Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Аллельный полиморфизм генов в генезе нарушения имплантации у пациенток с неудачными попытками ЭКО

На правах рукописи

БЕЛОКУРОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Аллельный полиморфизм генов в генезе нарушения имплантации у пациенток с неудачными попытками ЭКО

14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 АПР 2013

Москва - 2013

005051830

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Научные руководители: Панина Ольга Борисовна

доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, доцент

Самоходская Лариса Михайловна

Официальные оппоненты: Макацария Александр Давидович

чл.-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России

ведущий научный сотрудник ФГБУ «Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И.Кулакова» Минздрава России

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Российский университет Дружбы народов» Министерства образования и науки России

Защита диссертации состоится «_»_2013 года в 14.00 на

заседании Диссертационного совета Д 208.072.12 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «_»_ 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна

Агаджанова Анна Арамовна

доктор медицинских наук,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время частота бесплодия в браке по данным различных эпидемиологических исследований колеблется от 8% до 29% и не имеет тенденции к снижению во всех странах мира [Овсянникова Т.В., 2009; Ingerslev, 2012]. Бесплодный брак значительно влияет на демографические показатели, в связи с чем данная проблема приобретает не только медико-биологическое, но и важное социальное значение. Кроме того, неспособность иметь детей изменяет психологическую адаптацию пациентов в обществе и ведет к снижению качества жизни [Шаршенов А. К., 2004].

Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) является одним из наиболее современных и перспективных методов лечения бесплодия. В связи с широким распространением вспомогательных репродуктивных технологий особую актуальность приобретает вопрос повышения их эффективности. В европейских странах частота наступления беременности в программе ЭКО в расчете на перенос эмбриона в полость матки, согласно данным Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE), составляет около 30%. При этом пациентки с многократными неэффективными попытками ЭКО составляют около 30% от всех пациенток, которые получают лечение этим методом [Судома И.А., 2007].

К наиболее распространенным причинам неэффективности попыток ЭКО относятся: плохое качество эмбрионов, нарушение свертываемости крови, а также изменение кариотипа супругов и патология эндометрия [Феоктистов A.A., 2009]. Однако существует определенный процент циклов ЭКО, при которых причина ненаступления беременности остается неясной. В подобных ситуациях ряд исследователей в качестве возможной причины рассматривает нарушение имплантации плодного яйца в толщу эндометрия [Ширшев C.B., 2002].

Причин нарушения имплантации много, однако, одной из причин могут являться генетические особенности пациентки, в том числе и аллельный полиморфизм некоторых генов. Носительство тех или иных аллелей определенных генов может изменять течение биохимических процессов в организме пациентки и способствовать нарушению процесса имплантации. Имплантация плодного яйца — сложный многоступенчатый процесс с вовлечением большого числа клеточных и гуморальных факторов, в том числе белков эндотелиальной дисфункции, цитокинов и факторов ангиогенеза. Таким образом, большой интерес представляет изучение полиморфизма генов, принимающих участие в процессах имплантации, к которым относятся гены белков, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции, цитокинов и факторов ангиогенеза.

Цель исследования

Определение генетических предикторов нарушения процесса имплантации у пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО.

Задачи исследования:

1. Изучить и сопоставить встречаемость аллельных вариантов генов белков, связанных с эндотелиальной дисфункцией (MTHFR (677С/Т), eNOS (894G/T), p22-phox NADPH (242С/Т)), генов цитокинов (IL-lß (-51 IC/T), IL-6 (-174G/C), IL-10 (-1082G/A), TNF-a (-238G/A)) и генов факторов ангиогенеза (VEGF (-1154G/A), KDR (1719A/T и -604T/C) и Ang-2 (735G/A)) у пациенток с неудачными попытками ЭКО и у фертильных женщин.

2. Сопоставить частоту встречаемости аллельного полиморфизма генов ангиогенеза и нарушений внутриматочной перфузии.

3. Разработать метод оценки степени риска нарушения имплантации.

Научная новизна

На основании многофакторной оценки генотипа пациенток с неудачными попытками ЭКО и фертильных женщин определены гены, аллельные варианты которых ассоциированы с нарушением имплантации.

4

Впервые выявлена прямая взаимосвязь между носительством мутантных аллелей в гене ангиогенеза (УЕОР) и нарушением внутриматочной перфузии.

Практическая значимость работы

Для прогноза эффективности ЭКО и возможной терапевтической коррекции при исключении других причин нарушения имплантации обоснована целесообразность проведения генотииирования пациенток с неудачными попытками ЭКО по генам 1Ь-1Ь, ТОТ-а и УЕСР, поскольку аллельный полиморфизм этих генов является фактором риска нарушения имплантации.

