Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клиника, иммунокорригирующая терапия и функциональное состояние Т-клеточного и фагоцитарного звеньев иммунитета при инфекционном мононуклеозе у детей

На правах рукописи

УДИЛОВА ЕЛЕНА ЕВГЕНЬЕВНА

КЛИНИКА, ИММУНОКОРРИГИРУЮЩАЯ ТЕРАПИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ Т - КЛЕТОЧНОГО И ФАГОЦИТАРНОГО ЗВЕНЬЕВ ИММУНИТЕТА ПРИ ИНФЕКЦИОННОМ МОНОНУКЛЕОЗЕ У ДЕТЕЙ

14.00.09-Педиатрии

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Екатеринбург - 2007

003065472

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская государственная мсдщи некая академия Федерального агентства но здравоохранению и социальному развитию» на базе Муниципального учреждения «Городская клиническая больница № 40» и Муниципального учреждения «Клинико-диагностический центр», г. Екатеринбург

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Фомин Виталий Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Захарова Светлана Юрьевна

доктор медицинских наук Вахлова Ирина Вениаминовна

Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Челябинск

Защита диссертации состоится «¡ил октября 2007 г. в 10-00 часов на заседании совета по защите докторских диссертаций Д208.102.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская [-осу дарственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 620028, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО УГМА Росздрава по адресу: 620028, г. Екатеринбург, ул. Ключевская, 17, а с авторефератом на сайте академии: www.usma.ru.

Автореферат разослан « " » СМТЛ ок>, 2007 г

Ученый секретарь совета,

доктор медицинских наук, профессор

Рождественская Е.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возбудитель инфекционного мононук-леоза (ИМ) вирус Эпштейн-Барр (EBV) является одним из самых распространенных вирусов известных на сегодняшний день До 90% населения инфицированы EBV [Учайкин В Ф, 2002, Rickinson AB et al, 1996] Доказана роль латентной EBV-инфекции для группы незлокачественных лимфопролиферативных заболеваний, к которым относятся Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром, хроническая активная EBV-инфекция и острый EBV-ассоциированный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз [Coffey A J. et al, 1998, Honda К et al, 2000, Kawa К, 2000] Имеется достоверная связь EBV с рядом злокачественных новообразований, таких как лимфома Беркитта, назофарингеальная карцинома [Литвиненко Н Г, 2003, Cohen JI 2000; Gibbons D L et al, 1994] Предполагают, что EBV может быть причиной развития внутриутробных аномалий [Беляков В Д и др, 2001, Блохина Е Б., 2003, Kawa К., 2000]. Благодаря научным достижениям, в последние годы углубились представления об этиологии и патогенезе, предложены новые методы лабораторной диагностики и лечения ИМ [Сабурова Е Б, 2000; Учайкин В Ф, 2002, Царькова С А., 1987, Kimura Н. et al, 1999; Wurtzler Р, 1993] Многими авторами ИМ рассматривается как болезнь иммунной системы, так как EBV обладает тропностью к иммуно-компетентным клеткам [Larochelle В et al 1998, Roberge Ch et al, 1998, Wutzier P ,1993, Wilson A.D et al, 1998, Straus S.E et al, 1993] Способность EBV к персистенции обусловлена большим набором генов, дающих ему возможность избегать иммунного контроля организма [Брайан В, 1992, Cohen J.I., 1997, Moore KW et al, 1990, Hsu D-H et al, 1990, Tomasi Т., 1992]

Опубликованные данные о роли Т-клеточного, фагоцитарного и гуморального звеньев иммунной системы в иммунопатогенезе ИМ довольно Г"\

■Ли

противоречивы [Molesworth S J et al, 2000, Taga H et al, 1995, Wakasugi N et al, 1990, Foss H D, 1995, Ritter S et al, 1996] Недостаточно информации о роли CD3+- лимфоцитов, содержащих эндоплазматические цито-кины IFNy, IL2, TNFa и IL4 в иммунологической перестройке при ИМ у детей, отсутствуют единые подходы к использованию иммунокоррига-рующих препаратов в острый период заболевания, нет сведений о сочетанием использовании противовирусной и иммунокорригирующей терапии, что и послужило основанием для проведения настоящей работы

Цель исследования выявить клинические особенности, иммунопа-тогенетические закономерности взаимосвязи фагоцитарного и клеточного звеньев иммунной системы при ИМ у детей и оценить влияние анаферона детского на клинические и иммунологические показатели при изучаемой инфекции

Задачи исследования

1 Изучить клинику инфекционного мононуклеоза у детей разных возрастных групп в острый период и период ранней реконвалесценции при тяжелой и среднетяжелой форме болезни

2 Исследовать функциональные параметры нейтрофилов и моноцитов по данным фагоцитарной активности, бактерицидной активности фагощ-тов, спонтанного и стимулированного HCT - теста в зависимости от возраста и формы тяжести инфекционного мононуклеоза

3. Выявить особенности функционального состояния CD3+- лимфоцитов, содержащих эндоплазматические цитокины IFNy, IL2, TNFa и IL4 при изучаемой инфекции 4 Установить закономерности взаимосвязи фагоцитарного и клеточнэго звеньев иммунитета в динамике болезни с учетом тяжести заболевания и возраста

5 Оценить клиническую и иммунологическую эффективность применения анаферона детского при инфекционном мононуклеозе

Научная новизна исследования В отличие от ранее опубликованных данных, в работе, представлена динамика содержания СБЗ1-лимфоцитов, продуцирующих цитоплазматические цитокины (№N7, 1Ь2, ЮТа и 1Ь4) при спонтанном синтезе и в ответ на стимуляцию на протяжении трех недель болезни

Несмотря на клиническое выздоровление, численность субпопуляций Т-лимфоцитов, продуцирующих провоспалительные (№N7,1Ь2, ТИР а) и противовоспалительные (1Ь4) цитокины оставалась выше нормативной, что не исключает активность инфекционного процесса Данный феномен не зависит от возраста детей и формы тяжести болезни и отражает одну из общих иммунологических закономерностей

