Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клинико-биохимические и иммунологические особенности развития легочной гипертензии при врожденных пороках сердца у детей раннего возраста

На правах рукописи

Артеменко Ольга Игоревна

Клинико-биохимические и иммунологические особенности развития легочной гипертензии при врожденных пороках сердца у детей раннего возраста

С/

14.01.08 - Педиатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЗДЗиьэ^

Москва 2010

003490654

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

Профессор, доктор медицинских наук

Научный консультант:

Кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Профессор, доктор медицинских наук

Профессор, доктор медицинских наук

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет»

Защита диссертации состоится «_» февраля 2010 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д208.072.02 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Автореферат разослан «_» декабря 2009 года.

Н.П. Котлукова

М.П. Давыдова

И.В. Леонтьева М.И. Баканов

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор, доктор медицинских наук

Н.П. Котлукова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Врожденные пороки сердца (ВПС) занимают первое место среди причин развития легочпой гипертеюии (ЛГ) у детей. Перестройка, а затем склерозирование легочного сосудистого русла приводит к формированию комплекса Эйзенменгера, продолжительность жизни при котором не превышает 25-30 лет (Бураковский В.И., 1975, Белозеров Ю.М., 2004).

У детей первого года жизни при врожденных пороках сердца с лево-правым шунтом развивается гиперволемическая легочная гилертензия. При своевременной хирургической коррекции ВПС давление в легочной артерии снижается до нормальных значений, т.е. возможен полный регресс заболевания. Однако, у части пациентов по не совсем понятным причинам уже в раннем возрасте развиваются необратимые изменения легочных сосудов и даже радикальная коррекция порока оказывается бесперспективной (Бокерия Л.А., ¡999). В группу риска входят дети с синдромом Дауна и ВПС, у которых легочная гипертензия прогрессирует значительно быстрее.

Необходимо отметить, что высокое легочное сопротивление и высокое давление в легочной артерии, определяемые при помощи допплер-ЭхоКГ, не позволяют однозначно судить о степени перестройки легочного сосудистого русла (Levy M., 2007). Наиболее достоверным методом для определения прогноза заболевания в настоящее время является катетеризация полостей сердца и ипвазивное измерение давления в легочной артерии с использованием функциональных проб (ингаляции оксида азота, кислорода, введение блокаторов кальциевых каналов, простаноидов и др.) (Горбачевский C.B., 2006). Однако понятно, что такое исследование обладает высоким риском, проводится только в высокоспециализированных кардиохирургических стационарах и не может быть скрининговым.

Изучение патогенеза ЛГ при ВПС в конечном итоге направлено на: 1) поиск биохимического маркера степени ЛГ для решения вопроса о целесообразности и сроках хирургического лечения ВПС; 2) определение мишеней для фармакологической коррекции этого заболевания.

Нарастание легочного сосудистого сопротивления является следствием дисбаланса вазоконстрикторных и вазорелаксирующих стимулов. Поэтому неоднократно предпринимались попытки по содержанию вазоактивных субстанций (эндогелина-1, тромбоксана А2, продуктов окисления оксида азота и др.) в крови предсказать течение ЛГ (Granton G.T., 2002, Горбачевский C.B., 2006). Тем не менее, ключевым моментом все- таки является соотношение разных медиаторов, а не их абсолютная концентрация в крови.

Сведения о механизмах, лежащих в основе развития ЛГ, за относительно короткий срок (последнее десятилетие) позволили создать лекарства, к примеру, препараты простациклина, антагонисты эндотелиновых рецепторов и ингибиторы фосфодиэстеразы, значительно улучшающие качество жизни пациентов с этим заболеванием (Белозеров Ю.М., 2004).

Новым направлением в изучении патогенеза многих заболеваний сердца и сосудов (артериальной гипертензии, сахарного диабета, атеросклероза) стало определение роли свободных радикалов. Ткань легких вследствие ее анатомических особенностей и высокого напряжения кислорода наиболее подвержена окислительному стрессу и в норме характеризуется высокой активностью антиоксидантной системы. При патологических изменениях во время развития ЛГ происходит нарастание активных форм кислорода (Cracowski J.L., 2001, Black S.M., 2006), а по данным исследований последних лет они играют одну из ключевых ролей в процессах пролиферации и гипертрофии гладкомышечных клеток и фибробластов. Показано участие некоторых цитокинов в формировании ЛГ (Dorfimiller Р., 2003, Levi, М., 2007). Однако данные преимущественно зарубежной литературы по этому вопросу немногочисленны и касаются взрослых групп пациентов с комплексом Эйзенменгера. Это определило актуальность изучения новых аспектов патогенеза гиперволемической легочной гипертензии у детей первого года жизни с ВПС.

Цель исследования: оценка роли иммунных механизмов и антиоксидантной системы в патогенезе легочной гипертензии при врожденных пороках сердца с учетом особенностей легочной гемодинамики, а также обоснование целесообразности их коррекции у детей раннего возраста.

Задачи исследования

1) Определить уровень экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, TNF-а в лимфоцитарно-моноцитарной фракции клеток крови у детей раннего возраста с ВПС и легочной гипертензией.

2) Изучить параметры антиоксидантной системы: каталазную и общую анитоксидантную активность неферментативных соединений сыворотки, концентрацию общего глутатиона в плазме при легочной гипертензии у детей раннего возраста с ВПС.

3) Исследовать уровень нитритов и нитратов в сыворотке крови и экспрессию мРНК индуцибельной NO-синтазы в лимфоцитарно-моноцитарной фракции клеток крови у детей раннего возраста с ВПС и легочной гипертензией.

4) Проанализировать факторы, способствующие раннему развитию легочной гипертензии при ВПС у детей с синдромом Дауна.

Научная новизна

В работе установлено участие провоспалительных иммунных механизмов (П.-1, ТЫГ'-а) в развитии легочной гипертензии при ВПС и впервые показано, что их активация происходит на ранних стадиях заболевания у детей грудного возраста.

Впервые проведена комплексная оценка антиоксидантных параметров у здоровых детей в данной возрастной группе.

Изучена реакция антиоксидантной системы у грудных детей в ответ на изменения легочной гемодинамики при различных ВПС, а также у детей с наследствешюй предрасположенностью к окислительному стрессу при синдроме Дауна. Обнаружена взаимосвязь между активностью каталазы сыворотки и степенью тяжести легочной гипертензии у пациентов с несиндромальной формой ВПС.

Выявлены особенности патогенеза ЛГ у детей с синдромом Дауна, как то отсутствие ответа антиоксидантной системы на усиление окислительного стресса и низкий уровень экспрессии провоспалительных цитокинов при развитии ЛГ.

Практическая значимость

В работе изучены новые аспекты формирования легочной гипертензии у детей раннего возраста с ВПС, что пополняет знания о физиологии данного заболевания, в особенности -гиперволемической стадии ЛГ. Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения процессов патогенеза легочной гипертензии и поисков новых методов лечения. Обоснована целесообразность исследования эффективности антиоксидантных препаратов, как одного из направлений в терапии ЛГ и гипоксемии при ВПС, в том числе при синдроме Дауна.

Определены параметры антиоксидантной системы (каталазная и общая антиоксидантная активность неферментативных соединений сыворотки, концентрация общего глутатиона в плазме) у здоровых детей 1-го года жизни, которые могут быть использованы как нормативы для последующих исследований.

