления нДСТ различной степени выраженности. Частота ПРПО при нДСТ составила 45%. Пациентки, включенные в исследование, были сопоставимы по возрасту и массо-ростовым соотношениям. Средний возраст составил в I группе - 31,6±3,2 лет, во II - 31,8±3,3 лет, в III - 32,4±3,3 года. Рост и вес составили в I и II группах 166±5,7см и 67±13,3, 167±5,2см и 66,0±10,6 кг, соответственно, в III - 167,2 ±5,6см и 59±6,8кг. Результаты исследования установили достоверно более высокую частоту курения у пациенток I группы до и на ранних сроках беременности (47,9%) (OR 2,26; CI 1,24-4,1) и наличие «нервного стресса» в перечне профессиональных вредностей (54,2%) (OR 2,3; CI 1,2-4,1). Была получена статистически значимая положительная корреляция между ПРПО и наличием медицинского аборта в анамнезе 0=0,21, р<0,05), угрозой первого триместра 0=0,20, р<0,05) и ПРПО.

При изучении особенностей анамнеза и соматической патологии ветряная оспа (80,4%) (OR=0,44; С1=0,22-0,87), хронический тонзиллит (37,1%, OR-0,44; С1=0,23-0,86) и варикозное расширение вен (25,6%) (OR=0,4; С1=0,3-0,9) достоверно чаще отмечались во II группе. Однако при недоношенном сроке беременности было показано статистически значимое увеличение варикозного расширения вен нижних конечностей (41,2%) (OR 4,34; CI 1,12-16,76), хронического гастрита (35,3%) (OR 6; CI 1,28-28,12), астенического типа конституции (35,3%) (OR 6; CI 1,28-28,12), сколиоза (35,3%) (OR 6; CI 1,28-28,12) и плоскостопия (35,3%) (OR 6; CI 1,28-28,12). В связи с этим был проведен многофакторный анализ риска ПРПО на недоношенном сроке беременности в зависимости от симптомов нДСТ и получена двухфакторная модель, в которую вошли варикозное расширение вен нижних конечностей (1,6, р=0,006) и сколиоз (1,9, р=0,006). Полученные

данные свидетельствуют о важной роли нДСТ в генезе ПРПО. Однако, проведение ROC-анализа, с использованием в качестве моделей критериев выраженности нДСТ по Кадуриной Т.И., Смольновой Т.Ю. и Калмыковой A.C., показало недостаточную информативность вышеуказанных классификаций для прогнозирования ПРПО (AUC: 0,56 (CI 0,4-0,7), 0,53 (CI 0,37-0,7), 0,6 (CI 0,4-0,7, соответственно). В связи с чем на основании корреляционного и многофакторного анализов нами была предложена оригинальная формула (Х=2,8хПМК+3,5хХП+5,1хАК+4хМ), для прогнозирования ПРПО на недоношенном сроке беременности. Каждому фактору - симптому нДСТ было присвоено бальное значение с учетом значения коэффициента корреляции (ПМК - ПМК с регургитацией I степени р=0,28, АК - астеническая конституция /7=0,51, ХП - хронический пиелонефрит в анамнезе р=0,35, М - метеочувствительность р= 0,4, р<0,05), а их сумма определила значение шкалы. AUC для оригинальной модели составила 0,84 при недоношенном сроке беременности (качество модели «очень хорошее»). При значении шкалы 3 балла суммарная чувствительность и специфичность модели была максимальной, таким образом, это значение является «точкой отсечки» после которого риск ПРПО на недоношенном сроке беременности повышается.

Анализ акушерско-гинекологического анамнеза, показал увеличение частоты кандидозного вагинита (23,7%) и эктопии шейки матки (60,8%) (OR=0,50, 0=0,27-0,91) у пациенток II группы (OR=0,39, С1=0,17-0,91). Следует отметить, что только в III группе статистически значимо чаще регистрировалась уреаплазменная инфекция (76,5%) (OR 5,25; С1=1,4-19,6), что согласуется с работами (В. Jacobsson, 2009; K.J. Oh, 2010), указывающими на повышение частоты уреаплазменной и микоплазменной инфекции при ПРПО. Повторнобеременными были 51% пациенток I и 67% -II группы (OR=0,52, 0=0,3-0,95). Частота медицинского аборта до наступления данной беременности (28%) (OR=3,Q4, С1=1,4-6,7) была