Инфекционный процесс при инфекционном мононуклеозе не зависит от формы тяжести болезни и возраста и сопровождается высокой фагоцитарной активностью моноцитов и высокими показателями цитотоксичг-ских лимфоцитов, что обеспечивает благоприятное течение болезни

Обоснована целесообразность использования сочетанной терапии анафероном детским и ацикловиром при инфекционном мононуклеозе у детей

Практическая значимость работы. В результате проведенного исследования, выявлены нарушения иммунного гомеостаза при инфекционном мононуклеозе в острый период и период ранней реконвалесценции независимо от возраста больных и формы тяжести заболевания, которые являются показанием к назначению иммунокорригирующих препаратов

Для ускорения клинического выздоровления и коррекции иммунологических нарушений предложено использование анаферона детского со-

вместно с ацикловиром в острый период инфекционного мононуклеоза

Установлено, что дети 3-7 лет больные тяжелой и 7-14 лет среднетя-желой формой инфекционного мононуклеоза являются группой риска по развитию бактериальных осложнений, так как имеют низкие показатели нейтрофильного фагоцитоза в острый период и период ранней реконвалес-ценции

В качестве альтернативы антибактериальным препаратам предложено использование анаферона детского с учетом его стимулирующего действия на нейтрофильный фагоцитоз

Основные положения, выносимые на защиту

1 Общей иммунологической закономерностью инфекционного мэ-нонуклеоза у детей является повышение численности лимфоцитов, моноцитов, СБЗ+- лимфоцитов, СБ8+- лимфоцитов, высокие показатели фагоцитарной активности моноцитов и субпопуляций СОЗ+- лимфоцитов, содержащих цитоплазматические цитокины (ГРЫу, ТТМРа, 1Ь4) при спонтанном и стимулированном их определении

2 Содружественная синергическая реакция между активно фагоцитирующими моноцитами и С08 - лимфоцитами независимо от возраста регистрируется на первой неделе при среднетяжелой форме и на второй неделе при тяжелой форме болезни

3 Применение анаферона детского в острый период инфекционного мононуклеоза ускоряет клиническое выздоровление, приводит к увеличению СОЗ+/1РЫу '- клеток, фагоцитарной активности нейтрофилов и способствует снижению уровня циркулирующих иммунных комплексов

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на научно-практических конференциях МУ ГКБ №40 совместно с кафедрой детских инфекционных болезней и клинической иммунологии 59-й

Межвузовской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием Апробация работы проведена на заседании проблемной комиссии по специальности «Педиатрия» в ГОУ ВПО УГМА Росздрава По теме диссертации опубликовано 12 работ

Внедрение. Результаты исследования внедрены в работу боксового отделения МУ ГКБ №40 и поликлинических отделений детских больниц г. Екатеринбурга Результаты исследования включены в учебно-методическое пособие для врачей «Стандарты диагностики и лечения ш-фекционных болезней у детей на этапах оказания медицинской помощи» (Екатеринбург, 2006) Материалы работы используются в учебном процессе кафедрой детских инфекционных болезней и клинической иммунологии ГОУ ВПО УГМА Росздрава

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка основной использованной литературы, включающего 201 источник, в том числе 95 отечественных и 106 зарубежных Работа иллюстрирована 32 таблицами и 49 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе представлены материалы и результаты открытого ретроспективно-проспективного исследования, проведенного в г Екатеринбурге в 2003-2006 гг на базе боксового отделения МУ "ГКБ № 40" и МУ "ДИБ" В исследование были включены 132 ребенка с диагнозом ИМ в возрасте от 3-х до 14 лет, отобранные случайным методом из смещенной выборки (рис 1 ) Клиника изучена в зависимости от степени тяжести и возраста больных Анализ клинико-

лабораторной картины ИМ проведен на 1-ой, 2-ой и 3-ей неделе заболевания

Рис 1 Дизайн исследования

Всем больным в комплексе параклинического обследования проведено определение общего анализа крови в динамике болезни, биохимии ских показателей сыворотки крови (билирубина, тимоловой пробы, актш-ности трансаминаз) Биохимические исследования проводились на автош-тическом анализаторе «Spectram-2» фирмы Abbott В качестве нормативных значений использованы биохимические показатели здоровых детей

Этиологический диагноз подтвержден выявлением IgM к капсидно-му (VCA), IgG к ядерному (NA) и раннему (ЕА) антигенам EBV на основе ИФА тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» 25 больных были обследованы методом ГТЦР на EBV Обнаружение ДНК EBV в крови больных проводилось с использованием тест-систем «ДНК-сорб-В» (Россия), с последующей амплификацией специфических фрагментов вируса ПЦР-тест-системой «АмплиСенс-100-R» (Россия).

Иммунологические исследования проводились на базе Диагностического центра лабораторной диагностики ВИЧ, инфекционной патологии и болезней матери и ребенка (главный врач, д м н, профессор Я Б Бейкин) Параметры общего анализа крови регистрировались с помощью гематологического анализатора Cobas Micros 60 («АВХ») Иммунофенотипирование лимфоцитов осуществляли с использованием моноклональных антител CD3-FITC/CD20-PE, CD3-FITC/CD4-PE, CD3-FITC/CD8-PE, CD3-FITC/CD16+56-PE («Ю Test») методом проточной цитофлюорометрии на цитометре FACScan («Becton Dickinson») Количество иммуноглобулинов классов M, G, А в сыворотке крови определяли методом радиальной им-мунодиффузии в агаровом геле, предложенным G Mancini (1965) Содержание циркулирующих иммунных комплексов определяли методом преципитации их в 4 % растворе ПЭГ-6000 по V Haskova в модификации Ю А Гриневич (1981). Результаты оценивали в единицах экстинции с помощью спектрофотометрии на аппарате СФ-46 Функционирование НАДФ-оксидазной системы нейтрофилов оценивали при помощи спонтанного НСТ - теста (Демин, 1981)

