Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Клиническое значение полиморфизма генов цитокинов и гена гемохроматоза у больных хроническим гепатитом С

08-3

--/ с-с... \ ?

107 х ^

/и, с

На правах рукописи

Абдуллаев Санджар Мухудинович

Клиническое значение полиморфизма генов цитокинов и гена гемохроматоза у больных хроническим гепатитом С

14.00.05 - внутренние болезни 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2008

Работа выполнена в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова и ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова Росздрава.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Мухин Николай Алексеевич

кандидат медицинских наук, доцент Самоходская Лариса Михайловна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Моисеев Валентин Сергеевич

доктор медицинских наук Ижевская Вера Леонидовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова Росздрава

Защита состоится «ЛЗ» 0£ 2008 года в (3 часов ОС мин. на заседании диссертационного Совета Д.208.040.05 при ГОУ ВПО Московская медицинская Академия им. И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «4у> 2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Волчкова Елена Васильевна

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

2008 _____

Актуальность темы. Прогноз хронического гепатита С (ХГС), являющегося наиболее частой причиной развития цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) (Alberti A, Benvegnu L, 2004), а также ведущим показанием к трансплантации печени (Shiffman ML, Saab S., 2006), определяется темпом прогрессирования фиброза или развитием тяжелых внепеченочных проявлений и характеризуется значительными индивидуальными различиями (Benvegnü L, Gios М., 2004). Известно, что у 20-30% больных ХГС существует риск развития ЦП в течение 20-30 лет от момента инфицирования, и, в то же время, у значительной части пациентов с HCV-инфекцией формирования ЦП не происходит на протяжении всей жизни (Игнатова Т.М., 2000; Thomson BJ, Finch RG., 2005). Гетерогенность клинических проявлений и темпов прогрессирования фиброза печени при ХГС обусловливают сложность определения индивидуального прогноза заболевания и выбора тактики ведения больных.

В исследованиях, проведенных за два десятилетия с момента идентификации HCV, было установлено, что помимо целого ряда хорошо известных вирусных и внешних факторов, несомненная роль в определении течения и исходов ХГС принадлежит факторам хозяина (Огурцов П.П., Карпов В.В., 2000; Сторожаков Г.И., Никитин И.Г., 2000; Ивашкин В.Т., Павлов Ч.С., 2001; Alberti A., Vario А., 2005). Особое значение в работах последних лет отводится изучению генетического полиморфизма, играющего ключевую роль в определении индивидуальных особенностей ответа на один и тот же этиологический фактор (Bataller R., Brenner D.A., 2005). Среди генетических факторов хозяина у больных ХГС большинство исследований посвящено изучению однонуклеотидного полиморфизма (SNP) -наиболее распространенной формы индивидуальной генетической вариабельности. Однонуклеотидный полиморфизм в ряде случаев сопряжен с увеличением или уменьшением концентрации/активности продукта гена. Принимая во внимание решающее значение иммунных механизмов и интенсивности оксидативного стресса в прогрессировании фиброза печени и формировании ответа на противовирусную терапию (ПВТ), наиболее широко обсуждаемыми генами-кандидатами являются гены цитокинов и гемохроматоза (Bataller R., Brenner D.A., 2005). При этом

считается, что доминирование провоспалительных цитокинов ассоциировано с быстрым прогрессированием фиброза и лучшим ответом на ПВТ, тогда как преобладание противовоспалительных - с медленным накоплением фиброза и более низкой эффективностью ПВТ (Cecere A, Marotta F, 2004; Neuman MG, Sha К., 2007).

В литературе представлено большое число исследований, посвященных поиску взаимосвязи между аллельными вариантами генов-кандидатов и темпами прогрессирования фиброза печени, а также со спонтанным клиренсом вируса и ответом на ПВТ (Powell Е.Е., Edwards-Smith C.J., 2000; Gewaltig J., Mangasser-Stephan K., 2002; di Giovine F.S., Takhsh E., 2005). Вместе с тем, до настоящего времени убедительные данные об ассоциации однонуклеотидных замен с особенностями течения ХГС получены только для малого числа полиморфизмов. Разноречивость опубликованных работ во многом связана с неодинаковыми критериями включения/исключения больных, изучением различных популяций и обследованием сравнительно небольших групп больных, что увеличивает вероятность получения ложных корреляций (Newton-Cheh С, Hirschhorn, 2005). В большинстве работ по определению клинической значимости генетического полиморфизма изучаются больные, имеющие дополнительные факторы прогрессирования фиброза печени (в т.ч. алкоголь) (Richardson MM, Powell ЕЕ., 2005), отсутствует оценка влияния на результаты исследования других факторов хозяина и вируса, длительности заболевания (Bahr M.J., el Menuawy М., 2003; Tanaka Y., Furuta Т., 2003), и только в единичных работах проводится анализ комбинации генетических факторов (Richardson MM, Powell ЕЕ., 2005). Особо следует отметить крайнюю немногочисленность отечественных работ по изучению генетического полиморфизма при заболеваниях печени, которые представлены исследованиями по установлению генетических маркеров быстрого развития цирроза печени у пациентов с HCV-инфекцией (Romanov А.О., Belyaeva T.V., Esaulenko E.V., 2006) или у лиц, злоупотребляющих алкоголем (Моисеев B.C., Огурцов П.П., 2002; Русакова О.С., Гармаш И.В., 2006).

Таким образом, разноречивость результатов исследований, в том числе вследствие различной популяционной распространенности аллельных вариантов

генов цитокинов и гемохроматоза, а также ограниченность данных по российской популяции определили актуальность и необходимость проведения работы по выявлению аллельных вариантов генов-кандидатов, ассоциированных с особенностями течения и прогнозом ХГС.

Цель исследования: определить клиническую и прогностическую значимость носительства аллельных вариантов генов цитокинов и гена гемохроматоза, а также их влияние на результат противовирусной терапии у больных ХГС. Задачи исследования:

1. Исследовать распространенность генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов цитокинов (-511 С/Г гена IL-lb; -1082 G/A гена IL-10; -238 G/A гена TNF; -174 G/C гена IL-6 и +915 G/C гена TGF-Ы) и гена гемохроматоза (C282Y и H63D) в российской популяции и у больных ХГС.

2. Проанализировать особенности клинико-лабораторной картины у больных ХГС в зависимости от носительства определенных аллельных вариантов исследованных генов цитокинов и гена гемохроматоза.

3. Определить взаимосвязь между полиморфными маркерами исследованных генов и темпом прогрессирования фиброза у больных ХГС.

4. Исследовать ассоциацию между генетическим полиморфизмом и эффективностью противовирусной терапии.

Научная новизна. Впервые в России проведено клинико-лабораторное и морфологическое исследование значительной по численности выборки больных ХГС, имеющих разный темп прогрессирования фиброза печени, с определением у них частоты генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов цитокинов (IL-lb -511 С/Т; IL-10 -1082 G/A; TNF -238 G/A; IL-6 -174 G/C и TGF-bl +915 G/C) и гена гемохроматоза (HFE C282Y и HFE H63D). Впервые на большой группе здоровых доноров изучена распространенность генотипов и аллелей полиморфизма вышеуказанных генов в российской популяции.

Охарактеризованы особенности клинихо-морфологической и лабораторной картины заболевания в зависимости от носительства полиморфных маркеров исследованных генов. Впервые показана взаимосвязь между развитием смешанной

криоглобулинемии (СКГ) и носительством больными ХГС генотипа гена 1Ь-10 -1082 вв; также впервые показана ассоциация между уровнем гликемии и полиморфизмом гена ТОР-Ы +915 в/С; индексом массы тела и полиморфизмом гена 1Ь-1Ь -511 ОТ.

