Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Современная диагностика наследственного гемохроматоза

ВОЛОДИЧЕВА ЕЛЕНА МИХАИЛОВНА

На правах рукописи

рГ5 од

7 9 ЯНВ 2004

СОВРЕМЕННАЯ ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННОГО ГЕМОХРОМАТОЗА.

14.00.29 - гематология и переливание крови.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2003

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Научные руководители:

Кандидат медицинских наук

Доктор биологических наук, профессор

С П. Щербинина Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты: Д.м.н., профессор Луговская С.А. Д.м.н, профессор Голенков А.К.

Ведущая организация: Московская Медицинская Академия имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения России

Защита состоится " "__2003 г. в " " часов на заседании

диссертационного совета Д 001. 042. 01 в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр РАМН по адресу: 125167 г. Москва, Ново-Зыковский проезд, 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН. Автореферат разослан " "__2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук

В.Д. Реук

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы.

Наследственный гемохроматоз (НГ) относится к группе болезней "накопления", заключается в генетически обусловленном нарушении метаболизма железа, начинается задолго до проявления симптомов, характеризуется тяжелым, хроническим, прогрессирующим течением, неблагоприятным прогнозом, мало исследованными этиологией и патогенезом [Авцын А.П., 1991; Dadon М.М., 1982; Simon М., 1988].

Это одно из самых распространенных аутосомно-рецессивных заболеваний в Европе, Америке, Австралии с частотой гетерозигот 10-16%, развивающееся (гомозиготность), в среднем, в 3-7 случаях на 1000 носителей гена НГ [Bothwel and Macphail, 1998; Phatak et al, 1998, Dadon M.M., 1982].

Клиническая картина заболевания гетерогенна, обусловлена избыточным накоплением железа в виде ферритина и гемосидерина в паренхиматозных органах с последующим их фиброзом и функциональной недостаточностью, что приводит к относительно ранней инвапидизации и гибели больных [Сетгарова Д.А., Токарев Ю.Н., 1988; Валенкевич Л Н., Яхонтова О.И.. 1991; Niederau С. et al, 1996; Bothwell Т.Н., 1998].

Основной орган-«мишень» - печень. Молекулярный механизм, лежащий в основе токсического действия железа - это генерация свободных радикалов и перекисное окисление липидов [Bacon В R., Britton R.S. et al, 1990; Bonkovsky H.L., 1991].

Simon впервые в 1975 году показал, что НГ тесно сцеплен с антигенами HLA-A3, HLA-В7 н HLA-B14 основного комплекса гистосовместимости, кодируемых в коротком плече 6 хромосомы и являющимися для НГ генетическими маркерами наследственности [Basset M.L. et al, 1980, Simon M., Brissot, 1988; Feder J.N., 1996, Володичева E.M. et al, 2003].

HLA-A3 встречается у 55-71% больных НГ (у 19-31% в контрольной группе), HLA- В7 и В14 - соответственно у 46% и 18% больных гемохроматозом (частота у здоровых лиц 28% и 6%) [Simon М. et al, 1976, Milman N. et al, 1994, Fairbanks V.F., 1987, Edwards C.Q. et al, 1990]. Для НГ характерно несколько HLA гаплотипов: АЗ-В7 (39% наблюдений при частоте у здоровых 10%) [Simon М. et al, 1976, 1980, Логинов и др.,1988, Basset M.L. et al, 1984, Dyrszko H. et al, 1979], A3-B14 (23% наблюдений при частоте у здоровых 1%) [Серова Л.Д., 1980, Delia D. et al, 1982, Knau В. et al, 1991].

Повышение интереса к проблеме НГ связано с идентификацией гена гемохроматоза HFE и выделением его белкового продукта [Feder et al, 1996; Waheed et al, 1997; Parkkila et al, 1997; Feder et al,1998; Gross et al,1998, Lebron et al, 1998]. С 1996 года начала разрабатываться генная диагностика НГ, т.к. были найдены две характерные мутации

з

агшеля С282У и Н630 в гене НИЕ. Но использование дорогостоящего оборудования н реактивов при тнпировании ДНК ограничивает широкое применение метода.

До конца не решен вопрос адекватной специализированной лечебной помощи больным НГ.

В силу многообразия и неспецнфичности клинических проявлений, отсутствия характерных общепризнанных критериев выявления ранних стадий, длительности латентного периода заболевания, полисистемности поражения, наследственный гемохроматоз до настоящего времени остается наименее известным заболеванием для широкого круга отечественных клиницистов. В этой связи диагноз нередко определяется в терминальной стадии заболевания или на аутопсии. Каждое исследование, направленное на изучение этиологии, патогенеза, диагностики, клинических проявлений и возможного выявления маркеров ранней бессимптомной стадии НГ представляется чрезвычайно важным.

Данная работа предпринята с целью детального анализа клинико-лабораторных характеристик больных НГ, подробного освящения современных возможностей выявления и создания алгоритма скринирующей диагностики ранней стадии заболевания.

Ранняя диагностика позволит предупредить развитие осложнений за счет своевременно начатого лечения, улучшить прогноз течения болезни, увеличить выживаемость больных. Цель работы.

Определить критерии раннего установления диагноза наследственного гемохроматоза и разработать тактику обследования пациентов с подозрением на наличие этого заболевания. Задачи исследовании

1. Изучить результаты ДНК-диагностики н типирования по НЬЛ-антпгенам больных наследственным гемохроматозом .для установления взаимосвязи между наличием НЬА маркеров и мутаций гена ОТЕ

2. Определить частоту носнтельства различных серологических маркеров вирусов гепатитов В/С для уточнения их влияния на течение н прогноз заболевания.

3. Провести оценку клинического анализа крови, включая детальное исследование морфо-функциональных и биофизических свойств эритроцитов. Определить клиническую значимость выявленных изменений.

4. Оценить изменения биохимических показателей сыворотки крови больных наследственным гемохроматозом для уточнения функционального состояния печени как органа-мишени.

5. Определить обмен железа и феррокинетику у данной категории пациентов. Использовать полученные показатели для дифференциальной диагностики и оценки эффективности проводимой терапии.

6. Изучить содержание в сыворотке крови и эритроцитах витамина В12 и фолиевой кислоты для обоснованного их применения в составе комплексной терапии больных наследственным гемохроматозом.

7. Исследовать состояние системы плазменно-трочбоцитарного гемостаза с учетом опасности тромбозов при проведении лечебных кровопусканий.

8. Провести радиоиуклидные исследования органов кроветворения для уточнения функционального состояния гемопоэтическон системы. Использовать полученные показатели для ранней и дифференциальной диагностики данного заболевания. Научная новнзна и практическое значение работы

В России работа является первым комплексным исследованием клинико-лабораторных показателей пациентов с наследственным гемохроматозом и возможностей диагностики этого заболевания на ранней стадии.

Полученные результаты помогут улучшить выявляемость наследственного гемохроматоза и разработать патогенетически обоснованные методы его лечения.

Предложен алгоритм первичного обследования больных с подозрением на наличие наследственного гемохроматоза, включающий: НЬА-тппированне и ДНК-днагностику, серологическое исследование сыворотки крови на наличие маркеров вирусов гепатитов В и/пли С, полный клинический анализ крови с детальным изучением морфо-функциональных и биофизических свойств эритроцитов, биохимические показатели функции печени, обмен железа и феррокинетику, исследование системы тромбоцитарно-плазменного гемостаза, содержание фолиевой кислоты и витамина В12 в сыворотке и эритроцитах, радионуклидное исследование органов кроветворения.

Выявлено несоответствие между содержанием общего гемоглобина и гемоглобина в одном эритроците: у 50-55% больных имелось еннжение концентрации МСН при нормальных показателях общего НЬ. Найдены морфо-функцпоналыше изменения эритроцитов при наследственном гемохроматозе.

Установлена гетерогенность изменений показателем"! метаболизма железа. Отмечено достоверное увеличение НТЖ, ферритинов сыворотки и эритроцитов и не найдено высоких цифр сывороточного железа.

Продемонстрированы изменения гемопоэтической системы, свойственные больным наследственным гемохроматозом. Данные показатели можно использовать для прогноза и оценки эффективности проводимой терапии.

Обнаружено, что мутация гена НЕЕ Н630 встречается с большей частотой, чем мутация С282У. Не у всех пациентов, имеющих классические I П.А-маркеры, найдены мутации гена наследственного гемохроматоза, что доказывает необходимость проведения комплексного генетического обследования больных.

Частота выявления серологических маркеров вирусов гепатитов В/С у пациентов с наследственным гемохроматозом не превышает таковую в популяции доноров. Наличие данных маркеров усугубляет течения заболевания, чго подтверждается изменением биохимических показателей сыворотки крови, метаболизма железа и состоянием гемостаза.

Установлены разнонаправленные изменения гемостаза и фибринолиза, что должно учитываться при проведении лечебных мероприятий эфферентной терапии с целью предупреждения возможных тромбогенных осложнений.

Показано значительное снижение концентрации фолневой кислоты в эритроцитах больных наследственным гемохроматозом, что свидетельствует о дефиците этого витамина.

Ретроспективная оценка клинико-лабораторных показателей дает возможность более ранней дифференциальной диагностик« наследственного гемохроматоза, выработки тактики лечения, что значительно улучшает прогноз при этой патологии. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Показатели обмена железа у больных наследственным гемохроматозом характеризуются гетерогенностью: ферритины сыворотки и эритроцитов, степень насыщения трансферрина железом являются наиболее информативными биохимическими маркерами данного заболевания. Показатель сывороточного ферритина- ведущий признак в оценке развития сопутствующих вирусных гепатитов.

2. Выявлены разнонаправленные изменения гемостаза и фибринолиза. Доказана активация свертывающего каскада, протекающая на фоне депрессии фибринолиза.

3. Феррокинетика отличается высокой концентрацией плазменного железа, которое не используется для эригропоэза, а откладывается в депо. Эригропоэз у данных больных остается в пределах нормальных величин.

4. При раднонуклидном исследовании гемопоэтической системы обнаружено нарушение функции костного мозга, печени, селезенки. Степень выраженности найденных признаков служит контролем качества проводимой терапии и дополнительным прогностическим критерием.

5. НЬА-типирование лимфоцитов периферической крови серологическим методом (выявление классических маркеров НГ - антигенов НЬА АЗ. В7, В14) и ДНК-

диагностика (установление мутаций гена НРЕ) должны проводиться одновременно. Комплексный генетический анализ дает возможность установить диагноз наследственного гемохроматоза у пациентов, гетерозиготных по НЬА и в доклинической стадии заболевания.

6. Серологические маркеры вирусов гепатитов В/С усугубляют течение заболевания, что подтверждается изменениями биохимических показателей, системы гемостаза и метаболизма железа.

7, Найдено резкое снижение концентрации фолневой кислоты в эритроцитах при ее нормальном содержании в сыворотке крови.

Внедрение результатов исследованиям.