Для оценки внутриклеточного синтеза цитокинов мононуклеары периферической крови получали путем выделения на градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3) Спонтанную продукцию ИЛ2, ИЛ4, ИФНу и ФНОа Т-лимфоцитами оценивали по истечении 4 часов инкубации в присутствии брефельдина А при 37 °С, в атмосфере 5 % С02 В качестве активатора для стимуляции внутриклеточного синтеза использовали PMA («Sigma», 50 ng/ml) плюс иономицин («Sigma», lug/ml) Иммунофенотипирование проводили с использованием ФИТЦ-меченых анти-СОЗ-моноклональных антител (ООО «Сорбент», г Москва) ре-конъюгированных анти-ИЛ2-, ИЛ4-, ИФНу- и ФНОа-антител (Caltag)

Для оценки внутриклеточного киллинга (бактерицидной активности (БА) лейкоцитов, завершенности фагоцитоза) использовался метод, разра-

ботанный в лаборатории клинической иммунологии Института иммунологии МЗ РФ [Пинегин Б В, 2000] Лейкоциты выделяли в 3% растворе желатина в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) В опытную лунку вносили 90 мкл живых ФИТЦ-меченых бактерий (St Aureus Cowan 1), 20 мкл аутосы-воротки и 90 мкл лейкоцитов в концентрации 2 млн в 1 мл Смесь инкубировали 20 мин при 37°С, лейкоциты осаждали в течение 1 мин при 200g, 2 раза отмывали ФСБ от несвязавшихся бактерий, ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и инкубировали 1 час при 37°С После остановки киллинга лейкоциты разрушали в течение 10 мин и ресуспендировали в 200 мкл ФСБ с 2,5 мкг пропидиум иодида («Sigma»), окрашивающего только убитые клетки Через 30-40 мин пробы анализировали на проточном цитометре «FACSCan» (Becton Dickinson) Для оценки поглотительной активности (АФ) нейтрофилов и моноцитов использовался метод, разработанный в лаборатории клинической иммунологии Института иммунологии МЗ РФ [Пинегин Б В , 2000]. Лейкоциты выделяли в 3% растворе желатина в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) В опытную лунку вносили 90 мкл живых ФИТЦ-меченых бактерий (St Aureus Cowan 1), 20 мкл аутосыворотки и 90 мкл лейкоцитов в концентрации 2 млн в 1 мл После 30-минутной инкубации при 37°С лейкоциты осаждали в течение 1 мин при 200g, 2 раза отмывали ФСБ от несвязавшихся бактерий, ресуспендировали в 200 мкл ФСБ и вносили 5 мкл анти-CD 14 (РЕ) моноклональных антител («Caltag») для оценки мембранной экспрессии CD 14 рецептора на моноцитах Инкубировали 15 мин при комнатной температуре, затем вносили 200 мкл лизи-рующего раствора FacsLysmg (Becton Dickinson), через 5-12 мин однократно отмывали 200 мкл ФСБ и ресуспендировали в 200 мкл раствора ФСБ Анализ проб проводился на проточном цитометре «FACSCan» (Becton Dickinson) Оценивали процент клеток среди нейтрофилов и моноцитов, положительных по зеленой флюоресценции (поглотивших ФИТЦ-меченые бактерии)

Полученные иммунологические показатели были сопоставлены с показателями у здоровых детей соответствующих возрастных групп, представленными в сборнике научных статей «Адаптационно-компенсаторные иммунологические реакции в норме и патологии у детей» (Екатеринбург, 2003)

Анализ преимущественной направленности иммунного ответа по ТЫ или ТЬ2 типу проведен с использованием индекса поляризации (ИП), который рассчитывался по формуле [Богданова Л В , Лагерева Ю Г, 2003]

ип=-—--

СБЗ /1Ь4

Положительные значения ИП свидетельствовали о преобладании клеточно-опосредованных механизмов в иммунном ответе, отрицательные значения указывали на ведущую роль гуморального звена

Базисная терапия ИМ включала противовирусный препарат ацикло-вир, антигистаминные препараты и антипиретики

В соответствии с применяемой иммуномодулирующей терапией пациенты были рандомизированы по группам лечения Детям в основной группе (п=45) назначался предложенный нами анаферон детский Анафе-рон детский - отечественный препарат, который представляет собой сверхмалые дозы антител к интерферону--/ человека Препарат прошел полный цикл экспериментальных и клинических исследований в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ, был зарегистрирован в Российской Федерации и разрешен к применению (регистрационное удостоверение № Р№000372/01-2001 от 05.04 2001) Анаферон детский применялся на фоне базисной терапии с 1-7 дня болезни в течение 7 дней ежедневно перорально по 1 таблетке 3 раза в день, затем в течение месяца по 1 таблетке 1 раз в день

Дети контрольной группы (п=43) получали соответствующую базис-

ную терапию

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Office» и STATISTICA 6,0 фирмы StatSoft Inc (США) для персонального компьютера на базе процессора Intel Celeron 1200 Производился расчет следующих параметров число наблюдений, среднее значение, стандартное отклонение, стандартная ошибка среднего, минимум и максимум, размах Сравнг-ние двух независимых групп выполнялось с использованием параметрического метода проверки статистических гипотез - t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрических методов проверки статистических гипотез — критерии Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, Вальда-Вольфовица В сравнении двух зависимых групп применялся параметрический метод — t-критерий для зависимых выборок и непараметрический метод - вычисление критерия Вилкоксона Сравнение групп по качественному признаку реализовалось с метода - х2 по Пирсону Для описания взаимосвязи признаков допускались методы параметрического корреляционго-го анализа Пирсона (г) и непараметрические методы Спирмена (г), Кендала (т) Критический уровень статистической значимости (р) принимался равным 0,05 [Реброва О Ю., 2002] Единицы измерений приведены в системе СИ