Определены «профибротические» (1Ь-1Ь -511 СТ и -511 ТТ; 1Ь-6 -174 ОС и -174 СС; ТОР-Ы +915 вС и +915 СС; НРБ 63ГО и 63ББ) и «протективные» (1ЫЬ -511 СС и 1Ь-6 -174 вв) генотипы, ассоциированные соответственно с быстрым и медленным темпами прогрессирования фиброза печени. Показано, что комбинация «профибротических» и «протективных» генотипов является независимым фактором прогноза ХГС. Впервые среди отечественных работ продемонстрирована ассоциация генетического полиморфизма гена 1Ь-10 -1082 О/А с эффективностью противовирусной терапии.

Практическая значимость. Результаты проведенного исследования, позволившие выделить клинические и генетические факторы, влияющие на особенности течения ХГС, темпы прогрессирования заболевания и эффективность противовирусной терапии, имеют значение для оценки прогноза ХГС. Установлены генетические факторы, влияющие на особенности клинико-лабораторной картины ХГС, в том числе развитие СКГ. Разработана модель определения прогноза ХГС, основанная на анализе комбинации «протективных» и «профибротических» полиморфных маркеров генов цитокинов и гемохроматоза. Присвоение баллов «протективным» и «профибротическим» генотипам позволяет вычислить суммарный балл генетического профиля больных ХГС и по его значению прогнозировать течение заболевания: выделить больных с благоприятным прогнозом и больных, наиболее угрожаемых по развитию ЦП. Установлены клинические и генетические факторы, ассоциированные с низкой эффективностью противовирусной терапии. Проведенное исследование позволяет индивидуализировать тактику ведения больных ХГС, учитывая данные клинического и генетического обследования, а также разработать рекомендации по изменению образа жизни больными ХГС. Основные положения, выносимые на защиту.

1. У больных ХГС распространенность генотипа гена 1Ь-1Ь -511 СС (52,6%) достоверно выше, чем в популяции (40,6%; р=0,006), на основании чего можно предполагать, что носительство данного генотипа, ассоциированного с низкой продукцией провоспалительного цитокина ГЬ-1Ь, способствует хронизации НСУ-инфекции.

2. Больные ХГС с генотипом гена 1Ь-10 -1082 вв имеют повышенный риск развития СКГ; носители гетерозиготного генотипа гена 1Ь-1Ь -511 СТ имеют более высокий индекс массы тела, чем носители нормального (-511 СС) генотипа. У больных ХГС носительство генотипа гена ТОБ-Ы +915 йС сопряжено с более высоким уровнем гликемии, а наличие мутации гена гемохроматоза С282У (282 СУ генотип) - с повышенным содержанием сывороточного железа. Выявленные ассоциации имеют значение в понимании патогенеза ХГС и позволяют прогнозировать особенности клинического течения заболевания.

3. Определение генетического профиля, представляющего собой комбинацию генетических полиморфизмов, ассоциированных с быстрым (генотипы гена ГЬ-1Ь -511 СТ и -511ТТ; генотипы гена 1Ь-6 - 174 ОС и -174 СС; генотипы гена ТвР-М -+915 ОС и +915 СС; генотипы гена Н0?Е - бЗНГО и бЗБО), и медленным (генотип гена 1Ь-1Ь -511 СС; генотип гена 1Ь-б - 174 вО темпом накопления фиброза, позволяет прогнозировать течение ХГС - оценить риск формирования ЦП, что имеет значение для выбора тактики ведения больных.

4. Генетический полиморфизм гена 11,-10 -1082 в/А наряду с другими факторами хозяина определяет эффективность ПВТ. Генотип -1082 вв, ассоциированный с повышенной продукцией противовоспалительного цитокина 1Ь-10, является независимым предиктором отсутствия ответа на лечение или рецидива виремии. Генетический анализ, выявляющий носительство этого генотипа, целесообразно использовать в оценке прогноза эффективности противовирусного лечения. Внедрение результатов работы. Результаты настоящего исследования используются при обследовании и лечении больных ХГС в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней ММА им. И.М. Сеченова, включены в материалы лекционных курсов для студентов медико-профилактического

факультета, факультета подготовки научных и научно-педагогических кадров ММА им. И.М. Сеченова и факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова. Рекомендуется использовать полученные данные в планировании научных исследований по проблемам гепатологии, а практические рекомендации внедрить в практику специализированных отделений стационаров. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены 17 октября 200бг на заседании кафедры биологической и медицинской химии факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова и 15 февраля 2007г на совместном заседании кафедры терапии и профессиональных болезней медико-профилактического факультета ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава, академической группы академика РАМН H.A. Мухина, кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава, отдела нефрологии НИЦ ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава, кафедры внутренних болезней ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 170 страницах и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации и список литературы, состоящий из 54 отечественных и 267 иностранных работ. Работа проиллюстрирована 42 рисунками и 19 таблицами. База проведения исследований. Основными базами проведения исследования были кафедра терапии и профессиональных болезней медико-профилактического ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава и лаборатория генных и клеточных технологий кафедры биологической и медицинской химии ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материал исследования.

Обследовано 216 больных ХГС. В исследование включались проспективно все больные ХГС, поступающие в клинику для обследования и лечения, а также

ретроспективно из числа наблюдающихся амбулаторно. Из исследования исключались больные, употребляющие алкоголь, или имеющие другие дополнительные этиологические факторы поражения печени (коинфекция HBV, болезнь Вильсона-Коновалова, аутоиммунный гепатит, наследственный гемохроматоз), а также больные с ВИЧ-инфекцией и сахарным диабетом 1 и 2 типа.

Возраст больных колебался от 16 до 78 лет, продолжительность заболевания от предполагаемого момента инфицирования до включения в исследование варьировала от 1 года до 50 лет. Диагноз ХГС устанавливался на основании данных анамнеза, клинического обследования, результатов лабораторных методов диагностики, включая вирусологическое исследование (позитивные тесты на антитела к HCV и HCV RNA). Морфологическое исследование ткани печени с определением индекса гистологической активности и стадии фиброза (по RG Knodell) было проведено у 102 больных.

Для решения поставленных задач все обследованные больные ХГС были разделены на следующие группы:

1) для определения распространенности полиморфных маркеров исследованных генов у больных ХГС, а также для изучения взаимосвязи между аллельным полиморфизмом и особенностями клинико-лабораторной картины заболевания, нами были проанализированы данные всех 216 больных ХГС, включенных в настоящее исследование.

2) для определения взаимосвязи между полиморфными маркерами исследованных генов и темпами прогрессированием фиброза печени из 216 обследованных больных нами была сформирована группа из 120 пациентов, с известной стадией поражения печени и длительностью заболевания. На основании данных о длительности заболевания до проведения морфологического исследования (или установления диагноза ЦП) и выявленной стадии фиброза рассчитывался средний темп прогрессирования фиброза печени, представляющий собой отношение стадии фиброза к длительности болезни. У 37 больных было отмечено медленно прогрессирующее (средний темп прогрессирования фиброза 0,06 ед. фиброза/год) и у 83 больных - прогрессирующее (0,22 ед. фиброза/год) течение ХГС.

3) для определения ассоциации между носительством вариантных аллелей исследованных генов и эффективностью противовирусной терапии (ПВТ) нами была сформирована группа, состоящая из 59 больных с известным исходом лечения: 38 больных с устойчивым вирусологическим ответом и 21 больной с отсутствием ответа на лечение или рецидивом виремии после завершения терапии.

С целью определения распространенности полиморфизма генов цитокинов и гена гемохроматоза в российской популяции, а также подтверждения корректности генотипирования было обследовано 250 здоровых доноров, составивших контрольную группу, состоящую из лиц обоих полов, не имеющих маркеров ХГС и других этиологических факторов поражения печени. Этническая принадлежность больных ХГС и лиц в контрольной группе была одинаковой.

Методы исследования. 1. Клннико-лабораторное обследование.