Результаты диссертационной работы используются в Кабинете диагностики и лечения гемохроматозов ГУ ГНЦ РАМН и гематологическом отделении ГУЗ ТО «Тульская областная больница».

Основные, наиболее важные положения работы по новым методам диагностики наследственного гемохроматоза опубликованы в отечественных и зарубежных журналах Публикации

По материалам исследования опубликовано 7 научных работ. Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и их обсуждения, заключения и выводов, изложенных на 124 страницах. Материал диссертации содержит 15 рисунков, 23 таблицы, снабжен указателем литературы, состоящим из 415 источников, из них 110 отечественных и 295 иностранных. Содержание работы. Общая характеристика больных

Для решения поставленных задач была проанализирована медицинская документация (истории болезни, амбулаторные карты) с данными результатов первичного обследования 237 пациентов с увеличенными показателями обмена железа, клиническими признаками и НЬА-фенотипом, характерными для наследственного гемохроматоза (156 мужчин и 81 женщины в возрасте от 2,3 до 69 лет, медиана 36 лет). Давность заболевания 0-15 лет. В 50% случаев длительность заболевания составила от 4 до 7 лет. Большинство больных (28,2%) находились в возрасте 40-49 лет. Из общего количества больных НГ. женщины составляли 31,3%.

Комплексное многофакгорное, в том числе специализированное,, лабораторно-ипструментальное обследование с использованием современных методик, относящихся к высоким медицинским технологиям, проводилось амбулаторно при первичном обращении

в Гематологическом Научном Центре РАМН (директор - академик Воробьев А. И.) на базах: Кабинета трансфузионно-эксфузионной терапии (зав. к.м.н. Щербинина С.П.) и стационара дневного пребывания больных (зав. вед.н.с., к.м.н. Н. Н. Цыба).

Критериями диагноза являлись изменение показателей метаболизма железа (сывороточное железо, сывороточный ферритин, общая железосвязывающая способность, насыщение трансферрина железом, ферритин эритроцитов, траисферрин); наличие антигенов HLA- A3, В7, В14, гаплотипов АЗВ7, АЗВ14, мутаций гена HFE C282Y, H63D, данные диагностической чрескожной пункционной биопсии печени с гистологическим и биохимическим исследованием биоптага.

На основании данных HLA-типирования, пациенты были разделены условно на 2 группы: I группа - наличие классических HLA - гаплотипов: АЗВ7 или АЗВ14 (hh, 99 человек, мужчин - 76, женщин - 23) и II группа - наличие только одного HLA - маркера НГ: антигенов A3, В7, B14(h, 138 человек, мужчин -80, женщин - 58).

В каждой группе были сформированы по четыре подгруппы: мужчины (м) и женщины (ж) раздельно по наличию у них сывороточных маркеров вирусов гепатитов В и/или С. Подгруппы мужчин без маркеров вирусов гепатита. 1а и 2а; с маркерами: 16 и 26. Подгруппы женщин без маркеров вирусов гепатитов: 1в н 2в; с маркерами: 1г и 2г. Методы обследования больных.

Метаболизм железа исследовался в лабораторной группе изучения нарушений метаболизма железа отделения химиотерапии лейкозов н патологии эрптрона (руководитель - д.м.н., профессор Хорошко Н.Д.) ведущим научным сотрудником, к.б.н. Левиной A.A. и старшим научным сотрудником, к.б.н. Цибульской М М.

Уровни железа в сыворотке и общей жслезосвязывакицеи способности сыворотки крови определяли калориметрическим методом с батта-фенаитралином по методу Г'енри [Андреева А.П., Левина A.A., 1989] с помощью стандартных наборов Bio-La-Test-Fe фирмы "Lachema". Уровень насыщения трансферрина железом определяли расчетным способом из величин двух предыдущих показателей.

Ферритин сыворотки, эритроцитов определяли стандартным радиоиммунологическим методом с использованием наборов ИРМО-ферритин для людей [Левина A.A., Андреева А.П., 1984], использовали иммунорадиометрическип метод с использованием антител к ферритину, меченных |251.

Траисферрин определяли методом радиальной иммунодпффузии в агаре [Левина A.A. Андреева А.П., 1982] по Ritzmann с помощью наборов «Amersham».

НТЖ рассчитывали по соотношению сывороточного железа и общей желсзосвязывающей способности сыворотки.

Клинический анализ кроен

Исследование общего анализа крови проводилось с применением общепринятых методов [Меньшиков В В., ред.,1987] в клинико-диагностической лаборатории (зав. Л. Ю. Тихонова).

Определяли: общий гемоглобин (НЬ), среднее содержание гемоглобина в одном эритроците (МСН), гематокрит (Ht), число эритроцитов, ретикулоцитов (Rt), тромбоцитов, лейкоцитов с подсчетом лейкоцитарной формулы, СОЭ в сравнении с контролем.

Контролем для оценки результатов показателей периферической крови служила Карга научной разработки ГНЦ РАМН.

Морфофуикииональное исследование эритроцитов изучали в лабораторной группе дифференциальной диагностики гемолитических анемий (в.н.с. С. В. Колодей) клиники химиотерапии лейкозов (руководитель профессор д.м.н. Н.Д. Хорошко).

Количественные эритроцитарные показатели: средний объем эритроцитов (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (МСНС), распределение эритроцитов по объему, (RDW) и эрптроцнтограмму определяли на автоматическом анализаторе крови COBAS MICROS 18 ОТ.

Морфологию эритроцитов изучали унифицированным микроскопическим методом в мазках периферической крови, фиксированных в метиловом спирте и окрашенных по Нохгу [Гольдберг Д.И., Гольдберг Е.Д., 1980].

Осмотическую резистентность эритроцитов определяли унифицированным методом в модификации Л.И. Идельсона [Идельсон Л.И., 1970]

Количество HbF определяли по методу Бетке, уровень НЬАг - путем илюирования гемоглобиновых фракций после электрофореза на ацетат-целлюлозных пленках в Трнс -ЭДТА-боратном буфере рН 8,6. Анализ качественного состава гемоглобина проводили методом электрофоретического разделения гемоглобина на пленках Titan Ш и Titan 1У при рН -8,6 и рН -6,5 .

Нестабильность гемоглобина определяли по методу Carrel с нзопропанолом и методу Молчановой с н-бутанолом.

Для диагностики ПНГ использовали тесгы Хема и сахарозный, для исключения АИГА -прямую пробу Кумбса и полнбреновый тест.

БноФитческие свойства эритроцитов исследовали в лаборатории физической биохимии системы крови (ст.н.с. Е.С. Шурхина, руководитель - профессор, д.б.н. Ф.И. Атауллаханов);

Исследование геометрических параметров эритроцитов проводилось с помощью фильтрационно-осмотического метода (ФИОМ). В основе ФИОМ лежит измерение фильтруемости эритроцитов при различных осмотнчностях среды через фильтры с диаметром пор 3 мкм. Исследование деформируемости эритроцитов проводилось с помощью модифицированного гемореомера Хансса [Лисовская И.Л, Шурхина Е.С., 1998].

Измерялось отношение времени протекания фиксированного объема суспензии эритроцитов через фильтр с диаметром пор 3 мкм (t s) ко времени протекания такого же объема буфера (t ь) через этот же фильтр (t t/t 5). Осмотичность крови 290 миллиосмоль (мосМ).

При осмотичности 220 мОсм начинается резкое ухудшение фильтруемое™ эритроцитов здоровых доноров. При осмотичности 190 -200 мОсм более 30% эритроцитов становятся нефильтрующимися. Значение осмолярности, при котором суспензия эритроцитов перестает фильтроваться, называется критической (Ucr).

Буферные растворы, использовавшиеся для исследования фильтруемости, содержали 5 мМ KCl, 10 мМ HEPES, NaCl в концентрациях, необходимых для создания определенной осмотичности среды, pH 7,4. Биохимический анализ.

Исследование биохимического анализа проводилось с применением общепринятых методов [Меньшиков В.В., ред.,1987] в клинико-диагностической лаборатории (зав. -Л.Ю. Тихонова).

Определяли: общий белок, содержание альбуминов и глобулинов, холестерина, билирубина, уровень тимоловой пробы, активность щелочной фосфатазы, АсТ и АлТ Гемостазиогоалта. выполнялась в лаборатории клинической коагулологии (руководитель - профессор, д. м. и. С.А. Васильев) и включала: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ); протромбиновый индекс (ПИ), тромбиновое время (ТИ); концентрация фибриногена (по методу Клаусса), показатели этанолового и О-фенантралинового теста (реагенты фирмы «Технология-Стандарт», Россия) - качественное определение ранних продуктов деградации фибриногена и фибрина; ХНа-зависимый фибринолиз; уровень антитромбина III (AT HI, по методу Абильдгаард и в тесте с хромогенным субстратом); количество тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов оценивали при помощи лазерного агрегометра (фирма «Biola», Россия), используя в качестве агонистов АДФ и ристоцетин. Кровь из вены больных забирали в угренние часы, натощак, в числе других образцов крови, в 2 пробирки с цитратом натрия 3,8% в соотношении 1: 9 (цитрат натрия: кровь).

Серодиагностику вирусных гепатитов проводили в отделении контроля крови на вирусные гепатиты и СПИД (зав. д.б.н. Ф.П. Филатов) с помощью иммуноферментных тест-систем в соответствии с приказом Минздрава РФ от 28.09.98 № 282 «Об использовании иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти- ВГС) в сыворотке крови человека)).

Для определения тяжести поражения печени и прогноза течения были выбраны следующие вирусспецифические серологические маркеры: антитела к вирусу гепатита С (анти-HCV), HBsAg, анти-HBs, анти-HBcIgG, анти- HBcIgM.

Маркеры гепатита В исследовали иммунофермектным анализом (ИФА). HBsAg определяли, используя тест-систему СП «НИАРМЕДИК»: положительные- образцы проверялись в подтверждающем тесте фирмы «РОШ» (г. Москва); анти-HBs и анти-HBcIgG определяли с помощью реагентов ЗАО «Вектор-Бест-Европа» (г. Новосибирск), анти-HBcIgM - тест-системой фирмы «РОШ».

Обследование на наличие маркеров вирусов гепатита С включало на первом этапе определение антител методом ИФА с помощью тест-системы «Рекомбибест анти-HCV» ЗАО «Вектор-Бест-Европа».

Дважды положительные образцы были дополнительно исследованы или в подтверждающем тесте этой же фирмы, или с использованием иммуноблотинга с рекомбинакгными антигенами (RYBA).