Внедрение в практику

Результаты, полученные в ходе исследования, внедрены в практическую деятельность отделений новорожденных и грудного возраста Перинатального кардиологического центра ГКБ № 67 г. Москвы и используются в методической и практической работе для занятой со студентами, ординаторами и аспирантами на кафедре детских болезней № 2 ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы обсуждены на заседании кафедры детских болезней № 2 ГОУ ВПО РГМУ. Основные результаты работы доложены на

V Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии 2006» и

V Всероссийском конгрессе «Детская кардиология 2008».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав, посвященных результатам собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, заключения, практических рекомендаций и выводов. Библиография включает источника отечественной и - зарубежной

литературы. Диссертация иллюстрирована таблицами, графиками и рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Работа проводилась на базе Перинатального кардиологического центра ГКБ № 67 (главный врач - A.C. Шкода) и ДКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова (главный врач - В.В. Попов) г. Москвы. Для решения поставленных задач было обследовано 80 детей в возрасте от 1 до 34 месяцев. Основную группу составили пациенты с ВПС и повышением давления в легочной артерии (26 детей), не имеющие синдромальной патологии. Критериями исключения являлись острые и хронические инфекционные заболевания, пороки развития легких, другие возможные (помимо ВПС, гиперволемии) причины развития ЛГ, анемия III ст., декомпенсировапные соматические заболевания и аллергодерматозы в стадии обострения. В исследование не включали детей, перенесших кардиохирургическую коррекцию ВПС. В отдельную группу были выделены дети с ВПС и ЛГ в сочетании с синдромом Дауна (13 пациентов), т.к. известно, что эта категория детей наиболее рано развивает высокую необратимую ЛГ. Особенностью пациентов с синдромом Дауна является их генетическая предрасположенность к окислительному стрессу, обусловленная высокой активностью супероксидцисмутазы 1 типа, ген которой расположен в 21 хромосоме, вследствие чего повышается содержание перекиси водорода в крови. Для анализа данных были набраны 3 группы сравнения пациентов аналогичного возраста: 1) практически здоровые дети (23 ребенка); 2) дети с синдромом Дауна без кардиологической патологии (9 пациентов); 3) дети с ВПС и гиповолемией МКК (9 пациентов). Для уточнения

диагноза всем пациентам было проведено общеклиническое (выяснение анамнеза, осмотр, общие анализы крови и мочи) и кардиологическое обследование, которое включало ЭКГ, допплер-ЭхоКГ, рентгенографию грудной клетки, измерение сатурации. Характеристика групп представлена в табл.1.

Табл.1 Характеристика групп

Группа Врожденные пороки сердца Возраст, мес. Количество пациентов Примечание

ВПС с ЛГ ДМЖП, ДМПП, ОАП, ДОС отПЖв сочетании с ДМЖП 4,6 (1-14) 26 Систолическое давление в ПЖ 22-130 мм Н§

СД + ВПСсЛГ ООАВК, ДМЖП, ДМПП 10,4 (1-34) 13 Систолическое давление в ПЖ 20-105 мм Н§

Контрольная группа МАРС, ООО 5,8 (1-16) 23

СД без ВПС МАРС, ООО 4,7 (1-18) 9

ВПС с гипо-волемией МКК СЛА, ТФ, ДОС отПЖв сочетании с ДМЖП и СЛА, СЛА в сочетании с мпож. ДМЖП 5,5 (1 - 16) 9 Градиент ПЖ-ЛА 45 - 82 мм Нв

Примечание. Данные по возрасту пациентов представлены в виде среднего. В скобках даны минимальное и максимальное значения. ООАВК - общий открытый атриовентрикулярный канал, ДМЖП - дефект межжелудочковой перегородки, ДМПП - дефект межпредсердной перегородки, ДОС - двойное отхождение сосудов, МАРС - малая аномалия развития сердца, МКК - малый круг кровообращения, ОАП - открытый артериальный проток, ООО -открытое овальное окно, ПЖ - правый желудочек сердца, СД - синдром Дауна, СЛА -стеноз легочной артерии, ТФ - тетрада Фалло.

Выделенные группы пациентов были сравнимы по возрасту и распределению по толу. Пациенты с ВПС и признаками недостаточности кровообращения получали кардиологическую терапию в зависимости от тяжести НК - сердечные гликозиды (дигоксин), диуретики (верошпирон, фуросемид), ингибиторы АПФ (капотен), метаболические препараты (панангин, рибоксин, элькар).

Методы. Лабораторная часть исследования проводилась на кафедре нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины ГУНУ МГУ им. М.В.

Ломоносова (зав. кафедрой - д.б.н., профессор В.Б. Кошелев) под руководством к.б.н. М.П. Давыдовой. Для решения поставленных задач нами были изучены:

1. Провоспалительные факторы:

- экспрессия мРНК IL-1, IL-6, TNF-a в лимфоцитарно-моноцитарной фракции

крови;

2. Параметры антиоксидантной системы:

- активность каталазы сыворотки,

- общая антиохсидантная активность низкомолекулярных водорастворимых соединений сыворотки (АОА),

- концентрация общего глутатиона в плазме крови;

3. Показатели системы оксида азота:

- экспрессия мРНК индуцибельной NOS в лимфоцитарно-моноцитарной фракции

крови,

- содержание нитритов и нитратов в сыворотке.

Анализ экспрессии мРНК иитокинов IL-1. IL-6, TNF-a и индуцибельной NO-синтазы в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови методом обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Для анализа экспрессии проводили забор 1 мл венозной крови. Мононуклеарные клетки и лимфоциты периферической крови выделяли непосредственно после ее забора центрифугированием (при 24°С и 1500 g в течение 15 мин) в градиенте плотности Ficoll-Paque (1,077 г/см3), в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА. Отбирали обогащенную лимфоцитами и моноцитами интерфазу, добавляли эквиобъем тканевой среды RPMI и осаждали клетки центрифугированием в течение 15 минут при температуре 24°С и 400 g.

Выделение РНК. Выделение РНК проводили с помощью фенольно-хлороформного метода с использованием TRI-реагента (Sigma). После гомогенизации при добавлении 500 мкл TRI-реагента, образцы перемешивали с 150 мкл хлороформа и проводили разделение фаз центрифугированием (12000 g в течение 20 минут при 4°С). РНК из водной фазы осаждали добавлением эквиобъема изопропилового спирта и последующим центрифугированием при 14000 g в течение 30 минут при 4°С. Осадок РНК промывали дважды 75%-ным этанолом и растворяли в 25 мкл деионизованной воды, обработанной диэтилпирокарбонатом и содержащей 2 ед. активности ингибитора РНКаз (Sintol). Относительную концентрацию РНК оценивали электрофоретически.

Проведение ПНК-азной обработки РНК. Для удаления примеси ДНК образцы, содержащие 1-2 мкг РНК и 1 единицу активности ингибитора РНКазы, инкубировали в

течение 40 минут при 37°С с 2 единицами активности ДНКазы I, не обладающей РНКазной активностью (Fermentas). После инкубации инактивировали ДНКазу стоп-реагентом (Fermentas). Качество ДНК-азной обработки отслеживали по результатам ПЦР для Р-актина.

Проведение обратной транскрипции (ОТ) мРНК. Обратную транскрипцию проводили в течение 1,5 часов при 38°С в образцах, содержащих на 0,5-1 мкг обработанной ДНКазой РНК 100 единиц активности обратной транскриптазы MMuLV (Fermentas), 1 единицу активности ингибитора РНКазы, 0,1 мкг олиго(18)-с1Т праймеров (Sintol), 60 моль гексарандом праймеров (Sintol), 400 мкМ дезоксинуклеотидилтрифосфатов (Sigma).

Проведение полиметзной иепной реакции. В пробирки с кДНК вносили 0,13 мМ дезоксинуклеотидилтрифосфатов, 4 рмоль специфичных праймеров и 0,5 единицы активности Taq-полимеразы (Fermentas) в 1-кратном буфере для ПЦР. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием амплификатора "Терцик" ("ДНК-технология", Россия) в течение 39 (для р-актина) или 42 циклов (IL-1 р, IL-6, TNF-a) при параметрах: 95°С - 15 секунд, 60°С (для Р-актина, IL-ip, TNF-a) или 62°С (для IL-6) - 20 секунд, 72°С - 30 секунд.