достоверно выше у пациенток I группы, в этой же группе в 1,5 раза чаще имело место выскабливание стенок полости матки (в 44%) (OR=2,l, С1=1,14-4). В группе с ПРПО при недоношенном сроке также достоверно чаще отмечались внутриматочные вмешательства (41,1% - III группа, 8,8% - I и II группы) (OR 7,2; С1= 1,6-33,4), что позволяет рассматривать их в качестве неблагоприятного фактора ПРПО независимо от срока беременности. Проведенный анализ показал статистически значимое увеличение частоты угрозы выкидыша в первом триместре 56% (OR 2,2; CI 1,2-4,0)у пациенток I группы.

Экстренное оперативное родоразрешение достоверно чаще производилось в I группе (44%) (OR 2,1; CI 1,1-3,9). Достоверных различий в длительности родов и безводного промежутка в I, II группах выявлено не было. Преждевременными родами в III группе беременность завершилась в 82,5% случаев, остальные составили очень ранние преждевременные роды. В подавляющем большинстве случаев (85,7%) было произведено кесарево сечение. Длительность безводного периода составила в среднем 3 суток, максимально -19.

Анализ течения раннего неонатального периода выявил более высокую частоту асфиксии легкой степени в I группе (22,0%) (OR 2,75; CI 1,16-6,51) в то время как во II преобладал кожно-геморрагический синдром (12,4%) (OR 0,17; CI 0,03-0,82). В литературе имеются указания на повышение риска врожденной инфекционной патологии (пневмония, неонатальный сепсис), респираторного дисстресс синдрома плода, внутрижелудочковых кровоизлияний, некротизирующего энтероколита при ПРПО (J. Mateus, 2005; J. Rosenman 2009; Т.А. Manuck, 2009; А. Faksh, 2011). В нашем исследовании тяжелой инфекционной патологии раннего неонатального периода при ПРПО и доношенном сроке беременности выявлено не было. Однако в группе с ПРПО при недоношенном сроке имели место врожденная пневмония (26%), врожденный конъюнктивит (6%), что, по-видимому, отражает большую

значимость инфекционного фактора в генезе ПРПО при недоношенном сроке.

На втором этапе исследования были изучены морфологические и ИГХ особенности ткани плодных оболочек. Для ИГХ-исследования было отобрано 26 последов после самопроизвольных, своевременных родов у пациенток I и II групп с минимальным инфекционным индексом. При исследовании амниотической мезодермы установлено более упорядоченное расположение волокон коллагена в I группе (87,5%) (OR 21; CI 1,5-293,3). Невыраженная нейтрофильная инфильтрация плодных оболочек в обеих зонах встречалась редко, что позволяет сделать вывод об отсутствии гистологических признаков хориоамнионита в исследуемых образцах.

В настоящее время известно, что экспрессия EMMPRIN при своевременных самопроизвольных родах в плаценте и ПО повышается (Y.Q. Wang, 2006).В работах Li W. et al. (2004) показано отсутствие EMMPRIN в мезенхиальных клетках ПО (W. Li, 2004). В нашем исследовании при ИГХ-исследовании в группе с ПРПО выраженность реакции EMMPRIN была достоверно большей в эпителиальных клетках плодных оболочек в зоне разрыва (12,8±7,1 против 9,3±4,6 ед. опт. плотн., р=0,006) и вне зоны разрыва (9,9±7,8 против 7,9±5,4 ед. опт. плотн., р=0,01), а также в клетках синцитиотрофобласта плаценты (16,2±8,0 против 7,8±9,0 ед. опт. плотн. р=0,01) (рис.1). Также в данной группе реакция EMMPRIN была статистически значимо более выражена в амниотическом эпителии плодных оболочек в обеих зонах, по сравнению с мезенхимальными клетками при тех же условиях (в зоне разрыва: 12,8±7,1 против 8±5,6 ед. опт. плотн., р=0,02; вне разрыва: 9,9±7,8 против 6,8±5,1 ед. опт. плотн., р=0,005).

20 I 18

s 12 5 10

Median □ 25%-75% X Min-Max

Группа

Рис. 1 Результаты сравнения содержания EMMPRIN в эпителиальных клетках плодных оболочек в «зоне разрыва», в группах с (1) и без ПРПО (2).