Содержание витамина В12 и Лолиевой кислоты в сыворотке крови и эритроцитах определяли в лабораторной группе изучения нарушений метаболизма железа отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (руководитель - д.м.н., профессор Хорошко Н.Д.) твердофазным непрямым конкурентным методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител к витамину В12 и фолиевой кислоте производства фирмы "Sigma" (США) [Левина АА. et al, 2000; Мамукова Ю.И. et al, 2002]. Исследование Феррокинетики основано на внутривенном введении (в локтевую вену) в физиологическом растворе хлорида натрия радиоактивного изотопа железа для инъекций, последующем взятии проб из вены другой руки обследуемого, определении отдельно радиоактивности плазмы и эритроцитов [Huffetal., 1951, Сахибов Я.Д., 1973г., Лапченков В. И. et al., 1973 г., Воробьев А.И., ред., 1985]. Проводила в радиоизотопной лаборатории ГНЦ РАМН к.м.н. Л.А. Пустовойт (руководитель - проф. Сукясян Г.В.).

Использовали 59Fe - цитрат - препарат железа, меченый радиоактивным изотопом и включающийся в гемоглобин эритроцитов, имеющий у - излучение и период полураспада 45 дней.

Определяли: время полуклирснса - период полувыведення (Ti/j( s,,Fe, оборот 59Fe плазмы, эритроцитов и степень утилизации Fe для эритропоэза через 72 часа, 4 суток, 7 суток с одновременным определением концентрации НЬ, гсматокрита, количество эритроцитов, концентрации НЬ в 1 эритроците (МСН).

Эффективность эритропоэза оценивали по количеству радиоактивного железа, включенного в состав гемоглобина циркулирующих эритроцитов.

Сичнтиграфическое исследование гемопоэгичсской системы производили в радиоизотопной лаборатории ГНЦ РАМН (руководитель - д м.и. Я.Д. Сахибов) через 4560 минуг после внутривенного введения от 180 до 220 М15к пирфотеха, меченного 99гаТс (технеций), полученного из элюата генератора.

Сбор, информации осуществляли в режиме «все тело» в передней и задней проекциях, сцинтиграфпя печени и селезенки - в режиме «статика». 11сиользовалась гамма-камера ОН 110 (фирма «Siemens», USA). Количественная оценка сцннтнграфии осуществлялась на системе обработки данных ОН 160.

Определяли: накопление РФП в костном мозге (центральные и периферические отделы костной системы), печени и селезенке (изучали форму органа, его размеры, активность накопления РФП с подсчетом количества импульсов па орган и единицу объема, а также процентного соотношения и характер распределения РФП к органе).

Распределение оценивалось качественными характеристиками: равномерность и неравномерность (диффузно-равномерная, диффузно-неранномерная и очаговая). Типиуование HLA локусое А и В проводили серологическим методом с использованием классического лимфоцитогоксического комплемент - зависимого теста [Зотиков Е.А., 1976, Terasaki Р., 1976] с использованием типирующнх реактивов фирмы Тисанс" (г. Санкт-Петербург) и Республиканской СПК (Республика Беларусь) в Лаборатории иммунологического типирования клеток крови (зап. проф. Зарецкая Ю.М.) и в Лаборатории иммуногематологии (зав. проф. Зотиков Н А ).

Контролем служили сведения о частоте встречаемое'! п лшнгенов HLA среди жителей г. Москвы [Зотиков Е.А., 1982].

Определение основных C282Y. H63D и S65C мутаций гена HFE выполняли в Лаборатории генной инженерии (руководитель - к.б.н. Мнсюрпн А.В., н.с. Зборовский С.С.) методом ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) [Зборовский С.С. et al, 20011

Тонкоигольная пункиионная биопсия печени выполнялась доцентом, к. м. н. М.В. Северовым, при кратковременном стационарном пребывании больных в клинике терапии профболезней 1 ММА имени И.М. Сеченова.

По показаниям проводшшсь дополнительные лабораторные, эндоскопические, ремтгенраднологнческне (УЗИ п KT) исследования.

Статистический яиялич результатов. проводили путем вычисления средней арифметической по Петерсу с оценкой достоверности различия средних величин между сопоставляемыми группами по доверительному коэффициенту (t Стыодента) с помощью критерия достоверности (Р), результат считайся достоверным при Р < 0, 05. Полученные данные анализировались при помощи средств статистического анализа программы Excel 97.

Результаты и ну обсуждение.

У обследованных пациентов жалобы были неспецифпчны: на общую слабость, повышенную утомляемость, недомогание, вялость, снижение аппетита, масЬы тела, внимания, работоспособности. Наиболее часто встречались следующие клинические признаки: астеновегетативный синдром, дискомфорт в правом подреберье, диспепсический синдром, снижение массы тела, кожный зуд, гепато- и спленомегалпя, геморрагический синдром (десневые, носовые кровотечения), боли в области сердца и нарушение ритма, меланодермпя, артралгни.

/. Пммупогепетический профи ль и выявление мутаций гена HFE у больных НГ.

По результатам типирования 237 больных НГ по антигенам HLA А и В локусов установлено, что (рис. 1): - в группе I (условные гомозиготы) частота встречаемости HLA-A3 составляла 96,0% (в контроле 30,3%): HLA В7 - 87,9% (в контроле 23,4%); HLA В14 - 18,2% (в контроле 5,0%), HLA В13 12,1% (в контроле - 9,0%). Наши данные согласуются с данными литературы [Сетгарова Д А., 1986; Романова Е.А., 1999, Edwards C.Q. et al, 1977]. Низкая частота встречаемости у обследованных больных I группы (3-4%) характерна для антигенов локуса В: В17, BIS, В27;

во II группе (условные гетерозиготы) было выявлено увеличение частоты встречаемости, по сравнению с контролем, для следующих антигенов: I1LA A3 - 55,1% (30,3%); All -14.5% (13,3%), В7 - 34,8% (23,4%); В13 - 12,3% (9,0%), В14 12,3% (5,0%); В35 - 27,5% (22,3%). У пациентов с гетерозиготной формой НГ частота встречаемости классических маркеров - антигенов HLA - A3, В7, В14 оказалась более низкой, чем у гомозиготных лиц (примерно в 2 раза) п менее выражено превышала контрольные показатели. Но во II группе нами обнаружена более высокая частота встречаемости HLA-AU, В35 по сравнению с данными для гомозиготной формы НГ

При обследовании 12 семей больных НГ выявлена частота встречаемости гаплотипа АЗ В7 в I группе в 38,46% случаев против 10% у здоровых лиц, во II группе - в 7,1%.

Гаплотип АЗ-В14 обнаружен в 12,8% случаев (в контроле 1%) в I группе и в 1,8% случаев во II группе, гаплотип А3-В35 - в 10,2% случаев (у здоровых лиц его частота встречаемости 6,2%) и в 7,0% случаев в I и II группах соответственно. Исследование ДНК проводилось у 65 пациентов из I и II группы (деление на группы проводилось условно по результатам НЬА-типирования).

В I фуппе (при типировании по НЬА все больные этой группы имели классические гаплотипы АЗ В7 и АЗ В14) среди обследованных 35 больных в целом мутации выявлены у 17 человек: 6 гомозиготных по С282У и I гомозиготный по НбЗО мутации, 3 пациента были гетерозиготны по С282У и 7 - гетерозиготны по НбЗО мутации.

Во II группе (пациенты этой группы при типировании по НЬА имели в фенотипе только один классический НЬА-маркер: НЬА АЗ, В7 или В14) из 30 обследованных пациентов мутации выявлены у 12: 2 гетерозиготных по С282У, 8 гетерозиготных по НбЗО, 1 гомозиготный по С282У мутации и 1 гомозиготный по НбЗО мутации. Также во II группе в I исследовании выявлена гетерозиштность по мутации 565С.

Таким образом, в I группе (100% больных с наличием классических НЬА гаплотипов) мутации выявлялись у 48,6% пациентов (17 человек), во II группе (100% больных имели наличие одного классического НЬА маркера) мутации выявлялись в 43, 3% случаев (13 человек).

□ 12 человек (имеют

мупшю) П53 человека (мутация отсутствует)

□81,50%

Ркс.2. Распределение частоты мутации С282 У.

26,20%

□ 17 человек (имеют мутацию)

□ 48 человек (мутация отсутствует)

73,80%

Рпс.З. Распределение частоты мутации Н631)

Полученные результаты позволяют полагать, что, возможно, не все ассоциированные с заболеванием генетические маркеры четко выявлены. Типирование по НЬА и исследование ДНК по выявлению мутаций гена НРЕ не являются взаимно исключающими методами обследования и должны проводиться одновременно.

По клиническим данным, типирование по НЬА-антнгенам шире диагностирует наследственный гемохроматоз.

Комплексное генетическое обследование - типирование лимфоцитов периферической крови по НЬА антигенам серологическим методом н анализ ДНК - дает возможность выявления НГ у пациентов, гетерозиготных по НЬА и в доклинической стадии НГ. Но, к сожалению, ДНК - диагностика - метод исследования высоких медицинских технологий -малодоступен для практических врачей: применение этого метода ограничено из-за использования дорогостоящего медицинского оборудования и реактивов.

В результате • проведения НЬА типирования и генетического исследования ДНК возможна ранняя диагностика НГ, позволяющая своевременно разработать профилактические программы и начать рациональную тактику лечения этой тяжелой наследственной патологии.

2. Серологические маркеры вирусных гепатитов V больных наследственным гемохроматозом.

Дифференциальную диагностику НГ проводят с хроническим заболеванием печени вирусной этиологи», учитывая наличие клинически сходных признаков и жалоб, предъявляемых больными, что, возможно, обусловлено цнтотоксическнм действием микроэлемента на мембрану гепатоцитов [Кириленко В.А. с соавт., 1982].

Больные НГ относятся к группе высокого риска заражения гепатотропнымн вирусами из-за необходимости постоянного проведения повторных лечебно-диагностических парентеральных процедур.

Маркеры вирусов гепатитов В/С были обнаружены у 41 человека (27 мужчин и 14 жешцин) - это 23% от общего количества больных.

Частота встречаемости вирусспецнфических маркеров в сыворотке больных НГ в сравнении с таковыми показателями у доноров крови представлена на рпс.4.

4(1 35

20 15 11) -5 ■ 1) —

щ-

Иг

а II ти ЦСУ НВэЛг анти НВс|£М ТИП

антм ПВс анти НВс1еС анти ан 1114 Л ти НВс

|сЭдоноры (У.) 1,5 3,8 34,6 20,6 1,24 ' 33,<» 20,6

|Н11Г(%) 2,2 1,1 6,2 4,5 2.8 10,7 1,7

рис. 4. Частота встречаемости впрусспеипфичсскнх маркеров у больных НГ в сравнении с донорами.

В целом у больных НГ наиболее часто выявлялись антитела к НВх (10,7%) н НВс (6,2%), что свидетельствует о ранее перенесенной инфекции.и наличии хронического гепатита и согласовывалось с биохимическими показателями.

Инфнилрованпосгь НСУ отмечалась у 3 пациентов, что является фактором развития первичной гепагацеллюлярной карциномы.