Были использованы следующие пары праймеров:

для р-актина - 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGАС,

5'-TCGGCCGTGGTGGTGAAGC,

для IL-1 р - 5'-CTCCTCACCCACACCATCAGCCGC,

5'-GAAGGTTGGATGTTCGTCCTCCACT,

для TOF-a - 5'-CAGAGAGTCCTGTGCTGAATGTGGA,

5'-AGAGGAGGGTTTCTTAGAACCAA,

для IL-6 - y-GATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCACA,

5'-CATTTGTGGTTGGGTCAGGGGTGGT,

для iNOS - 5'-GGCTCCTTCAAAGAGGCAAAAATAGA,

5'-AGTAATGGCCGACCTGATGTTGC.

Результаты ПЦР анализировали электрофоретически, используя 2%-ный агарозный гель. Производилась фотосъемка геля в ультрафиолете на цифровую камеру «Kodak DC 290 Zoom», с обработкой полученного изображения программой «KODAK ID Image Analysis Software» («Kodak», США). Результатом явилась относительная яркость полос ампликонов, выраженная в условных единицах, сравниваемая с яркостью продуктов ПЦР положительного контроля (кДНК стимулированных лимфоцитов). Количественный анализ проводили на основании калибровочных кривых, полученных по результатам амплификации растворов контрольной кДНК после последовательных 10-ти кратных разведений.

Определение активности антиоксидантной системы

Измерение каталазной активности сыворотки крови проводили при помощи спектрофотометрии. При длине волны 240 нм регистрировали истощение H2Oj в пробе, содержащей 50 мкл сыворотки на 2 мл инкубационной смеси (50 мМ PBS, рН=7,4, Н2С>2 10 мМ) за 1 мин., из чего рассчитывали максимальную активность каталазы на мл сыворотки.

Измерение содержания общего глутатиона в плазме крови проводили спектрофотометрически при длине волны 412 нм. К 1 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН=7,5, добавляли 150 мкл депротеинизированной плазмы. Реакцию начинали добавлением DTNB (до концентрации 200 мкМ). Для восстановления окисленного глутатиона использовали глутатион-редуктазу в концентрации 0,5 Ед/мл, что требовало внесения NADPH (до 100 мкМ). Концентрацию глутатиона определяли после 1 мин. инкубации по калибровочной шкале.

Измерение АО А сыворотки крови осуществлялось методом фотохемилюминесценции (ФХЛ). К раствору, содержащему 1500 мкл бидистиллята, 1000 мкл карбонатного буфера (0.1 М, рН=10,4) и 10 мкл люминола (1мМ, рН=7,83), добавляли по 10 мкл сыворотки. Число измерений каждого образца было равно трем. Результаты измерения АОА водорастворимых антиоксидантоз представлялись в эквивалентных единицах концентрации аскорбиновой кислоты путем сравнения полученных данных АОА с экспериментальными данными градуировочной кривой для аскорбиновой кислоты в диапазоне концентраций от 10 до 400 мкМ.

Для определения содержания нитритов и нитратов в сыворотке крови производили депротеияизацию сыворотка путем добавления в пробу этанола в соотношении 1:2. С целью восстановления нитратов до нитритов использовали раствор VClj. Для определения концентрации нитритов использовали реакцию Грисса. После инкубации в течение 60 мин. при t=37 С измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм. Содержание нитратов/нитритов вычисляли по калибровочной шкапе.

Статистическая обработка данных

Полученные результаты обрабатывались с помощью пакета программ SPSS 15.0. Данные представлены в виде медианы с указанием минимального и максимального значений либо среднего (М) ± стандартная ошибка среднего (SD). Оценка различий между группами проводилась при помощи непараметрических методов. Степень связи между признаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена (к). Значения р<0,05 считали значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В нашей работе было обследовано 39 пациентов с ВПС и лево-правым шунтом, следствием чего является развитие гиперволемической легочной гипертензии. 13 пациентов с синдромом Дауна и ВПС были выделены в отдельную группу т.к. известно, что у них легочная гипертензия прогрессирует быстрее.

В группах детей с ВПС родители предъявляли жалобы на одышку, утомляемость при кормлении и другой физической нагрузке, недостаточную прибавку массы тела, задержку психомоторного развития. При антропометрии была обнаружена гипотрофия у 13 из 26 детей (50%) в основной группе, из них у 9 пациентов - гипотрофия II-III степени. Особенностью пациентов с синдромом Даука было наличие дефицита массы тела у всех 13 пациентов с ВПС, 10 из которых имели гипотрофию II-III степени.

Пациенты контрольной группы поступали в стационар для обследования по поводу шума в сердце. У них были диагностированы анатомические особенности, не влияющие на системную и легочную гемодинамику - дополнительные трабекулы или хорды левого желудочка, ООО, пролапс митрального клапана с минимальной регургитацией. Симптомов сердечной недостаточности у детей контрольной группы обнаружено не было. Систолическое давление в ПЖ составило не более 30 мм рт. ст..

Среди сопутствующей патологии у детей как основной, так и групп сравнения встречались следующие заболевания: функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта, дисбиоз кишечника, анемия, рахит, атопический дерматит, пахово-мошоночная грыжа, дисплазия тазобедренных суставов, последствия перинатального поражение ЦНС гипоксически-ишемического генеза в виде гидроцефального синдрома, синдрома повышенной нервно-рефлекторной возбудимости, синдрома мышечной дистонии, гипотонии, задержки психомоторного развития.

Кардиологическое обследование включало допплер-ЭхоКГ, рентгенографию грудной клетки, ЭКГ и определение сатурации крови кислородом.

Врожденные пороки сердца, давление в ПЖ и возраст пациентов в каждой группе представлены в табл. 1. Среди ВПС в основной группе доминировал ДМЖП - у 19 из 26 пациентов, который по частоте встречаемости в популяции в целом занимает 1-е место. У детей с синдромом Дауна наиболее часто встречался ООАВК (у 5 из 13 пациентов) -«типичный» ВПС для этого синдрома. Наличие порока сердца с лево-правым шунтом крови приводило к развитию клинических признаков недостаточности кровообращения (НК). Степень НК определяли по классификации H.A. Белокопь (¡987). Некоторые показатели инструментального обследования в образовавшихся группах приведены в табл. 2.

Табл.2 Некоторые показатели кардиологического инструментального обследования.

Группа п КТИ, % 8а02, % Систол, давление в

ПЖ, мм Нв

Контроль 23 56±3 96±2 20±5

(50-60) (95-98) (12-28)

ВПСсЛГ 26 63±5 91±5 62±26

(54-72) (78-97) (17-130)

НК0-1 9 58±3 96±1 34±15

(54-61) (95-97) (17-45)

НК11А 9 62±4 90±6 53±11

(57-68) (78-94) (38-68)

НКПБ 8 67±5 9Ш 80±25

(58-72) (84-94) (55-130)

ВПС с пшоволе- 9 57±5 85±8 70±13

мией МКК (47-63) (78-96) (45-82)

С гипоксемией 4 55±6 81±2 63±19

(47-60) (78-82) (45-82)

Без гипоксемии 4 60±3 95±1 75±7

(57-63) (94-96) (65-82)

СД, контроль 9 55±5 96±1 25±5

(49-59) (95-96) (15-30)

СД +ВПСсЛГ 13 62±8 88±5

(53-77) (80-97) 20-105

Примечание. Данные представлены в виде среднего (М) ± стандартная ошибка среднего (Ж). В скобках указаны минимальное и максимальное значения в каждой группе.

СД - синдром Дауна, КТИ - кардиоторажальный индекс, йаОг - сатурация крови 02.