Для сбора данных и их последующего анализа была разработана «карта обследования больного», включавшая жалобы, данные анамнеза заболевания и жизни, результаты проведенного лабораторного, инструментального и морфологического обследования, а также результат лечения больных. При анализе данных анамнеза жизни и заболевания особое внимание обращали на установление факта перенесенного острого' вирусного гепатита (ОВГ), желтушной формы ОВГ и наиболее вероятного фактора риска инфицирования, от которого производился отсчет длительности заболевания. У некоторых больных имело место несколько факторов риска инфицирования, при этом наиболее вероятным моментом инфицирования считалось воздействие, предполагающее максимальный обьем инфицирующего материала. В случае наличия нескольких одинаковых факторов риска (несколько гемотрансфузий), момент инфицирования рассчитывался как среднее между наиболее ранним и наиболее поздним фактором. Кроме того, больные тщательно расспрашивались относительно употребления алкоголя.

Клинико-лабораторное обследование включало проведение клинических анализов крови и мочи, биохимическое исследование сывороток крови в межклинической биохимической лаборатории ММА им. И.М. Сеченова (зав. - канд.

мед. наук Т.Н. Александровская), иммунологические исследования (межклиническая иммунологическая лаборатория ММА им. И.М. Сеченова, зав. - А.Г. Серова). Исследование антител к HCV и маркеров HBV (HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, HBcor IgM и HBcor суммарные) проводилось в межклинической иммунологической лаборатории ММА им. И.М. Сеченова; качественное и количественное исследование HCV RNA с генотипированием в лаборатории молекулярной диагностики ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (зав. - к.б.н. Г.А. Шипулин). Исследование уровня церулоплазмина сыворотки выполнялось всем больным моложе 40 лет.

2. Молекулярно-генетические методы.

Для определения генотипов изучаемых генов проводилось выделение ДНК из цельной венозной крови больных ХГС и доноров крови (контрольная группа) с последующим проведением амплификации определенных участков исследованных генов с помощью соответствующих праймеров. Для определения полиморфных аллелей генов цитокинов использовали метод полиморфизма длины рестриктных фрагментов (ПДРФ), а гена HFE - аллельспецифичную ПНР. Визуализация результатов и хранение результатов ПЦР и ПДРФ осуществлялись с помощью системы гель-электрофореза и цифрового фотографирования в УФ свете.

3. Статистическая обработка материала.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Достоверность различий оценивалась с помощью U-теста Манна-Уитни для независимых выборок в случае ненормального распределения последних. Для количественных признаков в случае нормального распределения достоверность различий оценивалась с помощью t - критерия. Статистическая значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивалась при помощи критерия %2 и точного критерия Фишера. Для оценки репрезентативности выборки контрольной группы и корректности определения полиморфных маркеров экспериментально определенные частоты генотипов и аллелей сравнивались с теоретически рассчитанными, исходя из уравнения Харди-Вайнберга. Темп убывания процента больных с I стадией фиброза и достижение ими П стадии рассчитывался с помощью теста выживаемости по Каплану-Мейеру (начальная точка -1 стадия фиброза, конечная точка - II стадия

фиброза). Кривые выживаемости разных групп больных сравнивали с помощью

теста log rank. Уровень значимости был принят как р<0,05. При р, лежащим в

пределах от 0,05 до 0,15, результат рассматривался как тенденция к различию. Для

статистической обработки был использован пакет программы Statistica 6.0 и SPSS 10.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Анализ распространенности полиморфных маркеров генов цитокинов и гена гемохроматоза у больных ХГС н в популяции.

Из 216 обследованных больных было 142 женщины (65,7%) и 74 мужчин

(34,3%). Средний возраст больных составил 44,0±15,5 лет (от 16 до 78 лет), средняя длительность заболевания от предполагаемого момента инфицирования до включения в исследование - 15,6±10,6 лет (1-50 лет). В группе больных с установленной стадией фиброза (на основании морфологического или клинико-инструментального обследования) I стадия фиброза диагностирована у 70 (44,6%), И стадия - у 20 (12,7%), III стадия - у 10 (6,4%) и IV стадия (цирроз печени) - у 57 (36,4%) больных.

Результаты генотипирования контрольной группы и больных ХГС представлены в таблице 1.

Таблица 1. Частота генотипов и аллелей полиморфных маркеров исследованных генов в

Полиморфизм Генотип/ Контроль Больные ХГС Р

йллель .<%) а(%)

1ЫЬ Генотип СС 101(40,6) 112 (52,6) 0,006

-511 С/Г Генотип СТ 120 (48,2) 75 (35,2) 0,003

Генотип ТТ 2! (11,2) 26(12,2) нд

Аллель Т 35.3 29,8 нд

TNF Генотип 00 69 (94,5) 198 (95,7) НД

•23! О/А Генотип СА 4(5,5) 9(4,3) нд

Геио-пт АА 0(0) 0(0) HI

Аллель А 2,7 2,2 ш

IU10 Генотип 00 87(36,1) 78 (36,6) нд

-1082 G/A Генотяп ОА 113 (46,9) 92 (43,2) нд

Генотип АА 41 (17,0) 43 (20,2) нд

Аллель А 40,5 41,8 нд

IL-6 Генотип ОС 73 (36,7) 73(34,3) нд

-174 О/С Генотип (ЗС 94 (47,2) 108 (50,7) «д

Генотип СС 32(16,1) 32(15,0) нд

Аллель С 39.7 40,4 нд

TOF-bl Генотип йв 235 (86,7) 213(85,9) нд

+915 О/С Генотип ОС 35(12,9) 29(13,6) нд

Генотип СС 1 (0,4) 1 (0,5) нд

Аллель С 6,8 7,3 нд

нте Генотип НН «(X (72,1) 141 (65,3) 0,04

нбзо Генотип НО 207 (24,6) 6« (30,6) 0,07

Ген&гип Т>и 27 (3,2) 9(4.2) >и

Аллель Ц 15,5 19,4 0,09

НРЕ Генотип СС 784 (93,4) 200 (93,5) щ

С282У Генотип СУ 54(6,4) 14 (6,5) яд

Генотип УУ 2(0,2) 0(0) ад

Аллель У 3,5 3,3 КД

Примечание: ид - статистически недостоверно.

Нами было установлено, что нормальный генотип гена 1Ь-1Ь -511 СС достоверно чаще выявлялся у больных ХГС, а гетерозиготный генотип - (-511 СТ), наоборот, достоверно чаще в контрольной группе. Кроме того, нормальный генотип гена НРБ - НРБ 63 НН - выявлялся достоверно чаще в контрольной группе, чем у больных ХГС. Распространенность генотипов и аллелей остальных исследованных полиморфизмов не различалась между группами.

Таким образом, можно предполагать, что носительство генотипа гена 1Ь-1Ь -511 СС, ассоциированного с низкой продукцией провоспалительного цитокина 1Ь-1Ь, является предрасполагающим фактором к хронизации НСУ инфекции, тогда как наличие высокопродуцирующего генотипа - (-511 СТ), наоборот, к самопроизвольному выздоровлению. Преобладание среди больных ХГС гетерозигот по НРБ НбЗБ полиморфизму, по-видимому, связано с большим удельным весом в исследовании больных с выраженной стадией фиброза.

2. Анализ взаимосвязи меэеду клиннко-лабораторными показателями и ноеительством вариантных аллелей исследованных генов у больных ХГС.

При монофакторном анализе нами не было установлено взаимосвязи между носительством больными ХГС определенных аллельных вариантов исследованных генов и повышением сывороточной активности «печеночных» ферментов. При многофакторном анализе было выявлено, что независимыми предикторами повышения уровня АЛТ, наряду с наличием стадии ЦП и степенью повышения уровня сывороточного железа, были генотип гена НБЕ — 63 НЭ и ИИ, а также генотип гена ТвР-Ы +915 йС (табл. 2).