Результаты исследования и их обсуждение. Для решения поставленных задач нами было обследовано 132 ребенка с ИМ в возрасте от 3-х до 14 лет Среди обследованных больных преобладали дети в возрасте 3-7 лет - 61,4%, дети 7-14 лет составили 38,6% Среднетяжелая форма болезни отмечена в 48,5% (64 больных), тяжелая в 51,5% (68 детей)

Основной клинический симптомокомплекс ИМ сохранял свои типичные черты и соответствовал данным предыдущих исследователей [Чи-решкина Н М, 1973, Гаспарян М.0, 1975, Царькова С А, 1987, Сабурова

Е Б , 2000] У больных отмечались повышение температуры тела до феб-рильных (89,9%) или субфебрильных (10,1%) цифр, лакунарная ангина (95%), проявления инфекционного токсикоза (87,1%), увеличение лимфатических узлов шейной группы (97,8%), затруднение носового дыхания (88,5%), увеличение печени (78,4%) и селезенки (66,2%)

Со стороны биохимических показателей регистрировалось увеличение активности трансаминаз - 52,2% (69 человек) и повышение тимоловой пробы 89,3% (118 детей)

В периферической крови наблюдалось нарастание количества лимфоцитов, появлялись атипичные мононуклеары (р<0,05)

Иммунологическое обследование позволило выявить в острый период болезни увеличение популяции Т - лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов, натуральных киллеров (р<0,05) (рис 2 )

Рис 2 Относительные показатели гемо- и иммунограммы в острый период ИМ (по отношению к норме)

Проведенное нами впервые при ИМ исследование субпопуляций СОЗ+- лимфоцитов, содержащих в цитоплазме провоспалительные (№Ыу, 1Ь2, ТЫРа) и противовоспалительные (1Ь4) цитокины, позволило установить, что общей закономерностью иммунологической перестройки субш-пуляции СОЗ - клеток в острый период ИМ является увеличение числа СОЗ+- лимфоцитов спонтанно продуцирующих №N7, 1Ь2, Т№а, 1Ь4 и

I БН

ЬЕи

■ 3-7 лет тяжелая форма (п=31) □ 3-7 лет средней тяжести (п=18) а 3-7 лет норма

—сйу—ч^г&е--

■ 7-14 лет тяжелая форма (п=17) И 7-14 лет средней тяжести (п=22) 07-14 лет норма

CD3+- лимфоцитов, секретирующих IFNy, TNFa, IL4 в ответ на стимуляцию in vitro и снижение коэффициента стимуляции CD3+/TNFa+, CD3+/IL4+, CD3+/IL2+- клеток по сравнению с нормативными значениями (р<0,05) (рис. 3.)

Одновременно с реакцией клеточного иммунитета при ИМ выявлялись изменения в гуморальном звене. Отмечено снижение численности В -лимфоцитов (р<0,05) Параллельно с нарастанием уровня IgA, IgM, IgG (р<0,05), определялось повышение ЦИК (р<0,05) Проведенный корреляционный анализ выявил прямую зависимость между IgM и ЦИК (г=0,56, р<0,05) и IgG и ЦИК (г=0,77, р<0,05), которая не исключает участие обоих классов иммуноглобулинов в формировании циркулирующих иммунных комплексов при ИМ.

Развитие острого воспалительного процесса при изучаемой инфекции сопровождалось изменениями неспецифического звена иммунитета, регистрировалось увеличение общего числа моноцитов и повышение их поглотительной активности (р<0,05)

Установлены положительные корреляционные связи между CD8+-лимфоцитами и моноцитами (г=0,82, р<0,05), CD8+- лимфоцитами и фагоцитарной активностью моноцитов (г=0,75, р<0,05), которые отражали кооперативное взаимодействие между клеточным и фагоцитарным звенм-ми иммунитета в ходе иммунного ответа при ИМ

Выявленная прямая корреляционная зависимости между количеством цитотоксических лимфоцитов и активностью AJIT (i=0,65, р<0,47) и уровнем ЦИК и активностью АЛТ (г=0,55, р<0,05), не позволяет исключить, как повреждающее действие CD8+- лимфоцитов на мембрану гепато-цитов, так и иммунокомплексный механизм повреждения мембран гепато-цитов

И ТЯЖЕЛАЯ )пИ7| ■ СРЕДНЕЙ ТЯЖЕСТИ (n=l!i) Н ТЯЖЕЛАЯ (П=Э1) ■СРЕДНЕЙ ТЯЖЕСТИ (п-19)

Рис. 3. Относительные показатели г;итоплазматических цнтокияов в острый период ИМ (по отношению к норме)

1'яжелую форму ИМ независимо от возраста отличала большая степень выраженности и большая продолжительность основных клинических симптомов: лихорадки (р<0.001), ангины (р<0,001), лимфоаденопатии (р<0,001), гепатоспленомегалии (р<0,001). Уровень АЛТ и ACT (р<0,05), количество атипичных мононуклеаров и моноцитов (р<0,05) , значения фагоцитарной активности моноцитов, С ОЙ'- лимфоцитов {р<0,05), CD3*-лимфоцитов содержащих IFNy, IL4 и IL2 при спонтанной к стимулированной секреции были выше, чем при йреднетяжелой форме (р<0,05). Кооперация между фагоцитарным и клеточным звеном иммунитета при тяжелой форме болезни наступала с опозданием, положительные корреляционные связи между CD8+- лимфоцитами и моноцитами (r=0,82, р<0,05), CDS -лимфоцитами и числом активно фагоцитирующих моноцитов (г=0,75, р<0,05) Определялись, начиная со второй недели заболевания.