На основе проведенного многофакторного анализа разработан метод оценки риска нарушения имплантации и прогнозирования эффективности ЭКО. Наличие определенных комбинаций генотипов С(-511)Т гена 1Ь-1Ь, гена ЮТ-а и С(-1154)А гена УЕвР позволяет отнести пациентку к группе без риска, с низким, средним или высоким риском нарушения имплантации.

Положения, выносимые на защиту

1. Аллельный полиморфизм генов ИЛЬ, ТОТ-а и УЕОР является фактором риска нарушения имплантации плодного яйца.

2. Наличие определенных комбинаций генотипов С(-511)Т гена 1Ь-1Ь, А(-238)С гена Т№-а и С(-1154)А гена УЕОР является основанием для отнесения пациентки в группу без риска, с низким, средним или высоким риском нарушения имплантации плодного яйца.

3. При наличии у пациенток полиморфизма генов ангиогенеза чаще выявляются нарушения внутриматочной перфузии на уровне базальных и спиральных артерий.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в работу отделения ЭКО «Центра планирования семьи и репродукции» ДЗ г. Москвы; используются в учебном

5

процессе при подготовке студентов, ординаторов и аспирантов на кафедре акушерства и гинекологии, кафедре биохимии и молекулярной медицины Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»; а также при выполнении государственного контракта № 16.512.11.2030 от 14 февраля 2011 г. с Министерством образования и науки России по теме: «Разработка метода дифференцированного выявления генетических маркеров аллельных вариаций генов материнской и фетальной ДНК, ведущих к нарушению роста и развития плода, в крови матери».

Апробация работы Основные положения работы доложены и обсуждены на совместной научно-практической конференции сотрудников кафедры акушерства и гинекологии Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, кафедры акушерства и гинекологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, кафедры биохимии и молекулярной медицины Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова и сотрудников ГБУЗ «Центр планирования семьи и репродукции» ДЗ г. Москвы 20 сентября 2012г., протокол №3.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных работ в отечественной и зарубежной печати, из них 3 - в журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.

Личное участие автора Автором лично проведена работа по отбору и клиническому обследованию тематических больных, изучению аллельных вариантов исследуемых генов у данных пациенток; статистическая обработка полученных данных и анализ результатов исследований.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 161 странице компьютерного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 36 отечественных и 180 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 20 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящая работа выполнена за период с 2009 по 2012 гг. на кафедре акушерства и гинекологии Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (зав. кафедрой - академик РАМН, д.м.н., профессор Г.М.Савельева) на базе Центра планирования семьи и репродукции (главный врач О.А.Латышкевич) и кафедре биохимии и молекулярной медицины Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (зав. кафедрой -академик РАН и РАМН, д.м.н., профессор В.А.Ткачук).

В исследование включены 192 женщины в возрасте от 27 до 39 лет. Для решения поставленных задач были сформированы 2 группы обследуемых:

В I группу вошли 90 пациенток с наличием в анамнезе двух и более попыток ЭКО, которые подразделялись на две подгруппы: подгруппа 1а представлена 47(52,2%) пациентками с бесплодием неясного генеза; в подгруппу 16 вошли 43 (47,8%) пациентки с трубно-перитонеальной формой бесплодия.

II группа (контрольная): 102 женщины с реализованной репродуктивной функцией (имевшие в анамнезе 1 и более своевременные роды здоровыми детьми).

Критерии включения пациенток в основную группу, возраст 25-38 лет; отсутствие наступления беременности в течение 1 года регулярной половой жизни без контрацепции; нормальный овариальный резерв (уровень ФСГ,

7

АМГ, ингибина Б); от 2-х до 5-ти попыток ЭКО, в результате которых беременность не наступила; удовлетворительное качество эмбрионов; нормальное состояние эндометрия по данным УЗИ (М-эхо 9-15мм, структура однородная); для пациенток с бесплодием неясного генеза - отсутствие патологии при обследовании супружеской пары; для пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием - отсутствие или доказанная непроходимость маточных труб.

Критерии исключения из основной группы: снижение овариального резерва; хроническая ановуляция; эндометриоз/аденомиоз; хронический эндометрит, патология эндометрия; мужской фактор бесплодия; плохое качество эмбрионов; врожденные пороки развития или приобретенные деформации полости матки; противопоказания к проведению ЭКО и вынашивания беременности; для пациенток с бесплодием неясного генеза -хламидиоз в анамнезе, хронический сальпингоофорит, гидросальпинкс, подтвержденная непроходимость маточных труб.

Всем пациенткам проводилось клиническое обследование, включающее изучение анамнеза, физикальных и лабораторных данных; УЗИ органов малого таза; определение содержания гормонов в сыворотке крови; микробиологическое исследование отделяемого влагалища и цервикального канала. Пациенткам с бесплодием неясного генеза проводилась также допплерометрия кровотока с количественной оценкой кривых скоростей в маточных, радиальных, базальных и спиральных артериях. При анализе результатов допплерометрического исследования сосудистой сети матки использовались нормативные показатели, разработанные Бугеренко Е.Ю. (2010).