Представленные данные свидетельствуют о том, что частота встречаемости маркеров вирусов гепатитов В и С у больных НГ не превышает частоты выявления носнтельства инфекции в донорской популяции. Это позволяет предположить, что гепатотропные вирусы усугубляют течение НГ, что требует индивидуального подхода к этой группе пациентов при выборе методов терапии. Для доказательности этого были изучены показатели биохимического анализа крови пациентов с НГ. 3. Биохимический шшлт крови при наследственном гемохраматме.

Ишепенпя биохимических показателей сыворотки крови больных НГ были гетерогенными, наиболее ярко выражены в I группе и в группах с наличием маркеров гепатогроппых вирусов (1(6), 1(г), 11(6), И(г)) (рис.5).

Во всех группах ~ в 30% - 50% случаев выявлялась дпепротепиемпя: снижение содержания альбуминовой фракции белка (р<0,05) при некотором повышении уровня а! -п у - глобулпповон фракции (р<0,001) (в группе 1(г) отмечалось повышение содержания глобулинов за счет всех фракций (р<0,01)).

Отмечалась тенденция к повышению уровня билирубина за счет «связанной» фракции во всех группах (р<0.5) - в 30% случаев.

Найденные изменения (днепротеинемия, повышение активности ферментов АлТ, АсТ, ЩФ, ЛДГ. высокие показатели осадочной тимоловой пробы) говорят о поражении печеночной ткани, более выраженном при наличии маркеров вирусов гепатитов В/С/

~ в 20-30% случаев во всех группах (за исключением группы 1(6)) в сыворотке крови больных выявлялось повышенное содержание Р-лппопротеидов (р<0,001) (66-108 ед). Найденные отличия статистически достоверны (р<0,05). Активные молекулы лннопротепдов, как известно, реагируют с эндотелием сосудов, что может усиливать клинические проявления НГ.

240 200 160 120 80 40

норма 1 гр. ВГ(-) 1 гр. ВГ(+) 2 гр.ВГ(-) 2 гр. ВГ(+)

И билирубин, мкмоль/л 20,5 28,4 34,8 17,7 14,7

□ АсТ, и/л г; 40 34,8 59 34,8 94,2

□ Ал Г, и/л 40 40 77 37,2 82,1

□ ЩФ, ед/л - ; . 140 - 126 199 111 226

□ тимоловая проба, сд • 5 2,5 6,7 3,1 10

рис. 5. Мшспаши ппк.1 ¡.пг ки биохимического ¡шалша крови у больных НГ.

4 Клинический аналт крови, морфо-функциоиальиые и Онофтнческие свойства

эритроцитов при НГ.

4.1. Клнннчссь'нй анализ крип».

В 2000 г. Barton J.C. et al на основании изучения параметров эритроцитов периферической крови 60 больных НГ с HFE генотипом показали, что у данных пациентов показатели содержания общего НЬ, гематокрита, MCV, МСН и МСНС значительно выше, чем у здоровых лиц и связано это, вероятно, с увеличенным синтезом НЬ вследствие увеличенного содержания железа в организме. Наши исследования показывают иные результаты.

Изменения показателей клинического анализа крови носили полиморфный гетерогенный характер. Наличия в 100% случаев высоких показателей НЬ, Ht, эритроцитов и МСН не установлено (рис.6).

Имелся разный уровень НЬ: у 70-80% пациентов отмечались нормальные цифры НЬ, в отдельных случаях НЬ превышал верхнюю границу нормы или был снижен.

Найдена тенденция к снижению МСН у 50-70% больных (р<0,05) и гематокрита (р<0,34).

При внутригрупповом анализе показателей во всех группах отмечена тенденция к лейкопении, тромбоцитопении, небольшому лимфоцитозу (р<0,02); в подгруппах с носительством маркеров вирусов гепатитов - тенденция к увеличению СОЭ (р<0,0001). В группе 1(6)- мужчины с наличием гаплотипов HLA АЗВ7 или АЗВ14 - носители антител к вирусам гепатитов В и/или С - выявлена 2-х ростковая цитопения (р<0,0001).

Найденные изменения не зависят от пола пациентов и гомозиготной или гетерозиготной формы наследственного гемохроматоза. Более значимые различия в соотношении исследуемых параметров отмечаются внутри каждой группы с приоритетным их изменением у больных с наличием сывороточных маркеров вирусов гепатитов В и/или С (разница достоверна, р<0,05).

рнс.6. Изменения показателен периферической кровн (НВ, МСН) у больных наследственным гемохроматозом.

4.2. Мопфо-функциоиальиые особенности эпптрончтов ппч наследственной гсмохпоматозр.

Количественные эрнтроцнтарные показатели во всех четырех группах в среднем укладывались в нормальные показатели.

Изменения морфологических показателей эритроцитов носили разноплановый характер вне зависимости от пола и возраста.

Установлено, что эритроциты больных НГ имеют тенденцию к изменению их величины п окраски по Hoxty (аннзоцитоз, анизохромия с преобладанием гипохромии). Наличие аномальных форм (мишеневндных эритроцитов, овало-, дакрно-, аканто-, мпкросфероцнтов и др.) указывает на наличие нормального и патологически измененного пула клеток. Появление в кровяном русле трансформированных эритроцитов предполагает появление реологических расстройств, внугрисосудистой агрегации [Козинец Г.И.. Снмоварт Ю.А.. 1984].

В патогенезе морфологических нарушений эритроцитов может играть роль селезенка и экстрамедулляриый гемопоэз [Farolino D.L. et а!, 1986]. В связи с нарушением утилизации железа эритроцитами в мембране эритроцитов возможно нарушение метаболизма, что, в свою очередь, также приводит к изменениям морфологии клеток [Yoshimoto М. Yavvata Y.. 1983].

Появление или увеличение числа эритроцитов с малым содержанием гемоглобина или появление пула клеток, отсутствующего в норме, служит отражением неэффективного эрптропоэза. что может рассматриваться как временный компенсаторный процесс или нарушение регуляции гемопоэза [Сулейман С., 1991]. J.3. Кнофизнчсскне свойства эпчтпончтоп.

Деформируемость - это способность эритроцита менять свою форму благодаря наличию избыточной поверхности, то есть разности между площадью поверхности эритроцита н площадью поверхности сферы такого же объема. Анализ распределения эритроцитов по деформируемости позволяет определить количество патологически измененных клеток. Ширина распределения показывает степень неоднородности суспензии [Литовская И.Я., Шурхпна Е.С., 1998]

Параметр U1 - это предельная осмолярность, при которой начинается резкое ухудшение фильтруемостн эритроцитов.

Параметр Ucr - критическая осмолярность, при которой суспензия эритроцитов перестает фильтроваться, зависящий от отношения площади поверхности эритроцитов к объему. Уменьшение Ucr происходит при увеличении отношения площади поверхности

эритроцитов к объему (увеличение сферичности). Как правило, это происходит вследствие дегидратации эритроцитов.

Только у 2 пациентов этот парамегр превышает норму (200-206 мОсм), что говорит об ухудшении деформируемости вследствие уменьшения отношения площади поверхности эритроцитов к обьему. В этом случае возможно появление микросфероцитов и сфероцитов.

У остальных исследовавшихся больных деформируемость была либо нормальной, либо улучшенной. Поскольку любое отклонение от нормы является признаком патологии, параметр Ucr можно использовать для оценки степени патологического процесса. 5. Исследование системы гемостта больных наследственным гемохпоматозом.

Основным методом коррекции избыточного количества железа являются многократные плановые кровопускания, с этой же целью возможно использование эфферентных методов терапии (плазмаферез) [Щербинина С.П. ct at, 1993, Щербинина С П. et al, 1997; Щербинина СЛ. et al, 2002, Смирнов О.А. et al, 1999] Это может привести к развитию гнперкоагуляшюнного синдрома у пациентов с гемохроматозом [Воробьев А.И. et al, 2002]. Поэтому необходимо тщательное коагулологнческое обследование пациентов.

Установлены разнонаправленные изменения гемостаза и фибринолиза. Имеет место активация свертывающего каскада, протекающая на фоне депрессии фибринолиза, что может приводить к развитию тромбогеннон опасности и гиперкоагуляционному синдрому при поступлении экзогенного прокоагулянтного материала.

Патологически значимые изменения АЧТВ, тромбннового времени и паракоагуляцнонных тестов наблюдались у всех больных. Укорочение АЧТВ выявлено в 41.8% случаев, удлинение - в 52,2% случаев, АЧТВ характеризует внутренний механизм запуска гемокоагуляционного каскада [Бокарев И.Н., 1989] и увеличивается за счет повышения содержания прокоагулянтов, принадлежащих к глобулинам или глнкопротеидам. в синтезе которых велика роль печени [Хазанов А.И., 1988]. Укорочение АЧТВ происходит при дефиците плазменных факторов.

В тромбиновом тесте оценивается конечный этап процесса свертывания. Гппокоагуляцпя в нем появляется раньше и выражена при ДВС-снндроме [Баркаган З.С., 1988; Бокарев И Н. et al, 1989]. Ускорение образования сгустка под влиянием тромбина говорит о гнперкоагуляцип. Укорочение тромбннового времени отмечено у 41,8% пациентов с НГ, удлинение показателя - у 40.3% больных.

Положительный этаноловый тест выявлен у 76,1% пациентов. О-фенантралнновын тест значительно укорочен в 82,1% случаев. Паракоагуляцнонные тесты - качественные реакции, регистрирующие феномен расслоения фпбрипогенового пула и образования

высокомолекулярных растворимых фпбрин-мономерных комплексов (РФМК). Это маркеры ДВС. На разных этапах развития ДВС-синдрома могут наблюдаться положительные результаты обоих тестов пли поочередно каждого из них [Баркаган 3. С., 1988]

Выявленные изменения не носят зависимости от. пола и формы заболевания (гомо- или гетерозпготностп), более выражены в группах пациентов с наличием сывороточных маркеров впрусон гепатитов В и/или С. Наличие данных маркеров усугубляет функциональные изменения печеночной паренхимы, что проявляется в дисбалансе синтеза компонентов плазменного гемостаза.

6. Метаболит желта I1 больных наследственным гемохроматазом.

Результаты комплексного исследования гомеостаза железа были разнонаправленными, подтверждая гетерогенность изменений исследуемых параметров и степень нарушения метаболизма железа при НГ (рис.7).

Суммарная оценка всех показателей обмена железа у больных НГ позволяет выделить НТЖ, сывороточный п эритроцнтарныП ферритнны как наиболее достоверный критерий развивающегося заболевания.

Изменения показателей метаболизма железа более выражены у мужчин с наличием классических маркеров наследственности НГ - гаплопшов НЬА АЗВ7 и АЗВ14 (р<0,001). Следовательно, половой признак у больных НГ играет существенную роль в оценке показателей, свидетельствующих о прогресспровании заболевания и эффективности применяемых методов лечения.

Показатель сывороточного ферритина - ведущий в оценке развития сопутствующих вирусных гепатитов, так как его уровень существенно выше у пациентов с наличием маркеров вирусов инфекционных гепатитов (р<0,001).