Возрастные особенности клинической картины ИМ, характеризовались большей частотой встречаемости i-епатолиенального синдрома при среднетяжелой форме у детей 3-7 лет (86,5%) по сравнению с 33,3% в группе 7-14 лет (р<0,05). Экзантема при тяжелой форме болезни в 2,4 раза

чаще регистрировалась у детей 7-14 лет (р<0,05) Повышение активности печеночных трансаминаз чаще определялось у детей 7-14 лет (р<0,05), в этой же возрастной группе отмечались более высокие значения уровней ACT и AJIT при тяжелой форме заболевания (р<0,05)

В иммунном статусе детей 3-7 лет в острый период ИМ наблюдалось снижение количества В - лимфоцитов (р<0,05), низкие значения спонтанного и стимулированного НСТ - теста (р<0,05) и стимулированной цитокинпродуцирующей способности CD3+/IL2+- лимфоцитов (р<0,05)

Период реконвалесценции ИМ характеризовался положительной динамикой со стороны основных клинических симптомов, но у части детей, перенесших тяжелую форму, сохранялись изменения со стороны лимфо-идной ткани в виде увеличения лимфатических узлов (18,7%) и ретикулярной ткани, которые проявлялись гепатолиенальным синдромом (15,1%)

Независимо от возраста и формы тяжести нормализации показателей периферической крови и фагоцитарного звена иммунитета не происходило, число лимфоцитов и моноцитов превышало нормативные значения (р<0,05), определялись атипичные мононуклеары (р<0,05), выявлялась гранулоцитопения (р<0,05) Помимо уменьшения общего количества гра-нулоцитов отмечалось снижение их функциональной активности, которое проявлялось угнетением фагоцитарной активности нейтрофилов (р<0,05) Сохранялась высокая фагоцитарная активность моноцитов (р<0,05)

Значения CD3+, CD8+, CD16+- лимфоцитов оставались выше нормативных (р<0,05) Количество CD3+- лимфоцитов, продуцирующих цито-кины (IFNy, IL4, TNFa) при спонтанном синтезе и в ответ на стимуляцию было повышено, регистрировалось снижение коэффициента стимуляции CD3+/IFNy+, CD3+/IL2+, CD3+/TNFa+- лимфоцитов

Тяжелую форму ИМ в период реконвалесценции от среднетяжелой отличали более высокие значения лейкоцитов, лимфоцитов (р<0,05), популяции CD3+ и CD8+- лимфоцитов (р<0,001), фагоцитарной активности

моноцитов (р<0,05), низкий уровень гранул оциго в (р<0,05) и повышенный уровень CD3 7lFNyT И CD3 7lL2+- клеток (р<0,05) (рис, 4.),

-1—г*

£ г> 5 с 5 f, 5 J; ; 3 Ь*

I g ï i1 Î 3 3 3 5 J -1

В ТЯЖЕЛАЯ |п=31) ИСРЁДНЕИ ТЯЖЕСТИ (п=1В) В ТЯЖЁЛАЯ (п=17) 1СРЁДНЁЙ ТЯЖЕСТИ (п=22]

Рис. 4. Относительные показатели пито плазматических цитокинов в период реконва-лесценшш ИМ (по отношению к норме)

Дети 3-7 лет в период реконвалесценции имели низкие значения спонтанного и стимулированного ИСТ - геста (р<0,05 по сравнению с нормой). Так как у детей данного возраста регистрировалось снижение не только общего числа гранулопитов, поглотительной функции пейтрофи-лов. но и их резервных возможностей (реакции в ответ на стимуляцию) и метаболической активности они являются группой риска но развитию бактериальных осложнений.

Индекс поляризации, отражающий преимущественную направленность иммунного ответа, в период реконвалесценции имел положительные значения при сред нетяже л ой форме ИМ в группе детей 3-7 лет и при тяжелой форме у детей 7-14 лет, что свидетельствовало о преобладании кле-точно-опосредованных механизмов иммунного ответа. Отрицательные значения ИП регистрировались при тяжелой форме у детей 3-7 лет и сред-нетяжелой форме в группе детей 7-14 лет и указывали на преобладание гуморального иммунитета.

По мнению некоторых авторов, дисбаланс субпопуляций Thl/Th2 клеток в сторону Th2, приводит к персистентному течению инфекции, в то время как преобладание цитокинов Thl лимфоцитов ведет к циклическому течению болезни [Иванова В В , 2005, Julius М et al, 1993] Таким образом, формирование персистирующей EBV - инфекции можно ожидать у детей 3-7 лет, перенесших тяжелую форму и 7-14 лет среднетяжелую форму ИМ

Т о комплексное клинико-иммунологическое исследование позволило выявить основные механизмы адаптивно-компенсаторной реакции при ИМ у детей В ответ на внедрение EBV происходит активация клеточного иммунитета, что проявляется увеличением числа цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров, повышается синтез, как провоспали-тельных, так и противовоспалительных цитокинов CD3+- лимфоцитами В результате лизиса CD8+- и CD16+- лимфоцитами инфицированных EBV клеток, развивается вирусемия, с последующей нейтрализацией вируса специфическими антителами, повышается уровень IgM, IgG, формируется большое количество циркулирующих иммунных комплексов. Развитию иммунокомплексного процесса препятствует активация моноцитарно-макрофагального звена иммунитета, в результате чего образовавшиеся циркулирующие иммунные комплексы элиминируются макрофагами, что способствует выздоровлению (рис 5 )

Нарушения иммунного гомеостаза при ИМ, снижение функциональной активности Т — лимфоцитов диктуют использование в комплексной терапии больных иммуноориентированных лекарственных средств, сго-собствующих коррекции дисбаланса различных звеньев иммунитета

В нашей работе с целью иммунокоррекции использовался индуктор эндогенного интерферона анаферон детский в острый период заболевания

Независимо от возраста и формы тяжести при использовании анафе-рона детского получен положительный клинический эффект, который за-

ключался в сокращении продолжительности лихорадки и ангины (р<0,05)

Гипертрофия лимфоидных органов

Лихорадка

Гепатолие-

нальный

синдром

СМ) ( 1ЧК

Рис 5 Схема иммунопатогенеза ИМ

Дети, получавшие анаферон детский, имели более высокий уровень гранулоцитов, фагоцитарной активности нейтрофилов и СОЗ'/ШКу+-лимфоцитов по сравнению с детьми, получавшими базисную терапию (р<0,05) и более низкие значения ЦИК и СБЗ+/1Ь4+- лимфоцитов (р<0,05), а так же положительные значения индекса поляризации