У каждой женщины, включенной в исследование, проводился забор венозной крови для генетического анализа, состоящего из этапа выделения ДНК и последующего проведения полимеразной цепной реакции. Проведение генетического исследования включало в себя определение

8

аллельных полиморфизмов генов, ведущих к дисфункции эндотелия (МТНРЯ, еКГОБ, р22-рЬох ИАБРН), генов цитокинов (1Ь-1Р, 1Ь-6,1Ь-10, Т№-а), факторов ангиогенеза (УБОР, КОЯ и А1^-2).

Статистическая обработка данных проводилась при помощи пакета 81аЙ5Нса 8.0 с использованием ^критерия Стьюдента (для количественных признаков) и двустороннего точного критерия у2 Фишера (для качественных признаков). Многофакторный анализ проводился с использованием модели логистической регрессии. Подбор коэффициентов для создания балльной шкалы осуществлялся при помощи регрессионного анализа. Уровень значимости был принят как р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Средний возраст женщин в исследуемых группах различался хоть и не значительно, однако достоверно. В группе пациенток с ЭКО возраст колебался от 24 до 38 лет, средний возраст составил 32,9±3,18 года, а в группе контроля возраст колебался от 24 до 40 лет, средний возраст составил 31,4±3,72 года (р=0,003). Средний возраст менархе у женщин с ЭКО и женщин контрольной группы (13,4±1,2 ~ и 12,8±1,6 лет соответственно), длительность менструального цикла (29,2±2,1 и 28,7±2,4 дней) и продолжительность менструаций (5,5±1,4 и 6,0±1,0 дней) были сопоставимы и соответствовали физиологическим параметрам.

Среднее число беременностей в основной группе составило 0,99±1,04, в контрольной - 2,46±1,36, родов 0,13±0,34 и 1,64±0,59 соответственно (р=0,0000001). В основной группе только у 13,33% пациенток в анамнезе были одни роды, больше одних родов в анамнезе в данной группе не наблюдалось. В основной группе среднее количество абортов составило 0,26±0,43, в контрольной - 0,7±0,98 (р=0,0001). В основной группе у 25,6% пациенток в анамнезе был один аборт, больше одного аборта в данной группе не проводилось. Эктопия шейки матки встречалась у 18,9% пациенток основной группы и 41,2% - группы контроля (р=0,001), эндометриоз не

9

встречался у пациенток основной группы, а в контрольной группе наружный генитальный эндометриоз в анамнезе был у 8,8% пациенток (р=0,004), аденомиоз - у 10,2% (р=0,001). Спаечный процесс в малом тазу был диагностирован у 17,8% пациенток I группы (16) и ни у одной пациентки контрольной группы (р=0,00001). Хроническое воспаление придатков встречалось у 25,6% пациенток основной группы (16) и у 5,9% - контрольной (р=0,0002). Тубэктомия по поводу трубной беременности была произведена у 26,7% пациенток основной группы (16) и у 3,9% - группы сравнения (р=0,00001). Помимо этого у 12,2% пациенток основной группы произведена тубэктомия по поводу гидросальпинкса. У пациенток основной группы первичное бесплодие диагностировано у 41,11% пациенток, вторичное - у 58,89%. Длительность бесплодия варьировала в широком диапазоне - от 2 до 18 лет, составив в среднем 6,87+3,71года. Количество попыток ЭКО также было различным (от 2 до 5), в среднем 2,7±1,14.

При анализе показателей лабораторных исследований (общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи, гемостазиограмма) существенных различий выявлено не было.

При проведении исследования нами были исследованы гены белков, вовлеченных в формирование эндотелиальной дисфункции, так как эндотелиальная дисфункция отражает генерализованное нарушение всех функций эндотелия, что сопровождается нарушением регуляции сосудистого тонуса, проницаемости, увеличением прокоагулянтной, проагрегантной, антифибринолитической и противовоспалительной активности эндотелиального слоя [Петрищев H.H., 2003].

При сравнительной оценке частоты встречаемости аллелей и генотипов генов белков, связанных с дисфункцией эндотелия (полиморфизм С242Т гена p22phox, G894T гена eNOS и С677Т гена MTHFR) нами не выявлено достоверных различий среди пациенток с неудачными попытками ЭКО и пациенток группы контроля (табл.1).

10

Таким образом, нами не выявлено взаимосвязи между носительством полиморфных аллелей генов, связанных с эндотелиальной дисфункцией, и предрасположенностью к нарушению имплантации.