Основным эхокардиографичеким критерием, характеризующим степень легочной гипертензии, было систолическое давление в правом желудочке (ПЖ), которое определяли по градиенту регургитации на трикуспидальном клапане или по градиенту давления ЛЖ-ПЖ при наличии ДМЖП. У всех пациентов основной группы и группы «СД + ВПС» отмечался лево-правый сброс крови. При этом признаки легочной гипертензии (повышение систолического давления в ПЖ, расширение ЛА, увеличение правых отделов сердца) были обнаружены у 33 из 39 пациентов. Систолическое давление в ПЖ составило 17-130 мм рт.ст..

На рентгенограмме у пациентов с ВПС и лево-правым шунтом обнаруживали усиление сосудистого рисунка по артериальному типу, расширение и утрату структурности корней легких, признаки эмфиземы легких, кардиомегалию, выбухание дуги легочной артерии. В табл.2 продемонстрировано нарастание кардиоторакального индекса (КТИ) одновременно с нарастанием давления в ПЖ по мере утяжеления клинических симптомов сердечной недостаточности.

Основными особенностями ЭКГ являлись признаки гипертрофии правого и/или левого желудочков, нагрузка на предсердия, нарушения проводимости в виде блокады правой ножки пучка Гиса, метаболические изменения миокарда желудочков. Нарушения сердечного ритма

в виде редкой желудочковой экстрасистолии были зарегистрированы лишь у одного ребенка с ДМЖП и начальной ЛГ.

Статистически значимые отличия в насыщении крови кислородом были обнаружены между пациентами с «ВПС и гиповолемией МКК» и контрольной группой - 85±8 и 96±2 % соответственно (р<0,05). Снижение сатурации у данных пациентов обусловлено наличием классических «синих» ВПС - ТФ, ДОС со СЛА - в этой группе. Статистические различия между другими группами по сравнению с контролем не найдены.

Безусловно, все вышеперечисленные клинико-ииструментальные особенности хорошо описаны и составляют «классический» симптомокомплекс легочной гипертензии при ВПС у детей раннего возраста. Основное внимание в нашей работе было уделено изучению роли антиоксидантных механизмов, системы оксида азота и иммунных провоспалителъпых факторов при данной патологии.

1. Провоспалительные факторы: экспрессия мРНК провоспалителъных иитокииов в лшфоиитарно-моноцитатой фракции крови.

В нашем исследовании планировалось определить, насколько рано при ВПС с обогащением МКК и формированием ЛГ в процесс вовлекаются провоспалительные цитокины (1Ь-1, 11,-6, ТКР-а), и сопоставить их уровень со степенью гемодинамических нарушений. Острые и хронические инфекционные заболевания были критерием исключения для всех групп. Их отсутствие было подтверждено по данным осмотра, клинических анализов крови и мочи, рентгенографии органов грудной клетки, отсутствия патогенной флоры в посеве из носа и зева, отрицательных результатов посева кала на микробы кишечной группы. У пациентов с ВПС и лево-правым шунтом было обнаружено увеличение экспрессии 1Ь-1 и Т№-а в лимфоцитах по сравнению с контролем (табл.3, рис.1), и их уровни коррелировали между собой (к = 0,77, р<0,05). Примечательно, что у здоровых детей зависимость уровней экспрессии этих цитокинов между собой отсутствовала.

Ш Контроль ИВПСсПГ

□ ВПС с гиповолемией МКК

асд

0СД*ВПС сЛГ

TN F-а

1L-1

Рис.1 Экспрессия провоспалительных цитокинов в лимфоцнтарно-моноцитарной фракции крови. СД - синдром Дауна, МКК - малый круг кровообращения. * р<0,05.

Наши данные совпадают с литературными, в которых продемонстрирована активация провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-a, хемокинов) при ЛГ в более старших возрастных группах (DorfmtiHer Р., 2003, G.P., 2008). Провоспалительные цитокины синтезируются иммунными клетками в периферической крови и лимфоцитарно-моноцитарными бронховаскулярными инфильтратами в легких, а также эндотелиальными клетками. Предполагаются различные пути влияния провоспалительных факторов на легочное сосудистое русло. В культуре легочных артериальных гладкомышечных клеток показано увеличение экспрессии циклооксигеназы 2 типа под воздействием IL-1 (3, IL-6, TGF-(?i, что приводит к гиперпродукции PgE2 - одного из основных легочных вазоконстрикторов - и угнетение синтеза простациклина (Bradbury 2002, Itoh А., 2003). Провоспалительные цитокины стимулируют образование свободных радикалов. Обнаружено негативное влияние IL-6 и TNF-a на количество и функции предшественников эндотелиальных клеток, которые мобилизуются из костного мозга и участвуют в постнатальном васкулогенезе (Diller Р.,

Известно, что провоспалительные цитокины оказывают неблагоприятное влияние на функциональное состояние миокарда (Kelly R.A., 1997). Нами изучена динамика экспрессии IL-1 и TNF-a в зависимости от степени НК. Полученные данные неоднозначны (табл.3). Наибольший уровень экспрессии обоих цитокинов получен у детей с НК НА, а при

2008).

утяжелении НК наблюдается снижение их экспрессии в лимфоцитах, хотя она по-прежнему остается выше, чем в группе сравнения. Объяснением этого явления, возможно, служит тот факт, что 3 из 8 детей в группе НК ЦБ получали глкжокортикоиды (преднизолон), обладающие мощным противовоспалительным действием.

Табл.3 Экспрессия провоспалительных цптокинов в лнмфоцитарно-моноцитарной

фракции крови.

Группа п TNF-a IL-1

Контроль 13 1.4 (0,3-43,7) 3,1 (0-87,3)

ВПСсЛГ 17 8,7* (0-390,5) 37,5* (0,1-933,8)

HK0-I 4 3,6 (0-104,2) 24,3 (5,7-665,0)

HKIIA 7 22,8 (2,0-390,6) 256,8 (4,9-933,8)

НК ПБ 6 9,0 (0-220,7) 14,9 (0,1-119,1)

ВПС с гиповолемией 6 5,8** 4,4

МКК (0,2-24,2) (0-319,1)

СД, контроль 6 0,6 (0,4-0,7) 3,6 (2,6-7,7)

СД +ВПСсЛГ 7 0,9** (0,3-1,1) 0,5 ** (0,4-5,0)

Примечание. Данные представлены в виде медианы в условных единицах, в скобках указаны минимальное и максимальное значение в каждой группе. НК - недостаточность кровообращения.

* р<0,05 по сравнению с контрольной группой. ** р<0,05 по сравнению с группой «ВПС+ЛГ»

У пациентов с ВПС и гиповолемией МКК не обнаружено усиления экспрессии провоспалительных цигокинов в мононуклеарах крови, что, по нашему мнению, связано с «сохранностью» легочного сосудистого русла при данной патологии.

Следует отметить, что нами не выявлено экспрессии IL-6 в лнмфоцитарно-моноцитарной фракции крови во всех группах. Однако по литературным данным при ЛГ и синдроме Эйзенменгера имеет место нарастание этого цитокина в крови и легких в более старших возрастных группах (Dorímüller Р., 2003, Diller G.P., 2008). Возможно, что экспрессия IL-6 увеличивается на более поздних стадиях заболевания и ее отсутствие является особенностью детей первого года жизни.

Низкая экспрессия провоспалительных цитокинов при ЛГ у детей с ВПС и синдромом Дауна, вероятно, связана с относительным иммунодефицитным состоянием, что свойственно пациентам с этой патологией (Kola 1997, Goldacre M.J., 2004).

2. Параметры аитиоксидантной системы.

В нашем исследовании впервые была проведена комплексная оценка антиоксидантных показателей у здоровых детей первого года жизни и пациентов с ЛГ (табл.4).

Табл.4 Параметры аитиоксидантной системы и уровень нитритов/нитратов в

сыворотке крови у детей с ВПС п различными типами гемодинамики.