При сравнительной оценке содержания ММР была установлена достоверно большая выраженность реакции ММР-9 в эпителиальных клетках как в зоне разрыва (28,8±3,7 против 25,2±2,2 ед. опт. плотн., р=0,019) так и вне зоны разрыва (28,1±10,8 против 26,4±2,7 ед. опт. плотн., р=0,0007), а выраженность реакции ММР-2 - в мезенхимальных клетках плодных оболочек в обеих зонах (р=0,04). Наши результаты совпадают с работами, в которых показана роль ММР-2 и 9 в процессах деградации CT (S. Parry 1998; А. Weiss, 2007). Таким образом, результаты морфологического и ИГХ исследования установили особенности архитектоники плодных оболочек, содержания ММР, свидетельствующих об изменении гомеостаза соединительной ткани при ПРПО, что обосновывает перспективность проведения молекулярно-генетических исследований, направленных на уточнение генетической предрасположенности к данному осложнению.

На основании проведения молекулярно-генетических исследований была выявлена ассоциация между ПРПО и полиморфизмом гена ММР9 -1562 С>Т [rs3918242] матери. Частота генотипа С/С составила 87,5% в группе с ПРПО и 52,9% в группе сравнения (р=0,026; OR=6,22; С1= 1,22-31,68).

Особый интерес представляло изучение полиморфизма гена ЕММРЯШ, не описанное до настоящего времени в ассоциации с беременностью. Нами было обнаружено статистически значимое увеличение частоты генотипа С/С -1153 С>Т [ге4919857] в группе с ПРПО при недоношенном сроке (85,7% и 36,7% в группе с ПРПО на недоношенном сроке и без ПРПО на доношенном сроке, соответственно; р=0,033; 011=10,36; С1=1,28-83,92).

Также в нашем исследовании было подтверждено сцепленное наследование полиморфных локусов -397 и -351 гена Е8Ш. При анализе распределения аллелей полиморфизмов гена Е8Ш у новорожденных была выявлена ассоциация аллеля -397С (р=0,05, 011=2,14 С1 1,02-4,47) и аллеля -35Ш (р=0,05; 011=2,29, С1 1,06-4,98) с ПРПО. При этом распределение аллелей и генотипов данных полиморфных локусов у матерей статистически значимо не различалось. При анализе распределения аллелей, образованных гаплотипами, выявлено статистически значимое снижение генотипической частоты гаплотипа ТА и повышение генотипической частоты гаплотипа Св у новорожденных при ПРПО (рис.2).

80

г?

» 70 —

¡60

г зо

40 ^^Н---М — --- -

■ "ПРПО

« зо

Норма

: ■ ■ —

ТА С6 СА

Гаплотипы ЕБШ -397 Т>С (Руи11) И -3516>А (ХЬа1)

Рис. 2 Генотипическая частота встречаемости гаплотипов Е8Я1 -397 Т>С (Руи11) и -35Ю>А (ХЬа1) у новорожденных в зависимости от наличия ПРПО.

Полученные данные явились основанием для клинико-функциональной оценки генотипа по полиморфизмам ESR1, на основании которой были выделены 3 генотипа: риска (содержащий два аллеля риска CG или сочетание аллеля риска и нейтрального аллеля СА), протективный (содержащий два аллея ТА или сочетание ТА и СА) и нейтральный. Генотип риска встречался у детей при ПРПО в 4 раза чаще, хотя различия не достигали статистической значимости, а протективный достоверно в 2 раза реже (30,0% и 56,7%, р=0,007; OR=0,33; С1=0,12-0,93) по сравнению со II группой. Таким образом, маркером протективного гаплотипа является генотип А/А -351 гена ESR1, а маркером гаплотипа риска - генотип С/С -397 гена ESR1, что может быть использовано в практике при сочетанном анализе обоих маркеров. В настоящее время описана функциональная значимость полиморфизмов гена ESR1 -397 Т>С (Pvull) и -351G>A (Xbal) при остеопорозе, атеросклерозе, гипоспадии, инфаркте миокарда и др. (J. loannidis, 2004; S.C. Schuit, 2004; L. Gennari, 2005; P.B. Rapuri, 2006; J.D. Yager 2006; S. Ban, 2008; L.C. Yang, 2009; L. Liu, 2013). Ранее была показана роль полиморфизмов гена ESR1 -397 Т>С (Pvull) и -351G>A (Xbal) в нарушении репарации, в частности в формировании неполноценного рубца матки, при этом фактором риска являлось наличие в генотипе пациентки гаплотипа СА. Полученные нами данные свидетельствуют о существенной роли генотипа плода в патогенезе ПРПО. При этом, сходные тенденции, наблюдаемые при анализе генотипа матери, по-видимому, вторичны, и объясняются 50% общностью генотипов матери и ребенка. Таким образом, для оценки генетически обусловленного риска ПРПО равнозначным по значимости является генотипирование не только матери, но и отца. Используя дискриминантный анализ, мы оценили вклад генотипов матери и ребенка в формирование предрасположенности к ПРПО. В модель вошли функциональная оценка гаплотипа ESR1 ребенка, количество аллелей Т в генотипе матери по полиморфизму VEGFA: -936 С>Т, количество аллелей Т в генотипе матери по полиморфизму ММР9: -