Таблица 1

Распределение генотипов и аллелей генов, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции, у женщин с неудачными попытками ЭКО и группы контроля

Полиморфизм Генотип/ аллель ЭКО, % (п) п=90 Группа контроля, % (п), п=102 р ДЛЯ критерия /2 Фишера ош (95% ДИ)

С242Т гена СУВА СС 32 (35,6) 36(35,3) 0,97 0,5 (0,28-1,09)

ст 43 (47,8) 48 (47,1) 0,92 1,03 (0,59-1,81)

тт 15(16,7) 18(17,6) 0,86 0,93 (0,44-1,99)

Т-аллель 40,6 41,2 0,92 1 (0,57-1,75)

в894Т гена е1Ч08 во 48 (53,3) 50 (49,0) 0,55 1,19(0,68-2,05)

ОТ 36 (40,0) 42(41,2) 0,87 0,95 (0,53-1,7)

тт 6(6,7) 10(9,8) 0,44 0,66(0,23-1,9)

Т-аллель 26,7 30,4 0,43 0,86 (0,47-1,58)

С677Т гена МТНИ1 СС 54 (60,0) 53 (52,0) 0,26 1,39(0,8-2,43)

ст 28(31,1) 40 (39,2) 0,24 0,7 (0,38-1,28)

тт ' 8 (8,9) 9(8,8) 0,99 1,0(0,37-2,72)

Т-аллель 24,4 28,4 0,41 0,81 (0,43-1,52)

Гены цитокинов. При сравнительной оценке частоты встречаемости аллелей и генотипов генов цитокинов (С(-511)Т гена 1Ь-1Ь, С(-174)С гена 1Ь-

6, 0(-1082)А гена 1Ь-10 и С(-238)А гена ЮТ-а) нами были выявлены достоверные различия в генах 1Ь-1Ь (рис.1) и ТОТ-а (рис.2) [табл.2] у пациенток с неудачными попытками ЭКО и женщин группы контроля.

Таблица 2

Распределение генотипов и аллелей генов цитокинов у женщин с неудачными попытками ЭКО и группы контроля

Полиморфизм Генотип/ аллель ЭКО, п (%) N=90 Группа контроля, п (%), N=102 р для критерия /2 Фишера ош (95% ДИ)

С(-511)Т гена 1Ь-1Ь СС 33 (36,7) 57 (55,9) 0,008 0,46 (0,26-0,81)

ст 42 (46,7) 38 (37,3) 0,19 1,47 (0,82-2,63)

тт 15 (16,7) 7(6,9) 0,04 2,71 (1,05-7,04)

Т-аллель 40,0 26,0 0,003 1,9 (1,04-3,44)

С(-174)С гена 1Ь-6 во 30 (33,3) 41 (40,2) 0,33 0,75(0,27-2,11)

ее 46 (51,1) 47(46,1) 0,49 1,22(0,69-2,17)

СС 14(15,6) 14(13,7) 0,72 1,16(0,52-2,59)

С-аллель 41,1 36,8 0,4 1,18 (0,67-2,09)

С(-1082)А гена 1Ь-10 во 42 (46,7) 49 (48,0) 0,85 0,94 (0,54-1,65)

вА 32 (35,6) 34 (33,3) 0,75 1,1 (0,61-2,0)

АА 16(17,8) 19(18,6) 0,88 0,94(0,45-1,98)

А-аллель 35,6 35,3 1,0 1,0(0,56-1,78)

С(-238)А гена ТОТ-а во 68(75,6) 90 (88,2) 0,26 1,39(0,8-2,43)

вА 22 (24,4) 12(11,8) 0,24 0,7 (0,38-1,28)

А-аллель 12,2 5,9 0,03 2,14 (1,06-5,84)

Таким образом, можно сделать вывод, что носительство мутантной аллели Т гена IL-lb (С(-511)Т) ассоциируется с риском развития нарушения имплантации.

Это подтверждается данными литературы - провоспалительный цитокин IL-lb опосредует связь между эндометрием и эмбрионом в период имплантации и связывание данного цитокина с рецепторами в материнском организме необходимо для имплантации [Martin J.C., 2001]. Полиморфизм С(-511)Т гена IL-lb сопряжен с повышенным уровнем IL-lb в случае -511Т аллели и соответственно большей активностью воспалительных процессов у носителей этой аллели. Помимо этого Inagaki (2003) показал, что у пациенток с множественными неудачными попытками ЭКО концентрация IL-lb в полости матки выше по сравнению с фертильными женщинами.