Таблица 2. Взаимосвязь между клинико-лабораторным и показателями и аллельными

Клинико-лабораториые показатели Монофакторный анализ Многофакторный анализ

Повышение уроанл АЛТ 1.1» Более тяжелы стадия поражения печени (р<0,001); более

высокий уровень сывороточного железа (р—0,014); HFE 63 HD и DD генотипы (p<0,001)i TGF-lb +915 GC генотип (р<0,001)

Уровень ГТТ «... Уровень сывороточного железа (р-0,0 1 6); стали* поражения печени (р-0,011); уровень АЛТ (р—0,051 )

Повышенный уровень сывороточного железа HFE CY 282 генотип (р-0,1) Мужской пол (р<0,0|); высокий индекс массы тела (р-0,01); HFE 282 СУ генотип (р-0,03)

Уровень гликемии TGF-b! +915 GC генотип (р<0,01) Индекс массы тела (р-0,005); TGF-bl +915 GC генотип (р-0,003)

Индекс массы тела (ИМТ) IL-lb-511 CT генотип (р-0,03) Возраст (p^O.OOl); стали* поражении печени (р=0,02); 1L-Ib -îll CT (в-0,03)

Наличие смешанной крноглобулинемни IL-10-I082GG генотип (р-0,03) Длительность заболевания (р0,001), сплк» поражения печени (р<0,001); IL-10 -1082 GG генотнп (р-0,037)

Примечание: * взаимосвязь не выявлена.

При проведении монофакторного анализа нами была выявлена тенденция (р=0,01) к более высокому уровню ферремии у больных ХГС гетерозигот по мутации гена гемохроматоза С282У (282 СУ генотип; 158,4 мкг/дл) в сравнении с больными, являющимися носителями нормального генотипа (282 СС генотип; 131 мкг/дл) (рис. 1), что согласуется с данными литературы (Вопкоуэку Н.Ь., ОЬап<1о Л.У., 1999).

Рис. 1. Среднее значение уровн* желез» у больных Рнс. 2. Средний уровень гликемии у больных ХГС с

ХГС с нормальным (282 СС) и гетерозиготным (282 нормальным (+915 Ов) н вариантным (+915 вС)

СУ) генотипами по С282У полиморфизму гена НРБ. генотипами полиморфизма гена ТОР-Ы.

При многофакторном анализе гетерозиготное носительство мутации гена гемохроматоза С282У было независимым предиктором повышенного уровня сывороточного железа (р=0,03) наряду с такими параметрами как повышенный индекс массы тела (ИМТ; р=0,01) и мужской пол (р<0,01) (табл. 2).

В нашем исследовании впервые было установлено, что гетерозиготы по полиморфизму гена ТСР-Ы +915 &С имели достоверно более высокий уровень глюкозы (медиана - 116,9 мг/дл), чем больные с наиболее распространенным генотипом по данному полиморфизму (медиана - 101,7 мг/дл). При многофакторном анализе с включением в статистическую модель всех полиморфизмов, пола, возраста, стадии поражения, длительности заболевания и

ИМТ, независимыми предикторами повышенного уровня глюкозы являлись полиморфизм гена TGF-bl (р=0,003) и повышенный ИМТ (р=0,005) (табл. 2).

Анализ ассоциации между ИМТ и носительством определенных полиморфных маркеров выявил достоверные отличия для полиморфизма гена IL-1Ь -511 С/Т. У больных ХГС с -511 CT генотипом среднее значение ИМТ (26,2 кг/м2) было достоверно выше, чем у больных с -511 СС генотипом (24,3 кг/м2; р=0,02) (рис. 3).

40

30 * 20 10 о

30,4

от

RU

-10S2GG -1082 GA и -1002 АА

генотипы

Рис. 3. Среднее значение индекса массы тела у вольных ХГС с -511 СС и -511 CT генотипами полиморфизма гена IL-lb.

Рис. 4 Частота смешанной криоглобулинемян у больных ХГС с генотипом reim 1L-10 -1082 GG в сравнении с больными ХГС с -1082 GA и -1082 АА генотипами

При проведении многофакторного анализа полиморфизм гена IL-lb -511 С/Т по-прежнему был независимым предиктором более высокого ИМТ (табл. 2).

Нами также впервые было установлено, что носительство высокопродуцирующего генотипа гена IL-10 -1082 GG ассоциировано с развитием СКГ (рис. 4), которая при наличии у больных ХГС данного генотипа, выявлялась в 1,6 раза чаще (р=0,03) в сравнении с больными, имеющими другие генотипы данного полиморфизма (генотипы -1082 GA и -1082 АА). Выявленная взаимосвязь оставалась достоверной при проведении многофакторного анализа (р=0,037; табл. 2) по результатам которого, независимыми клиническими факторами, ассоциированными с развитием СКГ, были длительность заболевания (р<0,001) и более тяжелая стадия поражения печени (р<0,001).

Таким образом, нами было показано, что генетический полиморфизм является одним из факторов, определяющих особенности клинико-лабораторной картины ХГС. При многофакторном анализе выявлены ассоциации между увеличенной активностью АЛТ и носительством вариантных аллелей гена HFE -

генотип 63 НО и 63 ББ, и гена ТОР-Ы - генотип +915 вС. Также установлена связь меэаду повышенным индексом массы тела и носительством генотипа гена 1Ь-1Ь -511 СТ; повышенным уровнем гликемии и генотипом гена ТОР-Ы +915 ОС; повышенным уровнем ферремии и носительством мутантного генотипа гена НБЕ - 282 СУ. Кроме того, выявлено, что наряду с длительностью заболевания (р<0,001) и более тяжелой стадией фиброза печени (р<0,001), независимым фактором риска развития СКГ являлся высокопродудирующий генотип гена 1Ь-10 -1082 Ов.

3. Анализ взаимосвязи между прогресснрованием фиброза печени и носительством вариантных аллелей исследованных генов у больных ХГС.

Для определения взаимосвязи между генетическим полиморфизмом и

прогресснрованием фиброза печени нами были сформированы 2 группы больных ХГС. У 37 больных, составивших I группу, было отмечено медленно прогрессирующее течение заболевания (больные с 1 стадией фиброза при длительности заболевания не менее 10 лет). У 83 - прогрессирующее течение заболевания (больные со 2-4 стадиями фиброза независимо от давности инфицирования). Средний темп прогрессирования фиброза печени составил 0,06 ед. фиброза в год у больных I группы и 0,22 ед. фиброза в год у больных II группы (различия в темпе прогрессирования фиброза между группами статистически высоко достоверны - р<0,01).

Больные с прогрессирующим типом поражения печени были старше, инфицированы в более позднем возрасте и имели более высокий уровень аланиновой аминотрансферазы, чем больные с медленным прогресснрованием фиброза, т.е. группы отличались по известным факторам риска быстрого развития ЦП (рис. 5).

Рис. 5. Клинико-лабораторная характеристика больных ХГС с разным темпом прогрессировали* фиброза печени.

В тоже время, при проведении генетического анализа нами было установлено, что генотип гена 1Ь-1Ь -511 СС, ассоциированный с низкой продукцией провоспалительного цитокина 1Ь-1Ь, в 1,3 раза чаще выявлялся у больных с медленным прогрессированием фиброза (р=0,067) (табл. 3).

Таблица 3. Частота генотипов и аллелей полиморфных маркеров исследованных генов в у больных с медленным и быстрым темпом прогрессирования фиброза._

Полиморфмм Генотип/ Медленно прогрессирующее Прогрессирующе* Р

аллель течение ХГС течение ХГС

»(%) п(%)

1ЫЬ Генотип СС 24 (64,9) 40(48,2) 0,067

-311 ОТ Генотип СТ 11(29,7) 35(42,2) 0,137

Генотип ТТ 2 (5.4) 8(9,6) ЧД

Аллель Т 15(20,3) 51 (30,7) 0.062

Т!» Генотип вО 36 (97,3) 81 (97,6) ид

-238 О/А ГеяопшОА 1(2.7) 2(2,4) на

Генотип АА 0 0 я*

Аллель А 1(1,3) 2(1.3) нд

1Ы0 Генотип вО 17(46,0) 33 (39,8) ид

-1082 О/А Генотип ОА 11 (29,7) 32(38,6) на

Генотип АА 9(24,3) 18(21,7) нд

Аллель А 29 (39,2) 68 (41,0) нд

П.-6 Генотип 00 20(54,1) 18(21,7) <0,01

-174 О/С Генотип ОС 14 (37,1) 50(60,2) 0,02

Генотип СС 3(8,1) 15(18,1) 0,126

Аллель С 20 (27,0) 80(48,2) <0,0!