100% 80% 60% 40% 20% 0%

ги >Д

<гч 1

груп ма

гш.

шж

<.\ 2

груп па

±0х

□ СЖ ПОЖСС Ш1ТЖ ОФС ПФР )

Рис.7. МетяГмлиш желечя у больных наследственным гемохроматозом.

7. Первый опыт исследования кинетики железа у больных наследственным гемохрояштозом.

При исследовании обмена железа внутри организма (феррокинетнкн) изучается всасывание железа желудочно-кишечным трактом, исчезновение железа из плазмы, появление железа в эритроцитах, отложение железа в депо. С помощью этого метода можно получить более динамичную картину снабжения кислородом клеток костного мозга и производить количественную оценку продукции эритроцитов [Аркадьева Г.В., 1999].

Гест с ^Fe остается практически единственным функциональным тестом, позволяющим изучать ¡n vivo экстрамедуллярный эритропоэз [Воробьев А.И., ред., 1985].

Результаты оценки уровня феррокинетпчеекпх показателей у больных НГ (табл.1) позволили нам установить следующее (нормы ежесуточного оборота железа плазмы и эритроцитов рассчитывались в зависимости от средних показателей сывороточного железа):

1. Медиана полуклнренса плазмы 133 мин±13,9 мин (скорость выведения радиоактивного железа из плазмы увеличена у 4 пациентов из 7 обследованных).

2. Имея значение полуклнренса плазмы, расчетным методом определяли скорость транспорта железа в плазме (натуральный логарифм 2 = 0,693 делили на Т m плазмы 2,2 часа). Скорость клиренса плазмы 0,315. В данной группе больных увеличен оборот плазменного (18,45±2,0 мг/л) н незначительно - эритроцитарного Fe (13,42±1,7 мг/л), i.e. увеличено количество железа, транспортируемого в I л плазмы в сутки. Оборот железа эритроцитов показывает фракцию железа, утилизированного для эффективного образования эритроцитов и отражает ежесуточный уровень эратроцптарной продукции. Оборот железа плазмы больше нормы у 5 пациентов, у 2 - этот показатель на верхней границе нормы. Оборот железа эритроцитов находится в пределах нормы у 5 пациентов, у 2 - он превышает нормальные величины.

3. Степень утилизации Fe для эритропоэза в течение 5-6 суток снижена у 4 пациентов (большие сроки отражают выход меченых эритроцитов), только на 8 сутки у 1 пациента утилизируется Fe для эритропоэза больше, чем у здоровых людей (в среднем 110% при-' норме 84%), что, является особенностью эритропоэза больных наследственным гемохроматозом и свидетельствует о том, что в плазме содержится большое количество железа, которое не используется для эритропоэза, а, по всей видимости, откладывается в депо. При этом сам эритропоэз не нарушен.

4. Результаты радиометрии над органами, участвующими в процессе образования и утилизации эртроцптов (печень, селезекнка, костный мозг) у большинства пациентов

не отличались от нормы, что является, с нашей точки зрения, доказательством их активного участия в эрнтропоэзе. У 2 пациентов мы отмечали высокий счет над печенью и селезенкой и замедление кинетики Ре в костном мозге, что говорит о наличии увеличенных запасов Ке в этих органах и неэффективном эритропоэзе в костном мозге.

Табл.1 Средние показатели красной крови н феррокпнетнки у больных НГ.

Показатели Норма Данные пациентов М+т.

1. Количество больных, чел. 7

2. Возраст, лет 37,7+6

3. III), г/л 130-160 150,8±7,5 ■

4. Средннн концентрация НЬ и 1 эритроците, МСН, пг 30-35 31,14+0,46

5. Гсмагокрнт, % 40-48 40,7±1,4

6. Эритроциты, х 10 12 /л 4,0-5,0 4,6±0,2

7. 'Г 1/;(полуклнренс), мин 60-120 133+13,9*

8. ежесуточный оборот Ге плазмы, мг/л 8,4-15,5 18,45±2,0*

'). ежесуточный оборот Ре эритроцитов, мг/л 6,7-12,4 13,42+1,7*

10. Степень утилизации Ре для эритропоэза на 3 суткн,% п=4 50 40,2+14,5*

12. Степень утилизации на 5 сутки,% п=5 87 80,9±5,73*

♦разница достоверна по сравнению с нормой (р<0,05)

Я. Ридионгклидное исследование органов кроветворения у больных с наследстаепиым гемохроматоюм.

У абсолютного большинства больных (80%) с наследственным гемохроматозом выявляются сцинтиграфпческие признаки нарушения функции ретикуло-эндотелиальной системы скелета, что косвенно говорит о патологических сдвигах в кроветворных органах

Сочетание повышенного накопления радиофармпрепарата в макрофагах периферических отделов костной системы при снижении накопления РФП в центральных отделах с увеличением размеров печени, селезенки и днффузно-неравномернмм распределением радпофармпрепарата в печени - характерная для НГ сшплпграфическая картина.

Проведенным анализ свидетельствует о высокой информативности радионуклидного исследования для оценки активности кроветворения, выявления степени поражения печени и селезенки у больных НГ.

Полученные результаты при сопоставлении с клиническими, лабораторными и другими тешами дают возможность использовать их в клинике для ранней диагностики НГ и прогнозирования течения заболевания.

9. Сравнительный аналт содержания витамина В12 и фолатов в wumpomimax и сыворотке крови больных НГ.

Витамин В12 н фолиевая кислота играют значительную роль в процессах кроветворения, являются необходимыми компонентами для осуществления нормального синтеза белка, в частности гемоглобина, и предшественников ДНК [Malgnus Е.М., 1975].

Известны заболевания, сопровождающиеся высоким содержанием в крови вит. В12 и фолневой кислоты, в частности, это заболевания с поражением паренхимы печени, что может имен, место при гемохроматозе. Высокое содержание сывороточного витамина В12 у таких пациентов связано с реакцией высвобождения этой субстанции из гепатоцнгов вследствие их деструкции и нарушения функции [Wickramasinghe S.N. et al, 14851

Низкое содержание витамина В12 в сыворотке крови п фолневой кислоты в эритроцитах могут указывать на истинную тканевую недостаточность этих витаминов с вытекающими в дальнейшем последствиями, несмотря на нормальные показатели гемограммы [Matthews J.H. et al, 1988]. Уровень фолатов в плазме не является надежным индикатором дефицита фолагов, так как он быстро реагирует на поступление фолатов с пищей.

Недостаточность витамина В12 и фолневой кислоты нарушает процессы созревания эритроцитов, тромбоцитов, а дефицит фолиевон кислоты также вызывает и торможение клональной пролиферации стимулированных лимфоцитов, что приводит к нарушению иммунного ответа [Левина A.A. et al, 2000].

Настоящее исследование проведено с целью возможного выяснения роли фолиевон кислоты и вит. В12 в развитии клинических проявлений НГ, при проведении дифференциальной диагностики, в динамике при назначении адекватной терапии.

Оценка уровня витаминов проводилась в комплексе с оценкой содержания сывороючного железа и феррнтнпов сыворотки и эритроцитов для выявления возможной взаимосвязи их изменений.

При исследовании содержания витамина В12 и фолатов в сыворотке крови и эритроцитах нммуиоферментным методом [Левина A.A. et al] было достоверно (р<0,05) выявлено значительное снижение уровня фолиевон кислоты в эритроцитах при

24

нормальной концентрации фолатов в сыворотке (рнс.8). Снижение уровня фолатов в эритроцитах выявлено на фоне нормального значения СЖ и значительного 2-10 кратного превышения норм уровней ФС и ФРЭ. Это предположительно может быть связано с активацией макрофагальной системы, наблюдающейся . при НГ, повышенным потреблением фолатов и развивающимся тканевым дефицитом фолиевон кислоты.

40 35 30 25 20 15 I 0 5 0

шк

норма

III 1П

I группа мужчины

I группа же кщнны

II группа мужчины

II группа же нщины

норма № ах

Пфолиевлн кислота, сыворотка, нг/мл

5,5

В фол иевая кислота, эритроциты, пг/г/НЬ

1,9

1,8

Рис.8. Содержание фолпевой кисло!ы в сыворотке крови н эритроцитах больных НГ.

Уровень витамина В12 в сыворотке и эритроцитах не менялся во всех группах (рис.9), за исключением женщин И группы, где выявлено снижение витамина В12 в эрнгроцитах, что может говорить о его дефиците, неэффективном эритропоэзе и снижением утилизации железа внутри зритроидных клеток.

4

7.7

7,6

1 4

2.1

4.2

Рис. 9. Содержание витамина В12 в сыворотке и эритроцитах больных НГ.

Данная работа является первым опытом определения уровня внтамнна В12 и фолиевой кислоты у больных ИГ с учетом влияния этих витаминов на кроветворение и метаболизм железа. Ранеее определялся уровень витамина В12 и фолиевой кислоты у больных с различными формами анемий в плане проведения дифференциальной диагностики [Мамукова Ю.И. с! а1, 2002, Цветаева Н.В. е1 а1, 2003]. Предположительно, снижение уровня фолиевой кислоты в эритроцитах на фоне значительного повышения уровня ФС и ФРЭ возможно вследствие нарушенной усвояемости и реализации фолиевой кислоты клетками эрнтропоэза.

Заключение.

На основании полученных результатов, мы разработали н рекомендуем следующий диагностический алгоритм обследования больных при подозрении на наличие наследственного гемохроматоза:

- клшшко-анамнестнческпе данные

- развернутый клинический анализ крови с изучением морфо-функциоиальных свойств эритроцитов и их деформируемости.

- определение серологических маркеров вирусов инфекционных гепатитов В/С

- исследование метаболизма железа

- анализ биохимических показателей сыворотки крови коагулограмма

исследование содержания витамина В12 и фолиевой кислоты в сыворотке крови и эритроцитах

комплексное генетическое обследование (НЬА-типирование и ДНК-диагностика на наличие мутаций гена 11РЕ)

радпонуклидные методы диагностики (сцннтиграфическое исследование гемопоэтической системы).

Выводи.

1. У больных с гомозиготной формой наследственного гемохроматоза доказана высокая частота встречаемости антигенов НЬА АЗ 96,0% (против 30,3% в популяции доноров); В7 87,9% (против 23,4% в контрольной группе); В13 12,1% (против 9,0% в контрольной группе), В14 18,2% (против 5,0% у здоровых лиц). У пациентов с гетерозиготной формой заболевания частота встречаемости антигенов НЬА составила для антигена АЗ - 55,1% (против 30,3% в сравнении с контролем); В7 - 34,8% (против 23.4% в контроле); В14 - 12,3% (против 5,0% в контроле). Мутация С282У установлена в 18,5%, мутация НбЗБ - в 26,2% случаев.

2. Показатели обмена железа у больных наследственным гемохроматозом характеризуются гетерогенностью. В среднем в 40,0% случаев уровень сывороточного железа обнаружен в пределах нормальных показателей. Повышение феррптина сыворотки и эритроцитов, высокая степень насыщения трансферрииа железом, конкретные признаки заболевания, определяются соответственно у 85% и 65% больных.