Группа п Активность каталазы, Ед/мл сыворог. Общий вБИ в плазме, мкМ АОА сьшоротки, Ед в образце Ж)хв сыворотке, мкМ

Контроль 23 33,5±13,1 4,0±2,3 6,9±2,9 (п=9) 63±39

ВПСсЛГ 26 37,4±14,8 2,7±1,4 9,7±10,3 (п=9) 68±46

Ж 0-1 ст. 8 29,4±6,8 3,5±1,1 74±43

НК ПА ст. 9 37,9±20,8 1,8±1,1 65±56

НКПБст. 8 45,0±9,9* 3,0±1,7 66±42

ВПС с гиповолемией МКК 9 39,3±29,7 3,0±0,7 6,6±1,2 (п=6) 50±28

С гипоксемией 5 63,0±22,0 3,0±0,5 6,3±1,1 (п=3) 49±42

Без гипоксемии 4 15,5±8,2* 3,0±0,9 7,0±1,5 (п=3) 50±12

СД, контроль 9 39,3±21.2 1,8±1,0 10,5±2,6* (п=6) 158±114*

СД + ВПСсЛГ 13 34,4±17,1 3,0±3,7 9,5±7,4 (п=7) 126±66*

Данные представлены в виде среднего (М) ± стандартная ошибка среднего (8Б).

ОЭН - гяутатион, >10х - нитриты/нитраты. * р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

- Возрастная динамика обсуждаемых показателей в контрольной группе. Анализируя полученные данные, мы столкнулись с тем обстоятельством, что стандартных тестов и возрастных норм антиоксидантных показателей у детей 1-го года жизни до настоящего времени не разработано. В результате проведенного исследования было установлено, что в группе контроля концентрация глутатиона в плазме обратно коррелировала (к = -0,69, р<0,05) с возрастом ребенка (рис.2). Для каталазной и общей аитиоксидантной активности сыворотки зависимости от возраста обнаружено не было.

10 т

к = - 0,69

(0 II 12 13 14 15

Возраст, мес.

Рис.2 Концентрация глутатиона в плазме крови здоровых детей в зависимости от возраста.

По литературным данным известно о высоком уровне окислительного стресса у новорожденных и постепенном снижении различных маркеров окислительного стресса у детей с 1 года до 16 лет (Кацйтап Ы)., 2003, ТзикаЬага Н., 2007), Наши данные по падению концентрации общего глутатиона в плазме в течение 1-го года жизни у здоровых детей согласуются с общей тенденцией, отмеченной в литературе. Объяснением этого явления может служить более высокий уровень метаболизма и митохондриалыюго дыхания у детей.

- Катапазная активность сыворотки. Каталазная активность сыворотки на первый взгляд не отличалась между здоровыми детьми и детьми с ВПС (табл.4, рис.3). Она составила 37,4±14,8, 39,3±29,7 и 33,5±13,1 Ед/мл в группах «ВПС с ЛГ», «ВПС с гиповолемия МКК» и контрольной соответственно. Однахо мы обратили внимание на зависимость между величиной давления в правом желудочке при пороках с лево-правым сбросом крови (ДМЖП, ДМПП, АВК) и активностью каталазы. У пациентов с наиболее высоким давлением (систолическое давление в ПЖ 80±25 мм в правом желудочке была обнаружена более высокая каталазная активность сыворотки. Коэффициент корреляции 0,68 (р<0,05). Разделив пациентов с ВПС «бледного» типа на клинические группы по выраженности недостаточности кровообращения (НК), были получены достоверные отличия между группой сравнения и пациентами, страдающими Ж ПБ ст. и высокой ЛГ, а также между группами с начальной и высокой ЛГ (табл. 4, рис.3).

17

ВПС с гиперволемией МКК ВПС с гиповолемией МКК Синдром Дауна

Рис.3 Каталазная активность сыворотки при ВПС с различными типами легочной гемодинамики и хромосомной патологией.

НК - недостаточность кровообращения, ЛГ - легочная гипертензия, ВПС - врожденный порок сердца.

Вероятно, только значительное повышение давления в ЛА влияет на активность каталазы в отличие от прооксидантных ферментов, экспрессия и активность которых зависят даже от небольшого изменения напряжения сдвига (Grobe A.C.. 2006). С другой стороны, нарастание каталазной активности в миокарде показано при формировании «легочного сердца» (Farahmand F., 2004). Вовлечение в процесс провоспалительвых и тромбогенных факторов (IL-1, IL-6, TNF-a, ТхАг, серотонина) по литературным данным приводит к усилению окислительного стресса (Liu J.Q., 2004). Однако взаимосвязи между повышенным уровнем экспрессии IL-1 и TNF-a и определявшимися параметрами антиоксидантной системы у наших пациентов с ЛГ не выявлено.

Пациенты с ВПС и гиповолемией в легких были распределены на 2 группы в зависимости от степени насыщения крови кислородом. В первую группу вошли пациенты без признаков артериальной гипоксемии в покое, во вторую - пациенты со сниженной сатурацией (81±2 по сравнению с 96±2 % в контроле), диффузным цианозом, повышенным уровнем гемоглобина (149±35 и 109±15 г/л соотв.) и эритроцитозом (4,7±0,7 и 3,6±0,5х109/мл соотв.) в крови (табл. 4, рис.3). Эти дети отличались высокой активностью каталазы, в то время как у пациентов с обедненным легочным потоком, но без существенных признаков гипоксемии, каталазная активность сыворотки, напротив, была ниже, чем в контроле. Такое

разделение пациентов с ВПС «синего» типа с клинической точки зрения не выглядит удивительным и обусловлено, во-первых, разной степенью стеноза JIA, и, во-вторых, разной степенью смешения артериальной и венозной крови, т.е. величиной право-левого шунта. Недаром клинически выделяют «бледную» форму тетрады Фалло.

Пациенты с синдромом Дауна вне зависимости от степени ЛГ по активности каталазы не отличались от группы сравнения.

Концентрация глутатиона в плазме. Учитывая выявленную зависимость (вероятно, нелинейную) уровня общего глутатиона в плазме крови от возраста у здоровых детей 1-го года жизни, дальнейшее сравнение групп по этому показателю представляло значительные сложности. Небольшая численность каждой группы не позволила разделить их на еще более мелкие возрастные отрезки. О достоверных отличиях можно говорить только между здоровыми детьми и пациентами с синдромом Дауна без ВПС, у которых наблюдалось снижение уровня глутатиона в плазме крови. Также в группе пациентов с синдромом Дауна без ВПС найдена обратная корреляция средней силы (к = -0,72) между активностью каталазы и концентрацией глутатиона в плазме.

Общая антиоксидантная активность неферментативных соединений сыворотки. АОА низкомолекулярных соединений сыворотки у пациентов с синдромом Дауна была выше, чем в группе сравнения (10,5±2,6 Ед и 6,9±2,9 Ед в образце соответственно, р<0,05). В других группах различий обнаружено не было.

3. Система оксида азота: уровень нитритов/нитратов (NOx) в сыворотке и экспрессия мРНК iNOS в мононуклеарах крови.

В нашей работе были измерены уровень нитритов/нитратов в сыворотке крови методом спектрофотометрии и экспрессия индуцибельной NO-синтазы в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови при помощи ПЦР. Нитриты и нитраты - основной продукт окисления оксида азота. Неоднократно предпринимались попытки по их концентрации в крови судить о количестве «эндотелиального фактора расслабления сосудов» и активности NOS (Hampl V., 2000). С другой стороны известно, что в условиях окислительного стресса эндотелиальная NO-синтаза «переключается» на синтез активных форм кислорода. При этом увеличивается концентрация стабильных продуктов окисления N0 - нитритов и нитратов.

При анализе собственных данных корреляции продуктов окисления NO в сыворотке и гемодинамических показателей при ЛГ обнаружено не было (табл. 4), что отмечено и большинством других авторов. Соответственно, этот показатель не может характеризовать тяжесть ЛГ. Высокий уровень нитритов/нитратов у детей с синдромом Дауна, вероятно, объясняется повышением содержания перекиси водорода в крови, окисляющей оксид азота.