Рисунок 1. Частота встречаемости различных генотипов IL-1J3 у пациентов основной и контрольной групп

Фактор некроза опухоли (TNF-a) играет важную роль в процессах инвазии клеток трофобласта и мезенхимальном ангиогенезе [Demir R., 2004]. Носительство полиморфизма G(-238)A приводит к повышению продукции TNF-a. Полученные результаты подтверждают мнение ряда авторов об отрицательном влиянии повышенной концентрации TNF-a как в крови, так и в фолликулярной жидкости на наступление беременности [Lee K.S., 2000;

МкоЬйоэ К., 2004]. Под воздействием ТТчГР-сх активируются натуральные киллеры (ЫК-клетки), способные лизировать трофобласт [Сухих Г.Т., 2005].

Рисунок 2. Частота встречаемости различных генотипов ТМЕ-а у пациенток основной и контрольной групп

Таким образом, нами выявлена взаимосвязь между носительством мутантных аллелей и генотипов генов ИЛЬ и ТЫР-а и фертильностью женщин, что может свидетельствовать об их негативном влиянии на процесс имплантации.

Гены, связанные с ангиогенезом. Процессы ангиогенеза являются одними из ключевых на этапе подготовки эндометрия к имплантации и инвазии бластоцисты. При сравнительной оценке частоты встречаемости аллелей и генотипов генов факторов ангиогенеза (полиморфизм 0(-1154)А гена УЕСБ, А1719Т и Т(-604)С гена ЮЖ и 0(735)А гена Апв-2) нами были выявлены достоверные различия только в гене УЕОР у пациенток с неудачными попытками ЭКО и женщинами группы контроля (табл.3, рис.3).

Сосудисто-эндотелиальный фактор роста (УЕОР) участвует в координации процессов дифференцировки, миграции и инвазии трофобласта. Полиморфизм 0(-1154)А гена УЕОР ассоциирован со снижением уровня продукции УЕОР и замедлением процессов ангиогенеза.

Таблица 3

Распределение генотипов и аллелей генов цитокинов среди женщин с неудачными попытками ЭКО и группы контроля

Полиморфизм Генотип/ аллель ЭКО, п (%) N=90 Группа контроля, п (%), N=102 р ДЛЯ критерия х2 Фишера ош (95% ДИ)

С(-1154)А гена УЕвР 30 (33,3) 53 (52,0) 0,01 0,46 (0,26-0,81)

вА 28 (31,1) 36(35,3) 0,54 0,94 (0,66-1,33)

АА 32 (35,6) 13 (12,7) 0,0003 3,78 (1,82-7,83)

А-аллель 51,1 30,4 0,00001 2,43 (1,38-4,29)

А1719Т гена ЮЖ АА 49 (54,4) 50 (49,0) 0,46 1,25 (0,72-2,15)

АТ 39 (43,3) 49 (48,0) 0,51 0,83 (0,47-1,47)

ТТ 2 (2,2) 3 (3,0) 0,76 0,75 (0,12-4,65)

Т-аллель 23,9 27,0 0,56 0,85 (0,45-1,61)

Т(-604)С гена ЮЖ ТТ 30(33,3) 40 (39,2) 0,4 0,78 (0,43-1,4)

ТС 48 (53,3) 42 (41,2) 0,09 0,81 (0,45-1,4)

СС 12(13,3) 20(19,6) 0,25 0,63 (0,29-1,38)

С-аллель 40,0 40,2 1,0 1,0 (0,57-1,77)

С(735)А гена А1^-2 во 34 (37,8) 43(42,2) 0,76 0,91 (0,52-1,61)

вА 44 (48,9) 53 (52,0) 0,47 0,81 (0,46-1,44)

АА 12(13,3) 6 (5,9) 0,17 2,46 (0,88-6,9)

А-аллель 0,38 31,9 0,24 1,3 (0,73-2,31)

100 90

80 70

о. N5

52,0

20 10

"31Х

35Д.

12:7

а основная группа группа контроля

"р <0,05

Рисунок 3. Частота встречаемости различных генотипов УЕСБ у пациенток основной и контрольной групп

На основании полученных данных можно сделать вывод, что носительство мутантной аллели А гена УЕОР (С(-1154)А) ассоциируется с риском развития нарушения имплантации.

На втором этапе исследования мы оценили взаимосвязь внутриматочной перфузии и полиморфизма генов ангиогенеза у пациенток с неудачными попытками ЭКО по поводу бесплодия неясного генеза. У 39 пациенток из подгруппы с бесплодием неясного генеза (1а) основной группы было проведено сравнение результатов генотипирования по генам ангиогенеза и данными допплерометрии сосудов матки.

Пациентки были подразделены на подгруппы в зависимости от генотипа. В 1гц группу вошло 26 пациенток (66,7%), которые характеризовались наличием мутантной аллели в гомозиготном виде в одном гене или сочетанием гетеро- и гомозиготных генотипов по минорной аллели в 2-х и более генах. 1а2 группу составили 13 пациенток (33,3%), у которых выявлено отсутствие мутантных аллелей или встречался гетерозиготный генотип только в одном гене.