ТвР-Ы Генотип 00 35 (94,6) 68 (81,9) 0,03

+915 О/С Генотип ОС 2(5,4) 14 (16,9) нд

Генотип СС 0(0) 1 (1,2) нд

Аллель С 2(2.7) 16(9,6) 0,05

НРБ Генотип НН 29(78,4) 50(60,2) 0,04

Н630 Генотип НО 8(21,6) 27(32,5) 0,16

Генотип ОЭ 0(0) 6(7,2) нд

Аллель 0 <(10,1) 39 (23,5) 0.01

НРЕ Генотип СС 33 (91,9) 79 (95,4) нд

C282Y Генотип CY 3(8,1) 4(4,8) нл Генотип YY (0) 0 нл _Аллель Y_ 3(4,1)_4 (2.4)_нл

Примечание: нд - статистически недостоверно.

Гетерозиготный (-511 CT) и гомозиготный (-511 TT) генотипы, наоборот, в 1,4 и 1,8 раз чаще выявлялись у больных с прогрессирующим типом поражения печени, но различия не были достоверными. Можно предполагать, что носительство аллеля -511 Т, взаимосвязанного с повышенным уровнем IL-lb в сыворотке крови, ассоциировано с более быстрым прогрессированием поражения печени у больных ХГС.

Генотип гена IL-6 -174 GG в 2,5 раза чаще выявлялся у больных с благоприятным течением ХГС (р<0,01). Гетерозиготный генотип -174 GC, Наоборот, достоверно чаще встречался у больных ХГС с прогрессирующим типом поражения печени (р=0,02). Генотип -174 GC, как и гетерозиготный генотип, чаще встречался у больных с неблагоприятным течением ХГС, однако, различия не достигали статистической значимости (р=0,126), по-видимому, вследствие малого количества больных в I группе. Таким образом, нами впервые было установлено, что носительство больными ХГС аллеля гена IL-6 -174 С, ассоциировано с прогрессированием фиброза печени.

Генотипы полиморфизма гена TGF-bl, несущие вариантный аллель (+915 С), чаще выявлялись у больных ХГС с прогрессирующим вариантом поражения печени (р=0,05). Таким образом, по нашим данным, соответствующим представленным в литературе (Gewaltig J., Mangasser-Stephan К., 2002; Wang H., Mengsteab S., 2005), носительство этого аллеля ассоциировано с неблагоприятным течением заболевания.

Аналогичные данные были получены в отношении гетеро- и гомозиготного носительства вариантного аллеля гена гемохроматоза H63D. Пациенты, имеющие HFE 63D аллель гена гемохроматоза, достоверно чаще встречались среди больных ХГС с прогрессирующим типом течения заболевания (р=0,01). Таким образом, носительство аллеля 63D, взаимосвязанного с повышенным всасыванием железа в кишечнике, ассоциировано с быстрым прогрессированием фиброза печени, что

соответствует данным литературы (Bonkovsky HL, Troy N., 2002; Tung B.Y., Emond M.J., 2003).

В отношении остальных исследованных полиморфизмов нами не было выявлено статистически значимых различий между сравниваемыми группами больных (табл. 3).

Таким образом, на основании данных, полученных при монофакторном анализе, нами были определены «профибротические» генотипы (аллели), достоверно, либо на уровне тенденции ассоциированные с прогрессирующим течением ХГС, - генотипы, имеющие аллель гена IL-lb -511 Т (-511 СТ и -511 ТТ); генотипы, имеющие аллель гена IL-6 -174 С (-174 GC и -174 СС); генотипы, имеющие аллель гена TGF-bl +915 С (+915 GC и +915 СС); генотипы, имеющие аллель гена HFE 63 D (63 HD и DD). Наоборот, с благоприятным течением заболевания были ассоциированы «протективные» генотипы - генотип гена IL-lb -511 СС и генотип гена IL-6 -174 GG.

При проведении многофакторного анализа нами было установлено, что вместе с такими клиническими факторами риска прогрессирующего течения ХГС как поздний возраст инфицирования (р<0,01), большая длительность заболевания (р=0,01), более высокий индекс массы тела (р<0,01), с неблагоприятным течением был ассоциирован полиморфизм гена IL-6 -174 G/C (для генотипа гена IL-6 -174 GC р=0,05; для генотипа гена IL-6 -174 СС р<0,01). Остальные исследованные полиморфные маркеры, ассоциированные с темпом прогрессирования фиброза при монофакторном анализе, не являлись независимыми предикторами прогноза ХГС при проведении многофакторного анализа. Отсутствие независимого влияния большинства из исследованных полиморфных маркеров на темп прогрессирования фиброза печени не отрицает их значение в фиброгенезе, а лишь показывает наличие ассоциации этих факторов с клиническими параметрами, уже включенными в многофакторную модель.

Нами было установлено, что из исследованных полиморфных маркеров два были ассоциированы с благоприятным течением ХГС и восемь с неблагоприятным. Учитывая многофакторный патогенез ХГС, можно

предполагать, что выявленные «профибротические» генотипы будут иметь суммарный однонаправленный негативный эффект на течение заболевания, а «протективные», напротив, защищать от быстрого прогрессирования фиброза.

4. Использование полиморфных маркеров исследованных генов для определения прогноза ХГС.

Установленная нами ассоциация между течением ХГС и носительством

определенных полиморфных маркеров исследованных генов позволила нам предпринять исследование по использованию ее для определения прогноза заболевания. Генетический профиль больного ХГС может содержать как «протективные», так и «профибротические» генотипы, вследствие чего прогноз заболевания будет определяться их комбинацией, в которой могут доминировать «протективные» или «профибротические» генотипы. С целью упрощения суммирования «профибротических» и «протективных» генотипов у каждого больного нами произведено кодирование с присвоением генотипам с 1 профибротическим аллелем «-1» балла, с двумя профибротическими аллелями «2» баллов и т.д. «Протективным» генотипам присваивался «+1» балл при наличии одного протективного генотипа и «+2» балла в случае носительства двух протективных генотипов, и затем производилось суммирование генетического профиля у каждого больного (табл.4).

Таблица 4.

Балльная оценка генетического профиля у больных с медленным и быстрым

прогрессированием фиброза

Групп» Суммарный балл

■6 -5 -4 -2 -1 0 +1 .;.'• +2 .

п 0 0 0 2 3 8 13 I ■ .10 . .

(N-37) % 0 0 0 8.1 21,6 35,1 2,7 ' . 27,0 .'

П. п 1 3 5 9 27 16 ,., 15 .. ■4... : -з.. ■ 1

(N"83) % 1.2 3,6 6,0 10,8 гц, 19,3 18,1 4.8 ■ ;3.6 ,

Примечание: п - количество больных с определенным суммарным баллом

Суммарный балл «-2 и меньше» (т.е. пациенты с большим количеством профибротических аллелей) имели каждый седьмой больной (5 из 37; 13,5%) с медленно прогрессирующим течением и каждый второй больной (45 из 83; 54,1%)

с прогрессирующим течением ХГС, т.е. при таком суммарном балле (генетической комбинации) относительный риск прогрессирования заболевания равен 4 (54,1%/13,5%; р<0,001). Суммарный балл «О и более» имели 64,8% (24 из 37) больных с мягким течением ХГС и 26,5% (22 из 83) больных с прогрессирующим течением заболевания, т.е. в группе пациентов с суммарным баллом «О и более» риск прогрессирования заболевания составил 0,4 (26,5%/64,8%; р<0,001).