Экспрессия мРНК ¡NOS в лимфоцитах обнаружена у б пациентов: у 4 - из группы с гиперволемией МКК (n=17), у 1 - из группы с гиповолемией МКК (п=6), и у 1 - из группы сравнения (п=17). Причины экспрессии iNOS именно у этих детей и связи с другими параметрами, в частности, с уровнем NOx, найти не удалось.

Особенности антиоксидантпой зашиты при синдроме Дауна.

Антиоксидантная активность сыворотки, измеренная при помощи ФХЛ, характеризует суммарный антиоксидантный потенциал неферментативных водорастворимых соединений, содержащихся в крови. К ним относятся аскорбиновая кислота, глутатион, билирубин, мочевая кислота. Результаты для пациентов с синдромом Дауна, полученные в нашей работе, обобщены на рис. 4. У пациентов с синдромом Дауна АОА была выше, чем в группе сравнения (10,5±2,6 Ед и 6,9±2,9 Ед в образце соответственно, р<0,05), а уровень глутатиона в плазме ниже по сравнению со здоровыми детьми (1,8±1,0 и 4,0±2,3 мкмоль/мл, р<0,05). Разнонаправленность этих изменений свидетельствует, что повышение АОА при синдроме Дауна не связано с тиосульфидной системой, а зависит от количества других низкомолекулярных антиоксидантов, содержащихся в крови. По литературным данным известно, что у пациентов с синдромом Дауна повышена концентрация мочевой кислоты в плазме вследствие высокой интенсивности пуринового обмена (несколько генов ферментов, участвующих в метаболизме пуринов локализованы в 21 хромосоме). Также отмечен более высокий уровень аскорбиновой кислоты у детей с синдромом Дауна по сравнению с возрастным контролем (Brodsky G., 1997, Pallardo F.V., 2006). Вероятно, эти особенности отвечают за относительно более высокую АОА сыворотки при болезни Дауна.

У пациентов с синдромом Дауна в сочетании с ВПС и гиперволемией в легких сохраняется тенденция по двум выше указанным параметрам, но разброс значений слишком большой для обнаружения достоверных различий (АОА 9,5±7,4 Ед, глутатион 3,0+3,7 мкмоль/мл). Эта группа детей была разнородна и по возрасту, и по тяжести кардиологической патологии, степени НК. Ранее мы отметили, что у детей с ЛГ при несиндромальной форме ВПС каталазная активность сыворотки зависит от степени ЛГ, в частности, была выявлена прямая корреляция между активностью каталазы и давлением в правом желудочке. Тем не менее, у детей с синдромом Дауна подобной закономерности ни по одному из исследуемых параметров не обнаружено. Каталазная активность сыворотки в трех группах не отличалась (ДК 39,3±21,2 , Д-ЛГ 34,4±17,1, К 36,6±17,9 Ед/мл сыворотки). В большинстве исследований других авторов также активность каталазы была сравнима с контролем.

г

Неферментативная анти-оксидантная активность, Ед/мл сыворотки

Б Уровень нитритов и

нитратов сыворотки, мкМ

зоо *

250 200 150 | 100

50

—

llii

Д-к д-лг

д-к д-лг

В Активность каталазы, Ед/мл сыворотки

Г Концентрация глутатиояа в плазме, мкМ

»>-*

Йкщ»

шщш

Д-К д-лг

Д-К Д-ЛГ

Рис.4 Особенности антиоксидантной системы у детей с с-мом Дауна А - неферментативная антиоксидантная активность сыворотки, Б - уровень нитритов и нитратов в сыворотке, В - активность каталазы, Г - концентрация глутатиона в плазме. К - контрольная группа, Д-К - синдром Дауна без ВПС, Д-ЛГ - синдром Дауна + ЛГ.

L

В группе пациентов с синдромом Дауна без ВПС найдена обратная корреляция средней силы (к = - 0,72, р<0,05) между активностью каталазы и концентрацией глутатиона в плазме. И каталаза, и глутатионпероксидаза отвечают за детоксикацию перекиси водорода, концентрация которой в крови при болезни Дауна повышена. Эта зависимость, вероятно, обусловлена отрицательной обратной связью между двумя антиоксидантными ферментными системами, контроль которых может осуществляться как на уровне экспрессии генов ферментов так и регуляцией синтеза глутатиона.

Наше исследование показало, что в ответ на усиление окислительного стресса у детей с болезнью Дауна не происходит адекватной активации антиоксидантных ферментных систем (каталазы и глутатиона). Увеличение АОА низкомолекулярных соединений сыворотки на 2030 % вряд ли носит компенсаторный характер, а скорее связано с измененным пуриновым метаболизмом и повышением активности ксантиноксидазы.

Нарушения окислительного статуса при синдроме Дауна во многом генетически обусловлены. С одной стороны, повышенная экспрессия супероксиддисмутазы 1 при неизменной активности каталазы и сниженном уровне глутатиона приводит к избытку перекисных радикалов и окислительному стрессу. С другой стороны, высокая интенсивность пуринового обмена, способствующая накоплению эндогенного антиоксиданта - мочевой кислоты, также связана с трисомией по 21 хромосоме. Однако в равновесии между про- и антиоксидантными факторами первые имеют значительный перевес.

Анализ наших данных показывает, что на работу антиоксидантной системы у детей влияют множество параметров. Существуют генетические и возрастные особенности, например, падение концентрации глутатиона в плазме крови в течение 1-го года жизни у здоровых детей и изначально низкий его уровень при синдроме Дауна. Нарушение гемодинамики при ВПС влияет на другой компонент антиоксидантной защиты - каталазную активность сыворотки, при этом прослеживается тенденция от минимальных значений при снижении легочного потока до повышения активности фермента при гиперволемии и ЛГ. Переменная гипоксия известна как один из прооксидантных факторов и выраженная артериальная пшоксемия, возникающая вследствие смешения артериальной и венозной крови при «синих» пороках, очевидно, вызывает компенсаторное повышение каталазной активности крови. Использование антиоксидантов у детей с ВПС и ЛГ и при синдроме Дауна, вероятно, имеет хорошие перспективы, действуя сразу на несколько звеньев патогенеза.

Заключение

В работе исследованы новые аспекты формирования легочной гипертензии в первые годы жизни у детей с ВПС, что пополняет знания о физиологии данного заболевания. Доказано участие провоспалительных цитокинов и активация антиоксидантной системы при гиперволемической ЛГ. Существенными особенностями пациентов с синдромом Дауна является отсутствие ответа антиоксидантной системы и провоспалительных факторов иммунной системы на ухудшение легочной гемодинамики. Полученные данные указывают на целесообразность исследования эффективности антиоксидантов, как одного из направлений в терапии ЛГ и гипоксемии при ВПС, в том числе при синдроме Дауна.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов (1Ь-1 и Т№-а) в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови у детей 1-го года жизни с ВПС и гиперволемической легочной гипертензией, что свидетельствует об их вовлечении в патогенез на самых ранних стадиях заболевания.

2. Получена зависимость каталазной активности сыворотки от типа легочной гемодинамики (гипер- или гиповолемия) при ВПС, а также насыщения крови кислородом. Выявлена прямая корреляция средней силы между давлением в правом желудочке, определенном при помощи допплер-ЭхоКГ, и активностью каталазы сыворотки. Параллельно обнаружено повышение каталазной активности сыворотки при нарастании недостаточности кровообращения. Гипоксемия при ВПС с гиповолемией в легких также приводит к повышению активности каталазы.

3. Выявлена возрастная динамика, а именно, падение концентрации общего глутатиона в плазме в течение 1-го года жизни у здоровых детей.