При анализе результатов оценки кровотока в маточных артериях в исследуемой подгруппе пациенток выявлены умеренные нарушения, частота

(15,4%) и степень выраженности которых в подгруппах достоверно не различалась (1а, группа: СДО 6,5 ± 0,9, ПИ 2,2 ± 0,4, ИР 0,8 ± 0,05; 1а2 группа: СДО 7,22 ± 0,9, ПИ 2,2 ±0,35, ИР 0,8 ±0,02).

При допплерометрическом исследовании кровотока в радиальных артериях обращало на себя внимание повышение уголнезависимых показателей сосудистого сопротивления чаще и значительнее в lai подгруппе (у 50,0%; СДО 4,07±0,87, ИР 0,7±0,05, ПИ 0,77±0,28), по сравнению с 1а2 подгруппой (у 38,5%; СДО 3,85±0,06, ИР 0,71±0,061, ПИ 1,32±0,36). Средние значения максимальной систолической скорости в радиальных артериях в обеих группах составили 7,9±1,44 м/с и 8,9±2,67 м/с соответственно, что сопоставимо с нормативными показателями. При статистической обработке результатов обследования маточных и радиальных артерий нами не выявлено достоверных различий между группами (р>0,05).

В то же время нами выявлены значимые различия при оценке внутриматочной перфузии: нарушения гемодинамики на уровне спиральных и базальных артерий эндометрия отмечены у 20 (76,9%) пациенток в 1аг подгруппе и у 4 (30,8%) - 1а2 подгруппы (р=0,01 ).

При анализе результатов допплерометрии у пациенток lai подгруппы (с мутантными аллелями в значимых сочетаниях) выраженные нарушения гемодинамики, проявляющиеся в виде отсутствия визуализации базальных артерий, встречались у 5 пациенток (19,3%), спиральных артерий - у 14 пациенток (53,9%). В то же время в 1а2 подгруппе (с отсутствием мутантных аллелей или гетерозиготным носительством только в одном гене) базальные артерии визуализировались у всех наблюдаемых, отсутствие визуализации спиральных артерий эндометрия отмечено у 4 (30,8%) пациенток. Показатели максимальной систолической скорости кровотока у всех пациенток были в пределах нормальных значений. При этом уголнезависимые показатели сопротивления кровотока были повышены у 50,0% пациенток с мутантными

аллелями в генах ангиогенеза (средние значения составили для СДО 2,31± 0,25, ИР 0,58±0,07, ПИ 0,9±0,09), тогда как аналогичные показатели в 1а2 группе оставались в пределах нормальных значений.

При оценке влияния различных генотипов генов ангиогенеза на внутриматочную перфузию с помощью вычисления отношения шансов ((Ж) обнаружено, что у пациенток с множественными неудачными попытками ЭКО по поводу бесплодия неясного генеза при наличии мутантных аллелей в генах ангиогенеза нарушение кровотока в спиральных артериях отмечалось чаще в 7,5 раз, а в базальных артериях - в 4,6 раза. В то же время шанс выявления минорных генотипов исследуемых генов не изменялся при анализе гемодинамики в сосудах крупного калибра.

Таким образом, у пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО по поводу бесплодия неясного генеза при наличии аллельного полиморфизма генов ангиогенеза нарушения эндометриального кровотока диагностированы достоверно чаще по сравнению с пациентками, не имеющими полиморфизм в исследуемых генах. Влияние исследуемых ангиогенных факторов реализуется на уровне мелких сосудов маточного сосудистого древа, которые подвержены циклическим репродуктивным изменениям, в отличие от зрелых, полноценных сосудов большего калибра (маточные, радиальные артерии).

На третьем этапе исследования был проведен многофакторный анализ с включением в модель наиболее значимых полиморфизмов следующих генов: 1Ь-1Ь (полиморфизм С(-511)Т), ТОТ-а (полиморфизм 0(-238)А) и УЕОБ (полиморфизм С(-1154)А). При этом мы основывались на полученных данных о вкладе каждого из исследуемых генов в формирование предрасположенности к нарушению имплантации эмбриона. Оценка одновременно всех трех полиморфизмов генов выявила, что каждый из них вносит независимый, существенный и однонаправленный вклад в формирование предрасположенности к нарушению имплантации.