Для пациентов с суммарным баллом «-1», доля которых составляет приблизительно 20% в каждой группе, прогноз не может быть определен на основании предложенной модели ввиду равной доли таких больных в группе пациентов с медленным и быстрым прогрессированием фиброза.

Представлялось целесообразным определение влияния комбинации изученных генетических факторов на темпы прогрессирования фиброза печени у больных ХГС. На основании данных, представленных в таблице 3, нами были построены «кривые выживаемости» по Каплану-Мейеру трех групп больных:

1) больных с суммарным баллом «-2 и меньше»;

2) больных с суммарным баллом «-1»;

3) больных, с суммарным баллом «0 и более».

В качестве начальной точки принималась I стадия фиброза, а в качестве конечной точки (исхода) принималось достижение больными II стадии фиброза, при этом мы допускали, что скорость прогрессирования фиброза печени имеет линейный вид на всем протяжении заболевания (рис. 6).

I*

ь

Г

1 о.:

ТМ I ■-А

о

5

10

18

20

25

30

35 40

ГОДЫ

Рис. 6. Кривые убыли больных ХГС с I стадией фиброза в зависимости от суммарного балла.

При анализе полученных кривых выживаемости нами было установлено, что у больных с суммарным баллом «-2 и меньше» прогрессирование фиброза печени происходит быстрее, чем в группе с суммарным баллом «О и более». Что же касается промежуточной группы (суммарный балл «-1»), то она в большой степени неоднородна и эти больные не могут быть подразделены на группу с высоким или низким риском прогрессирования на основании исследования указанных полиморфных маркеров.

Оценка клинических и лабораторных данных у больных трех групп, сформированных на основании суммарного балла, позволила установить, что больные не различались ни по одному из показателей, включая возраст инфицирования и длительность заболевания (рис. 7). Вместе с тем были выявлены достоверные отличия в темпе накопления фиброза у больных с суммарным баллом «-2 и меньше» ('<-2') в сравнении с больными, имеющими суммарный балл «О и более» ('>0') (р<0,01).

Рис. 7. Клинихо-лабораторные показатели трех групп больных с разным суммарным баллом.

Таким образом, генетический профиль, представляющий собой совокупность «профибротических» и «протективных» аллелей, позволяет оценить темп прогрессирования фиброза печени у больных ХГС.

5. Анализ эффективности комбинированной противовирусной терапии в зависимости от носительства вариантных аллелей исследованных генов

Взаимосвязь между полиморфными маркерами исследованных генов и эффективностью противовирусной терапии была оценена у 59 больных ХГС, у 38 из которых, был достигнут устойчивый вирусологический ответ на курс комбинированной ПВТ (ответившие), и у 21 - отмечался рецидив или сохранение виремии (не ответившие). Основные клинические параметры больных, прошедших курс ПВТ, приведены на рис. 8.

Больные, не ответившие на ПВТ, были достоверно старше, имели ббльшую продолжительность заболевания, и среди них было больше пациентов на стадии ЦП. Также в группе больных, не ответивших на ПВТ, достоверно чаще выявлялась СКГ и трудно поддающийся лечению генотип вируса.

аояраст, лат % вольным в ЦП

длительность ••вогивния, лот

наличие ймашанной криоглоОулинамии.эЬ

И не отввтиии-мв на ПВТ □ ответив оме на ПВТ

уяашаштяшт.

тяяыг/яш/и

116.3

Рис, 8. Клинико-лабораторная характеристика больных ХГС, ответивших и не ответивших на ПВТ.

При монофакторном анализе нами не было выявлено достоверных отличий ни по одному из исследованных полиморфизмов. Однако для полиморфизма гена IL-10 -1082 G/A была выявлена тенденция к различию. Генотип гена IL-10 -1082 GG, ассоциированный с высокой продукцией IL-10, выявлялся чаще у не ответивших на ПВТ больных (р=0,16). При проведении многофакторного анализа, включавшего параметры, по которым, больные, ответившие и не ответившие на лечение, различались (см. рис. 8), -1082 G/A полиморфизм гена IL-10 являлся независимым предиктором, определяющим эффективность ПВТ (р=0,03), при этом генотип -1082 GG, был ассоциирован с низкой эффективностью лечения. Другими независимыми кофакторами, определяющими отсутствие

вирусологического ответа при многофакторном анализе, оказались - старший

возраст (р<0,001), большая длительность инфицирования (р=0,01), более тяжелая

стадия поражения печени (р=0,015), 1 генотип вируса (р<0,001) и наличие СКГ

(Р=0,03).

Выводы.

1. У больных ХГС распространенность генотипа гена IL-lb -511 СС (52,6%) выше, чем в популяции (40,6%; р=0,006), а генотипа гена HFE 63 НН (65,3%) ниже популяционной (72,1%; р=0,04).

2. Генетический полиморфизм является одним из факторов, определяющих особенности клинико-лабораторной картины ХГС: при многофакторном анализе выявлены ассоциации между увеличенной активностью АЛТ и носительством вариантных аллелей гена HFE - генотип 63 HD (р<0,001) и гена TGF-bl - генотип +915 GC (р<0,001), повышенным индексом массы тела и генотипом гена IL-lb -511 СТ (р=0,03), уровнем гликемии и генотипом гена TGF-bl +915 GC (р=0,003), а также повышенным содержанием железа в сыворотке и носительством мутантного генотипа гена HFE 282 CY (р=0,03).

3. Независимыми факторами риска развития смешанной криоглобулинемии являются более тяжелая стадия поражения печени (р<0,001), большая длительность заболевания (р<0,001) и носительство генотипа гена IL-10 -1082 GG (р=0,037).

4. При монофакторном анализе установлено, что с быстрым прогрессированием фиброза печени ассоциировано носительство генотипов генов цитокинов - IL-lb -511 ТТ и -511 СТ, IL-6 -174 СС и -174 GC, TGF-bl +915 GC и +915 СС и гена гемохроматоза HFE 63HD и 63DD, («профибротические» генотипы), с медленным темпом развития фиброза -генотипов гена IL-lb -511 СС и гена IL-6 -174 GG («протективные» генотипы).

5. Независимыми предикторами прогрессирующего типа поражения печени были поздний возраст инфицирования (р<0,01), большая длительность заболевания (р=0,01), более высокий индекс массы тела (р<0,01), генотипы гена IL-6 -174 GC (р=0,05) и -174 СС (р<0,01), а также генетический профиль,

представляющий комбинацию «профибротических» и «протективных» полиморфных маркеров. 6. Длительность заболевания (р=0,01), старший возраст (р<0,001), более тяжелая стадия фиброза печени (р=0,015), 1-ый генотип вируса (р<0,001), наличие смешанной криоглобулинемии (р=0,03) и генотип гена IL-10 -1082 GG (р=0,03) являются независимыми факторами отсутствия устойчивого ответа на противовирусную терапию.

Практические рекомендации.

1. Результаты исследования позволяют рекомендовать использование

генотипирования на фиброз-ассоциированные полиморфизмы генов цитокинов и гена гемохроматоза для прогнозирования течения ХГС и определения тактики ведения больного. С этой целью нами рекомендуется построение модели, основанной на определении «суммарного балла», отражающего генетическую предрасположенность к благоприятному или прогрессирующему течению ХГС. Выявление у больных ХГС низких значений «суммарного балла», свидетельствует о большом количестве профибротических аллелей, что сопряжено с быстрым прогрессированием фиброза. Вследствие этого таким больным необходимо настойчиво рекомендовать противовирусную терапию с целью избежания развития ЦП и преждевременной смерти.

2. В связи с установленной ассоциацией между генотипом гена IL-10 -1082 GG и риском развития СКГ у больных ХГС, представляется целесообразным определение генотипа полиморфизма гена IL-10 -1082 G/A с целью прогнозирования развития СКГ.