Более высокие значения СОЗ+/1РИ7+- лимфоцитов у детей основной группы и положительные значения индекса поляризации в данной группе детей свидетельствуют о направленности иммунного ответа по ТЫ типу. Низкие показатели ЦИК у детей основной группы по сравнению с кон-

трольной косвенно могут свидетельствовать об активирующем влиянии анаферона детского на элиминационную функцию макрофагов Более высокий уровень гранулоцитов и фагоцитарной активности нейтрофилов в период реконвалесценции у детей, получавших анаферон детский, способствует предотвращению развития бактериальных инфекций Поэтому, анаферон детский может стать альтернативой антибактериальным препаратам при ИМ

Согласно литературным данным основным патогенетическим механизмом осложненного, затяжного или хронического течения инфекций является неэффективность клеточной формы иммунной защиты, обусловленная супрессией макрофагального звена и нарушением активации и пролиферации ТЫ- подобных клонов Т - лимфоцитов [Иванова В В , 2005, Миш М й а1, 1993] Следовательно, использование анаферона детского в острый период ИМ предотвращает развитие бактериальных осложнений и формирование затяжного и хронического течения болезни

Выводы:

1 Основной клинический симптомокомплекс инфекционного мою-нуклеоза сохраняет типичные черты и разворачивается на первой -второй неделе заболевания Особенностью клинической картины инфекционного мононуклеоза у детей 3-7 лет является большая частота встречаемости гепатолиенального синдрома, у детей 7-14 лет чаще наблюдаются экзантема и повышение активности печеночных трансаминаз.

2 При инфекционном мононуклеозе независимо от возраста больных и формы тяжести на протяжении всего периода наблюдения отмечается повышение фагоцитарной активности моноцитов, в период рекш-валесценции — снижение фагоцитарной активности нейтрофилов, дети 3-7 лет в острый период и период реконвалесценции имеют низ-

кие значения спонтанного и стимулированного НСТ - теста

3. Общей закономерностью иммунологической перестройки субпогу-ляции CD3+- клеток в острый период инфекционного мононуклеоза и период реконвалесценции является увеличение числа CD3+-лимфоцитов спонтанно продуцирующих IFNy, IL2, TNFa, IL4 и CD3+- лимфоцитов, секретирующих IFNy, TNFa, IL4 в ответ на стимуляцию in vitro и снижение коэффициента стимуляции CD3+/TNFa+, CD3+/IL4+, CD3+/IL2+- клеток по сравнению с нормативными значениями

4 Взаимосвязь между показателем фагоцитарной активности моноцитов и числом CD8+- лимфоцитов не зависит от возраста и устанавливается при среднетяжелой форме на первой неделе, при тяжелой форме на второй неделе острого периода инфекционного мононуклеоза

5 Использование анаферона детского в комплексной терапии острого периода инфекционного мононуклеоза приводит к сокращению продолжительности лихорадки, ангины, снижению уровня циркулирующих иммунных комплексов, увеличению числа CD3+- лимфоцитов, продуцирующих IFNy, гранулоцитов, активно фагоцитирующих нейтрофилов

Практические рекомендации:

1 Дети 3-7 лет, перенесшие тяжелую форму инфекционного мононуклеоза и 7-14 лет - среднетяжелую форму, являются группой риска по формированию персистирующей EBV-инфекции, что является показанием к иммунологическому обследованию и назначению иммуно-корригирующей терапии

2 Развитие бактериальных осложнений инфекционного мононуклеоза наиболее вероятно у детей 3-7 лет, что требует настороженности со стороны педиатра

3 В острый период инфекционного мононуклеоза, учитывая снижение функциональной активности СОЗ'- лимфоцитов, рекомендовано использование совместно с ацикловиром индуктора интерферона -анаферон детский

4 Реконвалесцентам инфекционного мононуклеоза показано проведение иммунокорригирующей терапии, в связи со снижением функционального состояния клеточного звена и нейтрофилов

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Тункина Е Е Оценка эффективности анаферона при лечении детей, больных тяжелыми формами инфекционного мононуклеоза // Материалы 59-й межвуз научн -практ конф молодых ученых и студентов смеждунар участием - Екатеринбург 2004 -С 136-137

2 Тункина Е Е. Использование нестероидных противовоспалительных препаратов в комплексной терапии инфекционного мононуклеоза / Е.Е Тункина, Н.Е Сергеева Н Материалы 59-й межвуз научн -практ конф молодых ученых и студентов с междунар участием- Екатеринбург 2004 - С 138

3 Анаферон и циклоферон в комплексной терапии инфекционного мононуклеоза у детей / ВВ. Фомин, ЕЕ Тункина, ЕБ Сабурова, ИЮ Горелышева, ЮГ Лагерева // Инфекционные заболевания у детей проблемы, поиски, решения Материалы Всероссийской научно-практической конференции -СПб, 2004 — С147

4 Фомин В В Клинико-иммунологическая оценка эффективности анаферона в комплексной терапии инфекционного монэнуклеоза у детей / В В Фомин, Е Е Тункина, Е Б. Сабурова, Ю Г Лагерева, И Ю Го-

релышева// Russian Journal of Immunology Тез докл объедин имму-нол форума-2004 - Vol 9 suppl. 1-Р 185

5 Фомин В В Функциональное состояние фагоцитарного звена иммунитета при инфекционном мононуклеозе / В В Фомин Е Е Тункина И.Ю Горелышева Ю Г Лагерева // Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей (инфекция и иммунитет). Материалы Третьего Конгр. детских инфекционистов. M , 2004 — С 245

6 Тункина Е Е Клинические особенности инфекционного мононуклео-за у подростков /ЕЕ Тункина, H А Бацкалевич, И Ю Горелышева, Е К Шемякина // Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей (инфекция и иммунитет)- Материалы Третьего Конгр детских инфекционистов M, 2004 - С 232