4. Не найдено отличий общей антиоксидантной активности неферментативных соединений сыворотки у детей с ВПС, осложненных легочной гипертензией, по сравнению со здоровыми детьми.

5. Обнаружено равное содержание продуктов окисления оксида азота (нитритов и нитратов) у здоровых детей раннего возраста и пациентов с легочной гипертензией на фоне ВПС.

6. Установлено повышение нитратов и нитритов у детей с синдромом Дауна как при легочной гипертензии так и без кардиологической патологии, что обусловлено усилением окислительного стресса у этой группы пациентов.

7. Особенностью детей с синдромом Дауна являются снижение уровня обшего глутатиона в плазме, отсутствие активации антиоксидантной и иммунной системы в ответ на усиление легочного потока при ВПС с лево-правым шунтом.

Практические рекомендации:

1) Установленные параметры антиоксидантной системы (каталазная и общая антиоксидантная активность неферментативных соединений сыворотки, концентрация общего глутатиона в плазме) у здоровых детей раннего возраста могут быть использованы как нормативы для последующих исследований.

2) Выявленное усиление экспрессии провоспалительных цитокинов в лимфоцитаряо-моноцитарной фракции крови диктует целесообразность определения их уровня в крови и легочной ткани как в клинике так и в эксперименте.

3) Рекомендуется определение антиоксидантного статуса у детей с синдромом Дауна как при наличии ВПС так и без кардиологической патологии. Снижение резерва антиоксидантной защиты в ответ на усиление окислительного стресса при легочной гипертензии служит предпосылкой применения антиоксидантных препаратов у детей с ВПС и синдромом Дауна.

4) Отсутствие достоверных различий уровня нитритов/нитратов в сыворотке между пациентами с гиперволемической легочной гипертензией вследствие ВПС и здоровыми детьми не позволяет рекомендовать определение этого показателя как маркера эндотелиальной дисфункции при ЛГ у детей раннего возраста.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Давыдова М.П., Артеменко О.И., Котлукова Н.П., Цуканова А.Ю. Врожденные пороки сердца с усилением легочного кровотока сопровождаются увеличением каталазной активности крови // Тезисы докладов IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, "Механизмы функционирования висцеральных систем". - С-Пб, 2005 -с.117.

2. Tsukanova A.Y., Davydova М.Р., Artemenko O.I. Catalase activity is increased in patients with left-to-right blood shunt congenital heart diseases comparing with cyanotic diseases // International Student Congress of Medical Sciences, June 15-18, 2005, Groningen, Netherlands; Book of Abstracts. - p.47.

3. Артеменко О.И., Котлукова Н.П., Давыдова М.П., Радькова Е.В., Ильина О.Н. Особенности антиоксидантной системы у детей с врожденными пороками сердца // Материалы XIII Конгресса детских гастроэнтерологов России. - М., ИД «Медпрактика-М», 2006-с. 392-394.

4. Артеменко О.И. Ответ аятиоксидантной системы на нарушения легочной гемодинамики при врожденных пороках сердца // Материалы V Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - М., «ОВЕРЛЕЙ», 2006 - с. 99.

5. Котлукова Н.П., Артеменко О.И., Давыдова М.П., Ильина О.Н. Особенности патогенеза легочной гипертензии при врожденных пороках сердца у детей // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых - 2007». - Астрахань, 2007 - с. 76-79.

6. Артеменко О.И., Котлукова Н.П., Давыдова М.П., Курбатова Л.А., Селявко Ю.А. Антиоксидантные механизмы защиты при синдроме Дауна у детей // Материалы юбилейного XV Международного Конгресса детских гастроэнтерологов России и стран СНГ. - М., ИД «Медпрактика-М», 2008 - с. 62-65.

7. Артеменко О.И., Котлукова Н.П., Давыдова М.П., Курбатова Л.А., Цуканова А.Ю. Дисбаланс про- и антиоксидантных факторов у детей с врожденными пороками сердца и болезнью Дауна // Материалы V Всероссийского конгресса «Детская кардиология 2008». -М„2008 -с. 211.

8. Котлукова Н.П., Артеменко О.И., Давыдова М.П., Ильина О.Н., Курбатова Л.А. Роль окислительного стресса и антиоксидантной системы в патогенезе врожденных пороков сердца // Педиатрия, 2009, т.87(1). - с. 24-28.

9. Артеменко О.И., Котлукова Н.П., Давыдова М.П. Участие провоспалительных цитокинов в формировании легочной гипертензии у детей с врожденными пороками сердца // Материалы VIII Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», - М., 2009 - с. 123.

10. Котлукова Н.П., Артеменко О.И., Давыдова М.П., Архангельская О.Н. Специфика антиоксидантной системы у детей с врожденными пороками сердца при различных типах легочной гемодинамики // Сборник научных трудов, посвященный 50-летию ГКБ № 67. -Москва 2009-с. 125-129.

Список сокращений

АДЛВ Аномальный дренаж легочных вен

АОА Антиоксидантная активность

АПФ Ангиотензинпревращающий фермент

ВПС Врожденный порок сердца

ДМЖП Дефект межжелудочковой перегородки

ДМПП Дефект межпредсердной перегородки

ДОС Двойное отхождение сосудов

ДЭхоКГ Допплер-эхокардиография

КТИ Кардиоторакальный индекс

ЛА Легочная артерия

ЛГ Легочная гипертензия

МАРС Малая аномалия развития сердца

МКК Малый круг кровообращения

НК Недостаточность кровообращения

ОАП Открытый артериальный проток

ООАВК Общий открытый атриовентрикулярный канал

ООО Открытое овальное окно

ПЖ Правый желудочек сердца

ПЛГ Первичная легочная гипертензия

СД Синдром Дауна

СЛА Стеноз легочной артерии

ТФ Тетрада Фалло

ФХЛ Фотохемилюминесценция

ЭКГ Электрокардиография

GSH Глутатион

NOS NO-синтаза

Sa02 Насыщение (сатурация) крови кислородом

!1

\ 1

Заказ № 487. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Врожденные пороки сердца (ВПС) занимают первое хместо среди причин развития легочной гипертензии (ЛГ) у детей. Перестройка, а затем склерозирование легочного сосудистого русла приводит к формированию комплекса Эйзенменгера, продолжительность жизни при котором не превышает 25-30 лет [7,10].

У детей первого года жизни при врожденных пороках сердца с лево-правым шунтом развивается гиперволемическая легочная гипертензия [10,14]. В западной литературе такая JIГ называется гиперкинетической, т.к. обусловлена усилением легочного кровотока [129]. Особенностью гиперволемической ЛГ является то, что при своевременной хирургической коррекции ВПС давление в легочной артерии снижается до нормальных значений, т.е. возможен полный регресс заболевания. Однако у части пациентов по не совсем понятным причинам уже в раннем возрасте развиваются необратимые изменения легочных сосудов и даже радикальная коррекция порока оказывается бесперспективной [9]. В «группу риска» по развитию комплекса Эйзенменгера, например, входят дети с открытым атриовентрикулярным каналом, который в 50% случаев сочетается с синдромом Дауна [5,30].

Другой причиной формирования высокой ЛГ являются частые заболевания нижних дыхательных путей (пневмонии, бронхиты) у детей грудного и раннего возраста с ВПС, что вынуждает откладывать кардиохирургическое вмешательство. До сих пор встречаются случаи поздней диагностики ВПС и ЛГ.

Интересно отметить, что высокое легочное сопротивление и высокое давление в легочной артерии, определяемые при помощи допплер-ЭхоКГ, не позволяют однозначно судить о степени перестройки легочного сосудистого русла [106]. Наиболее достоверным методом для определения прогноза б заболевания в настоящее время является катетеризация полостей сердца и инвазивное измерение давления в легочной артерии с использованием функциональных проб (ингаляции оксида азота, кислорода, введение блокаторов кальциевых каналов, простаноидов и др.) [14]. Однако понятно, что такое исследование обладает высоким риском, проводится только в высокоспециализированных кардиохирургических стационарах и не может быть скрининговым.