1562 ОТ, количество аллелей Т в генотипе ребенка по полиморфизму 1153 ОТ. Чувствительность и специфичность полученной модели составили 84,6%. Было определено, что материнский и генотип плода вносят практически равный вклад в формирование предрасположенности к ПРПО (51% и 49%, соответственно).

Актуальность проблемы ПРПО не вызывает сомнений. Проведенное нами исследование подтвердило высокую частоту данного осложнения при нДСТ. Кроме того была показана высокая степень корреляции клинических проявлений нДСТ с ПРПО, что позволило разработать новую шкалу оценки риска ПРПО. На основании морфологических и ИГХ исследований была установлены признаки дезорганизации соединительной ткани при ПРПО, которые могут рассматриваться как проявление нДСТ и, в свою очередь, предрасполагать к ПРПО. Нарушения гомеостаза соединительной ткани, по-видимому, являются значимым патогенетическим механизмом ПРПО, при этом одним из инициирующих факторов может являться увеличение ЕММРЫМ. Проведение молекулярно-генетических исследований позволило выделить ряд полиморфизмов, ассоциированных с ПРПО, что определяет возможность их использования в качестве не инвазивных предикторов. Кроме того, результаты анализа полиморфизмов генов ММР9, ЕММРЯШ, Е8Ш позволяют утверждать, что независимыми не модифицируемыми факторами риска развития ПРПО являются как генотип матери, так и генотип плода, что обосновывает целесообразность генотипирования не только матери, но и отца для оценки генетически обусловленного риска ПРПО.

Выводы

1. Частота ПРПО при нДСТ составляет 45,2%. Модифицируемыми факторами риска ПРПО на доношенном сроке беременности являются: курение до и на ранних сроках беременности, «нервный стресс», наличие

медицинского аборта в анамнезе, наличие угрозы прерывания беременности в первом триместре.

2. Клиническими предикторами ПРПО на недоношенном сроке являются симптомы нДСТ: астенический тип конституции, пролапс митрального клапана с регургитацией I степени, сколиоз, плоскостопие, варикозное расширение вен нижних конечностей, хронический гастрит.

3. Течение беременности и родов при ПРПО ассоциируется с повышением частоты угрозы прерывания в первом триместре, формированием ИЦН, повышением частоты экстренного оперативного родоразрешения, а также повышением частоты асфиксии в раннем неонатальном периоде у детей, рожденных от матерей группы с ПРПО.

4. Морфологическими особенностями плодных оболочек при ПРПО являются изменения ЭЦМ в виде упорядоченного расположения волокон амниотической мезодермы, повышенного содержания ММР-2 в мезенхимальных клетках и ММР-9 в амниотическом эпителии плодных оболочек в зоне разрыва. Преобладание содержания ЕММРМЫ в амниотическом эпителии обеих зон и синцитиотрофобласте, а также преобладание ЕММРМЫ в амниотическом эпителии по сравнению с мезенхимальными клетками обеих зон позволяет предположить значимую роль ЕММРЛЛЧ при ПРПО.

5. Независимым не модифицируемым молекулярно-генетическим предиктором ПРПО для любого срока беременности является генотип С/С полиморфизма гена ММР9 -1562 С>Т [ге3918242] у матери, что обосновывает его использование в прогнозировании риска ПРПО.

6. Анализ распределения аллелей полиморфизмов гена ЕБЮ -397 Т>С (Руи11) и -35Ш>А (ХЬа1) у плода, имеющих неравновесность сцепления, выявил ассоциации аллеля -397С и аллеля -35Ю с ПРПО, что позволяет рассматривать наличие гаплотипа С С гена ЕБШ у плода как фактор

риска ПРПО, а наличие гаплотипа ТА гена ESR1 - как протективный фактор.