7. Опыт применения ацикловира и анаферона детского при инфекциш-ном мононуклеозе у детей / В.В Фомин, Е Е Тункина, И Ю Горелышева, Ю Г. Лагерева, Е Б Сабурова, Е.Ю Старокорова, H А Бацкалевич // Вестник Уральской Государственной Медицинской Академии -2004 - Выпуск 14- С 54-56

8. Фомин В.В Состояние цитокиновой системы при инфекционном ш-нонуклеозе у детей и обоснование иммунокорригирующей терапии в острый период заболевания / В.В Фомин. Я Б Бейкин, Е Е Тункина, Ю Г. Лагерева // Актуальные проблемы лабораторной диагностики и клинической иммунологии инфекционных и соматических заболеваний: Сб науч. тр - Екатеринбург, 2005 -С 185-190

9 Тункина ЕЕ Состояние цитокиновой системы при инфекционном мононуклеозе у детей /ЕЕ Тункина, Ю Г Лагерева // Материалы 60-й межвуз научн.-практ конф молодых ученых и студентов - Екатеринбург 2005 - С. 137-138

10 Патогенетическое обоснование иммунокорригирующей терапии при инфекционном мононуклеозе у детей / ВВ. Фомин, ЕЕ Удилова,

Я Б Бейкин, Ю Г Лагерева // Детские инфекции - 2006 - № 3 - С 23-26.

11 Фомин В В Состояние цитокиновой системы и применение анаферо-на при инфекционном мононуклеозе у детей / В В Фомин Е Е Уда-лова, Ю Г Лагерева // Сборник материалов XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Тез докл - М, 2006 - С 315

12.0 возможных механизмах гиперчувствительности немедленного типа при инфекционном мононуклеозе у детей / В.В Фомин, Е Е Удилова // Уральский медицинский журнал -2007 -№3 ~С 14-20

Подписано в печать 31.08.2007. Формат бумаги 60x84. Бумага для множи тельных аппаратов. Печать плоская Усл., печ. л. 1*5 Заказ 290 Тираж 100 экз. "Издательство

Уральского государственного экономического университета _Екатеринбург, ул. 8 Марта /Народной воли, 62/45_

ПОП УрГЭУ Уральский государственный

Экономический университет

Вирус Эпштейн-Барр (EBV) является одним из самых распространенных вирусов известных на сегодняшний день. До 90% населения инфицированы EBV [87, 174].

Доказана роль латентной EBV-инфекции для группы незлокачественных лимфопролиферативных заболеваний, к которым относятся Х-сцепленный лимфопролиферативный синдром, хроническая активная EBV-инфекция и острый EBV-ассоциированный гемофагоцитарный лимфогистгоцитоз [111,

137, 151].

Имеется достоверная связь EBV с рядом злокачественных новообразований, таких как лимфома Беркитта, назофарингеальная карцинома [114, 129].

Предполагают, что EBV может быть причиной развития внутриутробных аномалий [4, 7, 151].

Благодаря научным достижениям, в последние годы углубились представления об этиологии и патогенезе, предложены новые методы лабораторной диагностики и лечения инфекционного мононуклеоза [74, 87, 91, 157, 195].

Многими авторами инфекционный мононуклеоз рассматривается как болезнь иммунной системы, так как EBV обладает тропностью к иммунокомпе-тентным клеткам [130, 159, 181, 191].

Способность EBV к персистенции обусловлена большим набором генов, дающих ему возможность избегать иммунного контроля организма [112, 136,

138, 185].

Опубликованные данные о роли Т-клеточного, фагоцитарного и гуморального звеньев иммунной системы в иммунопатогенезе инфекционного мононуклеоза довольно противоречивы. Описано как угнетение, так и активация CD3, CD4, CD8 лимфоцитов под действием EBV вируса [127, 167, 175, 182, 189]. Недостаточно информации о роли CD3-лимфоцитов, содержащих эндо-плазматические цитокины: IFNy, IL2, TNFa, IL4 в иммунологической перестройке при инфекционном мононуклеозе у детей, отсутствуют единые подходы к использованию иммунокорригирующих препаратов в острый период заболевания, нет сведений о сочетанном использовании противовирусной и иммунокорригирующей терапии, что и послужило основанием для проведения настоящей работы.

Цель исследования: выявить клинические особенности, иммунопатоге-нетические закономерности взаимосвязи фагоцитарного и клеточного звеньев иммунной системы при инфекционном мононуклеозе у детей и оценить влияние анаферона детского на клинические и иммунологические показатели при изучаемой инфекции.

Задачи исследования:

1. Изучить клинику инфекционного мононуклеоза у детей разных возрастных групп в острый период и период ранней реконвалесценции при тяжелой и среднетяжелой форме болезни.

2. Исследовать функциональные параметры нейтрофилов и моноцитов по данным фагоцитарной активности, бактерицидной активности фагощтов, спонтанного и стимулированного НСТ - теста в зависимости от возраста и формы тяжести инфекционного мононуклеоза.

3. Выявить особенности функционального состояния CD3 лимфощтов, содержащих эндоплазматические цитокины: IFNy, IL2, TNFa, IL4 при изучаемой инфекции.

4. Установить закономерности взаимосвязи фагоцитарного и клеточного звеньев иммунитета в динамике болезни с учетом тяжести заболевания и возраста.

5. Оценить клиническую и иммунологическую эффективность применения анаферона детского при инфекционном мононуклеозе.

Научная новизна исследования.

В отличие от ранее опубликованных данных, в работе, представлена динамика содержания CD3 — лимфоцитов, продуцирующих цитоплазматические цитокины (IFNy, IL2, TNFa и IL4) при спонтанном синтезе и в ответ на стимуляцию на протяжении трех недель болезни.

Несмотря на клиническое выздоровление, численность субпопуляций Т-лимфоцитов, продуцирующих провоспалительные (IFNy, IL2, TNFa) и противовоспалительные (IL4) цитокины оставалась выше нормативной, что не исключает активность инфекционного процесса. Данный феномен не зависит от возраста детей и формы тяжести болезни и отражает одну из общих иммунологических закономерностей.