18

При оценке с учетом значений константы Вальда и р одновременно всех выбранных генов наиболее сильное влияние на формирование предрасположенности к нарушению имплантации оказывает полиморфизм 0( -1154)А гена УЕОР (р=0,016). Далее следует полиморфизм С(-511)Т гена 1Ь-1Ь (р=0,017) и наиболее слабый негативный эффект из исследуемых полиморфизмов оказывает полиморфизм С(-238)А гена ТЫР-а (р=0,04). С учетом полученных данных, были введены коэффициенты значимости для каждого из полиморфизмов. Суммарный балл по трем генам для каждой из пациенток высчитывался по формуле:

I = 0,15*(Ати, УЕСР) + 0,14*(Ати1ИЛЬ) + 0,18*(Ати( Т№-а), где Атц1 может принимать значения от 0 до 2 в зависимости от количества мутантных аллелей в генотипе пациентки.

Согласно присвоенным баллам была подсчитана сумма баллов для всех комбинаций генотипов по трем полиморфизмам. Далее было проведено разделение всех пациенток (основной и контрольной группы) на 4 группы: с отсутствием риска, с низким, средним и высоким риском предрасположенности к нарушению имплантации с учетом генотипа пациенток по трем генам (табл.4). К группе без риска предрасположенности к нарушению процесса имплантации были отнесены только пациентки с одной самой благоприятной комбинацией генотипов (без мутантных аллелей во всех 3-х генах). Группа с низким риском нарушения имплантации состояла из пациенток с наличием гетерозиготного генотипа по одному или двум генам. К группе со средним риском предрасположенности к нарушению имплантации были отнесены пациентки с гомозиготой по мутантной аллели только в одном гене или в сочетании с гетерозиготой по второму гену. К группе с высоким риском нарушения имплантации были определены носители хотя бы одной мутантной аллели в каждом гене или гомозиготное носительство мутантной аллели сразу в двух генах.

Таблица 4

Разделение генотипов на группы риска

Группа риска Описание Генотипы

Без риска нет мутантных аллелей во всех 3-х генах сс/ сс /сс

Низкий риск гетерозиготный генотип по одному или двум генам сс/ ст /сс о а/ сс /с с сс/ сс /са СА/СТ/СО СС/ СТ /СА С Л/ сс /СЛ

Средний риск гомозигота по мутантиой аллели только в одном гене или в сочетании с гетерозиготой по второму гену СС/ ТТ /сс АА/ с с /ас СА/ ТТ /СС АА/ СТ /СС ССПТЮА ' АА/ СС /СА

Высокий риск мутантная аллель в каяедом гене или гомозигота по мутантной аллели в двух генах С А/ СТ/СА АА/ТТ/СС ОА/ТТ/СА АА/ СТ /СА АА/ ТТ /ЄА

Наиболее негативные комбинации ОА/ТТ/вА, А А/СТАЗА и АА/ТТ/ОА (наличие гомозиготного носительства мутантных аллелей по одному или двум генам в сочетании с гетерозиготным носительством по остальным) встретились только в группе пациенток с неудачными попытками ЭКО (р=0,004). При таком разделении распределение женщин по группам риска существенно различалось среди пациенток с неудачными

попытками ЭКО и группы контроля - р=0,00002, -/2=^24,12 (табл. 5). При этом 80,0% пациенток контрольной группы были отнесены к группе без риска или с низким риском. В то же время половина пациенток с неудачными попытками ЭКО попала в группы со средним и высоким риском нарушения имплантации.

Таблица 5

Распределение пациенток по группам риска

Группа Степень риска

нет риска низкий риск средний риск высокий риск

ЭКО N (%) 8 (8,9%) 37 (41,1%) 33 (36,7%) 12 (13,3%)

Контрольная N (%) 30 (29,4%) 51 (50,0%) 18 (17,7%) 3 (2,9%)

Р 0,0005 0,25 0,003 0,01

Правильность такого распределения подтверждается и при анализе

клинической характеристикой пациенток в группах различного риска нарушения имплантации. Так в группе с неудачными попытками ЭКО большее количество беременностей в анамнезе зафиксировано у пациенток без риска. При этом в группе высокого риска нарушения имплантации у половины пациенток беременности отсутствовали, а пациентки с тремя беременностями в анамнезе и не встречались (табл.6).

Таблица 6

Распределение пациенток с неудачными попытками ЭКО по количеству

беременностей в группах различного риска нарушения имплантации

Количество беременностей Группа с неудачными попытками ЭКО, N=90 N (%)

Без риска Низкий риск Средний риск Высокий риск

0 2(25,0) 15(40,5) 14 (42,4) 6 (50,0)

1 1 (12,5) 11 (29,7) 12(36,4) 4 (33,3)

2 1 (12,5) 8(21,6) 4(12,1) 2(16,7)

>3 4 (50,0) 3 (8,1) 3 (9,1) 0

В контрольной группе различия в распределении количества беременностей также достоверно различались. Количество беременностей в анамнезе уменьшалось по мере повышения риска нарушения имплантации. И в группе высокого риска также не было пациенток с тремя беременностями в анамнезе (табл.7).