7. ПРПО является результатом совокупного воздействия на компоненты ЭЦМ плодных оболочек систем регуляции гомеостаза соединительной ткани матери и плода. Одним из ведущих звеньев патогенеза ПРПО является генетически детерминированное изменение содержания EMMPRIN в ПО, приводящее к изменению активности ММР-2 и ММР-9.

8. Материнский генотип и генотип плода вносят практически равный вклад в формирование предрасположенности к ПРПО (51% и 49% соответственно):

КЛДФ=[PuckESR 1]х1, 54605648934953+[VEGFA]х0,88238092 712046+[М МР9]х1,08316370822102+[BSGjxO,292244031407435+1,02236606737784, где [Puck ESRI] - функциональная оценка гаплотипа ESR1 ребенка (-1 -протективный, 0 - нейтральный +1 - генотип риска) [VEGFA] -количество аллелей Т в генотипе матери по полиморфизму VEGFA: 936 ОТ [rs3025039] [MMP9J - количество аллелей Т в генотипе матери по полиморфизму ММР9: -1562 С>Т [rs3918242] [BSG] - количество аллелей Т в генотипе ребенка по полиморфизму BSG (EMMPRIN): -1153 ОТ [rs4919857].

Практические рекомендации

1. На этапе подготовки к беременности и консультирования в женской консультации следует рекомендовать пациенткам отказ от курения, тщательное планирование беременности после проведенных внутриматочных вмешательств, а также снижение психоэмоциональной нагрузки с момента наступления беременности.

2. Пациенток с астеническим типом конституции, сколиозом, плоскостопием, пролапсом митрального клапана с регургитацией I степени, варикозным расширением вен нижних конечностей,

хроническим гастритом необходимо относить в группу повышенного риска ПРПО на недоношенном сроке беременности.

3. Для прогнозирования ПРПО на недоношенном сроке беременности рекомендуется к применению формула прогнозирования ПРПО в зависимости от наличия симптомов нДСТ: Х=2,8хПМК+3,5хХП+5,1хАК+4хМ, где ПМК - ПМК с регургитацией I степени, ХП - хронический пиелонефрит в анамнезе, А К - астеническая конституция, М — метеочувствительность. При Х>3 баллов следует относить пациенток в группу повышенного риска развития ПРПО на недоношенном сроке беременности.

4. При наличии высокого риска развития ПРПО по клинико-анамнестическим данным независимо от срока беременности рекомендуется определение молекулярно-генетического предиктора ПРПО - полиморфизма гена ММР9 -1562 С>Т [гя3918242] у матери.

5. При наличии высокого риска развития ПРПО по клинико-анамнестическим данным независимо от срока беременности следует проводить генотипирование матери и отца для оценки генетически обусловленного риска ПРПО, с определением полиморфизма гена ЕММРЯШ -1153(3800) ОТ [ге4919857] и полиморфизмов гена ЕЯЮ -397 Т>С (Руи11) [гэ2234693] и -35Ш>А (ХЬа1) [«9340799] с последующим анализом распределения аллелей.

6. Для определения риска ПРПО целесообразно обследование пациенток согласно разработанному алгоритму (см. приложение 1).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Акушерские и перинатальные исходы у пациенток с рубцом на матке и фенотипическими проявлениями дисплазии соединительной ткани / М.И. Кесова, О.В. Болотова, А.И. Мартынов, М.В. Санникова, И.В. Климанцев, Э.Ю. Амирасланов, Н.Е. Кан, Н.М. Касабулатов //

«Амбулаторно-поликлиническая практика - платформа женского здоровья»: сборник тезисов. М., 2009. С.99-100.

2. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани: акушерские и перинатальные исходы / М.И. Кесова, О.В. Болотова, А.И. Мартынов, М.В. Санникова, И.В. Климанцев, Э.Ю. Амирасланов, Н.Е. Кан, Н.В. Орджоникидзе // «Мать и дитя»: материалы III Регионального научного форума. Саратов, 2009. С. 124.