3. Для прогнозирования эффективности противовирусной терапии необходимо принимать во внимание результаты клинико-лабораторного исследования и данные генетического анализа на полиморфизм гена IL-10 -1082 G/A. При этом наличие у больных ХГС -1082 GG генотипа ассоциировано с низкой эффективностью противовирусной терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Игнатова Т.М., Абдуллаев С.М., Северов М.В. Факторы прогрессирования хронического гепатита С. // Гепатологический форум. - 2005; 1. - С. 11-16.

2. Абдуллаев С.М., Ефименко А.Ю., Балацкий А.В. Полиморфизм гена HFE -кофактор прогрессирования фиброза у больных хроническим гепатитом С русской этнической принадлежности // Вестник РГМУ, 2006, №2/49/ - С. 6. I Международная пироговская студенческая научная медицинская конференция, 2006, 16-17 марта, Москва, Россия.

3. Абдуллаев С.М., Самоходская Л.М., Игнатова Т.М., Мухин Н.А., Ткачук В.А. Прогрессирующее течение хронического гепатита С: роль полиморфизма генов цитокинов и HFE.// Сборник тезисов XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Ломоносов - 2006, 12-15 апреля, С. 484, Москва, Россия

4. Самоходская Л.М., Абдуллаев С.М., Целищева Ю.И., Игнатова Т.М., Краснова Т.Н., Мухин Н.А. Метод прогнозирования прогрессирующего течения (развития цирроза печени) при хроническом гепатите С. РОСПАТЕНТ. Регистрационный номер №2006127392 от 28.07.2006.

5. Abdullaev S.M., Ignatova Т.М., Samokhodskaya L.M., Mukhin N.A., Tkachuk VA. Natural history of chronic HCV infection: potential influence of polymorphisms in cytokine and hemochromatosis genes // Journal of Clinical Virology. - 2006. - Vol. 36. Suppl. 2.-S126.

6. Abdullaev S.M., Samokhodskaya L.M., Ignatova T.M. Cytokine gene polymorphisms in patients with chronic hepatitis С // Х1П International Student Congress of Medical Sciences, Groningen, 2006, June, 14-17, Abstract book, P. 285.

7. Abdullaev S.M., Ignatova T.M., Samokhodskaya L.M. Genetic profile contribution to the rate of fibrosis progression in chronic HCV patients // XIII Falk Liver Week, Frieburg, 2006, October, 06-11. Abstract book, P. P13.

8. Абдуллаев C.M., Целищева Ю.И., Самоходская Л.М., Бочков В.Н., Квасовка В.В., Игнатова Т.М., Краснова Т.Н., Мухин Н.А. Генетические факторы агрессивного течения хронического гепатита С // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2007. - N1.-C. 8-13.

9. Самоходская JI.M., Игнатова Т.М., Абдуллаев С.М., Краснова Т.Н., Некрасова Т.П., Мухин H.A., Ткачук В.А. Прогностическое значение комбинации аллельных вариантов генов цитокинов и гемохроматоза у больных хроническим гепатитом С И Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2007. - № 2. - С. 48-51.

Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям заведующему кафедрами терапии и профессиональных болезней ММА им. И.М. Сеченова и внутренних болезней ФФМ МГУ им. М.В, Ломоносова академику РАМН, профессору H.A. Мухину и к.м.н., с.н.с. Лаборатории генных и клеточных технологий в медицине ФФМ МГУ Л.М. Самоходской. Особую признательность и благодарность за постоянное внимание и консультативную помощь на всех этапах работы д.м.н. в.н.с. Т.М. Игнатовой и к.м.н. доц. Т.Н. Красновой. Автор также благодарит д.м.н., доц. Д.Т. Абдурахманова, к.м.н. А.Н. Мешкова и к.м.н., доц. В.Г. Авдеева за проявленное внимание к работе и ценные критические замечания, весь коллектив клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева ММА им. И.М. Сеченова, сотрудников гепатологического отделения (зав. Л.П. Успенская), коллектив академической группы академика РАМН H.A. Мухина, лично заведующего Лабораторией генных и клеточных технологий в медицине ФФМ МГУ академика РАН и РАМН В.А. Ткачука, и весь коллектив лаборатории за помощь и содействие в выполнении работы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ Аланиновая аминотрансфераза

ВИЧ Вирус иммунодефицита человека

ГГТ Гамма-глутамилтранспептидаза

гцк Гепатоцеллюлярная карцинома

имт Индекс массы тела

овг Острый вирусный гепатит

ПВТ Противовирусная терапия

ПДРФ Полиморфизм длины рестриктных фрагментов

ПЦР Полимеразная цепная реакция

СКГ Смешанная криоглобулинемия

УФ Ультрафиолет

ХГС Хронический гепатит С

ЦП Цирроз печени

HBV Вирус гепатита В

HCV Вирус гепатита С

HCVRNA РНК вируса гепатита С

HFE Ген гемохроматоза (Hemochromatosis gene)

IL-10 Интерлейкин-10 (Interleukin-10)

IL-lb Интерлейкин-lb (Interleukin-lb)

IL-6 Интерлейкин-6 (Interleukin-6)

SNP Однонуклеотидный полиморфизм (Single nucleotide polymorphism)

TGF-bl Трансформирующий ростовой фактор-bl (Transforming growth

factor-Ы)

TNF Фактор некроза опухоли (Tumor necrosis factor)

ММА им.И.М.Сеченова Подписано в печать 2008 г.

Тираж 100 экземпляров

i- 85 7 1

2007513344

2007513344

Актуальность темы. Прогноз хронического гепатита С (ХГС), являющегося наиболее частой причиной развития цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) [63], а также ведущим показанием к трансплантации печени [264], определяется темпом прогрессирования фиброза или развитием тяжелых внепеченочных проявлений и характеризуется значительными индивидуальными различиями [74]. Известно, что у 20-30% больных ХГС существует риск развития ЦП в течение 20-30 лет от момента инфицирования, и, в то же время, у значительной части пациентов с HCV-инфекцией формирования ЦП не происходит на протяжении всей жизни [16, 284]. Гетерогенность клинических проявлений и темпов прогрессирования фиброза печени при ХГС обусловливают сложность определения индивидуального прогноза заболевания и выбора тактики ведения больных.

В исследованиях, проведенных за два десятилетия с момента идентификации HCV, было установлено, что помимо целого ряда хорошо известных вирусных и внешних факторов, несомненная роль в определении течения и исходов ХГС принадлежит факторам хозяина [64]. Особое значение в работах последних лет отводится изучению генетического полиморфизма, играющего ключевую роль в определении индивидуальных особенностей ответа на один и тот же этиологический фактор [75]. Среди генетических факторов хозяина у больных ХГС большинство исследований посвящено изучению однонуклеотидного полиморфизма (SNP) — наиболее распространенной формы индивидуальной генетической вариабельности [76, 211]. Однонуклеотидный полиморфизм в ряде случаев сопряжен с увеличением или уменьшением концентрации/активности продукта гена. Принимая во внимание решающее значение иммунных механизмов и интенсивности оксидативного стресса в прогрессировании фиброза печени и формировании ответа на противовирусную терапию (ПВТ), наиболее широко обсуждаемыми генами-кандидатами являются гены цитокинов и гемохроматоза [76]. При этом показано, что доминирование провоспалительных цитокинов ассоциировано с быстрым прогрессированием фиброза и лучшим ответом на ПВТ, тогда как преобладание противовоспалительных — с медленным накоплением фиброза и более низкой эффективностью ПВТ [94,217],

В литературе представлено большое число исследований, посвященных поиску взаимосвязи между аллельными вариантами генов-кандидатов и темпами прогрессирования фиброза печени, а также со спонтанным клиренсом вируса и ответом на ПВТ [234, 132, 109]. Вместе с тем, до настоящего времени убедительные данные об ассоциации однонуклеотидных замен с особенностями течения ХГС получены только для малого числа полиморфизмов. Разноречивость опубликованных работ во многом связана с неодинаковыми критериями включения/исключения больных, изучением различных популяций и обследованием сравнительно небольших групп больных, что увеличивает вероятность получения ложных ассоциаций [212]. В большинстве работ по определению клинической значимости генетического полиморфизма изучаются больные, имеющие дополнительные факторы прогрессирования фиброза печени (в т.ч. алкоголь) [241, 285], отсутствует оценка влияния на результаты исследования других факторов хозяина и вируса, длительности заболевания [71, 282], и только в единичных работах проводится анализ комбинации генетических факторов [241]. Особо следует отметить крайнюю немногочисленность отечественных работ по изучению генетического полиморфизма при заболеваниях печени, которые представлены единичными исследованиями по установлению генетических маркеров быстрого развития цирроза печени у пациентов с HCV-инфекцией [243] или у лиц, злоупотребляющих алкоголем [44].