Инфекционный процесс при инфекционном мононуклеозе не зашсит от формы тяжести болезни и возраста и сопровождается высокой фагоцитарной активностью моноцитов и высокими показателями цитотоксических лимфоцитов, что обеспечивает благоприятное течение болезни.

Обоснована целесообразность использования сочетанной терапии ана-фероном детским и ацикловиром при инфекционном мононуклеозе у детей.

Практическая значимость работы.

В результате проведенного исследования, выявлены нарушения иммунного гомеостаза при инфекционном мононуклеозе в острый период и период ранней реконвалесценции независимо от возраста больных и формы тяжести заболевания, которые являются показанием к назначению иммунокорриги-рующих препаратов.

Для ускорения клинического выздоровления и коррекции иммунологических нарушений предложено использование анаферона детского совместно с ацикловиром в острый период инфекционного мононуклеоза.

Установлено, что дети 3-7 лет больные тяжелой и 7-14 лет среднетяжелой формой инфекционного мононуклеоза являются группой риска по разштию бактериальных осложнений, так как имеют низкие показатели нейтро-фильного фагоцитоза в острый период и период ранней реконвалесценции.

В качестве альтернативы антибактериальным препаратам предложено использование анаферона детского с учетом его стимулирующего действия на нейтрофильный фагоцитоз.

Положения выносимые на защиту:

1. Общей иммунологической закономерностью инфекционного моюнуклеоза у детей является повышение численности лимфоцитов, моноцитов, CD3+ -лимфоцитов, CD8 - лимфоцитов, высокие показатели фагоцитарной активности моноцитов и субпопуляций CD3+ - лимфоцитов, содержащих цито-плазматические цитокины (IFNy, TNFa, IL4) при спонтанном и стимулированном их определении.

2. Содружественная синергическая реакция между активно фагоцитирующими моноцитами и CD8 — лимфоцитами независимо от возраста регистрируется на первой неделе при среднетяжелой форме и на второй неделе при тяжелой форме болезни.

3. Применение анаферона детского в острый период инфекционного мононус-леоза ускоряет клиническое выздоровление, приводит к увеличению CD3 /IFNy - клеток, фагоцитарной активности нейтрофилов и способствует снижению уровня циркулирующих иммунных комплексов.

Апробация работы.

Основные положения диссертации обсуждены на научно-практических конференциях МУ ГКБ №40 совместно с кафедрой детских инфекционных болезней и клинической иммунологии, 59-й Межвузовской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. Апробация работы проведена на заседании проблемной комиссии по специальности «Педиатрия» в ГОУ ВПО УГМА Росздрава. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Внедрение.

Результаты исследования внедрены в работу боксового отделения МУ ГКБ №40 и поликлинических отделений детских больниц г. Екатеринбурга. Результаты исследования включены в учебно-методическое пособие для врачей «Стандарты диагностики и лечения инфекционных болезней у детей на этапах оказания медицинской помощи» (Екатеринбург, 2006). Материалы работы используются в учебном процессе кафедрой детских инфекционных болезней и клинической иммунологии ГОУ ВПО УГМА Росздрава.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка основной использованной литературы, включающего 201 источник, в том числе 95 отечественных и 106 зарубежных. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 49 рисунками.

выводы

1. Основной клинический симптомокомплекс инфекционного мононуклеоза сохраняет типичные черты и разворачивается на первой - второй неделе заболевания. Особенностью клинической картины инфекционного мононуклеоза у детей 3-7 лет является большая частота встречаемости гепато-лиенального синдрома, у детей 7-14 лет чаще наблюдаются экзантема и повышение активности печеночных трансаминаз.

2. При инфекционном мононуклеозе независимо от возраста больных и формы тяжести на протяжении всего периода наблюдения отмечается повышение фагоцитарной активности моноцитов, в период рекснвалесценции ч снижение фагоцитарной активности нейтрофилов; дети 3-7 лет в острый период и период реконвалесценции имеют низкие значения спонтанного и стимулированного НСТ-теста.

3. Общей закономерностью иммунологической перестройки субпопуляции CD3+ - клеток в острый период инфекционного мононуклеоза и период реконвалесценции является увеличение числа CD3+ — лимфоцитов спонтанно продуцирующих IFNy, IL2, TNFa, IL4 и CD3+ - лимфоцитов, секретирую-щих IFNy, TNFa, IL4 в ответ на стимуляцию in vitro и снижение коэффициента стимуляции CD3+/TNFa+, CD3+/IL4+, CD3+/IL2+ - клеток по сравнению с нормативными значениями.

4. Взаимосвязь между показателем фагоцитарной активности моноцитов и числом CD8 - лимфоцитов не зависит от возраста и устанавливается при среднетяжелой форме на первой неделе, при тяжелой форме на второй неделе острого периода инфекционного мононуклеоза.

5. Использование анаферона детского в комплексной терапии острого периода инфекционного мононуклеоза приводит к сокращению продолжительности лихорадки, ангины, снижению уровня циркулирующих иммунных комплексов, увеличению числа CD3 - лимфоцитов, продуцирующих IFNy, гранулоцитов, активно фагоцитирующих нейтрофилов.

- 137

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Дети 3-7 лет, перенесшие тяжелую форму инфекционного мононуклеоза и 7-14 лет - среднетяжелую форму, являются группой риска по формированию персистирующей EBV-инфекции, что является показанием к иммунологическому обследованию и назначению иммунокорригирующей терапии.

2. Развитие бактериальных осложнений инфекционного мононуклеоза наиболее вероятно у детей 3-7 лет, что требует настороженности со стороны педиатра.

3. В острый период инфекционного мононуклеоза, учитывая снижение функциональной активности CD3+ лимфоцитов, рекомендовано использование совместно с ацикловиром индуктора интерферона -анаферон детский.

4. Реконвалесцентам инфекционного мононуклеоза показано проведение иммунокорригирующей терапии, в связи со снижением функционального состояния клеточного звена и нейтрофилов.

- 138