3. Морфо-функцнональные изменения эритроцитов: анизоцитоз, анизохромпя (окраска по Нох1у). наличие аномальных форм (мншеневпдных, овало-, дакрпо-, аканто-, инкросфероцитов и др.) выявлено у 94% больных п используется при дифференциальной диагностике наследственного гемохроматоза с другой патологией эрптрона. Несоответствие между нормальным содержанием общего гемоглобина и снижением его концентрации в одном эритроците отмечается у 67% больных.

4. Установлено значительное снижение уровня фолиевой кислоты в эритроцитах у 98% больных. Уровень витамина В12 в сыворотке и эритроцитах не изменялся.

5. При сцинтпграфическом исследовании органов кроветворения выявлено в 60% случаев повышение захвата радиоактивной метки макрофагами периферических отделов костной системы: плечевые, коленные, голеностопные суставы, бедренные кости, у 52% больных - снижение накопления радионуклида центральными отделами. В 75% случаев найдены изменения размеров печени и распределения в гепатоцнтах раднофармпрепарага. У 85% больных установлено увеличение селезенки и повышение накопления в ней раднонуклндной метки по отношению к печени. Степень выраженности сшппиграфических изменений служит контролем качества проводимой тсрагшн.

6. Доказаны разнонаправленные изменения гемостаза п фнбринолнза, свидетельствующие о наличии тромбогеннон опасности. Укорочение АЧТВ нашли в 41.8% случаев, удлинение АЧТВ - в 52,2%, показатель не изменялся у 6,0%

пациентов. Укорочение тромбинового времени отмечено у 41,8% обследованных, удлинение того же показателя - у 40,3% больных, в 17,9% случаев он не менялся. Этаполовын тест положительный у 76,1% пациентов. О-фенантралиновый тест зпачшельно укорочен у 82,1%. Изменения не зависят от пола и формы заболевания.

Список опубликованных работ:

1. Володичевя Е.М., Щербинина С.П., Багрянцева С.Ю. «Серологические маркеры вирусных гепатитов у больных наследственным гемохроматозом»// Новое в трансфузпологни-2003, вып.34, стр.43-50

2 Володнчева Е.М., Щербинина С П., Цыба Н.Н., Орел Е.Б., Рудакова В.Е. «Гемостаз при неаследственном гемохроматозе»// Тромбоз, гемостаз и реология.-2003, №1, стр.59-63

3. Володичсва Е.М., Щербинина С.П., Мисюрин А.В., Зборовский С.С. «Иммуиогенетическнн профиль п выявление мутаций гена HFE у больных наследственным гемохроматозом»// Новое в трансфузнологии.-2003, вып.35, стр.45-56

4. Володичсва Е.М., Цыба Н.Н., Щербинина С П. «Клинический анализ крови при наследственном гемохроматозе»// Гематология и трансфузиолопш, 2003, том 48, №5, стр. 34-41

5. Щербинина С.П., Цыба Н.Н., Максимов П.И., Володичсва Е.М. «Опыт лечения больных с наследственным гемохроматозом»// Новое в трансфузнолопш.-2002. Вып.30, стр.52-64

6. Щербинина С.П., Мигунов В.Н., Варламова Е.Ю., Худова С.Ю., Володичсва Е.М. «Показатели iуморального иммунитета фракций аутологичной плазмы больных с наследственным гемохроматозом»// Аллергология и иммунология, №2, томЗ, июнь 2002 г.. сгр. 293-299

7. S. .Shchcrbinina, О. Sukyasyan, A. Karpov, М. Vakhrushheva, Е. Volodicheva. «Estimation of haemopoietic system in patients with hereditary hemochromatosis using radiomiclides»//13ul' International Conference on Oral Chelation in the Treatment of Thalassaemia and Other Diseases. July 12-15, 2003, Prague, Czech republic, pp. 72. Abstract.

Актуальность проблемы. Наследственный гемохроматоз (НГ) — патологическое состояние, характеризующееся тяжелым, хроническим прогрессирующим течением и неблагоприятным прогнозом. Популяционными исследованиями установлено, что это одно из самых распространенных аутосомно-рецессивных заболеваний в Европе, Америке, Австралии с частотой гетерозигот 10-16%, развивающееся (гомозиготность), в среднем, в 3-7 случаях на 1000 носителей гена НГ [Bothwel and Macphail, 1998; Phatak et al, 1998, Dadon M.M., 1982].

НГ относится к группе болезней "накопления", заключается в генетически обусловленном нарушении метаболизма железа и начинается задолго до проявления симптомов [Авцын А.П., 1991; Dadon М.М., 1982; Simon М., 1988]. Клиническая картина заболевания гетерогенна и обусловлена избыточным накоплением железа в виде ферритина и гемосидерина в паренхимагозньк органах с последующим их фиброзом и функциональной недостаточностью, что приводит к относительно ранней инвалидизации и гибели больных [Сеттарова Д.А., Токарев Ю.Н., 1988; Валенкевич Л.Н., Яхонтова О.И., 1991; Елисеев О.М., 1988; Niederau С. et al, 1996; Bothwell Т.Н., 1998].

Основной орган-«мишень» - печень. Молекулярный механизм, лежащий в основе токсического действия железа, это генерация свободных радикалов и перекисное окисление липидов [Bacon B.R., Britton R.S. et al, 1990; Bonkovsky H.L., 1991].

В отличие от других заболеваний, осложняющихся перегрузкой железом, патогенез и этиология НГ мало исследованы, что затрудняет его раннюю диагностику. В силу многообразия и неспецифичности клинических проявлений, отсутствия характерных общепризнанных критериев выявления ранних стадий заболевания, длительности латентного периода заболевания, полисистемности поражения, что свойственно многим генным болезням человека [Мутовин Г.Р., 1998], диагностика заболевания представляет для клиницистов значительные трудности, требует использования специальных, порой малодоступных и дорогостоящих биохимических, генетических, инструментальных и морфологических методов обследования больных. Нередко это является причиной запоздалой или ошибочной диагностики. В связи с этим разработка доступного в современных условиях диагностического алгоритма представляется актуальной.

Повышение интереса к проблеме НГ связано с идентификацией гена гемохроматоза HFE и выделением его белкового продукта [Feder et al, 1996; Waheed et al, 1997; Parkkila et al,1997; Feder et al,1998; Gross et al,1998; Lebron et al, 1998]. С 1996 года начала разрабатываться генная диагностика НГ, т.к. были найдены две характерные мутации аллеля C282Y и H63D в гене HFE. Но ДНК-диагностика НГ является методом высоких медицинских технологий с использованием дорогостоящего оборудования и реактивов, что ограничивает его широкое применение.

До конца не решен вопрос адекватной специализированной лечебной помощи больным НГ.

Это приводит к отсутствию должной настороженности у врачей, которая на основании наличия некоторых клинико-гематологических проявлений позволяет заподозрить НГ.

В этой связи каждое исследование, направленное на изучение этиологии, патогенеза, диагностики, клинических проявлений и возможного выявления маркеров ранней бессимптомной стадии НГ представляется чрезвычайно важным.

В нашей работе ударение сделано на выявлении ранних признаков этого заболевания, поскольку развернутая стадия представлена во многих обзорах зарубежных . [Bothwel and Macphail, 1998; Finch C.A. and Huebers H.A., 1982, V. Fairbanks et al, 1984, 1985, 1995] и отечественных авторов [Сеттарова Д.А. et al, 1988, Абрамов М.Г., 1989, Елисеев О.М., 1988].

Ранняя диагностика позволит предупредить развитие осложнений за счет своевременно начатого лечения, улучшить прогноз течения болезни, увеличить выживаемость больных.

В литературе основное внимание уделяется изменениям обмена железа при наследственном гемохроматозе и только в отдельных работах представлены выявленые изменения гемоглобина, гематокрита, СОЭ.

Публикаций, посвященных оценке результатов комплексного исследования клинико-лабораторных показателей, в доступной нам литературе не найдено.

В этой связи представляло научно-практический интерес выявить возможные закономерности и особенности изменений клинико-лабораторных показателей больных при первичном диагностическом обследовании.

Полученные результаты ретроспективного анализа большого количества клинического материала, представленные в данном исследовании, с нашей точки зрения, могут стать основой для разработки алгоритма первичного обследования больных с подозрением на наличие НГ.

Цель работы.

Цель работы — определить критерии раннего установления диагноза наследственного гемохроматоза и разработать тактику обследования пациентов с подозрением на наличие этого заболевания.

Задачи исследования

1. Изучить результаты ДНК-диагностики и типирования по НЬА-антигенам больных наследственным гемохроматозом для установления взаимосвязи между наличием НЬА маркеров и мутаций гена НБЕ.

2. Определить частоту носительства различных серологических маркеров вирусов гепатитов В/С для уточнения их влияния на течение и прогноз заболевания.

3. Провести оценку клинического анализа крови, включая детальное исследование морфо-функциональных и биофизических свойств эритроцитов. Определить клиническую значимость выявленных изменений.

4. Оценить изменения биохимических показателей сыворотки крови больных наследственным гемохроматозом для уточнения функционального состояния печени как органа-мишени.

5. Определить обмен железа и феррокинетику у данной категории пациентов. Использовать полученные показатели для дифференциальной диагностики и для оценки эффективности проводимой терапии.

6. Изучить содержание в сыворотке крови и эритроцитах витамина В12 и фолиевой кислоты для обоснованного их применения в составе комплексной терапии больных наследственным гемохроматозом.

7. Исследовать состояние системы плазменно-тромбоцитарного гемостаза с учетом опасности тромбозов при проведении лечебных кровопусканий.

8. Провести радионуклидные исследования органов кроветворения для уточнения функционального состояния гемопоэтической системы. Использовать полученные показатели для ранней и дифференциальной диагностики данного заболевания. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Показатели обмена железа у больных наследственным гемохроматозом характеризуются гетерогенностью: ферритины сыворотки и эритроцитов, степень насыщения трансферрина железом являются наиболее информативными биохимическими маркерами данного заболевания. Показатель сывороточного ферритина - ведущий признак в оценке развития сопутствующих вирусных гепатитов: его уровень существенно выше у пациентов с наличием серологических маркеров вирусов гепатитов. 2. Выявлены разнонаправленные изменения гемостаза и фибринолиза, что характерно для синдрома ДВС. Имеет место активация свертывающего каскада, протекающая на фоне депрессии фибринолиза, что представляет тромбогенную опасность и должно учитываться при проведении многократных лечебных кровопусканий.

3. Феррокинетика больных наследственным гемохроматозом отличается высокой концентрацией плазменного железа, которое не используется для эритропоэза, а откладывается в депо. Эритропоэз у данных больных остается в пределах нормальных величин.