Таким образом, разноречивость результатов исследований, в том числе вследствие различной популяционной распространенности аллельных вариантов генов цитокинов и гемохроматоза, а также ограниченность данных по российской популяции определили актуальность и необходимость проведения работы по выявлению аллельных вариантов генов-кандидатов, ассоциированных с особенностями течения и прогнозом ХГС.

Цель исследования: определить клиническую и прогностическую значимость носительства аллельных вариантов генов цитокинов и гена гемохроматоза, а также их влияние на результат противовирусной терапии у больных ХГС.

Задачи исследования:

1. Исследовать распространенность генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов цитокинов (-511 С/Т гена IL-lb; -1082 G/A гена IL-10; -238 G/A гена TNF; -174 G/C гена IL-6 и +915 G/C гена TGF-bl) и гена гемохроматоза (C282Y и H63D) в российской популяции и у больных ХГС.

2. Проанализировать особенности клинико-лабораторной картины у больных ХГС в зависимости от носительства определенных аллельных вариантов исследованных генов цитокинов и гена гемохроматоза.

3. Определить взаимосвязь между полиморфными маркерами исследованных генов и темпом прогрессирования фиброза у больных ХГС.

4. Исследовать ассоциацию между генетическим полиморфизмом и эффективностью противовирусной терапии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в России проведено клинико-лабораторное и морфологическое исследование значительной по численности выборки больных ХГС, имеющих разный темп прогрессирования фиброза печени, с определением у них частоты генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов цитокинов (IL-lb -511 С/Т; IL-10 -1082 G/A; TNF -238 G/A; IL-6 -174 G/C и TGF-bl +915 G/C) и гена гемохроматоза (HFE C282Y и HFE H63D). Впервые на большой группе здоровых доноров изучена распространенность генотипов и аллелей полиморфизма вышеуказанных генов в российской популяции.

Охарактеризованы особенности клинико-морфологической и лабораторной картины заболевания в зависимости от носительства полиморфных маркеров исследованных генов. Впервые показана взаимосвязь между развитием смешанной криоглобулинемии (СКГ) и носительством больными ХГС генотипа гена IL-10 -1082 GG; также впервые показана ассоциация между уровнем гликемии и полиморфизмом гена TGF-bl +915 G/C; индексом массы тела и полиморфизмом гена IL-lb -511 С/Т.

Определены «профибротические» (IL-lb -511 СТ и -511 ТТ; IL-6 -174 GC и -174 СС; TGF-bl +915 GC и +915 СС; HFE 63HD и 63DD) и «протективные» (IL-lb -511 СС и IL-6 -174 GG) генотипы, ассоциированные соответственно с быстрым и медленным темпами прогрессирования фиброза печени. Показано, что комбинация «профибротических» и «протективных» генотипов является независимым фактором прогноза ХГС. Впервые среди отечественных работ продемонстрирована ассоциация генетического полиморфизма гена IL-10 -1082 G/A с эффективностью противовирусной терапии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты проведенного исследования, позволившие выделить клинические и генетические факторы, влияющие на особенности течения ХГС, темпы прогрессирования заболевания и эффективность противовирусной терапии, имеют значение для оценки прогноза ХГС. Установлены генетические факторы, влияющие на особенности клинико-лабораторной картины ХГС, в том числе развитие СКГ. Разработана модель определения прогноза ХГС, основанная на анализе комбинации «протективных» и «профибротических» полиморфных маркеров генов цитокинов и гемохроматоза. Присвоение баллов «протективным» и «профибротическим» генотипам позволяет вычислить суммарный балл генетического профиля больных ХГС и по его значению прогнозировать течение заболевания: выделить больных с благоприятным прогнозом и больных, наиболее угрожаемых по развитию ЦП. Установлены клинические и генетические факторы, ассоциированные с низкой эффективностью противовирусной терапии. Проведенное исследование позволяет индивидуализировать тактику ведения больных ХГС, учитывая данные клинического и генетического обследования, а также разработать рекомендации по изменению образа жизни больными ХГС.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. У больных ХГС распространенность генотипа гена IL-lb -511 СС (52,6%) достоверно выше, чем в популяции (40,6%; р=0,006), на основании чего можно предполагать, что носительство данного генотипа, ассоциированного с низкой продукцией провоспалительного цитокина IL-lb, способствует хронизации HCV инфекции.

2. Больных ХГС с генотипом гена IL-10 -1082 GG имеют повышенный риск развития СКГ; носители гетерозиготного генотипа гена IL-lb -511 СТ имеют более высокий индекс массы тела, чем носители нормального (-511 СС) генотипа. У больных ХГС носительство генотипа гена TGF-bl +915 GC сопряжено с более высоким уровнем гликемии, а наличие мутации гена гемохроматоза C282Y (282 CY генотип) - с повышенным содержанием сывороточного железа. Выявленные ассоциации имеют значение в понимании патогенеза ХГС и позволяют прогнозировать особенности клинического течения t заболевания.

3. Определение генетического профиля, представляющего собой комбинацию генетических полиморфизмов, ассоциированных с быстрым (генотипы гена IL-lb -511 СТ и -511ТТ; генотипы гена IL-6 - 174 GC и -174 СС; генотипы гена TGF-bl - +915 GC и +915 СС; генотипы гена HFE — 63HD и 63DD), и медленным (генотип гена IL-lb -511 СС; генотип гена IL-6 - 174 GG) темпом накопления фиброза, позволяет прогнозировать течение ХГС — оценить риск формирования ЦП, что имеет значение для выбора тактики ведения больных.

4. Генетический полиморфизм гена IL-10 -1082 G/A наряду с другими факторами хозяина определяет эффективность ПВТ. Генотип -1082 GG, ассоциированный с повышенной продукцией противовоспалительного цитокина IL-10, является независимым предиктором отсутствия ответа на лечение или рецидива виремии. Генетический анализ, выявляющий носительство этого генотипа, целесообразно использовать в оценке прогноза эффективности противовирусного лечения.

1. Результаты исследования позволяют рекомендовать использование генотипирования на фиброз-ассоциированные полиморфизмы генов цитокинов и гена гемохроматоза для прогнозирования течения ХГС и определения тактики ведения больного. С этой целью нами рекомендуется построение модели, основанной на определении «суммарного балла», отражающего генетическую предрасположенность к благоприятному или прогрессирующему течению ХГС. Выявление у больных ХГС низких значений «суммарного балла», свидетельствует о большом количестве профибротических аллелей, что сопряжено с быстрым прогрессированием фиброза. Вследствие этого таким больным необходимо настойчиво рекомендовать противовирусную терапию с целью избежания развития ЦП и преждевременной смерти.

2. В связи с установленной ассоциацией между генотипом гена IL-10 -1082 GG и риском развития СКГ у больных ХГС, представляется целесообразным определение генотипа полиморфизма гена IL-10 -1082 G/A с целью прогнозирования развития СКГ.

3. Для прогнозирования эффективности противовирусной терапии необходимо принимать во внимание результаты клинико-лабораторного исследования и данные генетического анализа на полиморфизм гена IL-10 -1082 G/A. При этом наличие у больных ХГС -1082 GG генотипа ассоциировано с низкой эффективностью противовирусной терапии.

Практические рекомендации.