3. Течение беременности и родов у пациенток с рубцом на матке и недифференцированной дисплазией соединительной ткани / М.И. Кесова, И.В. Климанцев, А.И. Мартынов, О.В. Болотова, М.В. Санникова, Э.Ю. Амирасланов, Н.Е. Кан // «Мать и Дитя»: материалы X юбилейного Всероссийского форума. М., 2009. С.87-88.

4. Клинические и молекулярно-генетические факторы риска преждевременного разрыва плодных оболочек у беременных с недифференцированной дисплазией соединительной ткани / Н.Е. Кан, М.В. Санникова, А.Е. Донников, И.В. Климанцев, Э.Ю. Амирасланов, H.A. Ломова, М.И. Кесова, П.А. Костин, B.JI. Тютюнник, Г.Т. Сухих // Акушерство и гинекология. 2013. №4. С.32-40.

5. Санникова М.В. Современные представления о роли полиморфизмов генов в развитии осложнений беременности (обзор литературы) // Гинекология. 2012. №4. С.32-34.

6. Санникова М.В., Дубова Е.А. Морфологические особенности зоны разрыва плодных оболочек при наличии и отсутствии преждевременного разрыва плодных оболочек у пациенток с и без недифференцированной дисплазии соединительной ткани // Вестник РГМУ: Материалы VIII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых. 2013. С.12.

7. Дисплазия соединительной ткани и плацентарная недостаточность / И.В. Климанцев, М.В. Сашшкова, М.И. Кесова, Н.Е. Кан // АГ-ИНФО 2009. №1. С.21-23.

В. Течение репаративных процессов в рубцах матки у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани / М.И. Кесова, Н.Е. Кан, Е.А. Коган, Т.А. Демура, И.В. Климанцев, М.В. Санникова, Э.Ю. Амирасланов, H.A. Ломова, O.A. Сергунина // Материалы VI Международного конгресса по репродуктивной медицине. М., 2012. С.53.

9. Роль полиморфизма гена эстрогенового рецептора альфа (ESR1) в формировании неполноценного рубца на матке после кесарева сечения / Г.Т. Сухих, М.И. Кесова, А.Е. Донников, Н.Е. Кан, О.В. Болотова, Е.А. Коган, Т.А. Демура, И.В. Климанцев, Э.Ю. Амирасланов, М.В. Санникова, Д.Д. Абрамов, В.В. Кадочникова, Н.В. Орджоникидзе, Д.Ю. Трофимов // Акушерство и гинекология. 2011. №4. С.40-44.

10. Морфологические и молекулярно-генетические особенности неоангиогенеза в рубцовой ткани матки у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани / Г.Т. Сухих, Е.А. Коган, М.И. Кесова, Т.А. Демура, А.Е. Донников, А.И. Мартынов, Д.Ю. Трофимов, И.В. Климанцев, М.В. Санникова, Н.Е. Кан, П.А. Костин, Н.В. Орджоникидзе, Э.Ю. Амирасланов // Акушерство и гинекология. 2010. №6. С.23-27.

Список сокращений дДСТ - дисплазия соединительной ткани ИГХ - иммуногистохимический

нДСТ — недифференцированная дисплазия соединительной ткани

ПМК - пролапс митрального клапана

ПРПО - преждевременный разрыв плодных оболочек

ПО - плодные оболочки

СТ - соединительная ткань

ЭЦМ - экстрацеллюлярный матрикс

CI (confidence interval) - доверительный интервал

COL (collagen) - коллаген

ESR (estrogen receptor) - эстрогеновый рецептор

EMMPRIN, BSG (extracellular matrix metalloproteinase inducer, basigin) -экстрацеллюлярный индуктор матриксных металлопротеиназ

END1 (endotelin 1)-эндотелии 1

IL (interleikin) — интерлейкин

LAMC (laminin) - ламинин

ММР (matrix metalloproteinases) - матриксные металлопротеиназы OR (odds ratio) - отношение шансов р - коэффициент корреляции Спирмена

SNP (single-nucleotide polymorphism) - однонуклеотидные генные полиморфизмы

TLR (toll like receptor) - ЮП-подобный рецептор

VEGF (vascular endothelial growth factor) - сосудистый эндотелиальный фактор роста

Приложение 1 Алгоритм мероприятий для снижения риска ПРПО

Приложение 2 Фрагмент патогенеза ПРПО

Геном матери

Подписано в печать 07.05.2013 г. Формат 60x90 объем 1 печатный лист. Тираж 120 экз. Заказ №20130507-2 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39