4. При сцинтиграфическом исследовании гемопоэтической системы с помощью радиоактивной метки обнаружено нарушение функции костного мозга (сниженное накопление РФП макрофагами центральных отделов костной системы и повышенное — в периферических отделах: плечевые, коленные, голеностопные суставы, бедренные кости); печени (диффузная неравномерность распределения радионуклида с изменением размеров органа) и селезенки (спленомегалия и активное накопление РФП по отношению к печени). Степень выраженности найденных признаков служит контролем качества проводимой терапии и дополнительным прогностическим критерием.

5. НЬА-типирование и ДНК-диагностика (выявление мутаций гена НБЕ) должны проводиться одновременно: у пациентов с классическими маркерами наследственности системы НЬА (антигены НЬА-АЗ, В7, В14) мутация С282У гена НРБ найдена только в 18,5%, а мутация НбЗБ - в 26,2%. Комплексный анализ - типирование лимфоцитов периферической крови по НЬА - антигенам серологическим методом и генетическое исследование ДНК - также дает возможность установить диагноз наследственного гемохроматоза у пациентов без наличия НЬА - антигенов АЗ, В7, В14, у гетерозиготных по НЬА и у пациентов в доклинической стадии заболевания.

6. Серологические маркеры вирусов гепатитов В/С усугубляют течение заболевания. У пациентов с наличием этих маркеров имеются значительные изменения гемостаза и метаболизма железа. При исследовании показателей биохимического анализа сыворотки крови у данной группы больных отмечается диспротеинемия, повышение активности ферментов АсТ, АлТ, тимоловой пробы, увеличено количества В-липопротеидов.

7. Отличительной особенностью больных наследственным гемохроматозом является резкое снижение концентрации фолиевой кислоты в эритроцитах при ее нормальном содержании в сыворотке крови. Уровень витамина В12 в сыворотке крови и эритроцитах в большинстве случаев находится в пределах границ физиологической нормы. Определяемые параметры требуют дифференцированного подхода к лечебному применению данной группы витаминов у больных с перегрузкой железом.

Научная новизна и практическое значение работы

В России работа является первым комплексным исследованием клинико-лабораторных показателей пациентов с наследственным гемохроматозом.

Полученные результаты помогут в более ранней диагностике этой тяжелой наследственной патологии и разработке патогенетически обоснованных методов лечения данного заболевания.

Предложен алгоритм первичного обследования больных с подозрением на наличие наследственного гемохроматоза, включающий: НЬА-типирование и ДНК-диагностику, серологическое исследование сыворотки крови на наличие маркеров вирусов гепатитов В и/или С, полный клинический анализ крови с детальным изучением морфо-функциональных и биофизических свойств эритроцитов, биохимические показатели функции печени, обмен железа и феррокинетику, исследование системы тромбоцитарно-плазменного гемостаза, содержание фолиевой кислоты и витамина В12 в сыворотке и эритроцитах, радионуклидное исследование органов кроветворения.

При изучении клинического анализа крови выявлено несоответствие между содержанием общего гемоглобина и гемоглобина в одном эритроците: у 50-55% больных имелось снижение концентрации МСН при нормальных показателях общего НЬ. Найдены морфо-функциональные изменения эритроцитов при наследственном гемохроматозе.

При исследовании метаболизма железа и феррокинетики установлена гетерогенность изменений показателей. Отмечено достоверное увеличение НТЖ, ферритинов сыворотки и эритроцитов и не найдено высоких цифр сывороточного железа.

Продемонстрированы изменения гемопоэтической системы, свойственные больным наследственным гемохроматозом. Данные показатели можно использовать для прогноза и оценки эффективности проводимой терапии.

Обнаружено, что мутация гена НРЕ НбЗБ встречается с большей частотой, чем мутация С282У. Не у всех пациентов, имеющих классические НЬА-маркеры, найдены мутации гена I наследственного гемохроматоза, что доказывает необходимость проведения комплексного ! генетического обследования больных.

Частота выявления серологических маркеров вирусов гепатитов В/С у пациентов с наследственным гемохроматозом не превышает таковую в популяции доноров. Наличие данных маркеров усугубляет течения заболевания, что подтверждается изменением биохимических показателей сыворотки крови, метаболизма железа и состоянием гемостаза.

Установлены разнонаправленные изменения гемостаза и фибринолиза, что должно учитываться при проведении лечебных мероприятий эфферентной терапии с целью предупреждения возможных тромбогенных осложнений. г и

Показано значительное снижение концентрации фолиевой кислоты в эритроцитах больных наследственным гемохроматозом, что свидетельствует о дефиците этого витамина.

Ретроспективная оценка клинико-лабораторных показателей дает возможность более ранней дифференциальной диагностики наследственного гемохроматоза, выработки тактики лечения, что значительно улучшает прогноз при этой патологии.

Публикации

По материалам исследования опубликовано 7 научных работ. Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов и их обсуждения, заключения и выводов, изложенных на 124 страницах. Материал диссертации содержит 15 рисунков, 23 таблицы, снабжен указателем литературы, состоящим из 415 источников, из них 110 отечественных и 295 иностранных.

Выводы.

1. У больных с гомозиготной формой наследственного гемохроматоза доказана высокая частота встречаемости антигенов НЬА АЗ 96,0% (против 30,3% в популяции доноров); В7 87,9% (против 23,4% в контрольной группе); В13 12,1% (против 9,0% в контрольной группе), В14 18,2% (против 5,0% у здоровых лиц). У пациентов с гетерозиготной формой заболевания частота встречаемости антигенов НЬА составила для антигена АЗ - 55,1% (против 30,3% в сравнении с контролем); В7 - 34,8% (против 23,4%) в контроле); В14 - 12,3% (против 5,0% в контроле). Мутация С282У установлена в 18,5%, мутация НбЗБ - в 26,2% случаев.

2. Показатели обмена железа у больных наследственным гемохроматозом характеризуются гетерогенностью. В среднем в 40,0% случаев уровень сывороточного железа обнаружен в пределах нормальных показателей. Повышение ферритина сыворотки и эритроцитов, высокая степень насыщения трансферрина железом, конкретные признаки заболевания, определяются соответственно у 85% и 65% больных.

3. Морфо-функциональные изменения эритроцитов: анизоцитоз, анизохромия (окраска по Нох1у), наличие аномальных форм (мишеневидных, овало-, дакрио-, аканто-, микросфероцитов и др.) выявлено у 94% больных и используется при дифференциальной диагностике наследственного гемохроматоза с другой патологией эритрона. Несоответствие между нормальным содержанием общего гемоглобина и снижением его концентрации в одном эритроците отмечается у 67% больных.

4. Установлено значительное снижение уровня фолиевой кислоты в эритроцитах у 98% больных. Уровень витамина В12 в сыворотке и эритроцитах не изменялся.

5. При сцинтиграфическом исследовании органов кроветворения выявлено в 60% случаев повышение захвата радиоактивной метки макрофагами периферических отделов костной системы: плечевые, коленные, голеностопные суставы, бедренные кости, у 52% больных - снижение накопления радионуклида центральными отделами. В 75% случаев найдены изменения размеров печени и распределения в гепатоцитах радиофармпрепарата. У 85% больных установлено увеличение селезенки и повышение накопления в ней радионуклидной метки по отношению к печени. Степень выраженности сцинтиграфических изменений служит контролем качества проводимой терапии.

6. Доказаны разнонаправленные изменения гемостаза и фибринолиза, свидетельствующие о наличии тромбогенной опасности. Укорочение АЧТВ нашли в 41,8% случаев, удлинение АЧТВ - в 52,2%, показатель не изменялся у 6,0% пациентов. Укорочение тромбинового времени отмечено у 41,8% обследованных, удлинение того же показателя - у 40,3% больных, в 17,9% случаев он не менялся. Этаноловый тест положительный у 76,1% пациентов. О-фенантралиновый тест значительно укорочен у 82,1%. Изменения не зависят от пола и формы заболевания.

Заключение

Наследственный гемохроматоз, несмотря на успехи в накоплении знаний, остается наименее известной патологией современной медицины.

Это тяжелое HLA-ассоциированное полисистемное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, обусловленное генетическим дефектом, который приводит к повышенному всасыванию железа в желудочно-кишечном тракте.

Распространенность наследственного гемохроматоза: среди белой европейской расы гомозиготы встречаются от 1 на 100 до 1 на 300 жителей в разных странах, гетерозиготы — 10% европейского населения [Павлов Ч.С., 2001] . По разным литературным данным, 50% - 80% этих пациентов имеют мутацию C282Y на недавно открытом гене HFE хромосомы 6. Варианты гемохроматоза существуют и при мутациях еще неизвестных генов.

Feder J.N. в 1996 году назвал наследственный гемохроматоз «генетическим нарушением XXI века».

Пациенты с идентичной генетической основой демонстрируют различные фенотипические проявления заболевания. Фенотип может проявляться и как ранняя смерть, и как бессимптомное течение вплоть до зрелого возраста. В настоящее время большинству пациентов диагноз ставится только на развернутой стадии заболевания или аутопсии. Наследственный гемохроматоз редко диагностируется в популяции в целом, часто его путают с синдромом перегрузки железом, что увеличивает частоту диагностических ошибок до 45,2% [Сеттарова Д.А., 1988].

Как сообщается в разных источниках, у врачей нередко уходит 4-5 лет на выяснение правильного диагноза, несмотря на большое количество публикаций, предостерегающих от поздней ошибочной диагностики этого тяжелого заболевания.

Причины для поздней диагностики следующие: низкая осведомленность врачей о высокой частоте наследственного гемохроматоза, ожидание найти классическую триаду симптомов (цирроз, диабет, гиперпигментация), которые присутствуют только на развернутой стадии заболевания и у небольшого числа пациентов, неспецифичность и полиморфизм ранних симптомов (недомогание, легкая утомляемость, слабость, умеренные артралгии, диспепсия), разнообразие жалоб больных, длительный период скрытого течения болезни, полиорганность отложения железа, необходимость использования специальных, порой малодоступных и дорогостоящих методов обследования и лечения.

Актуальна и требует клинического решения проблема обоснования, разработки и совершенствования методов диагностики, клинико-морфологических особенностей и лечения больных наследственным гемохроматозом.

Цель настоящей работы - показать на основании ретроспективного анализа результатов комплексного многофакторного специализированного обследования пациентов с наследственным гемохроматозом, разработанного в ГНЦ РАМН, современные возможности диагностики заболевания на ранней стадии и создать алгоритм диагностического поиска, доступный для врачей-интернистов к применению в амбулаторных условиях.

На первом этапе диагностического поиска, всем больным с подозрением на наличие наследственного гемохроматоза, необходимо исследовать развернутый анализ крови с определением числа тромбоцитов, ретикулоцитов, подсчетом лейкоцитарной формулы. Недопустимо ограничиваться редуцированным анализом с определением гемоглобина, лейкоцитов и СОЭ, распространенным в учреждениях здравоохранения. Подобный анализ, создавая видимость исследования, не дает информации, уводит врача в сторону от правильного диагноза.