Изучение патогенеза ЛГ при ВПС в конечном итоге направлено на: 1) поиск биохимического маркера степени ЛГ для решения вопроса о целесообразности и сроках хирургического лечения ВПС; 2) определение мишеней для фармакологической коррекции этого заболевания.

Нарастание легочного сосудистого сопротивления является следствием дисбаланса вазоконстрикторных и вазорелаксирующих стимулов. Поэтому неоднократно предпринимались попытки по содержанию вазоактивных субстанций (эндотелина-1, тромбоксана А2, продуктов окисления оксида азота и др.) в крови предсказать течение ЛГ [14,82]. Тем не менее, ключевым моментом все таки является соотношение разных медиаторов, а не их абсолютная концентрация в крови. Сведения о механизмах, лежащих в основе развития ЛГ, за относительно короткий срок (последнее десятилетие) позволили создать лекарства, к примеру, препараты простациклина, антагонисты эндотелиновых рецепторов и ингибиторы фосфодиэстеразы, значительно улучшающие качество жизни пациентов с этим заболеванием [4,39,104,113,142].

Новым направлением в изучении патогенеза многих заболеваний сердца и сосудов (артериальной гипертензии, сахарного диабета, атеросклероза) стало определение роли свободных радикалов. Ткань легких вследствие ее анатомических особенностей и высокого напряжения кислорода наиболее подвержена окислительному стрессу и в норме характеризуется высокой активностью антиоксидантной системы. При патологических изменениях во время развития ЛГ происходит увеличение образования активных форм кислорода [44,59], а по данным исследований последних лет они играют одну из ключевых ролей в процессах пролиферации и гипертрофии гладкомышечных клеток и фибробластов. Показано участие некоторых цитокинов и гормонов в формировании ЛГ [63,106]. Однако данные литературы (в основном, зарубежной) по этому вопросу немногочисленны и касаются взрослых групп пациентов с комплексом Эйзенменгера. Это определило актуальность изучения новых аспектов патогенеза гиперволемической легочной гипертензии у детей первого года жизни с впс.

Цель исследования: оценка роли иммунных механизмов и антиоксидантной системы в патогенезе легочной гипертензии при врожденных пороках сердца с учетом особенностей легочной гемодинамики, а также обоснование целесообразности их коррекции у детей раннего возраста.

Задачи исследования

1) Определить уровень экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, TNF-a в лимфоцитарно-моноцитарной фракции клеток крови у детей раннего возраста с ВПС и легочной гипертензией.

2) Изучить параметры антиоксидантной системы: каталазную и общую анитоксидантную активность неферментативных соединений сыворотки, концентрацию общего глутатиона в плазме при легочной гипертензии у детей раннего возраста с ВПС.

3) Исследовать уровень нитритов и нитратов в сыворотке крови и экспрессию мРНК индуцибельной NO-синтазы в лимфоцитарно-моноцитарной фракции клеток крови у детей раннего возраста с ВПС и легочной гипертензией.

4) Проанализировать факторы, способствующие раннему развитию легочной гипертензии при ВПС у детей с синдромом Дауна.

Научная новизна

В работе установлено участие провоспалительных иммунных механизмов (IL-1, TNF-a) в развитии легочной гипертензии при ВПС и впервые показано, что их активация происходит на ранних стадиях заболевания у детей грудного возраста.

Впервые проведена комплексная оценка антиоксидантных параметров у здоровых детей в данной возрастной группе. Изучена реакция антиоксидантной системы у грудных детей в ответ на изменения легочной гемодинамики при различных ВПС, а также у детей с наследственной предрасположенностью к окислительному стрессу при синдроме Дауна. Обнаружена взаимосвязь между активностью каталазы сыворотки и степенью тяжести легочной гипертензии у пациентов с несиндромальной формой ВПС.

Выявлены особенности патогенеза ЛГ у детей с синдромом Дауна, как то отсутствие ответа антиоксидантной системы и иммунных факторов на усиление окислительного стресса при развитии ЛГ.

Практическая значимость

В работе изучены новые аспекты формирования легочной гипертензии у детей раннего возраста с ВПС, что пополняет знания о физиологии данного заболевания, в особенности - гиперволемической стадии ЛГ. Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения процессов патогенеза легочной гипертензии и поисков новых методов лечения. Обоснована целесообразность исследования эффективности антиоксидантных препаратов, как одного из направлений в терапии ЛГ и гипоксемии при ВПС, в том числе при синдроме Дауна.

Определены параметры антиоксидантной системы (каталазная и общая антиоксидантная активность неферментативных соединений сыворотки, концентрация общего глутатиона в плазме) у здоровых детей 1-го года жизни, которые могут быть использованы как нормативы для последующих исследований.

выводы

1. Обнаружена повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов (IL-1 и TNF-a) в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови у детей 1-го года жизни с ВПС и гиперволемической легочной гипертензией, что свидетельствует об их вовлечении в патогенез на самых ранних стадиях заболевания.

2. Получена зависимость каталазной активности сыворотки от типа легочной гемодинамики (гипер- или гиповолемия) при ВГ1С, а также насыщения крови кислородом. Выявлена прямая корреляция средней силы между давлением в правом желудочке, определенном при помощи допплер-ЭхоКГ, и активностью каталазы сыворотки. Параллельно обнаружено повышение каталазной активности сыворотки при нарастании недостаточности кровообращения. Гипоксемия при ВГ1С с гиповолемией в легких также приводит к повышению активности каталазы.

3. Выявлена возрастная динамика, а именно, снижение концентрации общего глутатиона в плазме в течение 1-го года жизни у здоровых детей. Для анализа антиоксидантной системы глутатиона у детей 1-го года жизни при легочной гипертензии и других заболеваниях требуется разработка стандартных нормативов либо выделение нескольких групп сравнения с интервалом не более двух месяцев.

4. Не найдены отличия общей антиоксидантной активности неферментативных соединений сыворотки у детей с ВПС и легочной гипертензией и здоровых детей.

5. Содержание продуктов окисления оксида азота (нитратов и нитритов) в сыворотке у детей 1-го года жизни с ВПС и легочной гипертензией не отражает степень эндотелиальной дисфункции и не может служить критерием тяжести при этом заболевании.

6. Обнаруженное повышение нитратов и нитритов у детей с синдромом Дауна как при легочной гипертензии так и без кардиологической патологии предположительно обусловлено усилением окислительного стресса у этой группы пациентов.

7. Особенностью детей с синдромом Дауна являются снижение уровня общего глутатиона в плазме, отсутствие активации антиоксидантной и иммунной системы в ответ на усиление легочного потока при ВПС с лево-правым шунтом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1) Установленные параметры антиоксидантной системы (каталазная и общая антиоксидантная активность неферментативных соединений сыворотки, концентрация общего глутатиона в плазме) у здоровых детей раннего возраста могут быть использованы как нормативы для последующих исследований.

2) Выявленное усиление экспрессии провоспалительных цитокинов в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови диктует целесообразность определения их уровня в крови и легочной ткани как в клинике так и в эксперименте.

3) Рекомендуется определение антиоксидаптного статуса у детей с синдромом Дауна как при наличии ВПС так и без кардиологической патологии. Снижение резерва антиоксидантной защиты в ответ на усиление окислительного стресса при легочной гипертензии служит предпосылкой применения антиоксидантных препаратов у детей с ВПС и синдромом Дауна.

4) Отсутствие достоверных различий уровня нитритов/нитратов в сыворотке между пациентами с гиперволемической легочной гипертензией вследствие ВПС и здоровыми детьми не позволяет рекомендовать определение этого показателя как маркера эндотелиальной дисфункции при ЛГ у детей раннего возраста.