Таблица 7

Распределение пациенток контрольной группы по количеству беременностей в группах различного риска нарушения имплантации

Количество беременностей Контрольная группа N=102 N (%)

Без риска Низкий риск Средний риск Высокий риск

0 0 0 0 0

1 2 (6,7) 12 (23,5) 6 (33,3) 2 (66,7)

2 17(56,7) 16(31,4) 6 (33,3) 1 (33,3)

>3 11(36,7) 23 (45,1) 6(33,3) 0

Таким образом, разработанная нами система оценки баллов позволяет с высокой вероятностью прогнозировать риск формирования предрасположенности к нарушению имплантации. С учетом полученных результатов можно утверждать, что наиболее значимыми в формировании предрасположенности к нарушению имплантации оказывается носительство полиморфных аллелей генов УЕвР (С(-1154)А), 1Ь-1Ь (С(-511)Т) и Т№-а (С(-238)А). На основании комбинаций этих генов можно отнести пациентку к группе высокого, среднего, низкого риска и отсутствию риска предрасположенности к нарушению имплантации и, таким образом, прогнозировать эффективность попыток ЭКО.

выводы

1. Невозможность выявления ведущей причины бесплодия явилось основанием для изучения полиморфизма генов как возможного предиктора неудачных попыток ЭКО.

2. Бесплодие «неясного генеза» ассоциировано с аллельным полиморфизмом генов цитокинов (1Ь -1Р (-511 С/Т) и Т№-а (238С/А)) и фактора ангиогенеза (УЕОР (-11540/А)).

2. Не выявлено роли аллельного полиморфизма генов МТРШЯ (677С/Т), еЫОБ (8940/Т), р22-рИох ЫАБРН (242С/Т), 1Ь-6 (-1740/С), ПЛО (-Ю820/А), КБ11 (1719А/Т и -604Т/С) и Апё-2 (7350/А) в формировании нарушения имплантации.

3. Имеется прямая зависимость между наличием полиморфизма генов ангиогенеза и нарушением внутриматочной перфузии на уровне мелких сосудов (базальных и спиральных артерий), что может свидетельствовать о нарушении имплантации.

4. Разработан метод отнесения пациенток в группу риска нарушения имплантации: в группу с высоким риском нарушения имплантации входят пациентки с хотя бы одной мутантной аллелью в каждом гене (1Ь-1Ь, ТОР-а и УЕОР) или гомозиготное носительство мутантной аллели сразу в двух исследуемых генах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В рамках обследования пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО целесообразно проведение генодиагностического исследования с анализом комбинаций генотипов С(-511)Т гена ИЛЬ, А(-238)0 гена ШР-сх и 0(-1154)А гена УЕОР.

2. При выявлении нарушения внутриматочной перфузии на уровне базальных и спиральных артерий рекомендовано проводить генотипирование пациенток по генам ангиогенеза.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белокурова М.В. Аллельный полиморфизм генов некоторых цитокинов у пациенток с неудачными попытками экстракорпорального оплодотворения / Белокурова М.В., Самоходская JI.M., Крамаренко М.П., Садекова О.Н., Панина О.Б., Савельева Г.М., Ткачук В.А. // Акушерство и гинекология. -2012.-№4-2-С. 62-66.

2. Белокурова М.В. Аллельный полиморфизм генов ангиогенных факторов у пациенток с неудачными попытками экстракорпорального оплодотворения / Белокурова М.В., Самоходская Л.М., Крамаренко М.П., Садекова О.Н., Панина О.Б., Савельева Г.М., Ткачук В.А. // Вестник РУДН. -2012. -№5 - С. 40-48.

3. Белокурова М.В. Оценка внутриматочной перфузии при аллельном полиморфизме генов ангиогенеза у пациенток с неудачными попытками экстракорпорального оплодотворения / Троскина Е.Ю., Белокурова М.В., Бугеренко Е.Ю.,Самоходская Л.М., Панина О.Б. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2012. - №5 - С. 36-40.

4. Белокурова М.В. Аллельный полиморфизм генов эндотелиальной дисфункции, цитокинов и ангиогенеза у пациенток с неудачными попытками экстракорпорального оплодотворения / Белокурова М.В., Клименко М.П., Самоходская Л.М., Панина О.Б. // Сборник материалов Всероссийского конгресса «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты» -М., 2011.-С. 134-136.

5. Белокурова М.В. Изучение полиморфизма генов у пациенток с первичным бесплодием неясного генеза и неудачными попытками экстракорпорального оплодотворения / Белокурова М.В., Клименко М.П., Садекова О.Н. // Материалы первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века»-М., 2012.-С. 152-153.

Заказ № 560. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул .Палиха 2а.тел.(499)250-92-06 www.postator.ru