Результаты изучения клинического анализа крови у пациентов с наследственным гемохроматозом, с нашей точки зрения, представляют определенный интерес для практического здравоохранения уже в силу доказательности отсутствия у подавляющего числа больных высоких показателей гемоглобина, количества эритроцитов, гематокрита, содержания гемоглобина в одном эритроците.

У пациентов всех исследованных групп имелся разный уровень НЬ: в большинстве случаев показатели находились в пределах физиологической нормы, в отдельных ситуациях НЬ превышал верхнюю границу нормы или был снижен. Снижение концентрации гемоглобина в одном эритроците была отмечена нами в 47,0-75,0% случаев.

Снижение показателя МСН является характерным для больных наследственным гемохроматозом, видимо, как следствие нарушений в патогенетических звеньях метаболизма железа.

Следует отметить, что полученные нами данные расходятся с данными литературы [Barton J.C. et al, 2000], которые говорят о высоких цифрах гемоглобина, эритроцитов, гематокрита, концентрации гемоглобина в одном эритроците у 75,0% обследованных больных. Авторы объясняют это повышенным синтезом эритроцитов на фоне повышенного содержания железа.

Однако исследования феррокинетики доказывают наличие нормального эритропоэза у | пациентов с наследственным гемохроматозом, несмотря па высокую концентрацию плазменного железа. Этот факт подтверждают и данные клинического анализа крови. С нашей точки зрения, свободное железо не участвует в усилении эритропоэза, а откладывается в депо.

Исследованы морфо-функциональные и пластические (деформируемость) свойства эритроцитов при наследственном гемохроматозе. Выявленные изменения носят разноплановый характер вне зависимости от пола и возраста. Найдено, что при этом заболевании имеются определенные сдвиги популяционного состава и морфологических свойств эритроцитов, которые могут носить как патологический, так и компенсаторно-приспособительный характер. Возможно, они отражают изменение кислородно-транспортной и гемостатической функции клеток красной крови при этом заболевании и являются немаловажным фактором в его патогенезе.

Появление аномальных форм эритроцитов (мишеневидных, овало-, дакрио-, аканто-, микросфероцитов) может свидетельствовать о возникновении осложнения заболевания или сочетании с патологией эритрона.

Фракция аномального клеточного пула и наличие эритроцитов с малым содержанием гемоглобина говорят о неэффективном эритропоэзе и, возможно, также являются следствием нарушений в процессах метаболизма железа.

Изменения деформируемости эритроцитов выявлено не было. Контроль над данным показателем поможет прогнозировать обострение процесса.

Подробно исследован метаболизм железа. Показатели обмена железа у больных наследственным гемохроматозом характеризуются гетерогенностью, подтверждая полиморфность клинического течения и степень нарушения метаболизма железа при этой патологии. Повышенное содержания сывороточного железа не отмечалось в 100% случаев: у 5,0-8,0% больных данный показатель снижался до 10,5±2,3 мкмоль/л. Поэтому этот достаточно простой метод может быть использован только в комплексе с другими.

Ферритины сыворотки и эритроцитов, степень насыщения трансферрина железом являются наиболее информативными биохимическими маркерами наследственного гемохроматоза [Lederle F.A., 1988, Sherloch S., 1991, Андреева А.П. et al, 1988], свидетельствующими о повышении общих и органных запасов железа в организме пациентов, что согласуется с нашими данными.

Изменения показателей метаболизма железа наиболее выражены у мужчин с наличием классических HLA-маркеров: гаплотипов HLA АЗ-В7 и АЗ-В14. Следовательно, половой признак играет большую роль при оценке прогрессирования заболевания и эффективности применяемых методов лечения.

Показатель сывороточного ферритина - ведущий параметр в оценке развития сопутствующих вирусных гепатитов: его уровень достоверно выше у пациентов с наличием серологических маркеров вирусов гепатитов.

Исследована частота встречаемости серологических маркеров вирусов инфекционных гепатитов при наследственном гемохроматозе с учетом большого количества парентеральных манипуляций. Установлено, что количество данных маркеров не превышает таковое в донорской популяции, но усугубляет течение заболевания, что подтверждается анализом биохимических показателей крови, метаболизма железа и оценкой функции плазменно-тромбоцитарного гемостаза.

Изменения биохимических показателей сыворотки крови при наследственном гемохроматозе гетерогенны. Найдены диспротеинемия, повышение активности ферментов АсТ, АлТ, тимоловой пробы, увеличено количества В-липопротеидов. Но патологически значимые изменения биохимических показателей выявлены только у пациентов с наличием НЬА - гаплотипов АЗ-В7, АЗ-В 14 и серологическими маркерами вирусов инфекционных гепатитов.

С учетом нарушенной белоксинтезирующей функции печени и необходимостью проведения эфферентных методов терапии (флеботомии, малообъемный прерывистый плазмоэритроцитаферез), исследовано состояние плазменно-тромбоцитарного гемостаза и системы фибринолиза у больных наследственным гемохроматозом.

Установлены разнонаправленные изменения АЧТВ, тромбинового времени и паракоагуляционных тестов, характерные для синдрома ДВС. Имеется активация свертывающего каскада, протекающая на фоне депрессии фибринолиза. Это может приводить к развитию тромбогенной опасности и синдрому диссеминированного впутрисосудистого свертывания в момент поступления экзогенного прокоагулянтного материала и должно учитываться при проведении многократных лечебных кровопусканиях.

Отмеченные нами изменения не носят зависимости от пола и формы наследственного гемохроматоза, но достоверно более выражены в группах пациентов с наличием сывороточных маркеров вирусов гепатитов В и/или С.

Наличие данных маркеров усугубляет функциональные изменения печеночной паренхимы, что проявляется в дисбалансе синтеза компонентов плазменного гемостаза.

Найденные изменения могут усложнять клиническое течение наследственного гемохроматоза, требовать коррекции лечения и служить контролем проводимой терапии.

С учетом влияния на кроветворение, исследовано содержание витамина В12 и фолиевой кислоты в сыворотке крови и эритроцитах больных наследственным гемохроматозом.

Отличительной особенностью этих пациентов является резкое снижение концентрации фолиевой кислоты в эритроцитах при ее нормальном содержании в сыворотке крови. Уровень витамина В12 в сыворотке и эритроцитах больных находился в пределах границ физиологической нормы, но у женщин с наличием HLA- маркеров A3, В7, В14 (условно "гетерозиготная" форма гемохроматоза) содержание его в эритроцитах снижалось.

Найденные изменения требуют дифференцированного подхода к лечебному применению данной группы витаминов у больных с перегрузкой железом.

При сциптиграфическом исследовании гемопоэтической системы пациентов с помощью радиоактивной метки выявлено в разной степени выраженности нарушение функции костного мозга (повышение захвата радиоактивной метки макрофагами периферических отделов костной системы: плечевые, коленные, голеностопные суставы, бедренные кости и снижение захвата радионуклидов центральными отделами); печени (диффузная неравномерность распределения радионуклидной метки с изменением размеров органа) и селезенки (увеличение размеров органа и накопления радионуклидной метки в нем по отношению к печени).

Выявленные сцинтиграфические признаки нарушения функции ретикуло-эндотелиальной системы характерны для наследственного гемохроматоза, косвенно свидетельствуют о патологических сдвигах в кроветворной системе обследованных больных, а степень их выраженности может служить контролем качества проводимой терапии и дополнительным прогностическим критерием.

Проведено комплексное генетическое обследование больных наследственным гемохроматозом: HLA-типирование и ДНК-диагностика (выявление мутаций гена HFE).

Установлено, что у пациентов с наличием клинической картины гемохроматоза и классическими маркерами наследственности системы HLA (антигены HLA-A3, В7, В14, гаплотипы АЗ-В7, АЗ-В14) мутация C282Y гена HFE выявляется только в 18,5%, а мутация H63D - в 26,2% случаев.

По клиническим данным, типирование по HLA-антигенам шире выявляет наследственный гемохроматоз. Исследование ДНК не исключает проведения HLA-типирования, эти два исследования должны проводиться одновременно.

Комплексное обследование - выявление HLA серологическим методом и генетическое ДНК типирование дает возможность диагностировать наследственный гемохроматоз у пациентов с гиперсидерозом неясного генеза; с клинической картиной гемохроматоза, но без наличия HLA - антигенов A3, В7, В14; у лиц, гетерозиготных по HLA и у пациентов в доклинической стадии заболевания, характеризующейся нормальным или несколько сниженным содержанием железа.

Синдром гиперсидероза встречается при других заболеваниях. Без результатов определения у больного классических маркеров наследственности гемохроматоза (антигены HLA- A3, В7, В14) и мутаций HFE гена, можно говорить только о «сидерозе» органов.

Таким образом, результаты, полученные в процессе комплексного обследования больных, позволяют заподозрить и установить диагноз наследственного гемохроматоза прижизненно, проводить дифференциальную диагностику с хроническими диффузными заболеваниями печени вирусной этиологии, поражениями печени при болезни Коновалова-Вильсона, аутоиммунной гемолитической анемией и вторичным (приобретенным) гиперсидерозом другой этиологии.

Для постановки раннего диагноза должны быть также обследованы родственники пациентов с наследственным гемохроматозом; больные с необъяснимым подъемом ACT, АЛТ с /или без гепатомегалии; пациенты с увеличением печени неясной этиологии даже при нормальных функциональных печеночных тестах; пациепты, имеющие одномоментно диабет и гепатомегалию; мужчины до 45 лет с нарушением половых функций и женщины с незапланированной аменореей.

Подозрительным является пациент с артритом мелких суставов кисти в сочетании с крупными суставами, особенно женщины до менопаузы с аменореей.

Можно заподозрить заболевание при необъяснимой застойной сердечной недостаточности, кардиомиопатиях или перикардите.

Гиперпигментация в сочетании с диабетом или какими-либо другими клиническими проявлениями дают основания для исследования метаболизма железа.

На основании полученных результатов, мы разработали и рекомендуем следующий диагностический алгоритм обследования больных при подозрении на наличие наследственного гемохроматоза: клинико-анамнестические данные - развернутый клинический анализ крови с изучением морфо-функциональных свойств эритроцитов и их деформируемости. определение серологических маркеров вирусов инфекционных гепатитов В/С исследование метаболизма железа анализ биохимических показателей сыворотки крови коагулограмма радионуклидные методы диагностики (сцинтиграфическое исследование гемопоэтической системы).

Дизайн диагностического поиска.

Клиника.

Гепатомегалия (цирроз, фиброз), сахарный диабет, миокардиопатия, артропатмия, меланодермия,, гипогонадизм, астено-вегетативный синдром и др.

Кровь: клинический анализ крови, биохимический анализ крови, метаболизм железа, гемостазиограмма, содержание 1витамина В12 и фолиевой кислоты в сыворотке и эритроцитах, серологическое исследование сыворотки крови на наличие вирусспецифических маркеров гепатитов